АНТИ-MIF АНТИТЕЛА Российский патент 2014 года по МПК C07K16/24 A61K39/395 A61P37/00 C12N5/10 C12N15/63 C12Q1/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам и их антиген-связывающим частям, которые специфически связывают С-концевую часть или центральную область фактора ингибирования миграции макрофагов (MIF). Эти анти-MIF антитела и их антиген-связывающие части дополнительно ингибируют биологическую функцию MIF человека. Изобретение также относится к выделенным тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов, полученных из анти-MIF антител, и молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие иммуноглобулины. Настоящее изобретение также относится к способу идентификации анти-MIF антител, фармацевтическим композициям, содержащим эти антитела, и способу применения этих антител и композиций для лечения заболеваний, связанных с MIF.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF) представляет собой цитокин, первоначально выделенный благодаря своей способности ингибировать случайную миграцию макрофагов in vitro (Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2; David et al. PNAS 1966, 56, 72-7). Хотя MIF был известен с 1966 года, его точная функция в большинстве клеток не была известна, но, по-видимому, MIF является ключевым регулятором, функционирующим в начале каскада врожденного и приобретенного иммунного ответа.

кДНК MIF человека была клонирована в 1989 году (Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6), а местоположение его гена было картировано на 22 хромосоме. Продуктом гена MIF является аминокислотный белок с молекулярной массой 12,5 кД. Белок является высоко консервативным: гомология по последовательности между MIF человека, мыши, крысы и быка составляет 90-96%. Однако с другими белками MIF не имеет существенной гомологии. Трехмерная структура MIF не похожа на структуру любого другого цитокина или гипофизарного гормона. Белок кристаллизуется в виде тримера из идентичных субъединиц. Каждый мономер содержит две антипараллельные альфа-спирали, которые упакованы против четырех параллельных бета-слоев. Мономер имеет два дополнительных бета-слоя, которые взаимодействуют с бета-слоями прилегающих субъединиц, образуя границу между мономерами. Три бета-слоя расположены так, что они образуют бочку, включающую доступный для растворителей канал, проходящий через центр белка вдоль молекулярной оси симметрии третьего порядка (Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196).

Было опубликовано, что секрецию MIF макрофагами индуцируют очень низкие концентрации глюкокортикоидов (Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71). Однако как провоспалительный цитокин MIF также противодействует эффектам (является контр-регулятором) глюкокортикоидов и стимулирует секрецию других цитокинов, таких как фактор некроза опухолей TNF-α и интерлейкин IL-1β (Baugh et al. Crit Care Med 2002, 30, S27-35), что позволяет предположить его участие в патогенезе воспалительных и иммунных заболеваний. MIF также напрямую ассоциирован с ростом лимфомы, меланомы и рака толстой кишки (Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20:751-62).

MIF является медиатором многих патологических состояний, и, поэтому, ассоциирован с множеством заболеваний, включая воспалительное заболевание кишечника (IBD), ревматоидный артрит (RA), синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS), астму, гломерулонефрит, IgA-нефропатию, рак, инфаркт миокарда (MI) и сепсис.

Против рекомбинантного MIF человека были получены поликлональные и моноклональные анти-MIF антитела (Shimizu et al., FEBS Lett. 1996, 381, 199-202; Kawaguchi et al., J. Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232; и Weiser et al., Cell. Immunol. 1985, 90, 167-78).

В терапии было предложено использовать анти-MIF антитела для ингибирования высвобождения TNF-α. Было опубликовано, что группа Calandra et al. (J. Inflamm. 1995. 47, 39-51) использовала антитела к MIF для защиты животных от септического шока, экспериментально вызванного грам-положительными и грам-отрицательными бактериями. Было предложено использовать анти-MIF антитела в качестве терапевтического средства для модулирования продукции цитокинов при септическом шоке и других воспалительных заболеваниях.

В патенте США № 6645493 раскрыты моноклональные анти-MIF антитела, полученные из клеток гибридомы, которые нейтрализуют биологическую активность MIF. На животной модели можно показать, что эти мышиные анти-MIF антитела обладают полезным эффектом при лечении эндотоксинового шока. Некоторые из описанных антител к MIF (III. D.9, XIV.14.3 и XIV.15.5) использовались в настоящем изобретении для сравнительных экспериментов.

В US 2003/0235584 раскрыты способы получения высокоаффинных антител к MIF с использованием животных, у которых проведен гомозиготный нокаут гена MIF.

В 1994 г. группой Galat et al. был описан фактор, ингибирующий гликозилирование (GIF) (Eur. J. Biochem. 1994, 224, 417-21). В настоящий момент известно, что MIF и GIF идентичны. Группой Watarai et al. (PNAS 2000, 97, 13251-6) были описаны поликлональные антитела, связывающие различные эпитопы GIF, для идентификации биохимической природы пост-трансляционной модификации GIF в клетках Ts. Группой Watarai et al. (PNAS 2000, 97, 13251-6) было опубликовано, что GIF присутствует в различных конформационных изоформах in vitro. Один тип изомера возникает в результате химической модификации единственного остатка цистеина. Химическая модификация приводит к конформационным изменениям в белке GIF и меняет его биологическую функцию.

Принимая во внимание сложную роль MIF в различных заболеваниях, весьма желательно выяснить функции эпитоп-специфичных антител к MIF и их применение в терапии. Таким образом, для лечения заболеваний и состояний, опосредованных MIF, необходимы эпитоп-специфичные анти-MIF антитела, которые ингибируют биологическую функцию MIF человека.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам и их антиген-связывающим частям, которые специфично связывают С-концевую или центральную область фактора ингибирования миграции макрофагов (MIF).

Изобретение дополнительно относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим эти антитела или их антиген-связывающие части, а также к векторам, включающим такую нуклеиновую кислоту, и к клеткам-хозяевам, включающим такой вектор, а также к способам рекомбинантного получения полипептидов, кодируемых молекулами нуклеиновых кислот.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим анти-MIF антитело или его антиген-связывающую часть. Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель или другие терапевтические средства.

Изобретение также относится к применению анти-MIF антитела или его антиген-связывающей части в изготовлении лекарственного средства для лечения иммунологических заболеваний, таких как воспалительные заболевания и гиперпролиферативные нарушения.

Изобретение дополнительно относится к анти-MIF антителу или его антиген-связывающей части для применения в лечении иммунологических заболеваний, таких как воспалительные заболевания и гиперпролиферативные нарушения.

Изобретение также относится к способам лечения ряда иммунологических заболеваний и состояний, таких как воспалительные заболевания и гиперпролиферативные нарушения, с помощью эффективного количества анти-MIF антитела или его антиген-связывающей части.

Изобретение также относится к способам диагностики. Анти-MIF антитело или его антиген-связывающую часть можно использовать для детекции MIF в биологическом образце.

Изобретение дополнительно относится к способу идентификации анти-MIF антитела, способного ингибировать активный MIF и вызывать полезный эффект в животной модели.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи анти-MIF антитела человека по изобретению.

На Фиг.2 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи анти-MIF антитела человека по изобретению.

На Фиг.3 показана ДНК-последовательность и ее трансляция вариабельной области легкой цепи анти-MIF антител человека по изобретению.

На Фиг.4 показана ДНК-последовательность и ее трансляция вариабельной области тяжелой цепи анти-MIF антител человека по изобретению.

На Фиг.5 показано конкурентное связывание мышиного антитела III. D.9 относительно контрольного антитела (C3) и анти-MIF антитела, Bax94. При увеличении количества антитела Вах94 можно наблюдать явную конкуренцию.

На Фиг.6 показано, что антитело Вах94 (точечная линия) и антитело Вах152 (пунктирная линя) увеличивают выживаемость и задерживают время смерти в животной модели перитонита по сравнению с контрольным антителом (С3).

