Способ определения комплемент-активирующей функции антител к SARS-CoV-2 для прогнозирования тяжести течения COVID-19 Российский патент 2024 года по МПК A61B5/1455 G01N33/49 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, инфекционным заболеваниям, и может быть использовано для прогнозирования тяжести течения Covid-19 при повторном инфицировании путем определения комплемент-активирующей функции антител к SARS-CoV-2 и гиперактивности системы комплемента по классическому пути.

Большинство пациентов, заболевших тяжелой формой Covid-19, находятся в критическом состоянии из-за развития острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Ухудшение функции легких объясняется дезадаптивным иммунным ответом, а не повышенной вирусной нагрузкой. Одна из теорий заключается в том, что активация резидентных иммунных клеток в легких посредством распознавания рецепторов стимулируют высвобождение провоспалительных цитокинов, выход нейтрофилов и моноцитов из сосудистого русла в бронхи. Эти клетки могут нарушить барьер между воздухом и кровью, вызывая повреждение коллатеральных тканей, особенно эпителиальных клеток дыхательных путей и эндотелиальных клеток сосудов, которые экспрессируют рецептор входа, ангиотензин-превращающий фермент 2 (АСЕ2) для вируса SARS-CoV-2. Повреждения клеток эндотелия сосудов могут быть причиной тромботических микроангиопатий.

В недавних исследованиях SARS-CoV, которые тесно связаны с SARS-CoV-2, было показано, что активация компонента комплемента С3 обостряет заболевание при ОРДС, ассоциированном с SARS-CoV-2. С3-дефицитные мыши, инфицированные SARS-CoV, имели меньше респираторных дисфункций, несмотря на эквивалентную вирусную нагрузку в легких, и это было связано с уменьшением инфильтрации легких нейтрофилами и моноцитами, более низким уровнем цитокинов и хемокинов в легких и в сыворотке крови [Gralinski, L.Е. et al. Complement activation contributes to severe acute respiratory syndrome coronavirus pathogenesis. mBiohttps://doi.org/10.1128/mBio.01753-18 (2018)]. Полученные данные свидетельствуют о том, что ингибирование ключевого компонента С3 комплемента может также уменьшить воспалительные легочные повреждения, обусловленные SARS-CoV-2 инфекцией. Заметное снижение инфильтрации легких нейтрофилами и снижение уровней как внутрилегочного, так и плазменного IL-6, наблюдаемый у инфицированных SARS-CoVC3-дефицитных мышей, предполагает возможность комбинирования ингибиторов С3 в схемах лечения для снижения уровня IL-6. Более того, восходящее позиционирование передачи сигналов С3 во врожденном иммунном каскаде также свидетельствуют в пользу более широкого противовоспалительного потенциала блокады С3 с такими агентами как компстатин (AMY-101) [Mastellos, D.С, Ricklin, D., Lambris, J. D. Clinical promise of next- generation complement therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov.18, 707-729 (2018)], который в настоящее время проходит испытания у пациентов с COVID-19. Подавление активации С3 вызывает блокаду генерации С3а и С5а анафилатоксинов, а также внутрилегочной активации С3 и высвобождению IL-6 из альвеолярных макрофагов или других клеток, экспрессирующих С3а рецепторы (C3aR) и/или рецепторы С5а (C5aR), тем самым снижая повреждение легких.

Ex vivo инфицирования цельной крови SARS-CoV в присутствии ингибитора С3, AMY-101, показали, что это препятствует высвобождению IL-6 [Mastellos, D.С, Ricklin, D., Lambris, J. D. Clinical promise of next- generation complement therapeutics. Nat. Rev. DrugDiscov.18, 707-729 (2018)].

Роль активации комплемента в патогенезе ОРДС, вызванного различными тяжелыми заболеваниями, убедительно доказана. Клинические же данные о роли гиперактивации комплемента в развитии ОРДС, ассоциированного с SARS-CoV-2, в настоящее время немногочисленны [Zilow, G. et al. Generation of anaphylatoxin С3а in plasma and bronchoalveolar lavage fluid in trauma patients at risk for the adult respiratory distress syndrome. Crit. CareMed. 20, 468-473 (1992)].

Исследования образцов легких умерших пациентов с тяжелой формой COVID-19 показали гиперактивацию комплемента, которая характеризовалась генерацией С3а в бронхо-альвеолярной жидкости, обнаружением большого количества C3b-фрагментов в тканях легких и повышением уровня С5а в сыворотке крови [Gao, Т. et al. Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over- activation. medRxiv Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.29.20041962 (2020)].

Важно отметить, что лечение пациентов с тяжелой формой Ковид-19 анти-С5 моноклональными антителами приводит к быстрому улучшению состояния больных с ОРДС, увеличению степени оксигенации крови и снижению системной воспалительной реакции в организме больного [Gao, Т. et al. Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over- activation. medRxiv Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.29.20041962 (2020)].

