СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К ПРОВЕДЕНИЮ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ У ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ ПУТЕМ ПРЕДИКЦИИ ЕЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/49 G01N33/52 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и радиологии, и может найти применение при лечении больных злокачественными опухолями головного мозга.

Оптимальные схемы лечения больных злокачественными опухолями головного мозга в настоящее время включают хирургическое удаление новообразования с последующей лучевой (ЛТ) и химиотерапией (XT). При таких стандартных схемах лечения без подбора первичных больных мультиформной глиобластомой медиана их выживаемости составляет 12-15 месяцев. ЛТ с использованием темозоломида (ингибитора репликации ДНК) приводит к повышению радиочувствительности опухоли и значительному улучшению выживаемости больных. Вместе с тем полезность ЛТ в этой схеме ограничена наличием в опухолях экспрессии О⁶-метилгуанин-ДНК метилтрансферазы (МГМТ). Темозоломид представляет собой ДНК-алкилирующий агент, который метилирует О⁶-гуанин (но он может быть репарирован ДНК-метилтрансферазой), а также повышает активность каспазы-3 [Stupp R., Mason W.P., van den Bent M.J., Weller M., Fisher В., Taphoom M., Brandes A.A., Caimcross G., Lacombe D., Mirimanoff R.O., Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. // N. Engl. J. Med. 2005. V.352. P.987-996; Hegi M.E., Diserens A.C., Gorlia T. Et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. // N / Engl. J. Med. 2005. V.352, P.997-1003]. Так как уровень экспрессии МГМТ в значительной степени влияет на эффективность ЛТ с темозоломидом, то измерение МГМТ-активности у больных является определяющим для формирования стратегии лечения в современной нейроонкологии.

Основными недостатками в определении радиочувствительности глиобластом, опосредованной измерением МГМТ-активности в опухолевых образцах, являются длительность анализа (не менее 2-4 суток), а также невозможность оперативно вести мониторинг лечения (для сопоставления результатов МРТ, КТ или ПЭТ с исходными параметрами необходимо не менее 2 недель, анализ с использованием экстракции нуклеиновых кислот из образца опухоли и проведения ПЦР для оценки статуса метилирования гена МГМТ требует несколько суток).

Одним из перспективных путей повышения эффективности предикции применения ЛТ путем существенного сокращения времени определения показателя, а также для осуществления мониторинга процесса лечения, необходимого для оперативной модификации ранее запланированной схемы терапии, является использование в качестве анализируемого материала проб крови конкретного опухоленосителя.

Известен способ определения показателей к проведению ЛТ у опухоленосителей, а именно больных раком мочевого пузыря, путем предикции ее эффективности, RU 2319963 С1.

Данный способ осуществляется путем взятия пробы крови, гамма-обучения этой пробы in vitro, инкубацию облученной и необлученной частей пробы крови и окрашивание ДНК компонентов обеих частей крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, определяют количество лейкоцитов L_o в облученной части пробы крови, количество лейкоцитов L_н в необлученной части пробы крови и отношение L_o/L_н, затем осуществляют окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови, определяют ИД_o - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИД_н - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит необлученной части пробы, вычисляют ИД_н/ИД_o и L_o/L_н, и при значении обоих указанных отношений более 1,0 считают показанным проведение ЛТ.

Указанный способ принят в качестве прототипа настоящего изобретения, поскольку с той или иной степенью достоверности результатов может быть использован и при других опухолях.

К достоинствам способа относятся его быстрое проведение и отсутствие ограничений неоднократного повторения, однако этот способ недостаточно эффективен при определении показаний к проведению ЛТ у опухоленосителей глиобластом и во многих случаях не позволяет достаточно надежно определить наличие или отсутствие таких показаний.

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности способа при определении показаний к проведению ЛТ у опухоленосителей глиобластом.