На Фиг.7 показано дифференциальное связывание антитела Вах94 с активным и неактивным MIF. Антитело Вах94 связывает активный MIF в прямом ELISA, при этом не связывая неактивный MIF.

На Фиг.8 приведена таблица, в которой обобщены in vitro свойства анти-MIF антител.

На Фиг.9 показаны проапоптотические эффекты анти-MIF антител на клетки. Показана активность клеточной каспазы-3 (эффекторной каспазы) после обработки клеток РС-3 антителами. Анализ проводили в трех повторах, и данные представлены в виде среднего значения ± SD (стандартное отклонение).

На Фиг.10 показан анти-инвазивные эффекты анти-MIF антител. Исследовали инвазию клеток рака простаты PC-3 через поры покрытых матригелем вкладышей Transwell™. Подсчитывали число проникших клеток в видимом поле (микроскопа при 400-кратном увеличении). Данные представлены в виде среднего ± SD из 3-10 подсчетов клеток в видимом поле, а также показаны значимые различия.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения и общие методики

Если в настоящем документе не указано иное, то научные и технические термины, используемые применительно к настоящему изобретению, будут иметь значение, обычно понимаемое средними специалистами в данной области. Обычно описанными в настоящем документе номенклатурами, используемыми применительно к культивированию клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии белка и нуклеиновых кислот (а также используемыми методиками) являются хорошо известные и обычно применяемые в данной области. Способы и методики по настоящему изобретению обычно проводят стандартными способами, хорошо известными в данной области и описанными в ряде общих и более конкретных источниках, на которые даны ссылки и которые описаны в настоящей спецификации, если не указано иное. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992); и Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990); которые включены в настоящее описание путем ссылки.

«MIF» или «фактор ингибирования миграции макрофагов» относится к белку, который известен как ключевой медиатор в иммунном и воспалительном ответе, особенно в качестве конт-регулятора действия глюкокортикоидов. MIF включает MIF млекопитающих, в частности, MIF человека (первичный номер доступа в базе данных Swiss-Prot: P14174), у которого мономерная форма кодирована в виде 115-аминокислотного белка, а продуцируется в виде 114-аминокислотного белка вследствие отщепления первого метионина. «MIF» также включает «GIF» (фактор, ингибирующий гликозилирование) и другие формы MIF, такие как слитые белки MIF. Нумерация аминокислот MIF начинается с N-концевого метионина (аминокислота 1) и заканчивается С-концевым аланином (аминокислота 115).

Термин «активный MIF» относится к природным конформационным изоформам MIF, которые важны вследствие своих биологических функций. Активный MIF включает изоформы, которые находятся на поверхности клеток (таких как ТНР1 и т.п.). Активный MIF также включает изоформы MIF, встречающиеся в сыворотке млекопитающих после бактериальной инфекции.

«Антитело» относится к интактному антителу и антиген-связывающей части, которая конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. В общем, см. Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (включенную путем ссылки). Термин «антитело» включает полученные генно-инженерными способами формы, такие как химерные или гуманизированные антитела.

Термин «антиген-связывающая часть» антитела относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген (например, MIF). Антиген-связывающие части могут быть получены с помощью методик рекомбинантных ДНК или ферментативного или химического расщепления интактных антител. Антиген-связывающие части включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fv и определяющую комплементарность область (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), химерные антитела, диатела и полипептиды, которые содержат, по меньшей мере, часть антитела, достаточный для специфического связывания антигена с полипептидом. Начиная с N-конца и до С-конца оба зрелых вариабельных домена легкой и тяжелой цепей содержат области FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Распределение аминокислот по доменам дано в соответствии с определениями, изложенными в Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), Chothia et. al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), или Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Антитело или его антиген-связывающая часть может быть модифицировано или связано с другой функциональной молекулой (например, другим пептидом или белком). Например, антитело или его антиген-связывающая часть может быть функционально связано с одной или несколькими молекулами, такими как другое антитело (примером является антитело с двойной специфичностью или диатело), или детектируемым агентом, цитотоксическим агентом, фармацевтическим агентом и/или линкерной молекулой.

Термин «антитело человека» относится к антителу, в котором последовательности вариабельных и константных доменов являются последовательностями человека. Термин охватывает антитела с последовательностями, полученными из генов человека, но которые были изменены, например, для уменьшения возможной иммуногенности, увеличения аффинности, удаления цистеинов, которые могут вызывать нежелательный фолдинг белков, и т.д. Термин охватывает такие антитела, полученные рекомбинантным способом в клетках организмов отличных от человека, которые могут давать не типичное для клеток человека гликозилирование.

Термин «гуманизированное антитело» относится к иммуноглобулинам, цепям иммуноглобулинов или их фрагментам (таким как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, или другие антиген-связывающие части антител), которые содержат последовательности из иммуноглобулинов организмов, отличных от человека.

Термин «химерное антитело» относится к антителу, которое содержит области антител одного или нескольких различных биологических видов.

Термин «выделенное антитело» или «выделенная его антиген-связывающая часть» относится к антителу или его антиген-связывающей части, которые были идентифицированы и выделены из источника получения антител, такого как библиотека фагового дисплея или В-клеточный репертуар.

Термин «K_D» относится к константе равновесия диссоциации Fab-части конкретного антитела с соответствующим антигеном.

Термины «центральная области» и «С-концевая область» MIF относятся к области MIF человека, включающей аминокислоты 35-68 и 86-115, соответственно.

Термин «эпитоп» включает любую белковую детерминанту, способную специфически связывать иммуноглобулин или фрагмент антитела. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как экспонированные аминокислоты, аминосахара или другие углеводные боковые цепи, и обычно имеют определенные трехмерные структурные характеристики, а также определенные характеристики заряда.

Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную петлю ДНК, в которую можно лигировать дополнительные фрагменты ДНК.

Термин «клетка-хозяин» относится к клеточной линии, способной продуцировать рекомбинантный белок после введения экспрессионного вектора. Термин «рекомбинантная клеточная линия» относится к клеточной линии, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что «рекомбинантная клеточная линия» означает не только конкретную используемую клеточную линию, но также и потомство такой клеточной линии. Поскольку в последующих поколениях могут возникнуть некоторые модификации вследствие либо мутации, либо влияния внешней среды, такое потомство в реальности может быть неидентично родительской клетке, но все равно включено в объем термина «рекомбинантная клеточная линия», используемого в настоящем описании.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому и всем растворителям, дисперсионным средам, оболочкам, антибактериальным и противогрибковым агентам, изотоническим и задерживающим абсорбцию агентам, и т.п., которые являются физиологически совместимыми.

Анти-MIF антитела

В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенным моноклональным антителам или их антиген-связывающим частям, которые специфически связывают С-концевую или центральную области MIF человека и дополнительно ингибируют биологическую функцию MIF. В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональными антителами является моноклональные антитела человека. В других вариантах осуществления изобретения моноклональными антителами являются гуманизированные моноклональные антитела.

В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь анти-MIF антитела содержит аминокислотную последовательность, которая тождественна аминокислотной последовательности V_L антитела Bax8 (SEQ ID NO: 1), антитела Bax69 (SEQ ID NO: 2), антитела Bax74 (SEQ ID NO: 3), антитела Bax94 (SEQ ID NO: 4), антитела Bax152 (SEQ ID NO: 5), антитела BaxA10 (SEQ ID NO: 6), или аминокислотной последовательности, которая имеет 85%, предпочтительно, 90% гомологии по последовательности с указанными аминокислотными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь содержит аминокислотную последовательность от начала CDR1 до конца CDR3 любого одного из указанных антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь анти-MIF антитела содержит, по меньшей мере, CDR1, CDR2 или CDR3 легкой цепи аминокислотных последовательностей, показанных на Фиг.1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельного домена (V_H) антитела Bax8 (SEQ ID NO: 7), антитела Bax69 (SEQ ID NO: 8), антитела Bax74 (SEQ ID NO: 9), антитела Bax94 (SEQ ID NO: 10), антитела Bax152 (SEQ ID NO: 12), антитела BaxA10 (SEQ ID NO: 12), или аминокислотной последовательности, которая имеет 85%, предпочтительно, 90% гомологии по последовательности с указанными аминокислотными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность от начала CDR1 до конца CDR3 любого одного из указанных антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь анти-MIF антитела содержит, по меньшей мере, CDR1, CDR2 или CDR3 тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, показанных на Фиг.2.

