МИКРОБНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/26 B09C1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к экологии и биотехнологии, а именно к технологическому использованию ассоциации микроорганизмов для очистки почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Нефть и нефтепродукты являются одними из самых распространенных загрязнителей окружающей среды. Разливы нефти, вызываемые авариями при ее добыче и переработке, при разгерметизации нефтепроводов наносят ощутимый вред экосистеме. Ежегодные потери составляют около 5% от всей добытой нефти. При этом основную техногенную нагрузку испытывает почва. За счет своей значительной адсорбирующей поверхности она способна аккумулировать загрязнения в больших количествах, что приводит к изменению агрохимических, физических, микробиологических характеристик и утрате плодородия. В связи с тем, что процесс естественного восстановления почвы загрязненной нефтью очень долгий и может составлять от 10 до 30 лет, особенно в условиях Сибири, где продолжительное время сохраняется пониженная температура, необходима разработка технологий очистки почвы от нефти. В настоящее время наиболее эффективным, экономичным, экологически безопасным методом по очистке нефтезагрязненных территорий является биоремедиация на основе микроорганизмов, способных разлагать углеводороды нефти. Для ликвидации последствий разливов нефти необходим поиск и выделение аборигенных штаммов, поскольку они адаптированы к региональным почвенно-климатическим условиям. Есть сведения, указывающие, что у эндофитных микроорганизмов встречаемость плазмид, ответственных за деградацию нефти, выше, чем у свободноживущих почвенных микроорганизмов. А в ризосфере растений численность микроорганизмов, способных к деструкции загрязнителя, больше, чем в отдаленных от нее слоях почвы. Поэтому целесообразно при биоремедиации нефтезагрязненной территории использовать эндофитные и ризосферные бактерии как перспективные нефтедеструкторы.

Известен способ получения и применения биопрепарата для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (патент РФ №2378060, МПК В09С 1/10 C12N 1/26, опубликован 10.01.2010), Биопрепарат содержит биомассу следующих штаммов бактерий: Pseudomonas sp. BKM В-2387Д, Pseudomonas putida BKM В-2380Д, Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д в равных соотношениях для жидкой формы и сухой формы биопрепарата. Для сухой формы биопрепарата он дополнительно содержит защитную среду при соотношении биомасса: защитная среда, равном 1:(1-1,5). Данный препарат получен путем глубинного культивирования смешанной бактериальной ассоциации штаммов бактерий на полусинтетической питательной среде. Общими признаками является наличие в препарате микроорганизмов, в том числе относящихся к роду Rhodococcus sp. Недостатками способа является невозможность разлагать высокие концентрации нефти, присутствие музейных культур микроорганизмов, неадаптированных под конкретные почвенно-климатические условия.

Известен способ получения биопрепарата для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (патент РФ 2361686, МПК В09С 1/10 C02F 3/34 C12N 1/26, опубликован 20.07.2009). Биопрепарат включает аэробные нефтеокисляющие микроорганизмы, минеральный питательный субстрат, нормальные парафины С12-С18 и твердый субстрат-носитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов он содержит ассоциацию представителей 4 родов и 8 видов: Bacillus cereus, В. subtilis, Actinomyces griseus, Act. glaucus, Pseudomonas fluorescens, Ps. mesentericus, Ps. denitrificans, Arthrobacter globiformis, выделенных из нефти Советского месторождения Западной Сибири в концентрации 2,5×10⁹ КОЕ/г. В качестве субстрата-носителя содержит сферозолу и дополнительно содержит глюкозу. Общими признаками является наличие в препарате микроорганизмов, выделенных из нефти. Недостатком способа является большое количество видов микроорганизмов, что усложняет процесс производства препарата.

Известен способ получения биопрепарата для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (патент РФ 2337069, МПК C02F 3/34 В09С 1/10 C12N 1/26, опубликован 27.10.2008). Препарат включает в качестве нефтеразрушающих микроорганизмов ассоциацию четырех штаммов: Saccharomyces sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» № Y-1036, Bacillus sp. KKM ГНЦ ВБ «Вектор» № В-1040, Bacillus sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» № В-1039, Enterobacter sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» № В-1038 в виде смеси их равных объемов с содержанием каждого компонента не менее 2×10¹² микробных тел/мл, а в качестве наполнителя - смесь равных количеств сахарозы, желатина и агарозы, при следующем соотношении компонентов, мас %: ассоциация четырех штаммов - 40-60, смесь сахарозы, желатина и агарозы - остальное. Общими признаками является то, что предлагаемый препарат работает при температуре от 4°С и выше. Недостатками способа являются высокая себестоимость и сложность наполнителя.

