РЕКОМБИНАТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рНI03 КОДИРУЮЩАЯ, ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК рНI03, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHI03-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2014 года по МПК C12N15/00 C12N15/17 C12N1/21 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli JM109/pHI03, который может быть использован для получения генно-инженерного инсулина человека, применяемого при изготовлении лекарственных препаратов для лечения инсулинозависимого сахарного диабета.

В настоящее время сахарный диабет (обычно также называемый «диабет») является одним из наиболее распространенных заболеваний в мире. Во всем мире от сахарного диабета страдают примерно 120 миллионов людей. Среди них примерно 12 миллионов страдают диабетом типа I, для которых необходима замена отсутствующей эндокринной секреции инсулина (RU 2313362, 2007).

Диабет представляет собой метаболическое расстройство, вызванное абсолютным или относительным дефицитом инсулина, который представляет собой единственный гипогликемический гормон, и основным признаком сахарного диабета является постоянная гипергликемия. Непрерывность гипергликемического состояния не только усугубляет метаболические расстройства, вызванные недостатком инсулина, но также вызывает микроангиопатию в почках, нервной ткани, сетчатке и им подобных органах и макроангиопатию, такую как артериосклероз. Диабет ассоциирован также с целым рядом хронических осложнений, включающих микрососудистые заболевания, такие как ретинопатия, нефропатия и невропатия, и макрососудистые заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца (RU 2358738, 2009).

Для лечения сахарного диабета предлагаются различные гипогликемические средства, такие как препараты инсулина, стимуляторы секреции инсулина, средства, сенсибилизирующие к инсулину, и ингибиторы α-глюкозидазы (RU 2358738, 2009). Хотя возможность применения указанных гипогликемических средств подтверждена в клинической практике, однако их практическое применение связано с целым рядом проблем. Например, в случае, когда у больных сахарным диабетом значительно снижается способность поджелудочной железы секретировать инсулин, эффективность средств, стимулирующих секрецию инсулина, и средств, сенсибилизирующих к инсулину, уменьшается.

Долгие годы основным препаратом, применяемым для профилактики и лечения диабета, является инсулин. Человеческий инсулин представляет собой полипептид, содержащий А-цепь из 21 аминокислоты и В-цепь из 30 аминокислот и имеющий, одну внутреннюю дисульфидную связь в А-цепи и две дисульфидные связи, которые связывают А-цепь и В-цепь (ЕА 05586, 2009).

Инсулин первоначально биологически синтезируется как "препроинсулин" специализированными клетками в островках Лангерганса поджелудочной железы, который представляет собой линейную молекулу, содержащую сигнальный пептид из 24 аминокислот (SP), В-цепь (В), С-пептид из 31 аминокислоты (С) и А-цепь (А), присоединенные в порядке, представленном формулой "SP-B-С-А". После транспорта в эндоплазматический ретикулум, сигнальный пептид отщепляется от препроинсулина с продуцированием "проинсулина (В-С-А)". Проинсулин образует дисульфидные связи в эндоплазматическом ретикулуме, принимая свою трехмерную структуру. Проинсулин расщепляется ферментом PC1/3 в точке соединения В-С, а затем расщепляется ферментом РС2 в точке соединения С-А. И наконец, два N-концевых основных аминокислотных остатка у С-конца В-цепи отщепляются карбоксипептидазой, образуя инсулин.

Способы получения лекарственного препарата инсулина были первоначально разработаны с использованием экстрактов из поджелудочной железы животных, таких как крупный рогатый скот и свинья. Однако, по составу аминокислот, человеческий инсулин отличается от инсулина животного происхождения. В результате, использование таких инсулинов для человека приводило к нежелательным эффектам (например, к аллергии). Кроме того, потребности в данном препарате не могут быть покрыты инсулином животного происхождения из-за ограниченности сырьевой базы. Поэтому разработаны технологии получения генно-инженерного инсулина человека, в которых используются в качестве продуцентов различные генно-модифицированные микроорганизмы.

В настоящее время большую часть инсулина человека получают при помощи технологий, в которых используются бактериальные штаммы, продуцирующие инсулин человека в составе гибридных белков в виде нерастворимых "телец включения". Гибридный белок - предшественник инсулина человека - состоит из лидерного пептида и аминокислотной последовательности проинсулина, в котором А- и В-цепи инсулина соединены С-пептидом. В качестве лидерных последовательностей использовали бычий протимозин (Tang J., Xue Y., Fan X., Fu Y. Clin. J. Biotechnol., 1993, v.9, p.71-78), иммуноглобулин, связывающий (IgG) домен белка А из S.aureus (Wei G., Hu MH., Tang LG. Biochem. Mol. Biol. Int., 1995, v.35, p.37-46; RU 2144957, 2000), N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (RU 2263147, 2004) и др.

Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека с использованием штамма-продуцента, сконструированного на основе плазмидной ДНК pPINS07, кодирующей гибридный полипептид массой около 17 кДа, в котором IgG-связывающий домен белка А из S.aureus соединен через пептидный линкер His6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека (RU 2144957, 2000). Существенным недостатком штамма-продуцента, содержащего плазмиду pPINS07, является продукция им гибридного белка, содержащего высокую долю лидерного пептида, что удорожает процесс производства и снижает выход целевого продукта.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемой группе изобретений является способ получения инсулина человека (RU 2354702, 2006), при использовании рекомбинантной плазмидной ДНК pHINS11 и штамма-продуцента E.coli JM109/pHINS11, направляющего синтез гибридного белка с молекулярной массой около 15,4 кДа, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона соединен через пептидный линкер с аминокислотной последовательностью проинсулина человека.

Для данного штамма-продуцента характерен высокий уровень биосинтеза гибридного белка, однако стадия ренатурация (рефолдинга) продуцируемого гибридного белка недостаточно эффективна.

Задачей заявляемой группы изобретения является создание нового штамма-продуцента гибридного белка, позволяющего проводить его более эффективную ренатурацию и получать конечный продукт - инсулин человека с более высоким выходом и по упрощенной технологии.

Технической задачей является создание новых плазмиды и штамма, обеспечивающих индуцибельный биосинтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 30% от суммарного клеточного белка.

Технический результат достигался конструированием рекомбинантной плазмиды pHI03, детерминирующей синтез гибридного белка с молекулярной массой около 14,7 кДа, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3) соединен через пептидный линкер (SEQ ID NO:4) с аминокислотной последовательностью проинсулина человека (SEQ ID NO:5), и созданием штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pHI03 на ее основе.

Получена рекомбинантная плазмида pHI03 (фиг.1), содержащая ДНК, с последовательностью нуклеотидов, представленной на фиг.2, кодирующая гибридный белок (фиг.2), состоящий из аминокислотных последовательностей лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3), пептидного линкера (SEQ ID NO:4) и проинсулина человека (SEQ ID NO:5).

Новая рекомбинантная плазмида pHI03 кодирует гибридный белок размером 134 а.о. с молекулярной массой 14,7 кДа, в котором аминокислотные последовательности лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3), и проинсулина человека (SEQ ID NO:5) соединены пептидным линкером (SEQ ID NO:4). Она состоит из фрагмента BamHI-EcoRI плазмиды рКК223-3 (Brosius J., Dull Т.J., Sleeter D.D., Noller H.F. J. Mol. Biol., 1981, v.148, p.107-127), содержащего промотор транскрипции tac; фрагмента ДНК EcoRI-BamHI (SEQ ID NO:1), содержащего ДНК (SEQ ID NO:6), содержащую последовательность Шайн-Дальгарно, которая расположена между EcoRI сайтом и стартовым кодоном гена гибридного белка, и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3) и пептидный линкер (SEQ ID NO:4); фрагмента ДНК BamHI-HindIII (SEQ ID NO:2), кодирующего аминокислотную последовательность проинсулина человека (SEQ ID NO:5); фрагмента HindIII-SnaI плазмиды рКК223-3, содержащего терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость клеток бактерий к ампицилину и участок инициации репликации (ori); и Eco47III-EheI фрагмента плазмиды рКК223-3; сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта EcoRI: BamHI - 155 п.о., HpaI - 168 п.о., HindIII - 426 п.о., Pvu I - 1366 п.о.

Оптимальные результаты достигаются при использовании в качестве ДНК с последовательностью Шайн-Дальгарно, ДНК, содержащую последовательность Шайн-Дальгарно и 7-10 нуклеотидов до стартового кодона гибридного белка, что обеспечивает эффективную трансляцию.

В качестве генетического маркера, может использоваться не только ген β-лактамазы (bla), но и другие гены, определяющие устойчивость клеток бактерий к антибиотикам или иные последовательности, обеспечивающие достижение подобного или аналогичного эффекта.

Достоинство заявляемой плазмидной конструкции и штамма-продуцента, содержащего указанную плазмиду, заключается в биосинтезе гибридного полипептида, обладающего более эффективной ренатурацией в процессе его рефолдинга после стадии растворения (солюбилизации) телец включения, позволяющее на последующих стадиях синтеза получать инсулин человека с более высоким выходом.

Другое преимущество заявляемых новых плазмидной ДНК и штамма-продуцента на ее основе заключается в биосинтезе гибридного полипептида с более высокой долей инсулина, которая составляет примерно 39%, благодаря уменьшению размера лидерной последовательности.