Ингибиторы C5 эффективно используются в клинике почти 15 лет, и их использование в клинических испытаниях при тяжелом течении SARS-CoV-2 подкреплены хорошо известной ролью оси С5а - C5aR в патогенезе ОРДС. Однако ингибирование С5 может быть частичным, что позволяет остаточной активности терминального пути снижать эффективность при гиперактивации комплемента, который наблюдается при инфекциях. Также эти препараты не будут влиять на ось С3а-C3aR. Ингибиторы проксимального комплемента (которые нацелены на С3 или его предшествующие активаторы) могут быть более эффективными, но они все еще находятся на стадии разработки, и ни один из них не одобрен для применения, хотя имеются обнадеживающие данные фазы II клинических испытаний.

Остаются дополнительные вопросы относительно терапевтического использование ингибиторов комплемента при COVID-19. Лишь у небольшой части пациентов развивается тяжелая форма болезни в виде ОРДС. Однако надежные клинические маркеры для прогнозирования тяжести течения на ранней стадии заболевания в настоящий момент отсутствуют. Биомаркеры активации системы комплемента обычно не используется, так как большинство из них нестабильны и имеют очень короткий период полураспада [Mastellos D.C. et al. Complement С3 vs C5 inhibition in severe COVID-19: Early clinical findings reveal differential biological efficacy //Clin Immunol. 2020 Nov; 220:108598. doi: 10.1016/j.clim.2020.1085983].

Повышенная функциональная активность классического пути системы комплемента свидетельствует о наличии воспалительного состояния в организме человека и является прогностическим маркером тяжести системной воспалительной реакции при COVID-19 инфекции. Данное предположение также подтверждается результатами исследования титра антител к SARS-CoV-2 при COVID-19, где убедительно показано прямая зависимость тяжести ОРДС от концентрации этих антител [Holter J.C., Pischke S.E., Elinede Boer, Andreas Lind et al. Systemic complement activation is associated with respiratory failure in COVID-19 hospitalized patients // Proc Natl Acad Sci USA. 2020 Oct 6;117(40):25018-25025. doi: 10.1073/pnas.2010540117; Noris M, Benigni A, Remuzzi G. The case of complement activation in COVID-19 multiorgan impact. Kidney Int. 2020 Aug; 98(2):314-322. doi: 10.1016/j.kint.2020.05.013. Epub 2020 May 24.PMID: 32461141; Ma L, Sahu SK, Cano M, Kuppuswamy V. et al. Increased complement activation is a distinctive feature of severe SARS-CoV-2 infection // bioRxiv. 2021 Feb 23:2021.02.22.432177. doi: 10.1101/2021.02.22.432177; Vitiello A, La Porta R, D'Aiuto V, Ferrara F. Pharmacological approach for the reduction of inflammatory and prothrombotic hyperactive state in COVID-19 positive patients by acting on complement cascade // Hum Immunol. 2021 Jan 20:S0198-8859(21)00014-8. doi: 10.1016/j.humimm.2021.01.007]. Повышенный уровень антител с высокой комплемент-активирующей функцией является причиной неконтролируемой активации системы комплемента по классическому пути и как итог - полиорганная недостаточность.

Основная, первичная функция антител - связывание с антигеном, в некоторых случаях оно непосредственно ведет к достижению эффекта, обеспечивая нейтрализацию бактериального токсина или предотвращая проникновение вируса в клетки. Однако чаще взаимодействие антител с антигеном остается безрезультатным, пока они не осуществят свои вторичные, "эффекторные" функции.

К одной из эффекторных функций иммуноглобулинов относится их избирательное взаимодействие с различными типами клеток (мононуклеары, нейтрофилы, тучные клетки, базофилы) при участии специальных рецепторов клеточной поверхности (FcR) [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с].

Другой важной эффекторной функцией IgM, IgG1, IgG2 и IgG3 после связывания с антигеном является активация классического пути системы комплемента [Bogers W.M.J.M., Stad R-K., van Es L., Daha M.R. Immunoglobulin A: Interaction with Complement, Phagocytic Cells and Endothelial Cells // Complement Inflamm. 1991. V.8. P. 347-358.]. Альтернативный и лектиновый пути активируются иммунными комплексами (ИК), содержащими IgA [Roos A., Bouwman L.H., van Gij Iswijk-Janssen D.J., et al. Human IgA Activates the Complement System Via the Mannan-Binding Lectin Pathway // J.Immunol. 2001. V. 167. P. 2861-2868.].

Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из многих компонентов, которые действуют каскадным механизмом. Эта система играет ключевую роль как в клиренсе ИК, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки.

Система комплемента может активироваться тремя путями (классический, альтернативный и лектиновый).