Согласно изобретению в способе определения показаний к проведению лучевой терапии у опухоленосителей путем предикции ее эффективности, включающий взятие пробы крови, гамма-облучение части этой пробы in vitro, инкубацию облученной и необлученной частей пробы крови, окрашивание ДНК-компонентов обеих частей крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, определение количества лейкоцитов в облученной части пробы крови, количества лейкоцитов в необлученной части пробы крови, окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови, определение ИД_о - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИД_н - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит необлученной части пробы, вычисление ИД_н/ИД_о, берут дополнительную пробу крови, в которую вводят водный раствор, содержащий ионы двухвалентного железа в концентрации 50-75 мг/л в объеме 8-14% от объема пробы крови, затем инкубируют дополнительную пробу крови в течение 15-30 минут, после чего осуществляют гамма-облучение части дополнительной пробы, далее инкубируют облученную и необлученную части дополнительной пробы в течение 2,5-3,5 часов, определяют количество лейкоцитов в облученной и необлученной частях дополнительной пробы, окрашивают все ДНК-содержащие компоненты частей дополнительной пробы и определяют ИД_{о доп} - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах дополнительной пробы в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИД_{н доп} - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит необлученной части дополнительной пробы, после чего вычисляют соотношение ИД_{н доп}/ИД_{о доп} и при ИД_{н доп}/ИД_{о доп}>ИД_н/ИД_о на 20-35% и ИД_н/ИД_о>1 считают показанным проведение лучевой терапии.

Заявителем не выявлены какие-либо технические решения, идентичные заявленному, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию «Новизна».

Введение ионов двухвалентного железа в дополнительную пробу крови перед облучением позволяет значительно увеличить радиочувствительность соматических клеток организма опухоленосителя сразу после облучения, так как наряду с обычным лучевым апоптозом начинают действовать дополнительные механизмы пострадиационной гибели, катализируемые ионами двухвалентного железа. Моделирование этого процесса ex vivo на ДНК крови с использованием ионов двухвалентного железа позволяет выявить для конкретного пациента возможность эффективного проведения ЛТ. Использование раствора с концентрацией Fe²⁺, более высокой чем 14%, увеличит содержание противоионов, тогда как применение концентраций, меньших 8%, потребует увеличения объема вносимой добавки для достижения заметного эффекта, что изменит общий ионный баланс в анализируемом образце крови. Оба этих фактора могут существенно отразиться на метаболизме ДНК в пробе и адекватности экстраполяции полученных результатов на распад ДНК в организме конкретного больного. Введение добавки в объеме 8-14% лишь незначительно изменит метаболизм ДНК в пробе, культивируемой ex vivo, по сравнению с обменом веществ в клетке, находящейся в организме. Это позволяет экстраполировать результаты, полученные вне организма, на аналогичные параметры организма, практически с наименьшими коррекциями. Таким образом, существенно повышается эффективность способа при определении показаний к проведению ЛТ.

Указанный выше новый технический результат позволяет сделать вывод о соответствии заявленного технического решения условию патентоспособности «Изобретательский уровень».

Заявленный способ реализуют следующим образом.

У больного глиобластомой берут 1,0 мл венозной крови основной пробы и 1,0 мл венозной крови дополнительной пробы. Ко всем пробам крови добавляют гепарин по 12,5 ед/мл, а также по 1,0 мл раствора Хенкса. Основную пробу крови затем делят на две примерно равные части, одну часть подвергают гамма-облучению в дозе 2 Гр, другую часть оставляют необлученной. Обе части инкубируют при 37°С в течение 3 часов. После этого осуществляют окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, в конкретном случае, 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (ДАФИ), при этом перед окрашиванием 0,05 мл каждой части основной пробы обрабатывают 10-кратным объемом лизирующей смеси, содержащей 0,5% тритон Х-100, 2М NaCl, 0,1 М Na₂EDTA и 0,01 М трис при рН 8,0 в течение 3-5 минут до просветления. Измеряют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения λ_возб=350 нм и длине волны эмиссии λ_эм=450 нм у облученной части пробы (I₀), затем к пробе добавляют 0,05 мл раствора ДАФИ в концентрации 4 мкг/мл и измеряют интенсивность флуоресценции - I₁; после этого к пробе добавляют 0,02 мл раствора стандартной ДНК в известной концентрации и определяют интенсивность флуоресценции I₂. Количество ДНК, нормированное на один лейкоцит в анализируемых частях основной пробы, рассчитывают по формулам:

