МИКРОБНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВАХ Российский патент 2021 года по МПК A01N63/20 C12N1/26 B09C1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к экологии и биотехнологии, а именно к технологическому использованию микроорганизмов для защиты растений, произрастающих на нефтезагрязненных почвах.

Нефть и нефтепродукты - основные химические загрязнители почвы, которая за счет своей значительной адсорбирующей поверхности способна аккумулировать загрязнения в больших количествах, что приводит к изменению агрохимических, физических, микробиологических характеристик и утрате плодородия. Все это отрицательно сказывается на росте и развитии растений, почвенных микроорганизмов и животных. Одним из наиболее перспективных и экологически безопасных методов восстановления почвы от нефтепродуктов является биоремедиация, основанная на естественных процессах разложения нефти в природе с участием микроорганизмов, способных окислять углеводороды. Однако при попадании в почву, микроорганизмы-нефтедеструкторы неизбежно вступают в контакт с растениями, произрастающими на загрязненных территориях. Их воздействие на растения осуществляется несколькими способами: непосредственное выделение внеклеточных биологически активных веществ, таких как фитогормоны; опосредованное воздействие путем разрушения пленки нефти, обволакивающей корневые волоски, для улучшения дыхания растений и получения питательных веществ, заблокированных нефтяной пленкой. Таким образом, с растения снимается не только негативный эффект нефти, но и происходит стимуляция роста и развития. Поэтому целесообразно использование микроорганизмов для защиты растений, растущих на нефтезагрязненных почвах.

Известен способ получения растительно-микробных ассоциаций для фиторемедиации на основе микроразмножаемых растений томата, рапса и арабидопсиса и плазмидосодержащих ризосферных бактерий, обладающих антимикробной активностью против бактерий вида Erwinia carotovora и грибов вида Phytophthora infestans (патент РФ №2443771, МПК C12N 1/00 C12N 1/14 A01N 63/00 В09С 1/10, опубл. 27.02.2012), который включает колонизацию посадочного материала культивируемых in vitro растений штаммом Pseudomonas aureofaciens BKM В-2500 Д, несущим плазмиды pBS216, pKSl, придающие устойчивость ему к нафталину и мышьяку, или Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501 Д, несущим плазмиды pBS216, pBS501, придающие устойчивость ему к нафталину и никелю. Изобретение позволяет повысить защиту растений от токсического воздействия нафталина и тяжелых металлов, а также рост и устойчивость растений к фитопатогенным микроорганизмам. Общими признаками является наличие в препарате микроорганизмов, обладающих фитозащитными свойствами. Недостатками способа является присутствие в препарате генно-модифицированных микроорганизмов, а также технически сложное микроразмножение растений.

Запатентован штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501 Д для биодеградации нефти и полициклических ароматических углеводородов и для защиты и улучшения роста растений в условиях комплексного загрязнения почв тяжелыми металлами (патент РФ 2008 126 545, МПК C12N 1/26 C12N 1/20 В09С 1/10 A01N 63/00 C12R 1/385, опубл. 10.01.2010). Биопрепарат включает аэробные нефтеокисляющие микроорганизмы, минеральный питательный субстрат, нормальные парафины С12-С18 и твердый субстрат-носитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов он содержит ассоциацию представителей 4 родов и 8 видов: Bacillus cereus, В. subtilis, Actinomyces griseus, Act. glaucus, Pseudomonas fluorescens, Ps. mesentericus, Ps. denitri/icans, Arthrobacter globiformis, выделенных из нефти Советского месторождения Западной Сибири, в концентрации 2,5×10⁹ КОЕ/г. В качестве субстрата-носителя содержит сферозолу и дополнительно содержит глюкозу. Общими признаками является наличие в препарате микроорганизмов, выделенных из нефти. Недостатком способа является большое количество видов микроорганизмов, что усложняет процесс производства препарата.

Известен микробиологический препарат для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и их защиты от насекомых-вредителей и болезней. Содержит в 1 г сухой крахмально-сахарозной смеси 2 млрд. жизнеспособных спор и клеток бактерий В. subtilis 26Д (ВНИИСХМ 128), 1 млрд. В. thuhngiensis ssp.thuringiensis (ВКПМ В5689) и 1 млрд. В. thuringiensis ssp.kurstaki (ВКПМ В6066) (патент РФ 2654569, МПК A01N 63/02, опубликован 21.05.2018). Изобретение позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных культур. Общими признаками является то, что предлагаемый препарат предполагает использование микроорганизмов для увеличения урожайности растений. Недостатком способа является невозможность использования в загрязненных почвах.

