ШТАММ МИКРОВОДОРОСЛИ Chlorella vulgaris ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ В КАЧЕСТВЕ СЫРЬЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА МОТОРНОГО ТОПЛИВА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/12 C12P7/64 C12R1/89 

Изобретение относится к штаммам микроводорослей и может использоваться для получения липидов в качестве сырья для производства моторного топлива.

Последнее десятилетие отмечено возрастанием интереса к разработке технологий, основанных на использовании альтернативной сырьевой базы для промышленности, в том числе и использованием растительной биомассы. Однако с бурным ростом производства биоэнергоносителей обозначилась общая мировая проблема, которая связана с занятием пахотных земель под выращивание энергетических культур, конкуренцией возобновляемой энергетики с сектором продовольственных товаров за сельскохозяйственное сырье, в первую очередь за кукурузу, сою, пшеницу. В связи с этим актуальны исследования по поиску оптимального источника растительной биомассы, характеризующегося одновременно высокой продуктивностью и доступностью, а также низкой ресурсо- и энергозатратностью при культивировании и переработке. В качестве подобного источника сырья рассматривают биомассу микроводорослей, которая по своим основным показателям как энергетическое сырье превосходит другие сырьевые биоресурсы. Биомасса микроводорослей служит источником липидов и углеводородов, используемых в производстве биотоплива.

Продуктивность микроводорослей по биомассе и липидам на порядок превышает продуктивность наземных растений. Так, например, в некоторых видах водорослей при оптимальных условиях культивирования содержание липидов превышает таковое в масличных растениях: у Botryococcus braunii 25-75% от сухой массы, у Chlorella sp.28-32%, Crypthecodinium cohnii 20%, Cylindrotheca sp.16-37%, Dunaliella primolecta 23%, Isochrysis sp.25-33%o, Nannochloris sp.20-35%, Nannochloropsis sp.31-68%, Neochloris okoabundans 35-54%, Nitzschia sp.45-47%, Phaeodactylum tricornutum 20-30%. При этом площадь, необходимая для их выращивания, является 50-100 раз меньшей, чем, например, для рапса [Chisti Y. Biodizel from Microalgae// Biotechnology Advances. 2007. - Vol.25. - P. 294-306].

Большинство штаммов микроводорослей имеют высокое содержание ненасыщенных жирных кислот, что не позволяет получать без дополнительной обработки на основе их липидов топливо с низкими цетановыми числами и хорошей устойчивостью к окислению. Стандартное топливо характеризуется цетановым числом 40-45, а топливо высшего качества имеет цетановое число 45-50. При значениях цетанового числа свыше 60 снижается полнота сгорания топлива, возрастает дымность выхлопных газов, повышается расход топлива. Слишком высокие цетановые числа увеличивают вязкость топлива при низких температурах. Поэтому смесь жирных кислот С18:1, С18:0 и С16:0, входящих в состав липидов масла микроводорослей, является наиболее подходящей для продукции биотоплива [Knothe G. Improving biodiesel fuel properties by modifying fatty ester composition //Energy Environ. Sci. 2009. V.2. P. 759-766].

Известен способ продукции полиненасыщенных жирных кислот штаммом микроводоросли Cryptheconidium conii при понижении концентрации хлоридов в культуральной жидкости [Патент США №7163811, МПК С12Р 7/64; A23D 9/00]. Недостатком данного способа является высокое содержание ненасыщенных жирных кислот (до 53,9% от массы масла) в биомассе микроводорослей, что значительно усложняет получение качественного биотоплива из-за возможности их окисления по непредельным связям.

Известны штаммы Pseudochoricystis ellipsoidea MBIC11204 и MBIC11220, продуцирующие в разных количествах углеводороды н-гептадецен, н-гептадекан, н-нонадецен и н-нонадекан. Недостатком данного штамма является то, что при культивировании используются витамины (В₁, В₁₂ и биотин), что значительно увеличивает стоимость производства биомассы и липидов данной микроводоросли. Кроме того, используется способ культивирования, включающий смену среды с богатой азотистыми соединениями на обедненную, что усложняет технологию производства.

Известна микроводоросль Pseudochoricystis ellipsoidea, продуцирующая углеводороды, которые можно использовать в качестве заменителя дизельного топлива - светлых нефтепродуктов [Европейский патент №1873233]. Представлен также способ получения углеводородов, предусматривающий культивирование данной микроводоросли, способной продуцировать углеводороды.