Класс и подкласс анти-MIF антител

Анти-MIF антитело по изобретению представляет собой выделенное моноклональное антитело. Анти-MIF антитело может быть молекулой IgG, IgM, IgE, IgA или IgD. В других вариантах осуществления изобретения анти-MIF антитело является IgG и представляет собой подкласс IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В других вариантах осуществления изобретения антитело принадлежит к подклассу либо IgG1, либо IgG4. В других вариантах осуществления изобретения антитело принадлежит к подклассу IgG4. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело IgG4 имеет единственную мутацию, меняющую серин (серин 228, по схеме нумерации Kabat) на пролин. Соответственно, субпоследовательность CPSC в Fc-области IgG4 становится СРРС, которая соответствует последовательности в IgG1 (Angal et al. Mol. Immunol. 1993, 30, 105-108).

Эпитопы MIF, узнаваемые анти-MIF антителами

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к анти-MIF антителам или их антиген-связывающим частям, специфически связывающим области 35-68-й или 86-115-й аминокислот MIF человека, соответственно, предпочтительно, анти-MIF антитела специфически связывают области от 50-й до 68-й или от 86-й до 102-й аминокислоты, соответственно, и ингибируют биологическую функцию MIF человека.

В других вариантах осуществления изобретение относится к анти-MIF антителам, которые специфически связывают активный MIF и дополнительно ингибируют биологическую функцию MIF. В некоторых вариантах осуществления изобретения активный MIF является мембраносвязанным.

Неожиданно оказалось, что в изучении связывания с MIF человека анти-MIF антитела по изобретению способны конкурировать с анти-MIF антителом III.D.9. Конкуренцию с III.D.9 можно определить, как описано в примере 5.

Аффинность связывания анти-MIF антител с MIF человека

Изобретение относится к анти-MIF антителам или их антиген-связывающим частям, которые связывают MIF человека с K_D 5×10^-7 M или меньше. В других вариантах осуществления изобретения антитела связывают MIF человека с K_D 5×10^-8 M или меньше, 5×10^-9 M или меньше или 5×10^-10 M или меньше.

Аффинность связывания анти-MIF антител или их антиген-связывающих частей с MIF человека можно определить способами, известными в данной области. Например, аффинность связывания можно измерить с помощью поверхностного плазменного резонанса (BIACORE). В примере 10 приведен способ определения констант аффинности анти-MIF антител с помощью методики BIACORE.

В некоторых вариантах осуществления изобретение дополнительно относится к анти-MIF антителам или их антиген-связывающим частям, которые связывают активный MIF с K_D меньше 500 нМ и дополнительно ингибируют биологическую функцию MIF человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-MIF антитела или их антиген-связывающие части связывают активный MIF с K_D меньше 50 нМ.

Получение анти-MIF антител

Анти-MIF антитела или их антиген-связывающие части по настоящему изобретению можно получить многими способами, известными специалисту в данной области, такими как скрининг библиотек фагового дисплея или фрагментов антител. Можно использовать различные форматы библиотек фагового дисплея, например, библиотеки scFv- или Fab-фрагментов и т.п. Скрининг библиотеки фагового дисплея проводят для поиска фрагментов антител с желаемой аффинностью к некоторым эпитопам, и генетический материал выделяют из соответствующего клона. В последовательных раундах создания и скрининга библиотек можно выделить фрагмент антитела с увеличенной аффинностью по сравнению с аффинностью исходно выделенного фрагмента антитела. Аффинность идентифицированного анти-MIF фрагмента можно дополнительно повысить с помощью созревания аффинности.

Нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные способы изготовления анти-MIF антител

Изобретение дополнительно относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим анти-MIF антитела или их антиген-связывающие части по настоящему изобретению, а также к векторам, включающим такую нуклеиновую кислоту, и к клеткам-хозяевам, содержащим такой вектор, а также к способам рекомбинантного получения полипептида, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ДНК-последовательность, кодирующая V_L-область анти-MIF антитела, включает нуклеотидную последовательность, которая тождественна последовательности V_L антитела Bax8 (SEQ ID NO: 13), антитела Bax69 (SEQ ID NO: 14), антитела Bax74 (SEQ ID NO: 15), антитела Bax94 (SEQ ID NO: 16), антитела Bax152 (SEQ ID NO: 17), антитела BaxA10 (SEQ ID NO: 18), показанных на Фиг.3, или последовательности, которая имеет 85%, предпочтительно, 90% гомологии по последовательности с любой из указанных нуклеотидных последовательностей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ДНК-последовательность, кодирующая V_H-область анти-MIF антитела, включает нуклеотидную последовательность, которая тождественна последовательности V_H антитела Bax8 (SEQ ID NO: 19), антитела Bax69 (SEQ ID NO: 20), антитела Bax74 (SEQ ID NO: 21), антитела Bax94 (SEQ ID NO: 22), антитела Bax152 (SEQ ID NO: 23), антитела BaxA10 (SEQ ID NO: 24), показанных на Фиг.4, или последовательности, которая имеет 85%, предпочтительно, 90% гомологии по последовательности с любой из указанных нуклеотидных последовательностей.

Получение анти-MIF антител по настоящему изобретению включает любой способ получения рекомбинантной ДНК с помощью генной инженерии, например, посредством обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК и клонирования в экспрессионный вектор.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор является вирусным вектором, в котором дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор способен к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую он введен (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку инициации репликации, или эписомальные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления изобретения вектор (например, неэписомальные векторы млекопитающих) может встраиваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина, и, таким образом, может реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы именуются в настоящем описании как «рекомбинантные экспрессионные векторы» (или просто, «экспрессионные векторы»).

Анти-MIF антитела можно получить с помощью обычных экспрессионных векторов, таких как бактериальные векторы (например, pBR322 и его производные) или эукариотические векторы. Эти последовательности, кодирующие антитело, могут быть представлены с регуляторными последовательностями, которые регулируют репликацию, экспрессию и/или секрецию из клетки-хозяина. Эти регуляторные последовательности, включают, например, промоторы (например, промоторы CMV или SV40) и сигнальные последовательности. Экспрессионные векторы также могут включать селекционные и амплификационные маркеры, такие как ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), гигромицин-B-фосфотрансферазы и тимидинкиназы. Используемые компоненты векторов, такие как селекционные маркеры, репликоны, энхансеры можно либо приобрести в продаже, либо получить с помощью стандартных способов. Векторы могут быть сконструированы для экспрессии в различных клеточных культурах, например, в клетках млекопитающих, таких как CHO, COS, HEK293, NS0, фибробласты, клетках насекомых, дрожжей и бактерий, таких как E. coli. В некоторых случаях используют клетки, которые позволяют оптимальное гликозилирование экспрессированного белка.

Ген легкой цепи анти-MIF антитела и ген тяжелой цепи анти-MIF антитела можно встроить в отдельные векторы, или можно встроить оба гена в один экспрессионный вектор. Гены антитела встраивают в экспрессионный вектор стандартными способами, например, лигированием по комплементарным сайтам рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе, или лигированием по «тупым» концам, если сайты рестрикции отсутствуют.

