СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНАЛИТА С ШИРОКИМ ДИНАМИЧЕСКИМ ДИАПАЗОНОМ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к способам иммуноанализа для детектирования или количественного измерения искомых аналитов в образцах и может быть использовано в лабораторной и клинической практике для детектирования антител, протеинов, гормонов, лекарственных форм в биологических образцах в широком диапазоне концентраций.

Иммуноанализ является наиболее используемым способом для определения аналитов в образце, при этом в основном используется взаимодействие аналита, например, антигена, со специфическим связывающим партнером, например с антителом, в результате взаимодействия которых образуется комплекс аналит-связывающий партнер, который может быть детектирован различными известными в измерительной технике средствами, например, флуоресценцией. Однако при измерении аналита в широком диапазоне концентраций возникает проблема так называемого хук-эффекта, который не позволяет точно измерять высокие концентрации аналита и вызывается рядом различных факторов. Например, при осуществлении одноступенчатого сэндвич иммуноанализа связывающие антитела смешиваются с образцом, в котором находится искомый аналит, к этой смеси добавляется антитело, меченой детектируемой меткой - конъюгат.Связывающие антитела связываются- с аналитом, образуя комплекс связывающее антитело-аналит.Конъюгат связывается с этим комплексом и метка конъюгата детектируется как значение величины искомого аналита. В присутствии избытка свободного аналита весь конъюгат связывается со свободным аналитом, в результате чего меньшая часть конъюгата может быть связана с образовавшимся комплексом, количество меток, связанных с комплексом, уменьшается, т.е. уменьшается количество детектируемого аналита, что исключает возможность точного измерения больших концентраций аналита.

Известен способ увеличения динамического диапазона измерений, основанному на реакции специфического связывания (США, заявка №2007/0259450, класс НКИ 436/514). Иммунологический способ основан на специфическом взаимодействии между аналитом и связывающим партнером, использующий тест-элемент, который имеет одну и более зон для нанесения образца, однако важно, чтобы в тест-элементе имелась по крайней мере одна зона для детектирования образца и одна контрольная зона. Обычно связывающими партнерами служат антитела, гаптены и их фрагменты, при этом тест-элемент содержит детектирующие зоны, или линии, содержащие связывающие партнеры с высокой аффинностью к аналиту, детектирующие зоны, или линии, содержащие связывающие партнеры с низкой аффинностью и контрольные зоны, например, содержащие аналог аналита. Способ простой, обладает хорошей воспроизводимостью, исключает хук-эффект и расширяет динамический диапазон измерения в сторону больших концентраций аналита. После проведения биоспецифических реакций измеряют сигналы детектируемых меток первой и второй зоны, определяют их соотношение и сравнивают с калибровочной кривой, в качестве детектирующих меток используют люминесцентные и флуоресцентные вещества.

Недостатком способа является низкая чувствительность в области низких концентраций аналита, обусловленная наличием большого фонового сигнала из-за отсутствия операции удаления не связавшихся реагентов.

Известен способ для проведения мультиплексного анализа множества аналитов (заявка США №2003/0153011, класс НКИ 435/6). Способ позволяет проводить мультиплексный анализ множества аналитов в одном и том же образце в пределах динамического диапазона исследований и определять присутствие, отсутствие, активность или концентрацию аналита путем определения пространственного связывания между искомым аналитом и связанным с твердой фазой специфическим связывающим лигандом. Способ может быть использован как для гомогенного, так и для гетерогенного иммуноанализа, при этом операции способа могут выполняться как последовательно, так и одновременно. В способе используют твердую фазу, например, частицы, для связывания искомого аналита, излишки образца, реагентов и других веществ удаляют из реакционной смеси; для детектирования комплексов, связанных с аналитом, используют флуоресцентные метки. Способ позволяет измерять как большие концентрации аналитов, так и низкие.

Недостатком способа является низкая производительность из-за необходимости последовательного анализа сигналов от каждой частицы.

Известен способ для определения аналита в образце (патент США, №7566573, класс НКИ 436/540). При осуществлении способа используют различные специфические связывающие партнеры, при этом равные аликвоты различных связывающих партнеров связаны с различными метками, например, флуоресцентной и фосфоресцентной. Измеряют сигналы от люминесцентной и флуоресцентной меток, связанных с аналитом, сравнивают со стандартной кривой и определяют присутствие или количество аналита путем сравнения сигналов от двух меток. Способ может быть использован для детектирования лекарственных форм, гормонов и др. в биологических жидкостях.

Недостатком способа является низкая производительность из-за необходимости проведения всех стадий анализ с каждой аликвотой всех связывающих партнеров последовательно.

Известен способ контроля чувствительности и динамического диапазона при гомогенных исследованиях (заявка США, №2009/0258373, класс НКИ 435/7.1). Способ позволяет перекрыть хук-эффект и расширить динамический диапазон точного исследования аналитов, например, протеинов, гормонов, бактерий, вирусов и т.п.или их комбинаций. При осуществлении способа образец с искомым аналитом инкубируют с первой парой реагентов для получения первого сэндвич комплекса, и со второй парой реагентов для образования второго сэндвич комплекса, если в образце присутствует аналит. При этом первая пара реагентов имеет более высокую аффинность по отношению к аналиту, чем вторая пара, выше примерно на порядок. Первая пара реагентов имеет первый связывающий партнер, иммобилизованный на твердом носителе, и второй связывающий партнер, меченый первой сигнальной меткой, вторая пара реагентов содержит третий связывающий партнер, иммобилизованный на твердом носителе, и четвертый связывающий партнер, связанный со второй сигнальной меткой. После инкубирования измеряют сигналы от первого и второго комплексов, сравнивают их со стандартными кривыми и определяют концентрацию аналита по соотношению сигналов.