Классический путь является Са²⁺/Mg²⁺ - зависимым каскадом, который в норме активируется при формировании ИК. С1, первый ферментный комплекс в каскаде, является пентамолекулярным комплексом. Включает одну молекулу C1q и по две молекулы C1r и C1s. С1 компонент связывается с Fc-фрагментом иммуноглобулинов в ИК через C1q домен и инициирует ферментативный каскад комплемента. Как только активируется C1, C1s расщепляет компонент С4, приводя к образованию C4b, который затем связывает С2. Иммобилизованный компонент С2 расщепляется при помощи фермента C1s с образованием С3-конвертазы (C4b, С2а) классического пути.

Альтернативный путь является Mg²⁺ - зависимым и активируется рядом разнообразных веществ, включающих полисахариды клеточных стенок дрожжей и бактерий, определенные биополимерные материалы. При иммобилизации C3b на поверхности на него садится фактор В, который расщепляется фактором D и образуется С3-конвертаза (C3b, Bb) альтернативного пути.

Лектиновый путь активирует комплемент при помощи маннан-связывающего лектина (MBL) через две сывороточные протеазы (MASP-1 и MASP-2) (подобно с C1r и C1s в классическом пути активации комплемента). MBL связывается с клеточными стенками патогенов, содержащих маннозу. Как и в классическом пути активации комплемента, для лектинового пути также требуются компоненты С4 и С2. Активация лектинового пути приводит к формированию С3-конвертазы, аналогичной с С3-конвертазой классического пути (C4b, С2а) [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с.].

Субстратом С3-конвертазы трех путей является ключевой компонент комплемента С3, при гидролизе которого образуются С3а (анафилатоксин) и C3b (опсонин). Присоединяя дополнительно молекулу C3b, С3-конвертаза обретает способность гидролизовать компонент С5, который запускает реакцию формирования мембрано-атакующего комплекса (МАК).

При активации комплемента генерируются биологически активные фрагменты белков С3, С4 и С5 (С3а-, С4а- и С5а-анафилатоксины) и C5b-9 (МАК), которые опосредуют воспалительные активности, включающие лейкоцитарный хемотаксис, активацию макрофагов, нейтрофилов и тромбоцитов, тучных и эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости, цитолиз и тканевое повреждение [Sahu A., Lambris J.D. Complement inhibitors: are surgent conceptin anti-inflammatory therapeutics // Immunopharmacology. 2000. V. 49. P. 133-148.].

Для исследования системы комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения исследуемой сыворотки добавляют к эритроцитам барана, сенсибилизированным антителами кролика (ЕА_к); 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну 50% гемолитическую единицу комплемента (СН₅₀) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50% 0,5 мл стандартной суспензии ЕА_к при 37°С в течение 45 мин. В 1 мл сыворотки здоровых доноров обычно содержится 20-40 СН₅₀ [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - 368 с.].

Однако существенным недостатком этого метода является использование анти-Форссмановских антител кролика для сенсибилизации эритроцитов барана, что ограничивает тест только гемолитической активностью комплемента. С этой точки зрения понятен интерес к способам определения комплемент-активирующей функции человеческих иммуноглобулинов.

Известен способ определения функциональной активности классического пути системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции путем проведения реакции лизиса эритроцитов человека группы А [Е(А)] сывороткой крови человека. Для этого используют 12,5% сыворотку крови человека, 1% суспензию Е(А), сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами [Е(А)мА/Т] в условиях вероналового солевого буфера (VBS²⁺) при температуре 37°С, инкубируют в течение 15 мин, реакцию комплемент-зависимого лизиса Е(А)мА/Т оценивают турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии Е(А)мАТ при длине волны 620 нм. Повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента отмечают при степени лизиса эритроцитов человека более 60%, при степени лизиса от 31% до 59% как нормальную и при степени лизиса менее 30% как пониженную функциональную активность классического пути системы комплемента [Способ определения функциональной активности системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции // Патент РФ №2756764. Опубл. 05.10.2021 г].

Недостатком данного способа является использование гетерологичных моноклональных IgM антител, что ограничивает информацию только функциональной активностью системы комплемента.

Существует метод определения титра гетерофильных антител (ГА) к эритроцитам барана с помощью реакции гемагглютинации при лабораторной диагностике инфекционного мононуклеоза (ИМ) (проба Пауля-Буннеля). ГА представляют собой IgM, взаимодействующие с антигенами животных неродственных видов, например, барана или быка. Эти антитела выявляются примерно у 90% больных инфекционным мононуклеозом. ГА в низком титре могут присутствовать и у здоровых людей. ГА при ИМ отличаются от ГА, присутствующих в сыворотке здоровых и больных сывороточной болезнью, по способности абсорбироваться тканью почек морской свинки и эритроцитами быка. Диагностически значимым является титр ГА от 1:128-1:256 и выше. Кроме инфекционного мононуклеоза, проба бывает положительной при лейкозах, вирусных гепатитах, цитомегаловирусной инфекции, лимфоме Беркитта, ревматоидном артрите и после введения иммунных сывороток [Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. Г. Лолора-младшего, Т. Фишера и Д. Адельмана. Пер. с англ. М.: Практика, 2000. - 806 с.].