Плазмидная ДНК pKK-GI-del02 (пример 1), полученная на промежуточном этапе конструирования заявляемой плазмидной ДНК, может быть также использована для конструирования рекомбинантной плазмиды, кодирующей гамма-интерферон человека, и получения на ее основе штамма-продуцента гамма-интерферона человека.

В заявляемую группу изобретений входят также трансформированные клетки Escherichia coli, содержащие указанную рекомбинантную плазмиду, кодирующую гибридный белок с проинсулином человека, а также штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHI03 - продуцент гибридного белка с проинсулином человека.

Штамм-продуцент Е.coli JM109/pHI03 получают путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК pHI03. После трансформации отбирают колонии, выращенные на среде с ампициллином, выделяют из них плазмиды и подвергают их рестрикционному анализу и секвенированию. Линию клеток, несущую плазмиду pHI03, несколько раз пересевают на среду с агарозой с добавлением ампициллина и полученной моноклоновой культурой инокулируют 5 мл жидкой среды с ампициллином. Культуру проверяют на наличие индуцируемой экспрессии гибридного белка, фасуют, добавляют глицерин и хранят при минус 70°С.

Полученный штамм Escherichia coli JM109/pHI03, несущий плазмиду pHI03, является продуцентом гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина человека и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1×3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного белка.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.

Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (bla).

Стабильность плазмиды в штамме. При поддержании клеток в течение нескольких месяцев на агаризованной среде LB, содержащей ампициллин, не наблюдаются потери или перестройки плазмиды, влияющие на экспрессию гибридного белка.

Штамм продуцирует гибридный белок, доля инсулина в котором составляет 39%, и который после индуцированной экспрессии накапливается в виде телец включения, а его содержание в бактериальной клетке составляет не менее 30% от общего белка клетки.

Полученный штамм-продуцент Е.coli JM109/pHI03 депонирован в ФГУП ГосНИИгенетики ВКПМ под номером В-11409 (справка о депонировании прилагается).

Сущность изобретения иллюстрируется следующими иллюстративными материалами.

На фиг.1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pHI03, где используются следующие обозначения:

P_tac - промотор транскрипции; T₁T₂ - rrnB терминаторы транскрипции рибосомного оперона E.coli; ori - участок инициации репликации; bla - ген β-лактамазы; leader - лидер, N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3); LK (linker) - пептидный линкер (SEQ ID NO:4); proinsulin - проинсулин человека (SEQ ID NO:5). Указанные уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции расположены на следующем расстоянии вправо от сайта EcoRI: BamHI - 155 п.о., HpaI - 168 n.o., HindIII - 426 n.o., Pvu I - 1366 п.о.

На фиг.2 представлена нуклеотидная последовательность гена гибридного белка с происулином человека в составе рекомбинантной плазмиды pHI03 и кодируемая им аминокислотная последовательность.

Сущность и преимущества изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование плазмиды pHI03, направляющей синтез гибридного белка с проинсулином человека.

Рекомбинантную плазмиду pHI03 конструировали на основе вектора рКК223-3 (Brosius J., Dull Т. J., Sleeter D.D., Noller H.F. J. Mol. Biol., 1981, v.148, p.107-127), который предварительно модифицировали. На первом этапе из плазмидной ДНК рКК223-3 удаляют фрагмент BamHI-EheI размером примерно 830 п.о., путем (при помощи) достройки «липких» концов после частичного гидролиза по BamHI и полного гидролиза по Ehe I и последующего лигирования полученных «тупых» концов (RU 2263147, 2005). Затем полученную плазмиду pКК223-3-del размером примерно 3750 п.о. делегировали по rop-гену (негативному регулятору копийности) для увеличения числа ее копий на бактериальную клетку (Twigg A.J. and Sherrat D. Nature, 1980, v.283, p.216-218). С этой целью ДНК плазмиды pКК223-3-del подвергали полному гидролизу рестриктазами Eco47III и SnaI, а полученный фрагмент Eco47III-SnaI (3,2 т.п.о.) лигировали. В результате получали плазмиду pКК223-3-del2 размером 3250 п.о., которую использовали в качестве вектора для клонирования фрагмента ДНК размером 160 п.о. (SEQ ID NO:1), фланкированного сайтами рестрикции EcoRI и BamHI и содержащего последовательность Шайн-Дальгарно и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека и пептидный линкер. Указанный фрагмент ДНК (SEQ ID NO:1) синтезировали химическим способом и встраивали в плазмиду pКК223-3-del2 по сайтами EcoRI и BamHI. В результате получали плазмидную ДНК pKK-GI-del02 размером примерно 3400 п.о., содержащую между сайтами EcoRI и BamHI последовательность Шайн-Дальгарно и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека и пептидный линкер.

