СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К ПРОВЕДЕНИЮ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ПЕРВИЧНОМ ЛИМФОГРАНУЛЕМАТОЗЕ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, точнее к радиобиологии лучевой терапии злокачественных опухолей, радиологии и радиоонкологии, и может найти применение при лечении системных заболеваний.

Лимфогранулематоз (ЛГМ) является часто встречающейся системной злокачественной опухолью, пораженной преимущественно молодой репродуктивный возраст. В настоящее время для лечения ЛГМ применяют лучевую, химиотерапию или их комбинацию. Лучевая терапия занимает ведущее место в лечении ЛГМ - она более эффективна при незапущенных стадиях, может быть применена локально (облучают исключительно зоны лечения), занимает меньше времени на лечение больного. Вместе с тем, радикальная лучевая терапия (РЛТ) вызывает изменения показателей периферической крови (ППК). Дело в том, что в повседневной практике врачам приходится обращаться чаще всего к ППК, решая вопрос о возможности проведения РЛТ с учетом риска возникновения ожидаемых осложнений. Подход к этому вопросу до настоящего времени остается чисто интуитивным [1]. Врачи радиологи прекращают облучение больных при уровне лейкоцитов в периферической крови составляющим 3•10⁹ кл/л и даже 2•10⁹ кл/л. РЛТ может привести к значительным изменениям гемограмм в виде уменьшения всех элементов белой крови (в большей степени лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов), глубина изменения которых может достигать 1 • 10⁹ кл/л [3].

Изменения ППК сопровождаются развитием определенного комплекса клинических симптомов, которые следует рассматривать с совокупности как проявление своеобразной формы подострого лучевого синдрома, индуцированного РЛТ. Гормональное и симптоматическое лечение в процессе РЛТ позволяет ослабить проявления этого осложнения при полной ликвидации побочных симптомов у 75,5% больных в сроки до 3 месяцев, у 25,5% - до 7 месяцев [1].

Однако устранение осложнений РЛТ за такое длительное время значительно удлиняет сроки и снижает эффективность лечения. Поэтому актуальным является вопрос о выборе оптимальной тактики лечения, в частности, об определении показаний к проведению РЛТ, что связано с гематологической толерантностью.

К настоящему времени известен способ прогноза лечения ЛГМ на основании определения скорости оседания эритроцитов (СОЕ) при исходной характеристике ППК [2] . Величина СОЕ коррелирует с глубиной анемии и числом гранулоцитов, но не с числом лимфоцитов, являющихся наиболее радиочувствительным компонентом крови. Вместе с тем, этот показатель не является информативным для определения 3-летней выживаемости пациентов при величине СОЕ ниже 30 мм/час, и, как отмечают авторы этой работы, не имеет прогностического значения для пациентов с системными симптомами.

Известен способ определения показаний к РЛТ ЛГМ по ППК [3], заключающийся в выявлении связи между такими параметрами ППК, как число палочкоядерных нейтрофилов и моноцитов и концентрация гемоглобина, у больных ЛГМ до лечения и прогнозом по критерию продолжительности жизни, который можно рассматривать как прогностический к проведению РЛТ. Способ позволяет при первичном обращении больного по ППК определить тенденцию прогноза по критерию выживаемости в течение длительных сроков наблюдения.

Оба этих метода несколько точнее интуитивного подхода, поскольку основаны на обективных показателях крови больного. Однако для выбора тактики лечения, а именно целесообразности и возможности проведения РЛТ они недостаточно информативны, так как являются лишь опосредованными показателями к проведению РЛТ.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, основанный на определении ППК, точнее уровня лейкоцитов в крови больного до начала РЛТ [1]. Этот способ взят нами в качестве прототипа. Он позволяет прогнозировать лейкопению, как осложнение при проведении РЛТ, являющейся результатом лучевого поражения организма пациента. Вместе с тем, этот способ, как и вышеописанные далеко не всегда отражают радиочувствительность пациента (которая может быть высокой и при достаточно большом числе лейкоцитов крови), а также не является специфическим и точным в отношении действия данного лучевого фактора.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности определения показаний к проведению РЛТ за счет выявления степени радиочувствительности пациента до начала проведения лучевой терапии.