Однако проба Пауля-Буннеля характеризует способность ГА к гемагглютинации, но не отражает одну из эффекторных функций гетерофильных антител - способность активировать систему комплемента.

Известен способ определения нарушения иммунного статуса человека, включающий исследование в сыворотке крови антител и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Предварительно определяют титр гетерофильных антител по методу Пауля-Буннеля, относительный уровень ЦИК методом преципитации ПЭГ 6000 и комплемент-активирующие свойства гетерофильных антител, путем инкубации стандартизированных эритроцитов барана при температуре 37°С в течение 30 мин с 0,8% сывороткой и с последующим измерением степени лизиса эритроцитов, после чего проводят расчет коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по системе комплемента (К_{ЭФГА-СК}) по формуле:

К_{ЭФГА-СК}=У/Т_ГА,

где У - степень лизиса, %, Т_ГА - обратный титр гетерофильных антител к эритроцитам барана, а определение нарушений иммунного статуса проводят путем сопоставления коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител с относительным уровнем содержания (ЦИК) в сыворотке [Способ определения нарушения иммунного статуса. Патент РФ №2247381. Опубл. 27.02.2005 г].

Недостатком данного способа является использование гетерологичных эритроцитов барана, гетерофильных (неспецифических) антител для сенсибилизации, а также использование низких концентрации сыворотки крови человека в тесте, что является нефизиологичным и не отражает комплемент-ингибиторный потенциал крови человека.

Таким образом, на настоящий момент не существует способа определения нарушений иммунного статуса, включающего комплексный анализ содержания антител человека к SARS-CoV-2, их комплемент-активирующих свойств и гиперактивности системы комплемента для прогноза тяжести течения Covid-19 или осложнений при вакцинации.

Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента способов комплексной оценки комплемент-активирующих функции антител к SARS-CoV-2 и активности системы комплемента для прогноза тяжести течения COVID-19 или осложнений после вакцинации.

Поставленная задача решается путем забора крови у пациента, получения из нее сыворотки и определения в сыворотке крови содержания антител к SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа, и функциональной активности системы комплемента в сыворотке крови человека, отличающийся тем, что определяют потребление комплемента по классическому пути иммунными комплексами, содержащими антитела к SARS-CoV-2, рассчитывают коэффициент комплемент-активирующей функции (К_КАФ) антител к SARS-CoV-2 как отношение степени потребления комплемента в % к содержанию этих антител и при повышенных значениях К_КАФ (более 1 ЕД) и активности комплемента (более 60%) прогнозируют гиперэргическую реакцию организма при повторных инфекциях и необходимость использования экулизумаба, моноклональных антител к С5 компоненту, для профилактики ОРДС и полиорганной недостаточности.

Таким образом, технический результат, получаемый при реализации изобретения, заключается в выявлении гиперактивации системы комплемента иммунными комплексами, содержащими анти-SARS-CoV-2 антитела, для прогнозирования тяжести течения Covid-19 или осложнений при вакцинации и выборе тактики лечения с использованием специфических ингибиторов системы комплемента.

Пример 1. Определение количества антител к SARS-CoV-2 в сыворотке крови обследуемых. В работе использовали тест-систему «SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ» производства АО «Вектор-БЕСТ», РФ. Метод определения основан на двухстадийном «непрямом» варианте твердофазного анализа. На первой стадии анализа содержащиеся в исследуемых образцах специфические антитела связываются с иммобилизованным на поверхности лунок планшета рекомбинантным антигеном SARS-Cov-2. На второй стадии конъюгат моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой хрена взаимодействует с комплексами «антиген-IgG». При инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках, содержащих образовавшиеся комплексы «aHTHreH-IgG-конъюгат». Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации IgG к SARS-CoV-2 в анализируемом образце. Результаты анализа считаются положительными, если КП_обр ≥1,1, и отрицательным, если КП_обр ≤0,8. Результат анализа считается пограничным, если 0,8≤КП_обр≤1,1. В случае пограничного результата рекомендуется повторно исследовать эти образцы параллельно с образцами данных пациентов, взятыми через 2-5 дней. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, в 9 пробах (12,5%) отсутствуют антитела класса IgG и IgM к SARS-CoV-2. В 41 пробе из 63 положительных проб (65%) содержание IgM меньше 0,8 ЕД (отрицательный анализ), в 22 пробах из 63 положительных проб (34,9%) повышенный уровень IgM (колебания от 1,2 до 9,2 ЕД). В 63 пробах повышенный уровень IgG к SARS-CoV-2 (колебания от 2 до 16,2 ЕД).