В способе не удается полностью исключить влияние хук-эффекта на точность измерения концентрации аналита.

Известен способ измерения аналита с расширенным динамическим диапазоном измерения (заявка США, №2011/0195853, класс НКИ 506/09). Изобретение относится к диагностическим тестам, связанным с аффинностью и позволяет измерять концентрацию 'искомых аналитов в широком диапазоне концентраций, даже если диапазон концентраций „превышает динамический диапазон измерения люминесцентной метки. Способ может быть использован на различных тест-сайтах: 96-ячеистых платах, на платформах микрорядов, чипах и т.д., при этом в способе используют нанесение связывающих партнеров на первом и втором тест-сайтах. По крайней мере один связывающий партнер содержит множество связывающих партнеров, каждый из которых проявляет аффинность к искомым молекулам, которая отличается от аффинности к искомым молекулам для других связывающих агентов. Для детектирования аналита используют вторичные меченые люминесцентной меткой антитела. Концентрацию молекул от минимальной до максимальной измеряют по суммарной кривой.

Способ не может обеспечить расширение динамического диапазона измерений в области высоких концентраций измеряемого аналита из-за избытка аналита и связывающих партнеров.

Наиболее близким является способ иммуноанализа с уменьшенной величиной хук эффекта (США, заявка №2008/2013, класс НКИ 435/7.1). Изобретение относится к иммуноанализу, используемому для детектирования или количественного измерения по крайней мере одного искомого аналита в образце и может быть использован для выявления в образце искомых аналитов, которые могут включать антигены, антитела, гаптены, гормоны, токсины, микроорганизмы, вирусы и т.п.Способ включает инкубирование в течение первого инкубационного периода первой смеси, содержащей тестируемый образец, исследуемый на содержание по крайней мере одного искомого аналита, первый специфический связывающий партнер, который связывается по крайней мере с одним искомым аналитом, второй специфический связывающий партнер, меченый первой детектируемой меткой, при этом при инкубировании образуется комплекс первый специфический связывающий-партнер аналит-второй специфический связывающий партнер. После инкубирования удаляют из первой смеси любым известным способом не связавшийся аналит.К первой смеси добавляют третий специфический связывающий партнер, меченый второй детектируемой меткой, в количестве, достаточном для уменьшения хук-эффекта при проведении иммуноанализа, инкубируют вторую смесь в течение второго инкубационного периода и детектируют сигнал первого специфического комплекса. При этом количество комплекса первый специфический связывающий партнер-аналит-втрой специфический связывающий партнер в исследуемом образце определяют либо путем сравнения со стандартной кривой для аналита, либо со стандартом, а количество аналита определяют путем измерения второй детектируемой метки во втором комплексе. В качестве детектируемых меток могут быть использованы флуоресцентные, хемилюминесцентные и другие метки, первая и вторая метки могут быть одинаковыми или разными, первый и второй специфические связывающие партнеры иммобилизованы на твердой фазе, в качестве которой могут быть использованы частицы, тест-трубки, микротитровальные платы, мембраны, чипы, диски и т.п.

Недостатком способа является ограниченность динамического диапазона в области малых концентраций аналита.

Задачей является создание способа для измерения концентрации аналитов в широком диапазоне концентраций

Техническим результатом при использовании изобретения является увеличение соотношения сигнал/шум как для области низких концентраций, так и для области высоких концентраций аналита, что приводит к увеличению точности определения концентраций аналитов.

Технический результат достигается предлагаемым изобретением. Сущность изобретения заключается в том, что в способе детектирования концентрации аналита с широким динамическим диапазоном, включающем получение первого специфического комплекса путем инкубирования первой смеси, содержащей первый специфический связывающий компонент, иммобилизованный на твердом носителе, исследуемый образец по крайней мере с одним искомым аналитом и второй специфический связывающий компонент, меченый первой детектируемой меткой, удаление не связавшегося аналита, добавление к первой смеси третьего специфического связывающего компонента, меченого второй детектируемой меткой, инкубирование второй смеси для получения второго специфического комплекса, удаление не связавшихся компонентов реакции, детектирование сигналов от меток, связанных с комплексами, и определение концентрации аналита путем сравнения измеренных сигналов с калибровочной кривой, для каждого искомого аналита иммобилизуют на твердом носителе на первой микрозоне первый специфический связывающий компонент с высокой аффинностью к искомому аналиту, а на второй микрозоне первый специфический связывающий компонент с низкой аффинностью к аналиту, второй специфический связывающий компонент с высокой аффинностью к искомому аналиту вносят на твердый носитель одновременно с исследуемым образцом, третий специфический связывающий компонент имеет низкую аффинность к искомому анлиту, при этом второй и третий специфические связывающие компоненты имеют идентичную эпитопную специфичность, после нанесения первых специфических связывающих компонентов на твердый носитель " его обрабатывают блокирующим раствором для исключения неспецифического связывания микрозон с другими компонентами реакции, после первой операции инкубирования удаляют не связавшиеся первые специфические компоненты и избыток блокирующего раствора, после второй операции инкубирования и удаления не связавшихся компонентов твердый носитель промывают буферным раствором, затем дистиллированной водой и регистрируют сигналы от каждой метки в каждой микрозоне.

Технический результат достигается тем, что второй специфический связывающий компонент вносят на твердый носитель в количестве, эквимолярном количеству первых специфических связывающих компонентов с высокой аффинностью к аналиту.