Известен способ получения и применения биопрепарата для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (патент РФ № 2428469, МПК C12N 1/20 C02F 3/34 C09K 3/32 В09С 1/10, опубл. 10.09.2011). Биопрепарат содержит, в (мас.%): нормальные парафины С12-С18 - 1.0-1.5, щавелевокислый аммоний - 0.05-0.1, хлористый калий - 0.1-0.5, водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий - до 100. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий используются бактерии Mycobacterium phlei. Увеличение срока годности препарата до 3-х месяцев достигается за счет введения в препарат хлористого калия, который подавляет вредное воздействие продуктов жизнедеятельности бактерий на сами бактерии. Общим признаком является наличие в препарате нефтеокисляющего микроорганизма. Недостатком способа является отсутствие фитозащитного эффекта.

Известен способ получения и применения биопрепарата для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (патент РФ №2365438, МПК В09С 1/10 C02F 3/34 C12N 1/26, опубл. 27.08.2009). Биопрепарат содержит в (мас.%): глицерин - 8-10, KNO₃ - 0.360-0.367, KH₂PO₄ - 0.054-0.055, Na₂HPO₄⋅12H₂O - 0.126-0.128, нефтеокисляющие микроорганизмы - не менее 3-10¹⁰ кл/мл препарата, вода - остальное. Общими признаками является отсутствие фитотоксичности биопрепарата, что позволяет применять фиторемедиацию на завершающих стадиях очистки. Недостатком способа является применение препарата для условий повышенных температур, что нереализуемо в большинстве районов РФ.

На сегодняшний день не существует микробного препарата, который бы использовался для защиты растений в условиях нефтезагрязнения, повышая при этом всхожесть семян и улучшая развитие растений в интактных почвах.

Наиболее близким к предлагаемому является способ фиторемедиации почвы, загрязненной углеводородами включающий посев растений-фиторемедиантов и применение суспензии штамма микроорганизма - деструктора углеводородов, стимулирующего рост растений для ускорения скорости очистки почв на сильно загрязненных участках (Патент РФ №2618096 МПК В09С 1/00, опубл. 02.05.2017). При посеве используют семена люцерны посевной Medicago sativa или пшеницу озимую Triticum durum, и суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д совместно с содержащей фитогормоны средой культивирования следующего состава, г/л: KNO₃ - 4.0; Na₂HPO₄ - 1.4; KH₂PO₄ - 0.4; MgSO₄×H2O - 0.8; сахароза -10.0; триптофан - 1.0. Штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д применяют в качестве фитостимулятора роста растений. Общими признаками является присутствие в препарате штамма Rhodococcus erythropolis, используемого совместно со средой культивирования.

Недостатком способа являются акцент на фиторемедиацию почвы, а не на фитозащиту; применение всего двух растений.

Задачей предлагаемого технического решения является снижение стрессового воздействия нефти на растения, улучшение их питания и аэрации, стимуляция интактных растений.

Техническим результатом является улучшение состояния растений, произрастающих на нефтезагрязненных территориях, повышение биологических показателей интактных растений.

Технический результат достигается тем, что микробный препарат для защиты растений, произрастающих на нефтезагрязненных почвах, содержащий суспензию клеток микроорганизма, имеющую свойства повышения биологических показателей интактных растений, одновременно нефтеразрушающих, фитозащитных и ростостимулирующих, согласно изобретению, в качестве ростостимулирующего микроорганизма в составе суспензии содержит Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, выделенный из ризосферы растений Elytrigia repens, произрастающего на нефтезагрязненной территории, в виде суспензии с содержанием не менее 1×10⁷ КОЕ/г. клеток в среде роста следующего состава (г/л): NaNO₃ - 3.0; K₂HPO₄⋅3H₂O - 1.0; MgSO₄⋅7H₂O - 0.5; KCl - 0.5; FeSO₄⋅7H₂O - 0.01; гексадекан - 20.0.

При получении биопрепарата, согласно изобретению, готовят суспензию жидкой культуры микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-2784D, выращиваемую глубинно на питательной среде следующего состава: NaNO₃ - 3.0, KH₂PO₄⋅3H₂O - 1.0, MgSO₄⋅7H₂O - 0.5, KCl - 0.5, FeSO₄⋅7H₂O - 0.01, C₆H₁₂O₆ - 5.0, с добавлением сырой нефти или гексадекана в концентрации 2% в качестве единственного источника углерода.

Штамм Rhodococcus erythropolis депонирован в коллекции ФБГУН ВКМ (г. Пущино) 12 октября 2017 г. под регистрационным номером ВКМ Ас-2784D.