Этот результат достигается тем, что в известном способе определения показаний к проведению лучевой терапии при лимфогранулематозе путем исследования лейкоцитов периферической крови, согласно изобретению, пробу крови делят на 2 части, одну из которых подвергают гамма-облучению в дозе 2 Гр, то есть дозой, равной разовой очаговой дозе, применяемой при РЛТ, затем обе пробы инкубируют в течение 3 часов, после чего в них определяют содержание ДНК в лейкоцитах, отношение найденных величин в облученной и необлученной пробах и при его значении менее 1 считают, что больному показано проведение лучевой терапии.

Целесообразно инкубацию проб крови проводить в растворе Хенкса при 37^oC, перед определением ДНК пробы крови лизировать раствором, содержащим 0,5% тритон X-100, 2M NaCl, 0,1 M Nа₂EDTA и 0,01 M трис при pH 8,0, а само определение ДНК в пробах проводить флуоресцентным методом, окрашивая их 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (ДАФИ).

Проведение гамма-облучения и анализа пробы крови каждого пациента в дозе 2 Гр моделирует лучевое воздействие на организм конкретного больного и позволяет учесть соотношение именно его радиочувствительных и радиорезистентных факторов.

Инкубация проб крови в речение 3 часов дает возможность получить достаточно значимые различия между облученной и необлученной пробами, которые являются результатом пострадиационных процессов, развиваются во времени и, как нами показано, является оптимальным для решения поставленной задачи. Более длительная инкубация лишь увеличит общее время определения, но не дает существенных преимуществ в выявлении различий. При меньшем времени инкубации достоверность различий не выявляется.

Определение содержания ДНК в лейкоцитах позволяет выявить различия в их количестве в облученной и необлученной пробах, что свидетельствует о влиянии на лейкоциты облученной пробы лучевого фактора.

Отношение содержания ДНК лейкоцитов облученной и необлученной проб характеризует степень деградации ДНК под влиянием лучевого воздействия, которое, как известно, имеет место при апоптотической форме гибели белых клеток крови, находящихся в интерфазе. Причем использование в этом отношении в знаменателе содержания ДНК необлученной пробы, отражающего неспецифическую гибель лейкоцитов в условиях инкубации.

Инкубацию проб крови целесообразно проводить в растворе Хенкса при 37^oC, что обеспечивает достаточное количество питательных компонентов среды для краткосрочной инкубации лейкоцитов при температуре, соответствующей таковой в организме человека.

Пробы крови перед определением ДНК целесообразно лизировать раствором, содержащим 0,5% тритон X-100, 2M NaCl, 0,1 M Na₂EDTA и 0,01 M трис при pH 8,0 в течение 3-5 мин, что позволяет солюбилизировать мембраны лейкоцитов и тем самым обеспечить беспрепятственный доступ флуорохрома (ДАФИ) к содержащейся в них ДНК. Это дает возможность быстро связаться флуоресцирующему лиганду с субстратом, что сокращает процедуру измерения ДНК до нескольких минут и делает весь метод пригодным для оперативной оценки.

Сущность способа заключается в следующем.

У больного ЛГМ берут 1,5 мл крови, добавляют гепарин (до 25 ед/мл) и 1,5 мл раствора Хенкса. Полученную смесь делят на 2 части. Одну из них облучают дозой 2 Гр, другая служит контролем. Обе пробы инкубируют в течение 3 ч при 37^oC. После этого в обеих пробах определяют концентрацию лейкоцитов (L) с помощью камеры Горяева и концентрацию ДНК флуориметрическим способом. С этой целью 0,05 мл пробы крови лизируют 10-кратным объемом смеси, содержащей 0,5% тритон X-100, 2M NaCl, 0,1 M Na₂EDTA и 0,1 M трис при pH 8,0, в течение 3 - 5 мин до просветления и 0,05 мл лизированной пробы добавляют к 1,0 мл трис-буфера. Измеряют интенсивность флуоресценции при λ_возб= 350 нм и λ_эм= 450 нм у лизированной пробы (I₀), затем к пробе добавляют 0,05 мл раствор ДАФИ в концентрации 2 мкг/мл и измеряют интенсивность флуоресценции (I₁), после чего к пробе добавляют 0,02 мл раствора стандартной ДНК в известной концентрации и определяют интенсивность флуоресценции (I₂). Концентрацию ДНК в лейкоцитах анализируемой пробы рассчитывают по формуле:

где K - коэффициент, зависящий от разбавления проб и стандарта, а также от концентрации стандарта (при одинаковых условиях измерения является величиной постоянной).