Технический результат достигается также тем, что первый специфический связывающий компонент вносят в количестве 10-50 нл с концентрацией 30-100 мкг/мл.

Технический результат достигается также тем, что в качестве первого специфического связывающего компонента используют антитела.

Технический результат достигается также и тем, что третий специфический связывающий компонент вносят на твердый носитель в количестве в молярном отношении в 50-100 раз больше, чем количество первых специфических связывающих компонентов.

Технический результат достигается и тем, что в качестве детектируемых меток используют платинакопропорфирин и бета-дикетонатные комплексы ионов европия.

Авторам не известно техническое решение, обладающее такой же совокупностью признаков, как предлагаемое изобретение. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует критерию новизны.

Известен способ измерения аналита с расширенным динамическим диапазоном измерения (заявка США, №2011/0195853, класс НКИ 506/09). В способе создают микроряды, например, в лунках микротитровальных плат для определения взятых из внешней среды образцов с искомыми аналитами. Ряды создаются в виде тест-сайтов, или микрозон, на которых иммобилизуют первые специфические связывающие компоненты с различной афиностью к искомому аналиту, строят калибровочные кривые для известных значений аналита, строят двойную (суммарную) калибровочную кривую, по которой определяют значение концентрации аналита в соответствии с измеренными значениями сигналов детектируемых меток. Однако при исследовании образцов с очень широким диапазоном концентраций искомого аналита может возникнуть ситуация, когда при динамическом диапазоне измерения, описанном в данном способе, не может быть измерена либо очень низкая концентрация аналита из-за недостаточной чувствительности "способа, либо высокая концентрация аналита из-за недостаточной информативности двойной кривой в зоне насыщения. Известен способ контроля чувствительности и динамического диапазона при гомогенных исследованиях (заявка США, №2009/0258373, класс НКИ 435/7.1). В способе используют две реагентных пары специфических связывающих компонентов, в которых второй и четвертый специфические связывающие компоненты мечены различными детектируемыми метками, при этом аффинность к аналиту первой пары специфических связывающих компонентов по крайней мере на порядок выше, чем у второй пары компонентов. В способе не удается полностью исключить влияние хук-эффекта на точность измерений, так как вторые специфические связывающие компоненты вносятся на твердый носитель одновременно с образцом с искомым аналитом и при избытке аналита удаляются из реакционной смеси. В предлагаемом способе использование двух микрозон с иммобилизованными первыми специфическим связывающими компонентами с различной аффинностью к аналиту, использование второго специфического связывающего компонента, меченого первой детектируемой меткой, и третьего специфического связывающего компонента, меченого второй детектируемой меткой и имеющего низкую аффинность к аналиту и близкую эпитопную специфичность со вторым специфическим связывающим компонентом, в совокупности с другими признаками технического решения позволяют расширить динамический диапазон как в сторону малых, так и в сторону больших концентраций аналита, повышает чувствительность и точность измерений. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует критерию уровня техники.

Способ может найти использование в микробиологии, биохимии, иммунологии, а также в здравоохранении при проведении клинических исследований образцов биологических жидкостей, взятых у пациентов для выявления различных заболеваний. Способ позволяет определять маркеры различных заболеваний, лекарства, гормоны, антигены и антитела. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует критерию промышленной применимости.

На фиг.1 показано размещение на твердом полимерном носителе первой микрозоны 1, содержащей первые специфические связывающие компоненты 2 с высокой аффинностью к аналиту, и второй микрозоны 3, содержащей первые специфические связывающие компоненты 4 с низкой аффинностью к аналиту, и схема формирования специфических комплексов между первьми специфическими связывающими компонентами 2 с высокой аффинностью к аналиту 5, первыми специфическими связывающими компонентами 4 с низкой аффинностью к аналиту 5, вторыми специфическими связывающими компонентами 6, конъюгированными с фосфоресцентной "меткой - платинакопропорфирином, аналитом 5, и третьими специфическими.связывающими компонентами 7, конъюгированными с фосфоресцентной меткой -бета-дикетонатными комплексами ионов европия на основе карбазола при проведении анализа при количестве аналита ниже, чем количество первых специфических связывающих компонентов с высокой аффинностью.

На фиг.2 показано распределение комплексов на твердой фазе в первой 1 и второй 3 микрозонах и схема формирования специфических комплексов между первыми 2, и 4, вторыми 6 и третьими специфическими связывающими компонентами 7 и аналитом 5 при проведении анализа при количестве аналита в пробе большем, чем количество первых связывающих компонентов с высокой аффинностью.

На фиг.3 показан калибровочный график зависимости уровня сигнала фосфоресценции от концентрации тиреотропного гормона (ТТГ) в пробе для микрозоны 1 с иммобилизованными на ней первыми специфическими связывающими компонентами 2 с высокой аффинностью к аналиту: кривая 8 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции платинакопропорфирина, конъюгированного со вторыми специфическими связывающими компонентами 6; кривая 9 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции бета-дикетонатных комплексов ионов европия, конъюгированных с третьими специфическими связывающими компонентами 7; уровень сигнала 10 от пробы с низкой концентрацией гормона; уровень сигнала 11 от пробы с высокой концентрацией гормона.