Наиболее близким аналогом предлагаемого штамма Chlorella vulgaris А1123 является штамм Chlorella vulgaris ESP-31 [Yeh K.L., Chang J.S. Effects of cultivation conditions and media composition on cell growth and lipid productivity of indigenous microalga Chlorella vulgaris ESP-31 // Bioresource Technology. 2012. V. 105. P. 120-127], который позволяет получать липиды, включающие 60-68% насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот в составе, в том числе, пальмитиновой (С 16:0), стеариновой (С 18:0) и олеиновой кислоты (С18:1).

Однако этот штамм при культивировании не позволяет получать липиды с высоким содержанием насыщенных кислот: содержание пальмитиновой кислоты составляет 16.44-26.46%, с стеариновой 7.07-14.92% от общего количества жирных кислот в липидах, в зависимости от используемой для культивирования среды.

Изобретение решает задачу получения штамма микроводоросли, обладающего способностью продуцировать липиды с высоким содержанием насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот, пригодных для применения их в качестве сырья для продукции моторных топлив высокого качества.

Поставленная задача решается тем, что предлагается штамм микроводоросли Chlorella vulgaris А1123, обладающий высоким содержанием насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот в составе липидов, в том числе, пальмитиновой, в качестве сырья для производства моторных топлив.

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris А1123 выделен из горячего источника у подножия вулкана Мутновский (Камчатка), идентифицирован в ИЦиГ СО РАН и депонирован в Коллекции микроводорослей ИФР РАН под регистрационным номером IPPAS С-616.

Штамм Chlorella vulgaris А1123 имеет следующую морфофизиологическую характеристику. Клетки круглые, шаровидные, с тонкой оболочкой без слизи, размером 3-5 мкм с одиночным пиреноидом размером 1 мкм, размножение происходит 4-8 автоспорами. На агаризованной среде ВВМ образует колонии зеленого цвета с ровным краем. Штамм авто- и миксотрофный. Температура культивирования от 20 до 35°С. Штамм растет на минеральной среде ВВМ, не требует для роста подачи в среду углекислого газа. Достаточный период освещения для роста - до 16-18 ч в сутки. При окрашивании флуоресцентным красителем Nile Red в цитоплазме клеток визуализируются капли липидов. Штамм не склонен к осаждению как в культуре, так и на стенках культивационной установки, сохраняет аксеничность при хранении. Штамм развивается вне зависимости от сезона года.

Полученный штамм по сравнению с ранее описанными штаммами обладает повышенным содержанием липидов с насыщенными и мононенасыщенными жирными кислотами. Общее содержание данных жирных кислот, определенных методом газовой хроматомасс-спектрометрии, составило 75%, как показано в Таблице, в том числе пальмитиновой - 38%, что превышает показатели штамма Chlorella vulgaris ESP-31 и позволяет получать сырье для производства биотоплива с повышенным содержанием насыщенных жирных кислот с улучшенными свойствами после обработки биомассы ультразвуком и экстракции растворителями. Содержание липидов штамма Chlorella vulgaris А1123 при миксотрофном культивировании составило 32% от сухого веса, кроме того, культивирование штамма не требует добавления в среду углекислоты и витаминов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Визуализация накопления липидов в клетках микроводоросли Chlorella vulgaris Al 123 при окраске флуоресцентным красителем Nile Red.

Культивирование штамма проводят в лабораторных условиях при температуре 25°С на среде ВВМ рН 6.8, и следующим составом из расчета на 1 литр:

NaNC₃ - 0,75 г.