Определив по формуле (1) концентрацию ДНК для лейкоцитов облученной (C₀) и необлученной (C_k) проб рассчитывают величину искомого показателя по формуле S=C_k/C_o.

При значениях этого показателя меньше 1 делают вывод о достаточной радиорезистентности пациента и считают, что больному показано проведение лучевой терапии.

Сущность способа иллюстрируется следующим примером.

Пример 1.

Анамнез - больной Бельский 19 лет, первичный ЛГМ ПА-стадия, поступил в клинику ЦНИРРИ МЗ РФ в мае 1995 г.

К 1, мл гепаринизированной (25 ед/мл) цельной пробы крови пациента Бельского добавили 1,5 мл раствора Хенкса. Получившуюся смесь разделили на 2 части. Одну из них облучили в дозе 2 Гр на гамма-установке "Луч-1" (⁶⁰Co, мощность дозы, 0,45 Гр/мин), другая служила контролем. Обе пробы инкубировали в течение 3 ч при 37^oC в суховоздушном термостате. После этого в обеих пробах определяли концентрацию лейкоцитов (L) обычным методом с помощью камеры Горяева и концентрацию ДНК флуориметрическим способом. С этой целью 0,02 мл пробы крови лизировали 10-кратным объемом смеси, содержащей 0,5% тритон X-100, 2M NaCl, 0,1 M Na₂EDTA и 0,1 M трис при pH 8,0, в течение 3 - 5 мин до просветления и 0,05 мл лизированной пробы добавляли к 1,0 мл трис-буфера. Интенсивность флуоресценции образца измеряли на спектрофлуориметре фирмы "Хитачи" (Япония) Model-850 при λ_возб= 350 нм и λ_эм= 450 нм. В данном случае (пример 1 таблицы) у необлученной лизированной пробы I_o = 4,9, затем к пробе добавляли 0,05 мл раствор ДАФИ в концентрации 2 мгк/мл и определили интенсивность флуоресценции I₁ = 24,2, после чего к пробе добавили 0,02 мл раствора стандартной ДНК тимуса теленка фирмы "Серва" (Германия) в концентрации 10 мкг/мл и определяли интенсивность флуоресценции I₂ = 29,7. Концентрацию ДНК в лейкоцитах анализируемой пробы рассчитывали по формуле (1). Данные определения экспериментальных параметров для лейкоцитов облученной и необлученной проб крови больного Бельского представлены в таблице 1.

Определив по формуле (1) концентрацию ДНК для лейкоцитов облученной (C_o) и необлученной (C_k) проб по формуле (2) рассчитали величину искомого показателя S = 0,80. Так как значение этого показателя было меньше 1, то был сделан вывод о достаточной радиорезистентности пациента, и сочли, что больному показано проведение лучевой терапии. Последующее определение надира лейкоцитов в процессе РЛТ показало, что действительно, снижение числа лейкоцитов было небольшим, и достигало лишь 71% от исходного значения. Осложнений в процессе РЛТ не было.

Для сравнения приводим данные лечения другого больного, которому, в соответствии с нашими показаниями, РЛТ не было рекомендовано, но курс лечения все же был проведен.

Анамнез - больной Трофимов 28 лет, первичный ЛГМ ША-стадия, поступил в клинику ЦНИРРИ МЗ РФ в июне 1995 г.

К 1,5 мл гепаринизированной цельной пробы крови пациента Трофимова добавили 1,5 раствора Хенкса и произвели определение всех вышеперечисленных параметров в условиях, описанных выше. Данные этих измерений также приведены в таблице. Как можно видеть из представленных данных велича S у пациента Трофимова была равна 1,21, что свидетельствовало о повышенной радиочувствительности пациента и являлось противопоказанием для проведения рутинного курса РЛТ. Несмотря на это, такое лечение было осуществлено и в процессе его обнаружилось, что снижение числа лейкоцитов было достаточно большим - до 36% от исходного значения. Это привело к осложнению процесса лечения, необходимости применения коррегирующей терапии.