На фиг.4 показан калибровочный график зависимости уровня сигнала фосфоресценции от концентрации тиреотропного гормона в пробе для микрозоны 3 с

иммобилизованными на ней первыми специфическими связывающими компонентами 4 с низкой аффинностью к аналиту: кривая 12 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции платинакопропорфирина, конъюгированного со вторыми специфическими связывающими компонентами 6; кривая 13 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции бета-дикетонатных комплексов ионов европия, конъюгированных с третьими специфическими связывающими компонентами 7; уровень сигналов 14 фосфоресцентных меток от исследуемой пробы с низкой концентрацией ТТГ; уровень сигнала 15 фосфоресцентных меток от пробы с высокой концентрацией ТТГ.

На фиг.5 показан калибровочный график зависимости уровня сигнала фосфоресценции от концентрации хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в пробе для микрозоны 1 с иммобилизованными на ней первыми специфическими связывающими компонентами 2 с высокой аффинностью к аналиту; кривая 16 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции платинакопропорфирина, конъюгированного со вторыми специфическими связывающими компонентами 6; кривая 17 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции бета-дикетонатных комплексов ионов европия, конъюгированных с третьими специфическими связывающими компонентами 7; уровень сигнала 18 от пробы с низкой концентрацией ХГЧ; уровень сигнала 19 от пробы с высокой концентрацией ХГЧ.

На фиг.6 показан калибровочный график зависимости уровня сигнала фосфоресценции от концентрации ХГЧ в пробе для микрозоны 3 с иммобилизованными на ней первьми специфическими связывающими компонентами 4 с низкой аффинностью к аналиту: кривая 20 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции платинакопропорфирина, конъюгированного со вторыми специфическими связывающими компонентами 6; кривая 21 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции бета-дикетонатных комплексов ионов европия, конъюгированных с третьими специфическими связывающими компонентами 7; уровень сигнала 22 от пробы с низкой концентрацией гормона ХГЧ; уровень сигнала 23 от пробы с высокой концентрацией гормона ХГЧ.

На фиг.7 показан калибровочный график зависимости уровня сигнала фосфоресценции от концентрации альфафетопротеина (АФП) в пробе для микрозоны 1 с иммобилизованными на ней первыми специфическими связывающими компонентами 6 с высокой аффинностью к аналиту: кривая 24 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции платинакопропорфирина, конъюгированного со вторыми специфическими компонентами 6; кривая 25 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции бета-дикетонатных комплексов ионов европия, конъюгированных с третьими специфическими связывающими компонентами 7; уровень сигнала 26 от пробы с низкой концентрацией АФП; уровень сигнала 27 от пробы с высокой концентрацией АФП.

На фиг.8 показан калибровочный график зависимости уровня сигнала фосфоресценции от концентрации альфафетопротеина в пробе для микрозоны 3 с

иммобилизованными на ней первьми специфическими связывающими компонентами 4 с низкой аффинностью к аналиту: кривая 28 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции платинакопропорфирина, конъюгированного со вторыми специфическими компонентами 6; кривая 29 - зависимость уровня сигнала фосфоресценции бета-дикетонатных комплексов ионов европия, конъюгированных с третьими специфическими связывающими компонентами 7; уровень сигнала 30 фосфоресцентной метки от пробы с низкой концентрацией АФП; уровень сигнала 31 фосфоресцентной метки от пробы с высокой концентрацией АФП.

Способ осуществляется следующим образом. Для осуществления способа используют по крайней мере три специфических связывающих компонента, в качестве которых могут быть использованы антитела, обладающие высокой или низкой аффинностью к аналиту. При этом высокая аффинность имеет константу связывания с аналитом менее 10^-10 M, а низкая аффинность -более 10"⁸ М„ В качестве твердого носителя при проведении исследований используют 96-луночные полистироловые микропланшеты фирмы Labsystems, кат.№95029140, при этом сорбционная емкость полистирола, как правило, составляет 2-3 нг иммуноглобулина на мм². В качестве детектируемых меток используют платинакопропорфирин и бета-дикетонатные комплексы ионов европия, сигналы фосфоресценции которых регистрируют в стробоскопическом режиме с временным разрешением люминесценции на сканирующем флуориметре ИФИ-03 "Диагем' (производство ЗАО "ИММУНОСКРИН). При возбуждении на длине волны 375 нм фосфоресценцию платинакопропорфирина регистрируют на длине волны 645 нм с задержкой 20 мкс и длительностью строба 100 мкс, фосфоресценцию бета-дикетонатных комплексов ионов европия регистрируют на длине волны 615 нм с задержкой 300 мкс и длительностью строба 400 мкс.

При осуществлении способа на поверхности твердого носителя иммобилизуют первые специфические связывающие компоненты в виде двух отдельных микрозон: в первой микрозоне иммобилизуют первый специфический связывающий компонент 2 с высокой аффинностью к аналиту, во второй микрозоне иммобилизуют первый специфический связывающий компонент 4 с низкой аффинностью к аналиту. Микрозоны наносят в виде капель объемом 5-50 мкл, при этом диаметр формируемых микрозон предпочтительно равен 0,2-0,7 мм. В каждую микрозону наносят первые специфические связывающие компоненты с высокой или низкой аффинностью в количестве 2-3 нг, что соответствует или незначительно превышает максимальную сорбционную емкость твердого носителя для микрозон заданной площади. Для снижения уровня неспецифической абсорбции компонентов пробы твердый носитель с нанесенными в виде микрозон первыми специфическими связывающими компонентами обрабатывают блокирующим раствором, в качестве которого может быть использован белок в количестве заведомо большем, чем сорбционная емкость твердого носителя, а после инкубирования промывают буферным раствором для удаления избытка блокирующего раствора.