Получение анти-MIF антител или их антиген-связывающих частей может включать любой известный в данной области способ введения рекомбинантной ДНК в эукариотические клетки с помощью трансфекции, например, посредством электропорации или микроинъекции. Например, рекомбинантную экспрессию анти-MIF антитела можно получить введением экспрессионной плазмиды, содержащей кодирующую анти-MIF антитело последовательность ДНК под контролем одной или нескольких регуляторных последовательностей, таких как сильный промотор, в подходящую клеточную линию-хозяина с помощью соответствующего способа трансфекции, что в результате приводит к клеткам, имеющим введенные последовательности, стабильно интегрированные в геном. Липофекционный способ является примером способа трансфекции, который можно использовать по настоящему изобретению.

Получение анти-MIF антител может также включать любой известный в данной области способ культивирования указанных трансформированных клеток, например, непрерывным или периодическим способом, и экспрессию анти-MIF антитела, например, конститутивную или индуцируемую.

Клеткой-хозяином по настоящему изобретению может быть любая эукариотическая клетка. В одном варианте осуществления изобретения клеткой является клетка млекопитающего со способностью проводить пост-трансляционные модификации анти-MIF антител. Например, указанную клетку млекопитающего получают из клеточной линии млекопитающего, как, например, клеточной линии, выбранной из группы, состоящей из клеток SkHep, CHO, HEK293 и ВНК. В одном варианте осуществления изобретения анти-MIF антитело экспрессируется в клеточной линии СНО, лишенной DHFR, например, DXB11, с добавлением G418 в качестве селекционного маркера. При введении рекомбинантных экспрессионных векторов, кодирующих гены антител, в клетки-хозяева млекопитающих антитела получают культивированием клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или секреции антитела в культуральную среду, в которой растут клетки-хозяева.

Анти-MIF антитела можно выделить из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков.

В дополнение, получение анти-MIF антител может включать любой известный в данной области способ очистки антител, например, с помощью анион-обменной хроматографии или аффинной хроматографии. В одном варианте осуществления изобретения анти-MIF антитело можно очистить из супернатантов культуры клеток с помощью гель-фильтрации.

Свойства анти-MIF антител

Изобретение относится к анти-MIF антителам или их антиген-связывающей части, которые обладают, по меньшей мере, одним из следующих свойств:

а) связываются с С-концевой или центральной областью MIF человека;

б) ингибируют подавляющую активность глюкокортикоидов (GCO);

в) ингибируют пролиферацию клеточных линий, таких как фибробласты или раковые клетки (например, NIH/3T3 или PC-3);

г) связываются с активным MIF;

д) не связываются с неактивным MIF;

е) конкурируют с мышиным анти-MIF антителом III.D.9.

В некоторых вариантах осуществления изобретения активным MIF является изоформа активного MIF, которая возникает в результате обработки MIF человека мягкими окислителями, такими как цистин, или в результате иммобилизации MIF человека на подложке, такой как планшет для ELISA или шарики. В других вариантах осуществления изобретения активным MIF является изоформа активного MIF, которая встречается in vivo после бактериальной инфекции у животных. В других вариантах осуществления изобретения активным MIF является изоформа активного MIF, которая встречается in vivo на поверхности клеток (например, THP1, CFB).

В некоторых вариантах осуществления изобретения неактивным MIF является восстановленный MIF (например, описанный в примере 7) или внутриклеточный MIF.

В других вариантах осуществления изобретения анти-MIF антитела или их антиген-связывающую часть связывают активный MIF с K_D меньше 500 нМ.

Фармацевтические композиции анти-MIF антител и способы лечения

Изобретение также относится к композициям, содержащим анти-MIF антитело или его антиген-связывающую часть, для лечения субъекта, нуждающегося в лечении связанных с MIF заболеваний, а именно, иммунологических заболеваний, таких как воспалительные заболевания и гиперпролиферативные нарушения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения субъектом, нуждающимся в лечении, является человек. Гиперпролиферативные нарушения, такие как раковые заболевания, которые можно лечить с помощью анти-MIF антител по изобретению, могут затрагивать любую ткань или орган и включают, но не ограничены этим, раковые заболевания головного мозга, легких, сквамозных клеток, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, молочных желез, головы, шеи, печени, почек, яичников, простаты, толстой и прямой кишки, пищевода, гинекологический рак, рак носоглотки или щитовидной железы, меланомы, лимфомы, лейкемии или множественные миеломы. В частности, анти-MIF антитела по изобретению пригодны для лечения карцином молочных желез, простаты, толстой кишки и легких.

Изобретение также охватывает способы лечения у субъекта, включая человека, воспалительных заболеваний, таких как васкулит, артрит, сепсис, септический шок, эндотоксиновый шок, синдром токсического шока, приобретенный синдром дыхательной недостаточности, гломерулонефрит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, перитонит, нефрит, атопический дерматит, астма, конъюнктивит, жар, малярия или псориаз, которые включают стадию введения указанному субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества анти-MIF антитела или его антиген-связывающей части.

В других вариантах осуществления изобретения композицию, содержащую указанное анти-MIF антитело по изобретению, используют для лечения воспалительного заболевания, выбранного из группы, состоящей из гломерулонефрита, воспалительного заболевания желудка, нефрита и перитонита.

Лечение может также включать введение одного или нескольких анти-MIF антител по изобретению или их антиген-связывающих частей, отдельно или с фармацевтически приемлемым носителем. Некоторыми примерами фармацевтически приемлемых носителей являются вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях в композицию предпочтительно вводить изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Дополнительными примерами фармацевтически приемлемых веществ являются увлажнители или минорное количество вспомогательных веществ, таких как увлажнители или эмульгаторы, консерванты или буферные вещества, которые увеличивают срок хранения или эффективность антитела.

Анти-MIF антитела по изобретению или содержащие их фармацевтические композиции можно вводить в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими, диагностическими или профилактическими средствами. Дополнительные терапевтические средства в зависимости от заболевания включают другие анти-неопластические, противоопухолевые, антиангиогенные, химиотерапевтические средства или стероиды.

Фармацевтические композиции по данному изобретению могут находиться в различных формах, например, в жидкой, мягкой или твердой лекарственных формах, таких как жидкие растворы (например, растворы для инъекции или инфузии), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого пути введения и терапевтического применения. Обычные предпочтительные композиции представляют собой растворы для инъекции или инфузии, такие как композиции, аналогичные используемым для пассивной иммунизации у людей. Предпочтительным путем введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, интраперитонеальный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело вводят с помощью внутривенной инфузии или инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело вводят с помощью внутримышечной или подкожной инъекции. Для опытного специалиста в данной области будет очевидно, что путь и/или вид введения будут варьировать в зависимости от желаемых результатов.

Анти-MIF антитело можно вводить однократно, но более предпочтительно многократное введение. Например, антитело можно вводить от трех раз ежедневно до одного раза в шесть месяцев или через больший интервал времени. Введение можно осуществлять по схеме, такой как введение три раза в день, дважды в день, один раз в день, один раз в два дня, один раз в три дня, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в три месяца и один раз в шесть месяцев.

Изобретение также охватывает применение анти-MIF антитела или его антиген-связывающего фрагмента в изготовлении лекарственного средства для лечения иммунологических заболеваний, таких как воспалительные заболевания и гиперпролиферативные нарушения.

Изобретение дополнительно охватывает применение анти-MIF антитела или его антиген-связывающего фрагмента в лечении иммунологических заболеваний, таких как воспалительные заболевания и гиперпролиферативные нарушения.

Изобретение также охватывает применение анти-MIF антитела или его антиген-связывающего фрагмента в способах диагностики. В одном варианте осуществления изобретения анти-MIF антитело или его антиген-связывающую часть можно использовать для детекции MIF человека в биологическом образце.