;

,

где ИД_о, ИД_н - количество ДНК на один лейкоцит, соответственно, в облученной и необлученной частях пробы;

Л_о, Л_н - количество лейкоцитов в облученной и необлученной частях пробы;

К - коэффициент, зависящий от разбавления проб и стандарта, а также от концентрации стандарта (К - при одинаковых условиях измерения является величиной постоянной).

Определив индексы ИД_н в необлученной и ИД_о в облученной частях пробы, вычисляют отношение ИД_н/ИД_о.

Одновременно с указанными выше операциями в отношении основной пробы в дополнительную пробу вводят водный раствор, содержащий ионы двухвалентного железа в концентрации 50-75 мг/л в объеме 8-14% от объема пробы крови, затем инкубируют дополнительную пробу крови в течение 15-30 минут; после этого осуществляют гамма-облучение части (примерно 50%) дополнительной пробы; инкубируют облученную и необлученную части дополнительной пробы в течение 2,5-3,5 часов; далее аналогично в основной пробе определяют количество лейкоцитов в облученной и необлученной частях дополнительной пробы, окрашивают все ДНК-содержащие компоненты частей дополнительной пробы и определяют ИД_{о доп} и ИД_{н доп} - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит, соответственно, облученной и необлученной частей дополнительной пробы. После этого вычисляют соотношение ИД_{н доп}/ИД_{о доп}. При ИД_{н доп}/ИД_{о доп}>ИД_н/ИД_о на 20-35% и ИД_н/ИД_о>1 считают показанным проведение лучевой терапии.

Пример 1.

Анамнез - больной Х-в, 44 года. Поступил в клинику ФГБУ РНЦРХТ МЗСР РФ с диагнозом: «мультифокальная глиобластома» IV степени злокачественности.

Облучение частей основной и дополнительной проб осуществляли на гамма-установке «Луч-1», мощность дозы 0,4 Гр/мин, суммарная доза - 2 Гр. Инкубацию осуществляли в термостате, количество лейкоцитов определяли с помощью камеры Горяева. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре «Хитачи» (Япония), Model-850, λ_возб=350 нм, λ_эм=450 нм.

Рассчитали ИД_н/Ид_о=1,25 и аналогчино ИД_{н доп}/ИД_{о доп}=1,58.

Поскольку ИД_{н доп}/ИД_{о доп} больше ИД_н/ИД_о на 26% и ИД_н/ИД_о>1 было сделано заключение о целесообразности проведения ЛТ с радиомодификатором (темозоломидом), которая была проведена с 13 декабря 2011 г. по 11 января 2012 г.

По данным МРТ-контроля от 25.05.12 г. по сравнению с данными МРТ от 12.12.11 г. размеры основного образования несколько уменьшились и составляли 31×32×15 мм.

Пример 2.

Анамнез - больной Д-в, 38 лет. Поступил в клинику ФГБУ РНЦРХТ МЗСР РФ с диагнозом «глиобластома» IV степени злокачественности.

У этого больного величина ИД_н/ИД_о=1,22 (отн. ед). ИД_{н доп}/ИД_{о доп} = 0,26 (отн. ед). Так как 0,26/1,21=0,21, то было сделано заключение о нецелесообразности лучевой терапии. Несмотря на негативную предикцию, ЛТ с радиомодификатором (темозоломидом) все же была проведена с 11 июля по 25 июля 2012 г.