На подготовленный таким образом твердый носитель вносят одновременно анализируемый образец, содержащий искомый аналит, и второй специфический связывающий компонент 6, меченый первой детектируемой меткой - платинакопропорфирином, и имеющий высокую аффинность к аналиту. В качестве "второго специфического связывающего компонента 6 могут быть использованы „конъюгаты специфических антител с детектируемой меткой, которые вносят в реакционную смесь в количестве, эквимолярном (эквивалентном) количеству первых специфических связывающих компонентов с высокой аффинностью. Первую реакционную смесь инкубируют в течение 30-60 минут для образования специфических комплексов первый специфический связывающий компонент-аналит-второй специфический связывающий компонент, меченый первой детектируемой меткой. После инкубирования первую смесь реагентов отмывают для удаления не связавшихся компонентов и добавляют в смесь третий специфический связывающий компонент 7, имеющий низкую аффинность к аналиту, близкую эпитопную специфичность со вторым специфическим связывающим компонентом 6 и меченый второй детектируемой меткой, качестве которой используют бета-дикетонатные комплексы ионов европия. Третий специфический связывающий компонент 7 вносят в количестве, превышающем количество первых специфических связывающих компонентов 2 с высокой аффинностью в 50-100 раз. Вторую реакционную смесь инкубируют в течение 10-15 минут для образования второго специфического комплекса первый специфический связывающий компонент-аналит-третий специфический связывающий компонент, твердый носитель промывают буфером, затем дистиллированной водой и высушивают.Регистрируют сигналы фосфоресценции обеих меток, связанных со специфическими комплексами, и определяют концентрацию искомого аналита путем сравнения измеренных значений сигналов от меток в микрозонах со значениями, определяемыми по калибровочным (стандартным) кривьм. Для построения калибровочных кривых способ осуществляют так же, как описано выше, с использованием аналита при заранее выбранных известных концентрациях в образце. Конъюгат специфических антител с фосфоресцентной меткой -платинакопропорфирином, предварительно получают по известной схеме, описанной ранее ((De Haas R.R. et.al., J.Histochem.&Cytochem. 1997 45 1279-1292). Конъюгат специфических антител с фосфоресцентной меткой - хелатом ионов европия, получают связыванием метилового эфира карбазола с антителами по схеме изложенной Кострюковой Т.С.с соавторами в Журнале органической химии, т.82, №3, 'Синтез и люминесцентно-спектральные свойства фторированных бензогетероциклических бета-дикетонов и их комплексов с европием',

Наличие двух микрозон с различной аффинностью первых специфических связывающих компонентов, а также наличие вторых и третьих специфических связывающих компонентов близкой эпитопной специфичности позволяет выявлять как очень низкие, так и высокие концентрации аналита в образце, превосходящие уровень концентраций первых специфических связывающих компонентов с высокой аффинностью к аналиту, иммобилизованных на твердом носителе и обеспечивает дополнительное расширение динамического диапазона в область высоких концентраций аналита. При этом сохраняется высокая чувствительность анализа благодаря тому, что при малом количестве аналита в пробе происходит его концентрированно в первой микрозоне.

Повышение чувствительности способа при определении низких концентраций аналита происходит за счет того, что аналит концентрируется на малой площади микрозоны 1 с первым специфическим связывающим компонентом 2 с высокой аффинностью к аналиту, чем обеспечивается превышение полезного сигнала над уровнем фоновой люминесценции твердого носителя. Расширение динамического диапазона измерений в сторону высоких концентраций аналита достигается за счет второй микрозоны 3 с иммобилизованными первыми специфическими связывающими компонентами 6 с низкой аффинностью к аналиту и за счет использования третьего специфического связывающего компонента 7, имеющего низкую аффинность к аналиту и близкую эпитопную специфичность со вторым специфическим связывающим компонентом 4. Третий специфический связывающий компонент не имеет возможности связывания с аналитом в первом специфическом комплексе, так как он не может вытеснить из первого комплекса вторые специфические связывающие компоненты 6, поэтому сигнал фосфоресценции, обусловленный второй детектируемой меткой, отражает концентрационную зависимость в области высоких концентраций аналита.

На фиг.1 показана схема формирования специфических комплексов между первыми, вторыми и третьими специфическими связывающими компонентами при количестве аналита в пробе существенно меньшем, чем количество первых специфических связывающих компонентов. При низкой концентрации искомого аналита 5, после проведения всех стадий иммуноанализа первая микрозона 1 содержит комплексы, включающие первые специфические связывающие компоненты 2-аналит 5-вторые специфические ввязывающие компоненты 6, которые занимают лишь часть поверхности микрозоны 1. Вторые специфические связывающие компоненты 6 представлены в виде конъюгата с первой фосфоресцентной меткой - платинакопропорфирином. При этом и в первой 1 и во второй 3 микрозонах сигналы от третьих специфических связывающих компонентов 7 практически отсутствуют, так как нет аналита, доступного для связывания с ним.

На фиг.2 показана схема формирования специфических комплексов между первыми, вторыми и третьими специфическими связывающими компонентами при количестве аналита в пробе существенно большем, чем количество первых связывающих компонентов с высокой аффинностью к аналиту, и распределение комплексов на твердой фазе в первой 1 и второй 3 микрозонах. Третьи специфические связывающие компоненты 7 представлены в виде конъюгата со второй фосфоресцентной меткой-бета-дикетонатным комплексом ионов европия.

В первой микрозоне 1 первые специфические связывающие компоненты 2 полностью связаны с аналитом 5 и в большей части связаны с третьими специфическими связывающими компонентами 7, чем со вторыми 6, которые связываются в объеме пробы с избытком аналита и вымываются на этапе промывки.