Анти-MIF антитела и их антиген-связывающие части также можно использовать для определения уровня MIF на поверхности клеток в ткани или клеток, полученных из ткани. В некоторых вариантах осуществления изобретения ткань поражена заболеванием. Ткань затем можно использовать в иммунологическом анализе для определения, например, общего уровня MIF, уровня MIF на клеточной поверхности или локализации MIF.

Изобретение дополнительно относится к наборам, содержащим анти-MIF антитело или его антиген-связывающую часть по изобретению или фармацевтическую композицию, содержащую такое антитело или часть. В дополнение к антителу или фармацевтической композиции набор может включать диагностические или терапевтические агенты. Набор может также включать инструкции для применения в диагностическом или терапевтическом способе.

Изобретение дополнительно относится к способу идентификации анти-MIF антител, способных ингибировать биологическую функцию MIF человека и вызывать полезный эффект в животной модели, путем проведения следующих стадий:

а) отбора антитела, которое связывает активный MIF и не связывает неактивный MIF;

б) тестирования указанного антитела в in vitro методах анализа, таких как метод анализа подавляющей активности глюкокортикоидов (GCO) или метод анализа клеточной пролиферации;

в) отбора антитела, которое ингибирует GCO и/или пролиферацию клеток.

Результаты показали, что анти-MIF антитело, которое связывает только активный MIF и не связывает неактивный MIF, а также ингибирует GCO и/или клеточную пролиферацию, вызывает полезный эффект в животной модели (например, смотри пример 6).

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, не ограничивающими изобретение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пример 1: Отбор антител

Для получения фрагментов анти-MIF антител человека использовали методику фагового дисплея

Начиная с библиотеки фагового дисплея проводили различные варианты скрининга, в трех из них использовали полноразмерный MIF (MIF человека на подложке/MIF человека в растворе/чередование MIF человека и мыши). В других использовали шесть пептидов из MIF, чередующихся с полноразмерным MIF. Эти шесть пептидов были сконструированы разделением белка MIF на шесть пептидов с длиной приблизительно 30 аминокислот с перекрывающимися последовательностями длиной приблизительно 15 аминокислот. После нескольких раундов селекции были найдены уникальные последовательности, которые связывались с мишенью скрининга, все связывающиеся последовательности были проэкспрессированы и очищены в виде IgG4-антител человека. Эти антитела были протестированы в ряде анализов для демонстрации in vitro ингибирования MIF. Для определения части связывания на белке MIF проводили эпитопное картирование. 193 антитела были протестированы и распределены в соответствии с их активностью ингибирования MIF in vitro. In vitro методы анализа описаны ниже. В качестве контроля использовали три мышиных анти-MIF антитела (III.D.9, XIV.14.3 и XIV.15.5).

Пример 2: Ингибирование активности MIF по подавлению эффекта глюкокортикоидов (GCO).

Этот способ основан на ингибировании эндогенного MIF, т.е. MIF, продуцируемого используемой клеточной линией. Этот способ применяется при скрининге антител и для определения кривых зависимости эффекта от дозы.

GCO-анализ для скрининга антител:

Суспензионную культуру клеток ТНР1 осаждали центрифугированием, и клетки ресуспендировали в свежей полной среде до плотности клеток 10⁶ клеток в мл. Эту культуру переносили в лунки 96-луночного микропланшета (90 мкл на лунку), и добавляли анти-MIF антитело до конечной концентрации 75 мкг/мл. Каждое антитело тестировали в трех повторах. После инкубации в течение ночи при 37°С добавляли дексаметазон до концентрации 2 нМ и после 1-часовой инкубации при 37°С добавляли LPS до конечной концентрации 3 нг/мл. После дополнительной 6-часовой инкубации при 37°С собирали супернатант и определяли концентрацию IL-6 с помощью ELISA (набор Cytoset, доступен в продаже). Усредняли данные по трем повторам и определяли процент секреции IL-6 по сравнению с контрольными антителами. Антитела, которые показывали секрецию IL-6 меньше 75%, оценивали как положительные.

Метод определения значений IC50

Эксперимент проводили, как было описано для скринингового анализа, за исключением того, что использовали увеличивающиеся количества антитела (обычно 1-125 нМ). Полученные кривые зависимости эффекта от дозы выражали как % ингибирования по сравнению с антителом, используемым в качестве отрицательного контроля. Эту кривую использовали для вычисления максимального ингибиторного эффекта антитела (% ингибирования макс.) и концентрации антитела, которая давала 50% от максимального ингибиторного эффекта (IC50).

Итоговые результаты приведены на Фиг.8 в колонке 3 (IC50) и колонке 4 (максимальное ингибирование). Для сравнения мышиное антитело XIV.14.3 дает только 36% ингибирования GCO (данные не приведены).

Пример 3: Ингибирование клеточной пролиферации

У находящихся в состоянии покоя клеток NIH/3T3 сыворотка стимулирует секрецию MIF, а MIF, в свою очередь, стимулирует пролиферацию клеток. Поэтому, антитела, ингибирующие этот эндогенный MIF, уменьшают пролиферацию находящихся в покое клеток NIH/3T3. Уменьшение пролиферации определяют по включению ³Н-тимидина.

1000 клеток NIH/3T3 инкубировали в 96-луночном планшете в течение выходных дней при 37°C в среде, содержащей 10% сыворотки. Затем клетки подвергали голоданию в течение ночи при 37°С с помощью инкубации в среде, содержащей 0,5% сыворотки. Удаляли среду, содержащую 0,5% сыворотку, и заменяли на свежую среду, содержащую 10% сыворотки, 75 мкг/мл антитела и 5 мкКю/мл ³Н-тимидина. После 16-часовой инкубации в СО₂-инкубаторе при 37°С клетки дважды промывали 150 мкл холодного PBS на лунку. С помощью многоканальной пипетки добавляли 150 мкл 5% (вес/объем) раствора ТХУ и инкубировали 30 минут при 4°C. Планшеты промывали 150 мкл PBS. Добавляли 75 мкл 0,5 M раствора NaOH с 0,5% SDS на лунку, перемешивали и хранили при комнатной температуре. Уровень радиоактивности измеряли на β-счетчике, смешивая 75 мкл раствора образца с 5 мл Ultima Gold (Packard). Проводили по три измерения для каждого образа, и значения сравнивали со значениями для контрольного антитела с помощью т-теста. Антитела, которые достоверно снижали пролиферацию (P<0,05), оценивали как положительные. Итоговые результаты приведены на Фиг.8, колонка 5.

Пример 4: Изучение связывания: определение эпитопов для анти-MIF антител

Каждый пептид разводили в буфере для пришивания белков к подложке до концентрации пептида обычно 5 мкг/мл, добавляли в микропланшеты (NUNC Immobilizer™ Amino Plate F96 Clear) и инкубировали в течение ночи при 4°C (100 мкл на лунку). В качестве контролей использовали рекомбинантный полноразмерный MIF и PBS. Планшет промывали 3 рада 200 мкл PBST, и добавляли антитела (4 мкг/мл в PBS) по 100 мкл на лунку, инкубировали 2 часа при комнатной температуре при мягком качании. Планшет промывали 3 раза 200 мкл PBST и добавляли детектирующее антитело (например, меченное HRP специфичное к Fc-области IgG человека, Sigma) в количестве 100 мкл на лунку. После 1-часовой инкубации при комнатной температуре при мягком качании планшет промывали 3 раза 200 мкл PBST. Каждую лунку инкубировали с 100 мкл раствора ТМВ (кат. № T-0440, Sigma) в течение 30 минут в темноте. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1,8 М раствора H₂SO₄ на лунку. Образцы измеряли при 450 нм.