Ранее было показано, что внутренние особенности гуморального иммунного ответа, включая антигенную специфичность, гликозилирование антител и подкласс IgG, влияют на прогрессирование инфекции тяжелого острого респираторного синдрома, вызванной коронавирусом-2 (SARS-CoV-2) [Bastard Р, Rosen LB, Zhang Q. Autoantibodies against type I IFNs in patients with life-threatening COVID-19. Science. 2020; 370:eabd4585]. В частности, неблагоприятный исход COVID-19 зависит от несбалансированного гуморального ответа, в результате которого нарушение вирусной нейтрализации трансформируется в чрезмерное системное воспаление [Giamarellos-Bourboulis EJ, Netea MG, Rovina N. Complex immune dysregulation in COVID-19 patients with severe respiratory failure. Cell Host Microbe. 2020;27:992-1000]. Например, тяжелая форма COVID-19 была связана с более высокой концентрацией в сыворотке провоспалительных спайк-специфичных IgG3 и афукозилированных антител IgG1, способных вызывать чрезмерную активацию макрофагов [Chakraborty S, Gonzalez J, Edwards K. Proinflammatory IgG Fc structures in patients with severe COVID-19. Nat Immunol. 2020;22:67-73]. Точно так же аутоантитела к интерферону I типа (IFN) были продемонстрированы у критических пациентов с COVID-19, копируя врожденные ошибки иммунитета к IFN типа I и приводя к нарушению врожденных и внутренних противовирусных иммунных ответов [Bastard Р, Rosen LB, Zhang Q. Autoantibodies against type I IFNs in patients with life-threatening COVID-19. Science. 2020; 370:eabd4585]. С другой стороны, было показано, что анти-спайковые моноклональные нейтрализующие антитела подкласса IgG1 из плазмы выздоравливающих пациентов с COVID-19 предотвращают опасное для жизни заболевание и в настоящее время проходят клинические испытания [Taylor PC, Adams AC, Hufford MM, de la Torre I, Winthrop K, Gottlieb RL. Neutralizing monoclonal antibodies for treatment of COVID-19. Nat Rev Immunol. 2021;21:382-393].

В этом проспективном исследовании авторы обнаружили, что уровень сывороточного IgG4 предсказывает плохой исход COVID-19. Основываясь на доступной литературе, антитела IgG4 могут способствовать прогрессированию COVID-19 посредством как минимум двух возможных механизмов, которые еще предстоит проверить. Поскольку анти-спайковый IgG4 показал низкую нейтрализующую способность in vitro по сравнению с антителами IgG1, IgG2 и IgG3, первая возможность состоит в том, что лица с выраженными иммунными ответами IgG4 могут быть более устойчивыми к инфекции SARS-CoV-2 [Suthar MS, Zimmerman MG, Kauffman RC. Rapid generation of neutralizing antibody responses in COVID-19 patients. Cell Rep Med. 2020;1]. С другой стороны, поскольку нейтрализующие аутоантитела против IFNγ, наблюдаемые у взрослых пациентов с множественными оппортунистическими инфекциями, в основном относятся к подклассу IgG4, есть соблазн предположить, что антитела против IFN связаны с ослабленным иммунитетом против SARS-CoV-2 и опасны для жизни. Пневмония COVID-19 также может быть IgG4 [Browne SK, Burbelo PD, Chetchotisakd P. Adult-onset immunodeficiency in Thailand and Taiwan. NEJM. 2012; 367:725-734]. Несмотря на ограничения, в основном связанные с ограниченным числом включенных пациентов, исследование идентифицирует антитела IgG4 как возможную дополнительную, упускаемую из виду, переменную гуморального иммунного ответа против SARS-CoV-2, связанного с прогрессированием COVID-19.

Систематическое исследование было проведено для изучения роли изотипа иммуноглобулина, плотности эпитопа и соотношения антиген/антитело по способности иммунных комплексов активировать классический и альтернативный пути человеческого комплемента и впоследствии связываться с рецептором эритроцитов (CR1) к C3b-, C4b активированным фрагментам компонентов С3 и С4. Для этой цели использовали серию химерных моноклональных антител, которые все имели один и тот же сайт комбинирования, но имели разные человеческие константные домены. Плотность антигенного эпитопа варьировали путем связывания различного количества молекул гаптена с бычьим сывороточным альбумином. Все три параметра влияют на фиксацию комплемента. В общем, активация комплемента лучше при избытке или эквивалентности антител, чем при избытке антигена, и лучше при высокой плотности эпитопа, чем при низкой плотности. Хотя эффекты различны для разных изотипов иммуноглобулинов и для двух путей. Было подтверждено, что IgG1 и IgG3 являются хорошими активаторами классического пути и толерантны к изменениям как плотности эпитопа, так и соотношения антиген/антитело. Показано, что иммунные комплексы, содержащие IgG4 и IgA, не активируют классический путь при данных условиях. IgG2 активирует классический путь только при высокой плотности эпитопа и при эквивалентности или избытке антител. IgM хорошо активирует классический путь только при более высоких плотностях эпитопа и при эквивалентности или избытке антител, но, кроме того, демонстрирует интересный и неожиданный феномен прозоны, когда иммунный комплекс при избытке антител ингибирует активацию комплемента классическим путем. Результаты активации альтернативного пути разительно отличаются. IgA, безусловно, является лучшим активатором альтернативного пути и относительно устойчив к плотности эпитопа и соотношению антиген/антитело. IgM, IgG1 и IgG3 не активируют существенно альтернативный путь ни при каких обстоятельствах. IgG2 - лучший подкласс IgG для активации альтернативного пути, но требует высокой плотности и эквивалентности эпитопа или избытка антител. Связывание с CR1 в целом соответствует количеству фиксированных молекул C3b. Однако комплексы IgG1 и IgG3 в избытке антигена хорошо активируют комплемент, но плохо связываются с CR1 рецептором на эритроцитах. Новообразованные комплексы, по-видимому, связывают комплемент таким же образом, как и те, которые связываются предварительно сформированными комплексами, но в этом случае они менее способны связываться с CR1 эритроцитов [Valim Y.M.L. and Lachmann P.J. The effect of antibody isotype and antigenic epitope density on the complement-fixing activity of immune complexes: a systematic study using chimaeric anti-NIP antibodies with human Fc regions // Clin Exp Immunol. 1991 Apr; 84(1): 1-8. doi: 10.1111/j.1365-2249.1991.tb08115.x].