Наличие в предлагаемом решении признаков, отличительных от признаков, характеризующих решение, принятое в качестве прототипа, позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения условию патентоспособности «новизна».

Сравнение предлагаемого технического решения с другими известными решениями в данной области, показывает следующее: не выявлено в результате поиска и сравнительного анализа технических решений, характеризующихся аналогичной с предлагаемым решением совокупностью признаков, обеспечивающих при использовании достижение аналогичных результатов, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Пример 1. Для получения биопрепарата брали штамм Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D.

Штамм микроорганизма предварительно выделяли из ризосферы растений нефтезагрязненной территории Заларинского района Иркутской области. Микроорганизм адаптирован к почвенно-климатическим условиям Восточной Сибири. Суспензию микроорганизма выращивали на питательной среде следующего состава (г/л): NaNO₃ - 3.0, KH₂PO₄⋅3Н₂О - 1.0, MgSO4⋅7H₂O - 0.5, KCl - 0.5, FeSO₄⋅7H₂O - 0.01, С₆Н₁₂О₆ - 5.0.

Приготовленную и простерилизованную в автоклаве при 1 атм. в течение 30 минут питательную среду вышеуказанного состава инокулировали бактериальным штаммом Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, в количестве 1 мл с титром 10⁷ и инкубировали в термостате при 26°С. Через 2 суток суспензия микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D с титром 10' КОЕ/мл готова для использования.

Пример 2. Способность суспензии микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D снижать токсическое действие нефти на растения. В качестве растительного объекта исследования использовали семена редьки масличной Raphanus sativus convar. oleiferus (L.) Sazonova&Stank., селекционный образец СИФИБР CO РАН «Линия ИрГСХА». Семена редьки масличной предварительно стерилизовали, тщательно промывали и замачивали на 24 ч в суспензии Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-2784D в концентрации 10⁷ КОЕ/мл. В качестве контроля служили растения, семена которых были замочены в стерильной водопроводной воде. Обработанные семена высевали в контейнеры с увлажненным стерильным песком (60% от полной влагоемкости) с добавлением 2% (V/V) нефти. Растения выращивали в контролируемых условиях: 20°С, освещение 2.1 клк с фотопериодом 14/10 ч (день/ночь) в течение 14 суток. Анализировали всхожесть, массу и длину надземной части и корней растения (табл. 1). Нефть оказывала ингибирующее влияние на прорастание необработанных бактериями семян и рост полученных из них растений. Всхожесть снижалась на 50%, длина подземной и надземной части растения и масса проростков - на 60%. Обработка семян редьки масличной суспензией микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-2784D повышала всхожесть на 25% относительно контроля, а у полученных из этих семян растений приводила к увеличению длины корня - на 50%, высоты надземной части и ее массы - на 40%.

В качестве растительного объекта исследования использовали семена гороха Pisum sativum. Результаты снижения ингибирующего действия нефти на растения суспензией микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D представлены в таблице 2.

В качестве растительного объекта исследования использовали семена кукурузы Zea mais L. Результаты снижения ингибирующего действия нефти на растения суспензией микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D представлены в таблице 3.

Пример 3. Способность суспензии микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D восстанавливать фотосинтетическую активность растений и их пигментную систему в условиях нефтяного загрязнения. В качестве объектов исследования использовали семена гороха Pisum sativum, кукурузы Zea mais L. Семена растений предварительно стерилизовали и замачивали на 24 ч в суспензии микроорганизма в концентрации 10⁷ КОЕ/мл. В качестве контроля использовали растения, семена которых были замочены в стерильной водопроводной воде. Обработанные семена высевали в контейнеры с увлажненным стерильным песком (60% от полной влагоемкости) с добавлением 2% (V/V) нефти на 14 суток. Результаты представлены в таблицах 4, 5.

Пример 4. Изучение фитостимулирующих свойств суспензии микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D.

Определение ауксиноподобной активности проводили в супернатанте бактерий Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D. Для стимуляции образования ауксинов микроорганизмом в жидкую минеральной среду следующего состава (г/л): NH₄NO₃ - 1.0; Mg CI₂ - 0.1; KH₂PO₄ - 3.0; K₂HPO₄ - 7.0; СаСО₃ - 1.0; рН 7.0 добавляли D, L-триптофан в концентрации 200 мг/л.

Количество ауксинов определяли по методу Сальковского в модификации Гордона и Вебера, а их биологическую активность - с помощью двух биотестов: по подавлению прорастания семян горчицы сарепской и по интенсивности укоренения черенков фасоли. Результаты представлены в таблице 6.