Пример 5: Конкуренция анти-MIF антител человека с мышиным анти-MIF антителом III.D.9

Для конкуренции с мышиным анти-MIF антителом III.D.9 использовали антитело Вах94.

96-луночные планшеты (NUNC Maxisorp) покрывали рекомбинантным MIF человека. Мышиное анти-MIF антитело III.D.9 и анти-MIF антитела человека разводили в TBST/2% БСА и смешивали, причем конечную концентрацию III.D9 поддерживали на уровне 2 мкг/мл, а концентрацию анти-MIF антител человека увеличивали от 0 мкг/мл обычно до 32 мкг/мл. После промывания микропланшета наносили антитела и инкубировали при комнатной температуре обычно в течение 2 часов. После промывания планшет инкубировали с пероксидазным конъюгатом антител к мышиным IgG (специфичным к Fc-области) в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания планшет инкубировали с раствором ТМВ, и реакцию останавливали добавлением раствора H₂SO₄. Аппроксимация полученной кривой конкуренции позволяет вычислить максимальное ингибирование связывания III.D.9. Итоговые результаты приведены на Фиг.8, колонка 6.

Пример 6: Увеличение выживаемости при использовании анти-MIF антител в животной модели перитонита, вызванного инфекцией E.coli

Эксперимент проводили согласно методике группы Calandra et al. (Nature Immunology, 2000) с использованием самок мышей NMRI (25-30 г, 6-10 недель), которым вводили с помощью интраперитонеальной инъекции 6000 КОЕ суспензии 0111:В4 E.coli в растворе 15% муцина и 4% гемоглобина. Две или три колонии (0111:B04 E.coli) из культуры на чашке с питательном агаром инокулировали в 10 мл TSB и инкубировали в течение ночи при 36°C при качании. Культуру разводили в физиологическом растворе до требуемых концентраций (ночная культура обычно достигает плотности 2*10⁹ КОЕ/мл) и смешивали с муцином и гемоглобином (1 объем разведенной бактериальной культуры, 2 объема 15% муцина, 2 объема 4% гемоглобина). Поскольку бактерии в разведенной смеси имеют тенденцию к осаждению, то смесь перемешивали между инъекциями. Для инъекций использовали широкую иглу (например, 23-й номер) для того, чтобы избежать закупоривания иглы осадком из инъекционной смеси. Антитело Вах94 (IgG4) и совпадающее по изотипу контрольное антитело вводили интраперитонеально за 2 часа до бактериального заражения. Дозировка антитела составляла обычно 800 мкг/мышь, и на каждую группу брали по 20 мышей. Статистически значимый эффект на выживаемость/время смерти мог быть показан для изотипов IgG1 и IgG4 анти-MIF антител человека. На Фиг.6 показаны результаты, полученные для антитела Вах94 и антитела Вах152 (IgG4). Для оценки кривых выживаемости использовали статистический метод Каплана-Мейера.

Пример 7: Специфичность связывания с активным MIF

Описанные в этом изобретении анти-MIF антитела способны различать активный и неактивный MIF, которые образуются в результате мягкого окисления или восстановления, соответственно. Различия между этими конформационными вариантами оценивали с помощью ELISA или поверхностного плазмонного резонанса.

ELISA для оценки дифференциального связывания антител:

- Трансформация MIF в его активную конформацию с помощью мягкого окисления.

Рекомбинантный MIF человека (0,5 мг/мл в PBS) инкубировали в течение 3 часов при 37°C с 3-кратным избытком (по объему) насыщенного раствора L-цистина в PBS (~ 0,4-0,5 мМ L-цистин). Затем проводили двукратный диализ MIF против PBS в диализной кассете Slide-A-Lyzer® с отсечением по молекулярному весу 7 кД (от компании Pierce).

- Трансформация MIF в его неактивную конформацию.

MIF восстанавливали при концентрации 0,5 мг/мл ночной инкубацией с 8-16 мМ дитиотреитолом (конечная концентрация) при 4°C.

- Протокол ELISA.

96-луночные микропланшеты (NUNC Maxisorp™) покрывали анти-MIF антителами при концентрации 5 мкг/мл (разведенными в буфере для пришивания белков к подложке). После промывания планшета с помощью TBST (Tris-солевого буфера с 0,1 % Tween-20 (по объему)) и блокирования с использованием 2% раствора (объем/вес) БСА в (TBST/2%БСА) в лунки добавляли серийные разведения либо активного, либо неактивного MIF, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Связанный MIF детектировали с помощью кроличьего поликлонального анти-MIF антитела и меченного пероксидазой хрена козьего антитела к антителам кролика (Biorad). С целью уменьшения неспецифического связывания для разведения MIF, кроличьего анти-MIF антитела и пероксидазного конъюгата использовали TBST/2%БСА. На Фиг.7 показаны результаты ELISA, полученные с антителом Bax94.

Оценка дифференциального связывания антител с помощью Biacore

Кинетику связывания активного и неактивного MIF с антителом Вах94 исследовали с помощью поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы Biacore 3000. Для этого иммобилизовали 10000 единиц резонанса Bax 94 на сенсорном чипе с СМ5-матрицей (карбоксиметилированным декстраном) и инкубировали с активным или неактивным MIF, huMIF, в провосстановительном и проокислительном глутатионовых редокс-буферах в диапазоне от 4,8 мМ GSH/0,2 мМ GSSG (GSSG = оксиленный глутатион) до 5 мМ GSSG в буфере HBS-EP (GE Healthcare). В качестве контроле использовали MIF для анализа связывания во второй проточной ячейке, содержащей иммобилизованное совпадающее по изотипу контрольное антитело. Для оценки вычитали единицы ответа связывания контрольного антитела и антитела Вах 94.

Пример 8: Детекция активного MIF на поверхности клеток ТНР-1

Клетки инкубировали с анти-MIF антителом Вах 94. Клетки промывали ледяным PBS и ресуспендировали в холодном буфере для лизиса клеток (Cell Signaling Technology®). Магнитные шарики с белком G, Magnetic Protein G Dynabeads® (Invitrogen), блокировали TBST с 5% обезжиренного сухого молока (вес/объем), промывали и добавляли к лизированным клеткам. Иммуноосаждение проводили в течение ночи при 4°C. Затем шарики промывали буфером для лизиса клеток и TBST и кипятили в буфере для наноса образцов на ДСН-ПААГ (без восстанавливающих агентов). Проводили ДСН-ПААГЭ образцов в невосстанавливающих условиях для Вестерн-блоттинга.

Пример 9: Связывание анти-MIF антител с мембраносвязанным MIF

Клетки ТНР-1 промывали ледяным PBS и ресуспендировали в холодном буфере для окрашивания клеток (Biolegend) с 200 мкг/мл мышиных IgG. Добавляли FITC- или TRITC-меченные анти-MIF антитела до конечной концентрации обычно 200-500 нМ и инкубировали при 4°C. Клетки последовательно промывали ледяным буфером для окрашивания клеток и ресуспендировали в буфере для окрашивания клеток с раствором Via-Prohe™ Cell Viability Solution (BD Biosciences). Интенсивность флуоресценции клеток измеряли на цитопроточном флуориметре FACS Canto™ II Flow Cytometry System (BD Biosciences) и средний FITC-/TRITC-сдвиг популяций живых клеток сравнивали с данными, полученными с использованием меченным красителем контрольным антителом, совпадающим по изотипу.

Пример 10: Определение аффинности Fab-фрагментов анти-MIF антител с помощью Biacore-анализа

Обычно 40 RU (единиц резонанса) рекомбинантного MIF человека иммобилизовали на сенсорном чипе с СМ5-матрицей (карбоксиметилированным декстраном) (Biacore). Разведенные в HBS-EP Fab-фрагменты впрыскивали в диапазоне концентраций обычно 6-100 нМ. После каждого цикла чип регенерировали в 50 мМ NaOH плюс 1 M NaCl. Аффинность вычисляли по модели Лангмюра 1:1. Итоговые результаты приведены на Фиг.8, колонка 7.