Далее плазмида pKK-GI-del02 была использована для конструирования плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок, в котором N-концевая последовательность гамма-интерферона (SEQ ID NO:3) через пептидный линкер (SEQ ID NO:4) соединена с последовательностью проинсулина человека (SEQ ID NO:5). Для этого синтезировали химическим способом фрагмент ДНК размером 410 п.о. (SEQ ID NO:2), фланкированный сайтами рестрикции BamHI и HindIII, и содержащий кодон для аргинина и нуклеотидную последовательность, кодирующую проинсулин человека, оптимизированную с учетом частоты встречаемости кодонов в геноме Е.coli. Указанный фрагмент ДНК клонировали в плазмиду pKK-GI-del02 по BamHI и HindIII сайтам.

В результате получили рекомбинантную плазмидную ДНК pHI03, строение которой подтверждали рестрикционным анализом. Структура гена, кодирующего гибридный белок, была подтверждена секвенированием.

Плазмидная ДНК pHI03 позволяет направлять синтез гибридного белка с более высокой долей инсулина, которая составляет 39%, благодаря уменьшению размера лидерной последовательности.

Кроме того, плазмидная ДНК pKK-GI-del02, полученная на промежуточном этапе конструирования заявляемой плазмидной ДНК, может быть также использована для конструирования рекомбинантной плазмиды, кодирующей гамма-интерферон человека, и получения на ее основе штамма-продуцента гамма-интерферона человека.

Пример 2. Получение штамма E.coli JM109/pHI03-продуцента гибридного белка с проинсулином человека.

Плазмидной ДНК pHI03 трансформируют компетентные клетки штамма E.coli JM109 и высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Отдельно локализованную колонию трижды пересевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученной моноклоновой культурой инокулируют 5 мл жидкой среды LB с ампициллином и инкубируют в течение ночи, при интенсивном встряхивании, при 37°С. Полученный штамм-продуцент E.coli JM109/pHI03 хранят в 15% глицерине при минус 70°С.

Для определения уровня индуцируемой экспрессии гибридного белка, ночную культуру засевают в разведении 1:50 в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и растят до мутности 0,8 при 37°С на качалке при 200 об/мин. К культуре добавляют ИПТГ до концентрации 1,0 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 3 часов. Клетки собирают центрифугированием, осадок суспендируют в буфере, содержащем 62,5 мМ трис-HCl, рН 6,8, 3% додецилсульфата натрия, 5% 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,01% бромфенолового синего и прогревают 3 мин на кипящей водяной бане. Полученный лизат клеток анализируют электрофорезом в 18% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Coomassie R-250, сканируют и проводят его денситометрию. Штамм продуцирует гибридный белок, доля инсулина в котором составляет 39%, и который после индуцированной экспрессии накапливается в виде телец включения, а его содержание в бактериальной клетке составляет по данным денситометрии 29±3% от общего белка клетки.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pHI03, направляющую синтез гибридного белка человека с проинсулином человека, содержащую ДНК, кодирующую гибридный белок с проинсулином человека размером 134 а.о. с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг.2, содержащей аминокислотные последовательности лидерного пептида, в виде N-концевого фрагмента гамма-интерферона человека, соединенного с проинсулином человека пептидным линкером. На основе рекомбинантной плазмиды pHI03 получен штамм Escherichia coli JM109/pHI03-продуцент гибридного белка с проинсулином, зарегистрированный в ФГУП ГосНИИгенетики ВКПМ под номером В-11409. Использование заявляемых изобретений позволяет упростить технологию выделения инсулина человека и повысить его выход. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рНI03, направляющая синтез гибридного белка человека с проинсулином человека, представленная на фиг.1, содержащая ДНК, кодирующую гибридный белок с проинсулином человека размером 134 а.о. с последовательностью, представленной на фиг.2, содержащей в своей структуре аминокислотные последовательности лидерного пептида, в виде N-концевого фрагмента гамма-интерферона человека SEQ ID NO:3, проинсулин человека SEQ ID NO:5, соединенные между собой пептидным линкером SEQ ID NO:4, а также ДНК SEQ ID NO:6, содержащая последовательность Шайн-Дальгарно, расположенной между EcoRI сайтом и стартовым кодоном гена гибридного белка, и сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта EcoRI: BamHI - 155 п.о., Hpal - 168 п.о., HindIII - 426 п.о., Pvu I - 1366 п.о.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК по п.1 отличается тем, что ДНК, содержащая последовательность Шайн-Дальгарно, содержит последовательность Шайн-Дальгарно и нуклеотидную последовательность, состоящую из 7-10 нуклеотидов.

3. Клетка Escherichia coli, содержащая рекомбинантную плазмидную ДНК pHI03 по п.1, - продуцент гибридного белка, содержащего проинсулин человека.

4. Штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHI03-продуцент гибридного белка с проинсулином человека, зарегистрированный в ФГУП ГосНИИгенетики ВКПМ под номером B-11409.