CaCl₂·2H₂O - 0,025 г

MgSO₄·7H₂O - 0,075 г

K₂HPO₄ - 0,075 г

KH₂PO₄ - 0,175 г

NaCl - 0,025 г

Na₂EDTA·2H₂O - 10 мг

FeSO₄·7H₂O - 4,98 мг

MnCl₂·4H₂O - 1,81 мг

ZnSO₄ - 0,222 мг

Co(NO₃)₂·6H₂O - 0,049 мг

NaMoO₄·5H₂O - 0,39 мг

CuSO₄·5H₂O - 0,079 мг

Н₃BO₃·2Н₂0 - 19,28 мг

Культивирование штамма микроводоросли в лимитированных по азоту условиях проводят в течение 7 дней, в объеме среды 200 мл в колбах на 500 мл, при непрерывном барботировании суспензии стерильным воздухом с скоростью 200 мл/мин, при освещенности 120 Вт/м² с фотопериодом 16 ч. Суспензию клеток смешивают с 1 мМ раствором Nile Red в воде, после чего проводят флуоресцентную микроскопию при длине волны возбуждения 450-490 нм и длине волны обнаружения 515-565 нм. Результаты приведены на рисунке, где показаны клетки микроводоросли Chlorella vulgaris А1123: А. - микроскопия в проходящем свете, Б. - флуоресцентная микроскопия при окрашивании красителем Nile Red. Масштаб 10 мкм. Стрелками показаны капли липидов в цитоплазме клеток.

Пример 2. Миксотрофное культивирование штамма микроводоросли Chlorella vulgaris Al 123 на среде с глюкозой.

Культивирование штамма проводят в лабораторных условиях на среде ВВМ при рН 6.8 и температуре 25°С аналогично примеру 1, но с добавлением глюкозы до 10 г/л, клетки осаждают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Экстракцию липидов из биомассы проводят по методу Фолча (Folch J., Lees М. and Sloane Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // Journal of biological chemistry. - 1957. V.226. - P. 497-509.) со следующей модификацией: клетки гомогенизируют с использованием ультразвукового генератора в течение 2 мин, при 30 кГц и мощности 130 Вт в смеси хлороформ:метанол (2:1). К полученной смеси добавляют четверть объема 0.9% раствора хлористого калия и интенсивно перемешивают. После расслоения жидкости органическую фазу отгоняют в токе азота, полученный остаток взвешивают и определяют содержание липидов по сухому весу. Содержание липидов в биомассе микроводоросли Chlorella vulgaris Al 123 на среде с глюкозой при миксотрофном культивировании составляет 32% (по сухому весу).

Пример 3. Анализ состава жирных кислот липидов микроводоросли Chlorella vulgaris А1123.

Для проведения анализа состава жирных кислот, входящих в состав липидов микроводоросли Chlorella vulgaris Аl 123, используют липиды, полученные, как описано в примере 2, для чего проводят их переэтерефикацию с целью получения метиловых эфиров жирных кислот как в работе [Christie W.W. Gas chromatography and lipids.Publisher: The Oily Press. - 1989. - P. 37-38]. Для этого навеску липидов (5 мг) растворяют в толуоле (1 мл), после добавляют раствор 1%-ной серной кислоты в метаноле (2 мл), интенсивно перемешивают. Смесь кипятят в течение двух часов, после добавляют 5 мл 5% раствора NaCl. Полученную смесь двукратно экстрагируют 5 мл гексана. Гексановый слой промывают раствором 2% NaHCO₃ и сушат над безводным Na₂SO₄, смесь фильтруют и удаляют растворитель в токе азота.

Состав метиловых эфиров жирных кислот липидов анализируют методом газовой хроматомасс-спектрометрии на приборе Agilent 7000 В с ионизацией электронным ударом (70 эВ), на колонке DB-5 (30 м × 0.25 мм), с температурным градиентом от 80°С до 290°С со скоростью повышения 4°С/мин. Температура инжектора и детектора была установлена на 250 и 230°С соответственно. Поток газа-носителя составляет 1.2 мл/мин. Идентификацию соединений производят путем сравнения получаемых данных с библиотекой спектров известных соединений. Результаты анализа, приведенные в Таблице, показывают, что микроводоросль Chlorella vulgaris Аl 123 обладает высоким содержанием как насыщенных жирных кислот С16:0, С18:0 (57%), так и мононенасыщенной С18:1, суммарное количество которых составляет 75%.

Таблица Состав жирных кислот микроводоросли Chlorella vulgaris Аl 123 при миксотрофном культивировании по данным газовой хроматомасс-спектрометрии. Жирная кислота С16:0 С18:0 С16:1 С16:2 С16:3 С18:1 С18:2 С18:3 % от общего количества 38 19 4 3 5 18 7 6   насыщенные ненасыщенные   57 43

Изобретение относится к области биохимии. Предложен штамм микроводоросли Chlorella vulgaris IPPAS C-616 для получения липидов в качестве сырья для производства моторного топлива. Штамм микроводоросли обладает способностью продуцировать липиды с высоким содержанием насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris IPPAS С-616 для получения липидов в качестве сырья для производства моторных топлив.