Известен способ получения и применения биопрепарата для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (патент РФ №2428469, МПК C12N 1/20 C02F 3/34 C09K 3/32 В09С 1/10, опубликован 10.09.2011). Биопрепарат содержит, мас. %: нормальные парафины С12-С18 - 1,0-1,5, щавелевокислый аммоний - 0,05-0,1, хлористый калий - 0,1-0,5, водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий - до 100. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Mycobacterium phlei. Увеличение срока годности препарата до 3-х месяцев достигается за счет введения в препарат хлористого калия, который подавляет вредное воздействие продуктов жизнедеятельности бактерий на сами бактерии.

Общим признаком является наличие в препарате нефтеокисляющего микроорганизма.

Недостатком способа является жидкая форма препарата, что сокращает срок его годности и неудобно для транспортировки.

Известен способ получения и применения биопрепарата для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (патент РФ №2365438, МПК В09С 1/10 C02F 3/34 C12N 1/26, опубликован 27.08.2009). Биопрепарат содержит в (мас. %): глицерин - 8-10, KNO₃ - 0.360-0.367, KH₂PO₄ - 0.054-0.055, Na₂HPO₄⋅12H₂O - 0.126-0.128, нефтеокисляющие микроорганизмы - не менее 3-10¹⁰ кл/мл препарата, вода - остальное. Общими признаками является отсутствие фитотоксичности биопрепарата, что позволяет применять фиторемедиацию на завершающих стадиях очистки. Недостатком способа является жидкая форма препарата, что сокращает срок его годности и неудобно для транспортировки.

На сегодняшний день не существует микробного препарата, который был бы адаптирован для условий Восточной Сибири, эффективно разлагал нефть и нефтепродукты при высокой их концентрации и низких положительных температурах почвы.

Наиболее близким к предлагаемому является способ очистки и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами (патент RU 2529735 МПК В09С 1/10, опубликован 27.09.2014), согласно которому готовят смесь из жидких бактериальных культур, в качестве которых берут штаммы Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12, в соотношении соответственно 3:1,5:0,5-3:2:1, и осуществляют обработку отходов обогащения бурого угля путем добавления к ним полученной жидкой смеси штаммов с последующим перемешиванием и высушиванием приготовленной смеси в течение не менее 2,5 суток при комнатной температуре, при этом отходы обогащения бурого угля и предварительно подготовленную смесь штаммов берут в соответственно соотношении, масс. %: 40-50:50-60. Общими признаками является присутствие в препарате нескольких микроорганизмов разных видов, а также высушивание препарата без использования сушилок. Недостатком способа являются высокие титры микроорганизмов, применение индивидуальных питательных сред для культивирования каждого вида микроорганизмов.

Задачей предлагаемого технического решения является микробная очистка почвы от нефти и нефтепродуктов, производимая в течение теплого сезона без выемки почвы с места загрязнения.

Техническим результатом является повышение степени очистки почв от нефтезагрязнения, возвращение ее сельскохозяйственной ценности.

Технический результат достигается тем, что микробный препарат на основе смеси бактериальных культур для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, согласно изобретению, в качестве нефтеразрушающих микроорганизмов содержит ассоциацию трех штаммов: Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D в виде смеси их равных объемов с содержанием каждого компонента не менее 1×10⁵ КОЕ/г, предварительно высушенных до влажности не более 10%.

При получении биопрепарата для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, согласно изобретению, готовят смесь из жидких бактериальных культур, в качестве которых берут штаммы Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-2784D, Acinetobacter guillouiae ВКМ B-3216D, Acinetobacter guillouiae ВКМ B-3217D, выращиваемые глубинно на питательной среде следующего состава: NaNO₃-3.0, KH₂PO₄⋅3H₂O - 1.0, MgSO₄⋅7H₂O - 0.5, KCl - 0.5, FeSO₄⋅7H₂O - 0.01, C₆H₁₂O₆ - 5.0, с добавлением сырой нефти или гексадекана в концентрации 2% в качестве единственного источника углерода. Для удобства использования, транспортировки, а также для увеличения срока годности биомасса микроорганизмов наносится на стерильный носитель, в качестве которого можно использовать цеолит с гранулами 1-3 мм. Высушивание приготовленной смеси происходит нестерильно при комнатной температуре в течение 1-3 суток до влажности не более 10%.

