СПОСОБ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ГЕПАТИТА Российский патент 2014 года по МПК G09B23/28 A61K38/47 A61P1/16 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии и гепато-логии, и касается способа терапии гепатитов.

Для лечения заболеваний печени используется большое количество медикаментозных и немедикаментозных способов [1, 2].

Известен способ экспериментальной терапии хронического гепатита, вызванного введением тетрахлоруглерода с помощью двукратного или курсового введения иммобилизированной гиалуронидазы [3]. Данный способ является наиболее близким к заявляемому и выбран в качестве прототипа.

Недостатком способа прототипа является его недостаточная эффективность, относительно высокая ксенобиотическая нагрузка на организм и ограниченная хроническим течением патологического процесса и его токсической этиологией область применения.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности и безопасности способа, а также расширение показаний к его применению.

Поставленная задача достигается техническим решением, заключающимся в однократном пероральном введении лабораторным животным (крысы) иммобилизированной гиалуронидазы в дозе 25 ЕД/кг при моделировании вирусного гепатита с помощью D-галактозамина.

Новым в предлагаемом изобретении является однократное использование иммобилизированной гиалуронидазы в дозе 25 ЕД/кг при моделировании гепатита.

Заболевания печени и желчевыводящих путей являются весьма распространенными во всем мире и занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость данной патологии печени определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов фармакологической терапии и профилактики данных заболеваний [1, 2]. При этом в последнее время активно ведутся исследования, направленные на разработку средств для лечения различных заболеваний, в том числе заболеваний печени, путем фармакологической стимуляции эндогенных стволовых клеток (СК) организма [4, 5]. На модели хронического гепатита, вызванного курсовым введением тетрахлоруглерода, показано наличие гепатопротекторных свойств у иммобилизированной гиалуронидазы [3], определяемых ее стимулирующим действием на стволовые клетки печени и ткани-депо. При этом оптимальный технический результат достигается лишь при курсовом введении данного средства в дозах 25-50 ЕД/кг, безусловно, сопровождающемся значительной ксенобиотической нагрузкой на организм [6], и исключительно после моделирования патологии печени. Кроме того, до настоящего времени не существует данных о наличии гепатопротекторных эффектов у иммобилизированной гиалуронидазы на других моделях патологии печени, в том числе заболеваниях вирусной этиологии.

Факт однократного применения иммобилизированной гиалуронидазы перед моделированием или одновременно с началом моделирования вирусного гепатита с помощью D-галактозамина для достижения выраженных терапевтических эффектов для специалиста является неочевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют осуществлять эффективную терапию острого экспериментального поражения печени, моделирующего заболевание вирусной этиологии, и предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Лабораторному животному (крысе) перед моделированием либо одновременно с началом моделирования вирусного гепатита с помощью D-галактозамина однократно перорально вводят иммобилизированную гиалуронидазу в дозе 25 ЕД/кг.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на беспородных крысах в количестве 46 штук, массой 250-300 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется). Для моделирования острого гепатита использовали D-галактозамин в водном растворе (Галактозамин гидрохлорид, Applichem, кат.№А6859). который вызывает острый гепатит, идентичный по морфологическим и биохимическим изменениям в печени вирусному гепатиту человека. Для этого крысам вводили D-галактозамин в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно в течение 3 дней [7].

У крыс: рассчитывали весовой коэффициент печени (отношение массы органа к массе животного), показатель, определяемый для интегральной оценки наличия гепатотропного влияния ксенобиотиков; проводили биохимические исследования содержания в сыворотки крови аспартат-, аланин-аминотрасфераз (АсАТ, АлАТ), биллирубина, активность щелочной фосфатазы (ЩФ); и морфологическое исследование печени [7]. Активность ферментов сыворотки крови определяли по общепринятым методам, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы Cormay и стандартные наборы фирм Cormay и «Витал Диагностик» (г.Санкт-Петербург). Кровь для исследования получали через катетер, имплантированный в бедренную артерию с последующей перевязкой сосудов. На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали количество гепатоцитов в состоянии некроза и фигур митозов на 1000 печеночных клеток. С помощью окулярной сетки Г.Г. Автандилова определяли относительную площадь инфильтрации печеночной паренхимы макрофагами и лейкоцитами и относительную площадь коллагеновых волокон. Для выявления РНК препараты печени окрашивали галлоцианином по Эйнарсону. Гликоген выявляли с помощью Шифф-йодной реакции по J. Mc.Manus. Количественное определение содержания в клетке указанных веществ проводили на сканирующем цитофотометре UNIVAR ("REICHERT-JUNG", Австрия) при длине волны 500 нм, фильтре №42, зондах диаметром 2 (РНК) и 3 (гликоген) мкм. У каждого животного измеряли содержание РНК и гликогена в 50 гепатоцитах. Для выявления липидов готовили криостатные срезы печени толщиной 10 мкм. Срезы фиксировали 4% кальций-формолом и окрашивали Суданом черным В. Степень жировой дистрофии оценивали в баллах [7]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Использовалась программа Statistica 6.0.