Первичная оценка способности суспензии микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D выделять поверхностно-активные вещества оценивалась косвенными методами (табл. 7). Для увеличения количества синтезируемых биосурфактантов микроорганизм выращивался на питательной среде с н-гексадеканом в качестве единственного источника углерода. Содержание внеклеточных биосурфактантов Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D - 1.523 мг/л питательной среды. Проведенные качественные реакции выявили в составе биосурфактанта углеводный и липидный компоненты, а также отсутствие пептидов и высокомолекулярных углеводов.

На ТС-хроматограмме выделенных экстракцией сурфактантов Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D детектируется одно компактное пятно с R_f 0.78. Это свидетельствует о наличии лишь одного биосурфактанта, либо нескольких очень близких по структуре, что не позволяет разделить их методом ТСХ.

Для биосурфактанта микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D был получен ИК-спектр в тонкой пленке, представленный на фиг. 1.

Наиболее интенсивными в спектре являются полосы валентных колебаний СН₂ групп в интервале 2950-2855 см^-1 и деформационных колебаний этих групп при 1460 и 722 см^-1. Широкая полоса поглощения в интервале 3400-2600 см^-1 характеризует колебания ν(OH) ассоциированных гидроксильных групп. Полоса ν(C=O) ассоциированной карбонильной группы расположена при 1652 см^-1. Простые эфирные и сложноэфирные группы характеризуются полосами с максимумами в интервале 1165-1018 см^-1, которые могут быть связаны с наличием фрагментов СН-О-СН и СН₂-O-СН₂. Колебанию ν(C=O) свободной карбонильной группы соответствует слабое плечо при 1738 см^-1 на высокочастотном крыле полосы при 1652 см^-1. Дублетная полоса колебаний δ(СН₃) при 1375 см^-1 свидетельствует о возможном наличии разветвленных С(СН₃)₂-групп. Следовательно, биосурфактант, продуцируемый Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, обладает сложной структурой, включающей длинноцепочечные алифатические углеводороды, эфирные, карбонильные и ОН-группы. Полученные данные позволяют предположить, что он представляет собой сложный эфир трегалозы и миколовых кислот.

На фиг. 2 представлены результаты световой микроскопии зоны корневых волосков Raphanus sativus convar. oleiferus, где (a) - нефть без бактерий, (б) - нефть и добавление штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, (в) - контроль без добавления нефти и бактерий, х 40.

Обнаруженная нами способность Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D продуцировать биосурфактанты позволила предположить, что одним из возможных механизмов положительного влияния на выживаемость растений в условиях нефтезагрязнения является эмульгирование нефтяной пленки на поверхности корней. Для подтверждения этой гипотезы было проведено исследование зоны корневых волосков с помощью световой микроскопии (фиг. 2). У растений, выращенных в условиях нефтезагрязнения, эта зона оказалась покрытой нефтяной пленкой, а количество корневых волосков было незначительно. В варианте «нефть+микроорганизм» нефтяная пленка на поверхности корня не наблюдалась, а развитие корневых волосков практически не отличалось от их развития у контрольных растений, выращенных без внесения нефти и обработки бактериями.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен микробный препарат для защиты растений, произрастающих на нефтезагрязненных почвах, содержащий суспензию клеток микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, не менее 1×10⁷ КОЕ/мл среды роста следующего состава (г/л): NaNO₃ - 3.0; K₂HPO₄⋅3Н₂О - 1.0; MgSO₄⋅7H₂O - 0.5; KCl - 0.5; FeSO₄⋅7H₂O - 0.01; нефть или гексадекан в концентрации 2% в качестве источника углерода. Изобретение обеспечивает стимуляцию роста растений, произрастающих на нефтезагрязненных территориях, повышение биологических показателей интактных растений. 7 табл., 4 пр., 2 ил.

Микробный препарат для защиты растений, произрастающих на нефтезагрязненных почвах, содержащий суспензию клеток микроорганизма, имеющую свойства повышения биологических показателей интактных растений, одновременно нефтеразрушающих, фитозащитных и ростостимулирующих, отличающийся тем, что в качестве ростостимулирующего микроорганизма в составе суспензии он содержит Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, в виде суспензии с содержанием не менее 1×10⁷ КОЕ/мл среды роста следующего состава (г/л): NaNO₃ - 3.0; Κ₂ΗΡO₄·3Η₂O - 1.0; MgSO₄·7H₂O - 0.5; KCl - 0.5; FeSO₄·7H₂O - 0.01; нефть или гексадекан в концентрации 2% в качестве источника углерода.