Таким образом, учитывая разные свойства подклассов IgG, нами были сформированы индивидуальные иммунные комплексы, содержащие рекомбинантный антиген SARS-CoV-2, для определения их комплемент-активирующих свойств в зависимости от подкласса IgG в этих комплексах.

Пример 2. Определение потребления комплемента иммунными комплексами, содержащими антитела к SARS-CoV-2.

В лунки иммунологических 96-ти луночных планшетов с плоским дном вносят по 10 мкл раствора антигена SARS-CoV-2, 27,5 мкл буфера VBS²⁺ и 12,5 мкл исследуемой сыворотки крови человека. Параллельно ставят контроль сыворотки, где вместо антигена добавляют 10 мкл физиологического раствора. Тщательно перемешивают и инкубируют 20 мин при 37°С. После инкубации добавляют 50 мкл 1% суспензии эритроцитов человека группы А по системе АВ0, сенсибилизированных моноклональными IgM анти-А антителами [Е(А)мА/Т]. Тщательно перемешивают и измеряют мутность проб при 620 нм (0 мин инкубации) на фотометре для ИФА. Затем инкубируют в течение 30 мин при 37°С. После инкубации тщательно перемешивают и измеряют мутность как описано выше. Степень лизиса определяют по калибровочному графику, где полный лизис Е(А)мА/Т представляет 100% лизис, а контроль Е(А)мА/Т на спонтанный лизис - 0% лизиса. Потребление комплемента иммунными комплексами, содержащими SARS-CoV-2, определяют как разность лизиса между контролем сыворотки и опытной пробой. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в 35 пробах (49%) сыворотки при инкубации с SARS-CoV-2 антигеном не приводит к существенному потреблению комплемента (менее 10%). Данный факт может быть обусловлен либо отсутствием антител к данному антигену, либо низкой комплемент-активирующей функцией антител к SARS-CoV-2 при формировании иммунных комплексов при предварительной инкубации сыворотки с данным антигеном.

Пример 3. Определение коэффициента комплемент-активирующей функции антител к SARS-CoV-2 в сыворотке крови человека.

Коэффициент комплемент-активирующей функции (К_КАФ) рассчитывали, как отношение % потребления комплемента иммунными комплексами, содержащими рекомбинантный антиген SARS-CoV-2, к содержанию анти-SARS-CoV-2 IgG в единицах. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, в 7 пробах отсутствие IgG антител к SARS-CoV-2 не вызывает потребление комплемента. В то же время в 5 пробах потребление комплемента не было связано с IgG антителами к SARS-CoV-2. Данный факт можно объяснить прямой активацией системы комплемента по лектиновому пути. В 24 пробах (38%) из 63 положительных по антителу IgG к SARS-CoV-2 К_КАФ оказался выше 1 ЕД. В остальных 39 (62%) положительных пробах К_КАФ был менее 1 ЕД.

Таким образом, можно констатировать, что чем выше величина К_КАФ, тем больше в пуле анти-SARS-CoV-2 антител класса IgG доля подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, которые обладают комплемент-активирующей функцией. И наоборот, чем ниже величина К_КАФ, тем больше в пуле доля IgG4, которые не активируют систему комплемента. Из полученных данных можно сделать следующие выводы:

1. Лица с преобладанием подклассов IgG1-3 в общем пуле антител IgG к SARS-CoV-2 при повторном заболевании ковид-19 могут дать гиперергическую реакцию;

2. Лица с преобладанием подклассов IgG4 в общем пуле антител IgG к SARS-CoV-2 при повторном контакте с вирусом ковид-19 могут перенести инфекцию в легкой форме.