Пример 11: Полезный эффект анти-MIF антител в животной модели серповидного гломерулонефрита

Анти-MIF антитела тестировали в крысиной модели серповидного гломерулонефрита, описанной Frederick W.K. Tarn et. al. (Nephrol Dial Transplant, 1999, 1658-1666).

Нефротоксичный нефрит вызывали у самцов крыс Wistar Kyoto одной внутривенной инъекцией анти-сыворотки к клубочковой базальной мембране крыс. В «предупредительном» варианте эксперимента лечение анти-MIF антителами и совпадающим по изотипу контрольным антителом начинали во время индукции нефрита (день 0) с помощью интраперитонеальной инъекции. Лечение обычно повторяли через день, и животных выбраковывали на 7 день для гистологического анализа. Мочу собирали перед экспериментом (базовая линия) и перед окончанием эксперимента (день 7). В «терапевтическом» варианте эксперимента лечение анти-MIF антителом начинали через 4 дня после индукции заболевания и повторяли через день. Крыс обычно выбраковывали на 8-й день. Мочу собирали перед экспериментом (базовая линия), перед началом лечения (день 4) и перед выбраковкой животных (день 8). Дозировка антител обычно составляла 1-20 мг/кг на инъекцию, и для каждой группы использовали от 6 до 8 крыс. Тяжесть заболевания определяли, измеряя протеинурию, инфильтрацию макрофагов в почечные клубочки и гистологические повреждения (образование экстракапиллярной пролиферации, т.е. полулуний). В «предупредительном» варианте эксперимента лечение анти-MIF антителом Вах69 (10 мг/кг на дозу) в течение 7 дней приводило к 47%-му снижению протеинурии по сравнению с животными, получавшими контрольное антитело. Лечение возникшего заболевания (терапевтический эксперимент) приводило к дозозависимому снижению протеинурии на 16% (10 мг/кг Вах69 на дозу) и 34% (20 мг/кг Вах69 на дозу) по сравнению с животными, получавшими контрольное антитело.

Пример 12: Полезный эффект анти-MIF антител в животной модели язвенного колита (адаптивный перенос наивных Т-клеток мышам Rag -/-)

Мышей C57BL/6 умерщвляли и выделяли клетки CD45RBhi (наивные Т-клетки) сортингом на цитопроточном флуориметре популяции клеток селезенки. Клетки CD45RBhi (5×10⁵) вводили с помощью интраперитонеальной инъекции 7-9 недельным мышам C57BL/6 Rag-/-, у которых приблизительно через 2 недели развивался язвенный колит (de Jong et al., Nature Immunology, 2001, 1061-1066). Анти-MIF антитела и совпадающее по изотипу контрольное антитело вводили с помощью интраперитонеальной инъекции дважды в неделю (доза 1 мг на мышь). В «предупредительном» варианте эксперимента лечение начинали во время инъекции Т-клеток. В «терапевтическом» варианте эксперимента лечение начинали через 4 недели после индукции заболевания. У мышей еженедельно проверяли вес и развитие заболевания. Обычно через восемь недель после переноса клеток CD4CD45RBhi реципиентам C57BL76 Rag-/- вычисляли индекс активности болезни (DAI) и собирали срезы толстой кишки для оценки гистологического индекса (HI). Индекс активности болезни (DAI) и гистологический индекс (HI) определяли в конце эксперимента на животной модели (DAI основан на четырех параметрах: сутулость и истощение (оценка 0 или 1), утолщение прямой кишки (0-3) и консистенция стула (0-3)). В «терапевтическом» эксперименте для лечения на возникшего заболевания использовали анти-MIF антитела Вах69 и ВахА10, и среднее значение DAI было значительно снижено приблизительно на 60% (Вах69) и приблизительно на 40% (ВахА10) по сравнению с мышами, получавшими совпадающее по изотипу антитело. Кроме того, средняя оценка HI была снижена приблизительно на 33% после лечения с помощью Вах69.

Пример 13: Полезный эффект анти-MIF антител в животной модели язвенного колита (агонистическая анти-CD40 модель)

Эта модель основана на активации макрофагов и дендритных клеток агонистическим анти-CD40 антителом, которое индуцирует патологический процесс в кишечнике, напоминающий воспалительное заболевание желудка у мышей Rag1-/-.

Совпадающие по возрасту и полу мыши Rag-1-/- (4-5 недельные) были приобретены в компании Jackson Laboratories и содержались в виварии две недели перед началом эксперимента. Агонистическое моноклональное антитело к CD40 (FGK45, IgG2a) или изотипический контроль, крысиное IgG2a, растворяли в PBS до концентрации 1 мг/мл. Пяти группам (по 10 мышей на каждую группу) вводили с помощью интраперитонеальной инъекции 200 мкг агонистического анти-CD40 моноклонального антитела, и из них четырем группам вводили анти-MIF антитела в день 0 и 1 (2×1мг на мышь). Шестой группе (10 мышам) вводили только изотипический контроль (крысиное IgG2a, группа здоровых животных). Мышей взвешивали в течение следующих 7 дней. На 7-й день вычисляли индекс активности болезни (DAI) и собирали срезы толстой кишки для оценки гистологического индекса (HI). Оценка DAI основана на: сутулость (0-1), истощение (0-1), консистенция стула (0-3) и утолщение прямой кишки (0-3). Гистологическая оценка основана на утолщении (0-3), удлинении криптов, воспалении (0-3) и абсцессе (0-1). Лечение анти-MIF антителами Вах94, ВахА10 и Вах69 значительно снижало оценку DAI (ВахА10: снижение на ~48%; Вах94: снижение на ~62%; Вах69: снижение на ~73%) по сравнению с мышами, получавшими изотипический контроль. Кроме того, средние оценки HI также уменьшались под действием этих антител.

Пример 14: Ингибирование роста опухоли у голых мышей Mf1 с помощью анти-MIF антител

Клетки аденомы простаты человека (РС-3) собирали из экспоненциально растущей культуры и смешивали с матригелем, лишенным ростовых факторов. 2×10⁶ клеток в 0,25 мл матригеля прививали подкожно в правую паховую область голых мышей Mf1. Лечение анти-MIF антителом Вах94 и изотипическим контролем С3 начинали через один день после прививки опухоли (0,6 мг антитела на мышь в день) и повторяли через день. Размер опухоли обычно начинали измерять через две недели после инъекции клеток и проводили через день. Объем опухоли вычисляли, используя формулу V=0,5×a×b² (в которой «a» является наибольшим диаметром, а «b» является наименьшим диаметром). Рост опухоли у мышей, получавших Вах94 был значительно снижен, а средний объем опухоли через 28 дней после индукции опухоли был в 4,3 раза выше в группе, получавшей изотипический контроль, по сравнению с группой, получавшей антитело Вах94.

В «терапевтическом» варианте эксперимента лечение антителами начинали через одну неделю после прививки опухоли. С помощью интраперитонеальной инъекции вводили через день по 50 мг/кг на дозу изотипического контрольного антитела С3 и анти-MIF антитела Вах69. Через 22 дня после начала введения антител определяли средний объем опухоли, который был в 2,7 раза выше в группе, получавшей С3, по сравнению с группой, получавшей Вах 69.