Во второй микрозоне 3 основной сигнал обусловлен третьими специфическими связывающими компонентами 7, количество которых в составе комплексов с аналитом и первыми связывающими компонентами прямо пропорционально концентрации аналита. Благодаря тому, что вторые 6 и третьи 7 специфические связывающие компоненты имеют близкую эпитопную специфичность, но значительно различаются по аффинности, уровень сигнала от третьих специфических компонентов 7 почти линейно увеличивается с увеличением количества аналита в пробе для области их высоких концентраций. При этом регистрация аналита в пробе возможна для высоких концентраций аналита, многократно превышающих сорбционную емкость первых специфических связывающих компонентов. Пример 1. Количественное определение тиреотропного гормона в сыворотке крови. На поверхность дна лунки микропланшета наносят с помощью наноплотера или другого известного устройства две отдельные микрозоны из мышиных моноклональных антител с высокой (константа связывания 2 10^-11 М) и низкой (константа связывания 2^{10- 8}М) аффинностью к гормону в виде микрокапель по 20 нл в концентрации 0,05 мг/мл. Для эксперимента используют антитела производства компании ООO ”Хема”, специфичные к суб-единице тиреотропного гормона. Для снижения вариабельности результатов исследования на дне лунки микропланшета формируют по три микрозоны с антителами с высокой аффинностью к аналиту и по три микрозоны с антителами с низкой аффинностью к аналиту. Микропланшет инкубируют в течение 18 часов при температуре 4°С, промывают и обрабатывают блокирующим раствором 15 мМ фосфатного буфера, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), в течение часа при комнатной температуре, затем блокирующий раствор удаляют и планшет высушивают.Приготовленный таким образом микропланшет используют для определения гормона в образце и для построения калибровочных кривых.

Для построения калибровочных кривых готовят калибраторы из очищенной от гормонов сыворотки, полученной из цельной крови доноров, путем добавления к сыворотке соответствующих количеств тиреотропного гормона и нанесения полученных растворов в виде проб по 100 мкл. Калибраторы содержат тиреотропный гормон в концентрации: 0, 0,01,0,05,0,25,1,25,10, 50,250 мкМЕ/мл.

Калибровочные пробы и исследуемые образцы крови в объеме 50 мкл помещают в разные лунки микропланшета, добавляют 50 мкл раствора специфических антител к тиреотропному гормону с высокой аффинностью, конъюгированных с фосфоресцентной меткой-платинакопропорфирином, в концентрации 5 нг/мл в реакционном 15 мМ трис-буфере, рН 7,75, содержащем 0,05% твин 20, 5% БСА (все реагенты SIGMA, США). Микропланшет инкубируют при встряхивании при температуре 18-25°С в течение 120 минут при комнатной температуре. После инкубирования лунки промывают буферным раствором и вносят третий специфический связывающий компонент в количестве 50 мкл (250 нг/мл конъюгата) специфических антител к тиреотропному гормону с фосфоресцентной меткой-бета-дикетонатным комплексом ионов европия. Инкубируют в течение 15 минут и затем промывают буферным раствором и дистиллированной водой, дно лунок высушивают под струей воздуха.

Проводят измерение сигналов фосфоресценции на приборе ИФИ-03 «Диагем» производства ЗАО «ИММУНОСКРИН как в лунках с известным содержанием гормона (калибровочные пробы), так и в исследуемых пробах. Регистрацию сигналов осуществляют, как описано выше.

Полученные сигналы от исследуемых образцов проб сравнивают с сигналами, полученными от калибровочных проб, которые представлены в виде калибровочных кривых, связывающих уровень сигнала фосфоресценции каждой из метки в каждой из микрозон. Из представленных на фиг.3 и фиг 4 данных, кривые 8 и 12 для платинапорфирина, а кривые 9 и 13 для бета-дикетонатных комплексов ионов европия, следует, что сигналы фосфоресценции для исследуемых проб могут быть определены по соотношению сигналов фосфоресценции двух меток в каждой из микрозон. При этом, предлагаемый способ обеспечивает определение гормона как ультранизких концентрации-уровни 10 и 14, так и высоких концентраций, уровни 11 и 15, полностью охватывая весь клинически значимый диапазон. Наличие четырех значений для каждой определяемой концентрации аналита повышает точность анализа.

Пример 2. Количественное определение хорионического гонадотропина в сыворотке крови.

На поверхности дна лунки микропланшета формируют специфические дискретные микрозоны для выявления хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Для детектирования ХГЧ создают идентичные микрозоны диаметром 0,5 мм из мышиных моноклональных антител с высокой, константа связывания 2,5 10^-11M, и низкой, константа связывания 1,4 10^-8 М, аффинностью к ХГЧ. Используют антитела производства компании роо «Алкорбио» или ООО «Хема», специфичные к ХГЧ. Для формирования микрозон на дно каждой лунки 96-луночного полистиролового микропланшета с помощью прибора для печатания чипов микрокапли по 25 нл растворов соответствующих антител в концентрации 0,05 мг/мл. Микропланшет инкубируют в течение 18 часов при 4°С, промывают и обрабатывают блокирующим раствором 15 мМ фосфатного буфера, содержащего 1% БСА, в течение 1 часа при комнатной температуре, удаляют блокирующий раствор и высушивают планшет.