Последующая магнито-резонансная томография головного мозга (от 12 сентября 2012 г.) выявила признаки продолженного роста опухоли. Рецидив заболевания произошел через 2 месяца.

При сопоставлении заявляемого способа предикции эффективности ЛТ с другими, используемыми с этой же целью, следует отметить, что последующая верификация изменения объема глиом с помощью МРТ показала правильность предикции изложенным в настоящей заявке способом в более чем 95% случаев в сравнении с 70-80% для известных способов.

Предлагаемый способ оценки эффективности ЛТ в сравнении с известными обеспечивает сокращение времени определения показателя предикции с нескольких суток до 4 часов и, кроме того, позволяет оперативно вести мониторинг лечения, когда невозможно получить опухолевый материал.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и радиологии, и может найти применение при лечении больных злокачественными опухолями головного мозга. В способе определения показаний к проведению лучевой терапии у опухоленосителей путем предикции ее эффективности, включающем взятие пробы крови, гамма-облучение части этой пробы in vitro, инкубацию облученной и необлученной частей пробы крови, окрашивание ДНК-компонентов обеих частей крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, определение количества лейкоцитов в облученной части пробы крови, количества лейкоцитов в необлученной части пробы крови, окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови, определение ИД_о - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИД_н - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит необлученной части пробы, вычисление ИД_н/ИД_о, берут дополнительную пробу крови, в которую вводят водный раствор, содержащий ионы двухвалентного железа в концентрации 50-75 мг/л в объеме 8-14% от объема пробы крови, затем инкубируют дополнительную пробу крови в течение 15-30 минут, после чего осуществляют гамма-облучение части дополнительной пробы, далее инкубируют облученную и необлученную части дополнительной пробы в течение 2,5-3,5 часов, определяют количество лейкоцитов в облученной и необлученной частях дополнительной пробы, окрашивают все ДНК-содержащие компоненты частей дополнительной пробы и определяют ИД_{о доп} - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах дополнительной пробы в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИД_{н доп} - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит необлученной части дополнительной пробы, после чего вычисляют соотношение ИД_{н доп}/ИД_{о доп} и при ИД_{н доп}/ИД_{о доп}>ИД_н/ИД_о на 20-35% и ИД_Н/ИД₀>1 считают показанным проведение лучевой терапии. Изобретение обеспечивает повышение эффективности способа при определении показаний к проведению ЛТ у опухоленосителей глиобластом. 2 пр.

Способ определения показаний к проведению лучевой терапии у опухоленосителей путем предикции ее эффективности, включающий взятие пробы крови, гамма-облучение части этой пробы in vitro, инкубацию облученной и необлученной частей пробы крови, окрашивание ДНК-компонентов обеих частей крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, определение количества лейкоцитов в облученной части пробы крови, количества лейкоцитов в необлученной части пробы крови, окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови, определение ИД_о - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИД_н - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит необлученной части пробы, вычисление ИД_н/ИД_о, отличающийся тем, что берут дополнительную пробу крови, в которую вводят водный раствор, содержащий ионы двухвалентного железа в концентрации 50-75 мг/л в объеме 8-14% от объема пробы крови, затем инкубируют дополнительную пробу крови в течение 15-30 мин, после чего осуществляют гамма-облучение части дополнительной пробы, далее инкубируют облученную и необлученную части дополнительной пробы в течение 2,5-3,5 ч, определяют количество лейкоцитов в облученной и необлученной частях дополнительной пробы, окрашивают все ДНК-содержащие компоненты частей дополнительной пробы и определяют ИД_{о доп} - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах дополнительной пробы в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИД_{н доп} - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит необлученной части дополнительной пробы, после чего вычисляют соотношение ИД_{н доп}/ИД_{о доп} и при ИД_{н доп}/ИД_{о доп}>ИД_н/ИД_о на 20-35% и ИД_н/ИД_о>1 считают показанным проведение лучевой терапии.