Хотя в проспективном исследовании было показано, что у людей, погибших от Ковид-19, доля IgG4 в общем пуле антител IgG к SARS-CoV-2 была существенно выше. Показано, что уровень сывороточного IgG4 предсказывает плохой исход COVID-19. Основываясь на доступной литературе, можно утверждать, что антитела IgG4 могут способствовать прогрессированию COVID-19 посредством как минимум двух возможных механизмов, которые еще предстоит проверить. Поскольку анти-спайковый IgG4 показал низкую нейтрализующую способность in vitro по сравнению с антителами IgG1, IgG2 и IgG3. Первая возможность состоит в том, что лица с выраженными иммунными ответами IgG4 могут быть более устойчивыми к инфекции SARS-CoV-2 [Suthar MS, Zimmerman MG, Kauffman RC. Rapid generation of neutralizing antibody responses in COVID-19 patients. Cell Rep Med. 2020; 1]. С другой стороны, поскольку нейтрализующие аутоантитела против IFNγ, наблюдаемые у взрослых пациентов с множественными оппортунистическими инфекциями, в основном относятся к подклассу IgG4, есть соблазн предположить, что антитела против IFN связаны с ослабленным иммунитетом против SARS-CoV-2 и опасны для жизни [Browne SK, Burbelo PD, Chetchotisakd P. Adult-onset immunodeficiency in Thailand and Taiwan. NEJM. 2012; 367:725-734]. Несмотря на ограничения, в основном связанные с ограниченным числом включенных пациентов, исследование идентифицирует антитела IgG4 как возможную дополнительную, упускаемую из виду, переменную гуморального иммунного ответа против SARS-CoV-2, связанного с прогрессированием COVID-19.

Следует отметить, что наличие повышенного уровня IgG4 в пуле IgG у лиц, умерших от ковид-19, может привести к отложению иммунных комплексов в органах и тканях, их агрегация при длительной циркуляции в кровотоке может изменить их свойства, привести к системной активации комплемента и как следствие - к полиорганной недостаточности. К сожалению, в представленной работе не были исследованы длительно циркулирующие иммунные комплексы, содержащие SARS-CoV-2.

Пример 4. Определение специфичности антител к SARS-CoV-2 в тесте потребления комплемента. Для подтверждения специфичности антител к SARS-CoV-2 были проведены исследования потребления комплемента иммунными комплексами, содержащими антиген кори. В лунки иммунологических 96-ти луночных планшетов с плоским дном вносят по 10 мкл раствора антигена SARS-CoV-2 или вакцину от кори (вирус кори аттенуированный) (НПО «Микроген», МЗ РФ), 27,5 мкл буфера VBS²⁺ и 12,5 мкл исследуемой сыворотки крови человека. Параллельно ставят контроль сыворотки, где вместо антигена добавляют 10 мкл физиологического раствора. Тщательно перемешивают и инкубируют 20 мин при 37°С. После инкубации добавляют 50 мкл 1% суспензии эритроцитов человека группы А по системе АВ0, сенсибилизированных моноклональными IgM анти-А антителами [Е(А)мА/Т]. Тщательно перемешивают и измеряют мутность проб при 620 нм (0 мин инкубации) на фотометре для ИФА. Затем инкубируют в течение 30 мин при 37°С. После инкубации тщательно перемешивают и измеряют мутность, как описано выше. Степень лизиса определяют по калибровочному графику, где полный лизис Е(А)мА/Т представляет 100% лизис, а контроль Е(А)мА/Т на спонтанный лизис - 0% лизиса. Потребление комплемента иммунными комплексами, содержащими SARS-CoV-2, определяют как разность лизиса между контролем сыворотки и опытной пробой. Полученные результаты представлены на таблице 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, потребление комплемента при инкубации сывороток крови с коревой вакциной наблюдается только в трех пробах. Причем в одной пробе (№6) отсутствовали антитела к SARS-CoV-2, а в пробе №11 тестировался высокий уровень антител к SARS-CoV-2. В пробе №8 потребление комплемента вирусами кори было в два раза меньше, чем антигеном SARS-CoV-2. В остальных 13 пробах (81%) практически не наблюдается потребления комплемента коревой вакциной. Потребление комплемента в 2 пробах №5 и №6 антигеном SARS-CoV-2 при отсутствии антител, возможно, обусловлено высокой активностью лектинового пути активации системы комплемента.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о специфичности антител к SARS-CoV-2.