Пример 15: Проапоптотический эффект анти-MIF антител

Проапоптотический эффект анти-MIF антитела Вах94 был показан в клеточном анализе активности каспазы-3 на клеточной лини рака простаты человека РС-3. Клетки РС-3 высевали на культуральные чашки диаметром 10 см (~10⁶ клеток на чашку) в присутствии 10% фетальной бычьей сыворотки. Через 24 часа добавляли свежую среду, содержащую антитело Вах94 (100 нМ) или контрольное антитело С3 (100 нМ). После другой инкубации в течение 48 часов приготавливали клеточные лизаты, и измеряли активность каспазы-3, добавляя флуоресцентно-меченный каспазный субстрат (Фиг.9).

Пример 16: Ингибирование инвазии опухолевых клеток

Анти-MIF антитела Вах94 и Вах69 тестировали с помощью метода анализа инвазивной активности клеток Transwell™, используя клеточную линию рака простаты человека РС-3.

Высевали 5×10⁴ клеток РС-3 на лунку 24-луночных планшетов Transwell™ (размер пор 8 мкм), покрытых поли-D-лизином на нижней поверхности поликарбонатной мембраны и имеющих лишенный ростовых факторов матригель на поверхности вкладышей Transwell™. Клеткам позволяли прикрепиться в течение 4 часов в присутствии 10% фетальной бычьей сыворотки. Затем среду заменяли на бессывороточную среду, и клетки оставляли голодать в течение ночи (т.е. на 16 часов). Далее в нижний отсек добавляли соединения (10 нМ MIF, 500 нМ антитело). Клеткам позволяли мигрировать через пористую мембрану в течение 24 часов. После инкубации прикрепленные мигрировавшие клетки на нижней поверхности мембраны окрашивали раствором Гимза. Число клеток, прикрепленных к нижней поверхности мембраны, подсчитывали в независимых полях зрения при 400-кратном увеличении (Фиг.10).

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложено моноклональное антитело и его антиген-связывающие части, которые специфически связывают C-концевую или центральную область фактора ингибирования миграции макрофагов (MIF). Анти-MIF антитело и его антиген-связывающая часть дополнительно ингибируют биологическую функцию MIF человека. Также описаны выделенная тяжелая и легкая цепь иммуноглобулинов, полученных из анти-MIF антител, и молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие иммуноглобулины. Кроме того, раскрыт способ идентификации анти-MIF антител, фармацевтические композиции, содержащие эти антитела, и способ применения этих антител и композиций для лечения заболеваний, связанных с MIF. 9 н. и 13 з.п. ф-лы, 10 ил., 16 пр.

1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывает C-концевую или центральную область MIF и ингибирует биологическую функцию MIF человека, где кодирующая V_L-область указанного антитела включает нуклеотидную последовательность, которая тождественна последовательности V_L антитела Bax8 (SEQ ID NO: 13), антитела Bax69 (SEQ ID NO: 14), антитела Bax74 (SEQ ID NO: 15), антитела Bax94 (SEQ ID NO: 16), антитела Bax152 (SEQ ID NO: 17), антитела BaxA10 (SEQ ID NO: 18) или последовательности, которая имеет по крайней мере 85% гомологии по последовательности с любой из указанных нуклеотидных последовательностей, и ДНК последовательность, кодирующая V_H-область антитела, включает нуклеотидную последовательность, которая тождественна последовательности V_H антитела Bax8 (SEQ ID NO: 19), антитела Bax69 (SEQ ID NO: 20), антитела Bax74 (SEQ ID NO: 21), антитела Bax94 (SEQ ID NO: 22), антитела Bax152 (SEQ ID NO: 23), антитела BaxA10 (SEQ ID NO: 24) или последовательности, которая имеет по крайней мере 85% гомологии по последовательности с любой из указанных нуклеотидных последовательностей.

2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть обладает, по меньшей мере, одним из следующих свойств:
а) ингибирует подавляющую активность глюкокортикоидов (GCO);
б) ингибирует пролиферацию раковых клеток или фибробластов;
в) связывается с активным MIF;
г) не связывается с неактивным MIF;
д) конкурирует с мышиным анти-MIF антителом III.D.9.

3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1 или 2, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть связывает MIF человека с K_D меньше 500 нМ.

4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть связывает активный MIF.

5. Моноклональное антитело по п.1, где указанное антитело представляет собой антитело субформата IgG4.

6. Моноклональное антитело по п.5, где указанный субформат IgG4 имеет одну мутацию, в результате которой субпоследовательность CPSC в Fc-области IgG4 становится СРРС.

7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержит:
а) CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, независимо выбранные из тяжелой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из антитела Bax8, антитела Bax69, антитела Bax74, антитела Bax94, антитела Bax152 и антитела BaxA10;
б) CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, независимо выбранные из легкой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из антитела Bax8, антитела Bax69, антитела Bax74, антитела Bax94, антитела Bax152 и антитела BaxA10.

8. Моноклональное антитело по п.1, где антитело содержит:
в) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 90% идентична аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела Bax8, антитела Bax69, антитела Bax74, антитела Bax94, антитела Bax152 и антитела BaxA10;
г) аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 90% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи антитела Bax8, антитела Bax69, антитела Bax74, антитела Bax94, антитела Bax152 и антитела BaxA10.

9. Моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть по п.1 для применения в лечении иммунологического заболевания, причем указанное иммунологическое заболевание является воспалительным заболеванием или гиперпролиферативным нарушением.

10. Моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть по п.9, где указанное воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из васкулита, артрита, сепсиса, септического шока, эндотоксинового шока, синдрома токсического шока, приобретенного синдрома дыхательной недостаточности, гломерулонефрита, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, перитонита, нефрита и псориаза.

11. Фармацевтическая композиция для лечения иммунологического заболевания, выбранного из воспалительного заболевания или гиперпролиферативного нарушения, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, в которой моноклональным антителом является антитело, выбранное из группы, состоящей из антитела Bax8, антитела Bax69, антитела Bax74, антитела Bax94, антитела Bax152 и антитела BaxA10.

13. Фармацевтическая композиция по п.11, где указанное воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из васкулита, артрита, сепсиса, септического шока, эндотоксинового шока, синдрома токсического шока, приобретенного синдрома дыхательной недостаточности, гломерулонефрита, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, перитонита, нефрита и псориаза.

14. Способ лечения у субъекта, включая человека, иммунологического заболевания, выбранного из воспалительного заболевания или гиперпролиферативного нарушения, включающий стадию введения указанному субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества моноклонального антитела или антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8 или фармацевтической композиции по п.11 или 12, причем указанное антитело или указанная антигенсвязывающая часть дополнительно ингибирует биологическую функцию MIF человека.

15. Способ по п.14, в котором указанное воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из васкулита, артрита, сепсиса, септического шока, эндотоксинового шока, синдрома токсического шока, приобретенного синдрома дыхательной недостаточности, гломерулонефрита, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, перитонита, нефрита и псориаза.

16. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или легкую цепь моноклонального антитела или антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8.

17. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.16, где вектор необязательно содержит контролирующую экспрессию последовательность, функционально связанную с указанной молекулой нуклеиновой кислоты.

18. Клетка-хозяин для получения антитела по п.1, содержащая вектор по п.17 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.16.

19. Клетка-хозяин по п.18, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь моноклонального антитела или антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8.

20. Клетка-хозяин, которая продуцирует моноклональное антитело или антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-8, содержащая вектор по п.17 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.16.

21. Способ получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части, включающий культивирование клетки-хозяина по п.18 или 20 при подходящих условиях и выделение указанного антитела или его антигенсвязывающей части.

22. Способ идентификации анти-MIF антител, способных ингибировать биологическую функцию MIF человека и вызывать полезный эффект в животной модели, путем проведения следующих стадий:
а) отбора антитела, которое специфически связывает C-концевую или центральную область MIF;
б) тестирования указанного антитела в in vitro методах анализа;
в) отбора антитела, которое ингибирует активность глюкокортикоидов (GCO) и/или пролиферацию клеток.