Для построения калибровочных кривых готовят калибраторы из очищенной от ХГЧ сыворотки цельной крови доноров путем добавления к сыворотке соответствующих количеств ХГЧ и нанесения полученных растворов в виде проб по 100 мкл. Калибраторы содержат ХГЧ в концентрации 0,2,5,10, 50,250,500,2000,20000 мМЕ/мл.

Калибровочные пробы и исследуемые образцы крови в объеме 50 мкл помещают на дно разных лунок микропланшета, добавляют 50 мкл раствора специфических антител к ХГЧ с высокой аффинностью, константой связывания 3,5 10^10-11М, конъюгированных с фосфоресцентной - меткой платинакопропорфирином, в концентрации 5 нг/мл в реакционном 15 мМ трис-буфере, рН 7,75, содержащем 0,05% твин 20, 5% БСА (все реагенты фирмы SIGMA, США). Конъюгат специфических антител с фосфоресцентной меткой - платинакопропорфирином получают по известной схеме, описанной ранее. Микропланшет инкубируют при встряхивании при температуре 18-25°С в течение 20 минут и 18 часов при температуре 2-8°С. После инкубирования лунки промывают буферным раствором и вносят третий специфический связывающий компонент в количестве 50 мкл (250 нг/мл конъюгата) специфических антител к ХГЧ с фосфоресцентной меткой-бета-дикетонатным комплексом ионов европия, инкубируют в течение 15 минут и затем промывают буферным раствором и дистиллированной водой. Дно лунок высушивают под струей воздуха.

Проводят измерение сигналов фосфоресценции на приборе ИФИ-03 «Диагем» производства ЗАО «ИММУНОСКРИН как в лунках с известным содержанием гормона (калибровочные пробы), так и в исследуемых пробах. Регистрацию сигналов осуществляют, как описано выше.

Из представленных на фиг.5 и фиг.6 данных, кривые 16 и 20 для платинапорфирина, а кривые 17 и 21 для хелатов ионов европия, следует, что для количественного определения ХГЧ в области низких концентраций значимыми являются сигналы от конъюгатов вторых специфических компонентов с высокой аффинностью, меченых первой фосфоресцентной меткой. При этом, предлагаемый способ обеспечивает определение гормона как ультранизких концентрации-уровни 18 и 22, так и высоких Концентраций, уровни 19 и 23, полностью охватывая весь клинически значимый диапазон. Наличие четырех значений для каждой определяемой концентрации аналита повышает точность анализа.

Низкие уровни сигналов от конъюгатов вторых специфических связывающих компонентов с высокой аффинностью к аналиту подтверждают отсутствие высоких концентраций аналита в пробе. Для количественного определения высоких концентраций гормона в пробе значимыми являются сигналы от третьих специфических связывающих компонентов с низкой аффинностью, меченых второй фосфоресцентной меткой. Низкие уровни сигналов первой фосфоресцентной метки от конъюгатов вторых специфических связывающих компонентов с высокой аффинностью к аналиту указывают на то, что они связываются с избыточным по отношению к первым специфическим связывающим компонентам свободным гормоном в объеме пробы и удаляются на стадии промывки.

Способ обеспечивает охват всего клинически значимого диапазона значений ХГЧ (1-210⁵ мМЕ/мл) при использовании в существенно более низкой концентрации первых специфических связывающих компонентов. При этом наличие второй микрозоны с низкой аффинностью к аналиту первых специфических связывающих компонентов и введение в реакционную смесь третьих специфических связывающих компонентов после удаления гормона, избыточного по отношению к емкости микрозон с первыми связывающими компонентами, обеспечивает более крутой характер кривой 17 изменения уровня сигнала при увеличении концентрации гормона в пробе, что, соответственно, расширяет диапазон измерения и увеличивает точность детектирования гормона в области высоких концентраций.

Пример 3. Количественное определение альфафетопротеина в сыворотке крови. На поверхности дна лунки микропланшета формируют специфические дискретные микрообласти для выявления альфафетопротеина (АФП). Для детектирования АФП создают идентичные микрообласти диаметром 0,5 мм из мышиных моноклональных антител с высокой, константа связывания 1,5 10^-11M, и низкой, константа связывания 1,7 10^-8М, аффинностью к АФП. Используют антитела производства компании ООО «Алкорбио» или ООО «Хема», специфичные к АФП. Для формирования микрозон на дно каждой лунки 96-луночного полистиролового микропланшета с помощью прибора для печатания чипов наносят микрокапли по 25 нл растворов соответствующих антител в концентрации 0,05 мг/мл. Микропланшет инкубируют в течение 18 часов при 4°С, промывают и обрабатывают блокирующим раствором 15 мМ фосфатного буфера, содержащего 1% БСА, в течение 1 часа при комнатной температуре, удаляют блокирующий раствор и высушивают микропланшет.

Для построения калибровочных кривых готовят калибраторы из очищенной от АФП сыворотки крови доноров путем добавления соответствующих количеств АФП и нанесения полученных растворов в виде проб по 100 мкл. Калибраторы содержат АФП в концентрации: 0, 0,25, 1,25, 10, 50, 250, 500, 2000 МЕ/л.

Калибровочные пробы и исследуемые образцы крови в объеме 50 мкл помещают в разные лунки микропланшета, добавляют 50 мкл раствора специфических антител к АФП с высокой аффинностью, константой связывания 3 lO^'M, конъюгированных с фосфоресцентной меткой - платинакопропорфирином, в концентрации 5 нг/мл в реакционном 15 мМ трио-буфере, рН 7,75, содержащем 0,05% твин 20, 5% БСА (все реагенты фирмы SIGMA, США). Микропланшет инкубируют при встряхивании при температуре 18-25°С в течение 20 минут и 18 часов при температуре 2-8°С. После инкубирования лунки промывают буферным раствором и вносят третий специфический связывающий компонент в количестве 50 мкл (250 нг/мл конъюгата) специфических антител к АФП с фосфоресцентной меткой - хелатом ионов европия, инкубируют в течение 15 минут и затем промывают буферным раствором и дистиллированной водой. Дно лунок высушивают под струей воздуха.