Результаты исследований 9 больных вышеописанным способом и данные клинических наблюдений, полученные в процессе лечения, приведены в таблице 2. Как видно из представленных в таблице 2 данных, первые 6 больных, которым согласно предлагаемого способа было рекомендовано проведение РЛТ, так как в среднем S = 0,75±0,07, перенесли полный курс лечения (20 сеансов - 40 Гр) с допустимым снижением числа лейкоцитов до 64,5±9,7%, относительно исходных значений, что соответствовало 2,25±0,13•10⁹ кл/л. У остальных 3 больных, которым не было рекомендовано проведение РЛТ, так как S было больше 1, в процессе лечения обнаруживалась глубокая лейкопения (в среднем - до 20,0±6,7%, относительно исходных значений), что потребовало дополнительной поддерживающей терапии для восстановления картины крови. Для лучшего понимания выбора тактики лечения приводим установленную нами зависимость в виде графика (фиг. 1), на котором по оси абсцисс отложены величины определяемого нами показателя (S), а по оси ординат - степень снижения лейкоцитов в процессе РЛТ ЛГМ. Как можно видеть из рисунка, при значениях S менее 1 степень снижения числа лейкоцитов в процессе РЛТ ЛГМ не превышает 40% от исходного значения, что является показанием к проведению курса лучевой терапии.

По сравнению с известными способ имеет ряд существенных преимуществ.

1. Способ позволяет определить показания к проведению курса РЛТ до начала лечения и осуществить его с положительным результатом.

2. Способ может быть использован не только до начала лечения, но и для мониторинга процесса проведения РЛТ, поскольку основан на определении уровня радиочувствительности пациентов в любой период проведения курса лечения.

Способ разработан в лаборатории биотестирования токсических факторов окружающей среды и отделе клинической радиологии ЦНИРРИ МВ PФ с положительным результатом.

Использованная литература.

2. Tubiana V., Attie E., Flamant R., Gerard-Marchant R., Hayat M. Prognosid factors in 454 cases of Hodgkin's disease. Cancer Res., 1971, v.31, p. 1801-1810.

3. Филатова А.М., Шатинина Н.Н. Прогностическое значение показателей периферической крови у больных лимфогранулематозом. Диагностика и лечение лимфом. Л.: ЦНИРРИ, 1981, с. 95-96.

1. Холин В.В., Корытова Л.И., Коврижкина Т.А. Показатели периферической крови при разных способах лечения лимфогранулематоза. Мед. радиология, 1991, т.36, с. 22-26.

Способ заключается в исследовании лейкоцитов периферической крови первичного больного лимфогранулематозом после гамма-облучения одной части пробы крови в дозе 2 Гр инкубации облученной и необлученной проб в течение 3 ч при 37^oС, определении в них содержания ДНК и нахождении соотношения этих величин в облученной и необлученной пробах. При значении этого отношения менее 1 делают вывод о достаточной радиорезистентности пациента и считают, что больному показано проведение лучевой терапии. Способ позволяет определить показания к проведению курса лучевой терапии до начала лечения и осуществить его с положительным результатом. Способ может быть использован не только до начала лечения, но и для монитора процесса проведения лучевой терапии, поскольку основан на определении уровня радиочувствительности пациентов в любой период проведения курса лечения. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.

1. Способ определения показаний к проведению лучевой терапии при первичном лимфогранулематозе путем исследования лейкоцитов периферической крови, отличающийся тем, что пробу крови делят на 2 части, одну из которых подвергают гамма-облучению в дозе 2 Гр, затем обе пробы инкубируют в течение 3 ч, после чего в них определяют содержание ДНК в лейкоцитах, отношение найденных величин в облученной и необлученной пробах и при его значении менее 1 считают, что больному показано проведение лучевой терапии. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубацию проб крови проводят в растворе Хенкса при 37^oC. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что перед определением содержания ДНК пробы крови лизируют раствором, состоящим из 0,5% тритон Х-100, 2М NaCl, 0,1 М Na₂ЕДТА и 0,01 М трис при pH 8,0. 4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что определение содержания ДНК в пробах проводят флуоресцентным методом, окрашивая их 4',6-диамино-2-фенилиндолом.