Штамм Rhodococcus erythropolis депонирован в коллекции ФБГУН ВКМ (г. Пущино) 12 октября 2017 г. под регистрационным номером ВКМ Ас-2784D.

Штамм Acinetobacter guillouiae 1 депонирован в коллекции ФБГУН ВКМ (г. Пущино) 12 октября 2017 г. под регистрационным номером ВКМ В-3216D.

Штамм Acinetobacter guillouiae 2 депонирован в коллекции ФБГУН ВКМ (г.Пущино) 12 октября 2017 г. под регистрационным номером ВКМ В-3217D.

Наличие в предлагаемом решении признаков, отличительных от признаков, характеризующих решение, принятое в качестве прототипа, позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения условию патентоспособности «новизна».

Сравнение предлагаемого технического решения с другими известными решениями в данной области, показывает следующее.

Не выявлено в результате поиска и сравнительного анализа технических решений, характеризующихся аналогичной с предлагаемым решением совокупностью признаков, обеспечивающих при использовании достижение аналогичных результатов, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Пример 1. Для получения биопрепарата брали штаммы Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D.

Штаммы микроорганизмов предварительно выделяли из эндо- и ризосферы растений нефтезагрязненной территории Заларинского района Иркутской области. Микроорганизмы адаптированы к почвенно-климатическим условиям Восточной Сибири. Микроорганизмы выращивали на питательной среде следующего состава (г/л): NaNO₃-3.0, KH₂PO₄⋅3H₂O - 1.0, MgSO4⋅7H₂O - 0.5, KCl - 0.5, FeSO₄⋅7H₂O - 0.01, C₆H₁₂O₆ - 5.0.

Приготовленную и простерилизованную в автоклаве при 1 атм. в течение 30 минут питательную среду вышеуказанного состава индивидуально инокулировали бактериальными штаммами Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D в количестве 1 мл с титром 10^-7 и ставили в термостат при температуре 26°С. Через 2 суток бактериальные культуры штаммов Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D, B-3217D с титром 10^-8 готовы для использования.

Пример 2. Для получения биопрепарата заявленным способом брали полученные жидкие штаммы Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D с титром 10^-8 в соотношении 1:1:1 и смешивали между собой. Полученную жидкую смесь вышеуказанных штаммов приливали к стерильному носителю, в качестве которого использовали цеолит с размером частиц 1-3 мм. Полученную смесь перемешивали, раскладывали на горизонтальной поверхности и сушили при комнатной температуре в течение 2 суток.

Пример 3. Приготовленную вышеуказанным способом суспензию микроорганизмов 10^-7 КОЕ/мл добавляли в питательную среду состава: (г/л): NaNO₃ - 3.0, KH₂PO₄⋅3H₂O - 1.0, MgSO₄⋅7H₂O - 0.5, KCl - 0.5, FeSO₄⋅7H₂O - 0.01, С₆Н₁₂О₆ - 5.0. в количестве 1 мл. Туда же вносили сырую нефть в концентрации 5, 10, 20 и 50%. Смесь инкубировали при температуре 26°С на качалке. Через два месяца культивирования оценивали выживаемость микроорганизмов и степень деструкции нефти. Результаты приведены в таблице.

Пример 4. Приготовленную вышеуказанным способом суспензию микроорганизмов вносили в модельную почву, искусственно загрязненную нефтью в концентрации 10% (масс). В контейнеры помещали по 200 г почвы, затем загрязняли ее сырой нефтью, инокулировали суспензией микроорганизмов-деструкторов с титром 10⁷ КОЕ/мл и тщательно перемешивали стерильным шпателем. Контролем служила загрязненная почва без внесения микроорганизмов. Инкубирование почвы проводили в течение 60 суток при температуре 25°С. Через два месяца в пробах почвы определяли убыль нефти. Для заявленного препарата она составляла 70%.

Изобретение относится к биотехнологии. Микробный препарат содержит смесь предварительно высушенных до влажности не более 10% штаммов Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D в равных объемах с содержанием каждого компонента не менее 1×10⁷ KOE/г. Изобретение позволяет повысить степень очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. 1 табл., 3 пр.

Микробный препарат на основе смеси бактериальных культур для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, отличающийся тем, что в качестве нефтеразрушающих микроорганизмов он содержит ассоциацию трех штаммов: Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D в виде смеси их равных объемов с содержанием каждого компонента не менее 1×10⁷ КОЕ/г, предварительно высушенных до влажности не более 10%.