Пример 5. Определение функциональной активности системы комплемента сыворотки крови человека. Функциональную активность классического пути системы комплемента определяли как описано в патенте РФ №2756764, опубл. 05.10. 2021 г. Бюл. №28. Кратко: в лунки иммунологических 96-ти луночных плоскодонных планшетов вносят последовательно 12,5 мкл сыворотки крови человека, 37,5 мкл вероналового буфера с солями Са и Mg (VBS²⁺) и 50 мкл Е(А), сенсибилизированных моноклональными IgM антителами. В качестве контроля используют: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (50 мкл Е(А)мАт+50 мкл VBS²⁺); 2 - Контроль на полный лизис (50 мкл Е(А)мАт +50 мкл Н₂О). Степень лизиса Е(А)мАт в % определяют по калибровочному графику, где 100% лизис представляет контроль на полный лизис и 0% лизиса представляет контроль эритроцитов на спонтанный лизис. Пробы инкубируют в течение 15 мин при 37°С. Определяют лизис Е(А)мАт методом турбидиметрии по снижению мутности при 620 нм на планшетном фотометре для ИФА анализа. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Как видно из данных, представленных в таблице 5, в 23 пробах (32%) наблюдается повышенная активность системы комплемента, в 9 пробах (13%) активность комплемента меньше 30% (пониженная активность). В остальных 40 пробах активность системы комплемента в пределах нормы (от 30 до 69% лизиса).

При расчете коэффициента комплемент-активирующей функции выпадают 9 проб из-за отсутствия антител к SARS-CoV-2. Для дальнейших анализов нами использованы пробы с наличием антител к SARS-CoV-2 (всего 63 пробы). Данный коэффициент нами введен для оценки удельной комплемент-активирующей функции антител к SARS-CoV-2, который рассчитывали как отношение потребления комплемента в % к концентрации антител к SARS-CoV-2. Как видно из данных таблицы 5, данный коэффициент колебался от -0,1 до 7,1 ЕД. Отрицательные значения К_КАФ (-0,1 ЕД для пробы №13) и 0 значение (для пробы №14) свидетельствуют об отсутствии связывания комплемента иммунными комплексами, содержащими SARS-CoV-2. Дальнейшая судьба подобных иммунных комплексов, которые не активируют классический путь системы комплемента, связана с длительной циркуляцией их в кровотоке, их модификацией и агрегацией с последующим развитием болезней иммунных комплексов.

Высокие значения К_КАФ (более 1 ЕД) свидетельствуют о возможной гиперэргической реакции организма человека при повторных заражениях данным вирусом SARS-CoV-2. Фактором, усугубляющим данное состояние, является повышенная активность системы комплемента, которая свидетельствует о наличии воспалительного процесса в организме данных пациентов.

Таким образом, проведенные исследования выявили 7 пациентов (11%) с угрозой гиперэргической реакции при повторном контакте с вирусами SARS-CoV-2. Иммунная реакция организма при повторном инфицировании может вызвать усиленный синтез антител с высокой эффекторной (комплемент-активирующей) функцией к Covid-19, что может привести к неконтролируемой активации системы комплемента по классическому пути и острому респираторному дистресс-синдрому и полиорганной недостаточности (тяжелое течение инфекции). Раннее выявление лиц с повышенными показателями комплемент-активирующей функцией антител к SARS-CoV-2 и гиперактивностью системы комплемента позволит сформировать группу риска по COVID-19 инфекции и тем самым снизить тяжесть течения ОРДС путем использования экулизумаба, моноклональных антител к С5 компоненту системы комплемента.

Изобретение относится к медицинской иммунологии. Описан способ определения комплемент-активирующей функции антител к SARS-CoV-2 для прогнозирования тяжести течения COVID-19. Определяют содержание антител методом иммуноферментного анализа и функциональную активность системы комплемента в сыворотке крови человека. При этом определяют потребление комплемента по классическому пути иммунными комплексами, содержащими антиген SARS-CoV-2, рассчитывают коэффициент комплемент-активирующей функции (К_КАФ) антител к SARS-CoV-2 как отношение степени потребления комплемента, %, к содержанию этих антител. При повышенных значениях К_КАФ, более 1 ЕД, и активности комплемента более 60% прогнозируют гиперэргическую реакцию организма при повторных инфекциях и необходимость использования экулизумаба, моноклональных антител к С5 компоненту. Изобретение позволяет осуществлять профилактику ОРДС и полиорганную недостаточность. Изобретение может быть использовано для прогнозирования тяжести течения Covid-19 при повторном инфицировании путем определения комплемент-активирующей функции антител к SARS-CoV-2 и гиперактивности системы комплемента по классическому пути. 5 табл., 5 пр.

Способ определения комплемент-активирующей функции антител к SARS-CoV-2 для прогнозирования тяжести течения COVID-19, включающий определение содержания антител методом иммуноферментного анализа и функциональной активности системы комплемента в сыворотке крови человека, отличающийся тем, что определяют потребление комплемента по классическому пути иммунными комплексами, содержащими антиген SARS-CoV-2, рассчитывают коэффициент комплемент-активирующей функции (К_КАФ) антител к SARS-CoV-2 как отношение степени потребления комплемента в % к содержанию этих антител и при повышенных значениях К_КАФ, более 1 ЕД, и активности комплемента более 60% прогнозируют гиперэргическую реакцию организма при повторных инфекциях и необходимость использования экулизумаба, моноклональных антител к С5 компоненту, для профилактики ОРДС и полиорганной недостаточности.