Проводят измерение сигналов фосфоресценции на приборе ИФИ-03 «Диагем» производства ЗАО «ИММУНОСКРИН как в лунках с известным содержанием гормона (калибровочные пробы), так и в исследуемых пробах. Регистрацию сигналов осуществляют, как описано выше.

Полученные сигналы от исследуемых образцов проб сравнивают с сигналами, полученными от калибровочных проб, которые представлены в виде калибровочных кривых, связывающих уровень сигнала фосфоресценции каждой из метки в каждой из микрозон. Из представленных на фиг.7 и фиг.8 данных, кривые 24 и 28 для платинапорфирина и кривые 25 и 29 для хелатов ионов европия, построенных для микрозон, сформированных из антител с высокой и низкой аффинностью, следует, что сигналы фосфоресценции для исследуемых проб могут быть определены по соотношению сигналов фосфоресценции двух меток в каждой из микрозон. При этом, предлагаемый способ обеспечивает определение АФП как ультранизких концентрации-уровни 26 и 30, так и высоких концентраций, уровни 27 и 31, полностью охватывая весь клинически значимый диапазон. Наличие четырех значений для каждой определяемой концентрации аналита повышает точность анализа.

Изобретение относится к способам иммуноанализа для детектирования или количественного измерения искомых аналитов в образцах и может быть использовано в лабораторной и клинической практике для детектирования антител, протеинов, гормонов, лекарственных форм в биологических образцах в широком диапазоне концентраций. Сущность способа заключается в том, что для каждого искомого аналита иммобилизуют на твердом носителе на первой микрозоне первый специфический связывающий компонент с высокой аффинностью к искомому аналиту, на второй микрозоне иммобилизуют первый специфический связывающий компонент с низкой аффинностью к искомому аналиту, на микрозоны одновременно вносят аналит и второй специфический связывающий компонент, меченый первой детектируемой меткой и имеющий высокую аффинность к аналиту, первую смесь инкубируют и получают первый специфический комплекс, меченый первой детектируемой меткой, к первой смеси добавляют третий специфический связывающий компонент, меченый второй детектируемой меткой и имеющий низкую аффинность к искомому аналиту, при этом второй и третий специфические связывающие компоненты имеют идентичную эпитопную специфичность, затем инкубируют вторую смесь и получают второй специфический комплекс, меченый второй детектируемой меткой, удаляют не связавшиеся компоненты реакции и детектируют сигналы меток, связанных с первым и вторым специфическими комплексами в первой и второй микрозонах, концентрацию аналита определяют путем сравнения измеренных сигналов с калибровочной кривой, построенной для известных значений концентрации аналита. Использование способа позволяет повысить точность определения концентраций аналитов. 5 з. п.ф., 3 пр., 8 ил.

1. Способ детектирования концентрации аналита с широким динамическим диапазоном, включающий получение первого специфического комплекса путем инкубирования первой смеси, содержащей первый специфический связывающий компонент, иммобилизованный на твердом носителе, исследуемый образец по крайней мере с одним искомым аналитом и второй специфический связывающий компонент, меченый первой детектируемой меткой, удаление не связавшегося аналита, добавление к первой смеси третьего специфического связывающего компонента, меченого второй детектируемой меткой, инкубирование второй смеси для получения второго специфического комплекса, удаление не связавшихся компонентов реакции, детектирование сигналов от меток, связанных с комплексами, и определение концентрации аналита путем сравнения измеренных сигналов с калибровочной кривой, отличающийся тем, что для каждого искомого аналита иммобилизуют на твердом носителе на первой микрозоне первый специфический связывающий компонент с высокой афинностью к искомому аналиту, а на второй микрозоне первый специфический связывающий компонент с низкой афинностью к аналиту, второй специфический связывающий компонент с высокой афинностю к искомому аналиту вносят на твердый носитель одновременно с исследуемым образцом, третий специфический связывающий компонент имеет низкую афинность к искомому аналиту, при этом второй и третий специфические связывающие компоненты имеют идентичную эпитопную специфичность, после нанесения первых специфических связывающих компонентов на твердый носитель его обрабатывают блокирующим раствором для исключения неспецифического связывания микрозон с другими компонентами реакции, после первой операции инкубирования удаляют не связавшиеся первые специфические компоненты и избыток блокирующего раствора, после второй операции инкубирования и удаления не связавшихся компонентов твердый носитель промывают буферным раствором, затем дистиллированной водой и регистрируют сигналы от каждой метки в каждой микрозоне.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что второй специфический связывающий компонент вносят на твердый носитель в количестве, эквимолярном количеству первых специфических связывающих компонентов с высокой аффинностью к аналиту.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что первый специфический связывающий компонент вносят в количестве 10-50 нл с концентрацией 30-100 мкг/мл.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве первого специфического связывающего компонента используют антитела.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что третий специфический связывающийся компонент вносят на твердый носитель в количестве в молярном отношении в 50-100 раз больше, чем количество первых специфических связывающих компонентов.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве детектируемых меток используют платинакопропорфирин и бета-дикетонатные комплексы ионов европия.