Пример 1.

В первый день эксперимента, обозначенный как «день 1», начинали вводить D-галактозамин, общий период наблюдения составлял 4 сут. Иммобилизированную гиалуронидазу (имГД) (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск), представляющую собой высокоочищенную тестикулярную бычью гиалуронат-эндо-P-N-ацетилгексозаминидазу, вводили перорально по трем схемам. Первая схема предполагала введение лекарственного средства по способу прототипу: в виде курсового двукратного введения на 1 и 2 дни после введения D-галактозамина в дозе 35 ЕД/кг (доза и режим введения были определены в предварительных экспериментах как максимально эффективные). Вторая схема предполагала однократное введение иммобилизированной гиалуронидазы после первого введения D-галактозамина в дозе 25 ЕД/кг. Третья схема предполагала введение имГД на нулевой день перед началом моделирования острого гепатита. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.

Группы животных:

1) Интактные животные. Группа 1.

2) Контрольные животные, введение D-галактозамина. Группа 2.

3) Группа с курсовым двукратным введением лекарственного средства на 1 и 2 дни после введения D-галактозамина. Группа 3.

4) Группа с однократным введением лекарственного средства в 1 день введения D-галактозамина. Группа 4.

5) Группа с предварительным введением лекарственного средства на 0 день перед введеним D-галактозамина. Группа 5.

При морфологическом исследовании печени крыс с острым поражением печени D-галактозамином, получавших дистиллированную воду, было обнаружено нарушение балочного строения. Преобладала гидропическая (белковая) дистрофия гепатоцитов. Встречалось большое количество гепатоцитов в состоянии апоптоза различной степени выраженности от деградации ДНК до образования «классических» телец Каунсильмена, которые у человека считаются непрямыми маркерами вирусного гепатита [Серов В.В., Лапиш К., 1989]. Портальная и внутридольковая строма была диффузно инфильтрирована лимфоцитами и макрофагами с примесью нейтрофильных лейкоцитов.

Со стороны морфометрических параметров в группе 3 не выявлялось значимых отличий с группой острого гепатита, вызванного введением D-галактозамина (табл.1). В то же время в группах 4 и 5 отмечалось снижение количества апоптозных гепатоцитов, что сопровождалось снижением степени жировой инфильтрации печени в виде статистически не значимой тенденции.

Вместе с тем у крыс через 3 дня после начала введения D-галактозамином отмечалось повышение коэффициента массы печени. В сыворотке крови статистически значимо возрастала активность АлТ и АсТ, содержание билирубина, а также имелась тенденция к увеличению активности щелочной фосфатазы (табл.2). Необходимо отметить также у крыс этой группы увеличение времени тиопенталового сна, вероятно, в связи с ингибированием ферментных систем гепатоцитов, ответственных за антитоксическую функцию печени (табл.3).

При введении иммобилизированной гиалуронидазы на фоне острого D-галактозаминового гепатита весовой коэффициент печени в третьей группе животных превосходил соответствующий показатель первой группы (52,1±2,4 против 44,9±1,9), что было близко к соответствующему значению группы животных с гепатитом без фармакологической коррекции (57,9±1,8). В группах 4 и 5 изученный параметр не отличался от соответствующего значения группы «интактные животные» (группа 1). Наблюдалась также нормализация активности АлТ в группах 3, 4 и 5, АсТ - в группах 4 и 5. Время тиопенталового сна уменьшалось по сравнению с контролем (гепатит) в группе 4 и 5. В группах 3 данный показатель хоть и снижался по сравнению с контролем, но не достигал статистической значимости (табл.3).

Таким образом, иммобилизированная гиалуронидаза в условиях интоксикации D-галактозамином обладала максимально выраженным гепатопротекторным действием при ее однократном введении в самой низкой используемой дозе (25 ЕД/кг) после моделирования патологического процесса либо одновременно с началом моделирования гепатита.

Предлагаемый способ позволяет эффективно снижать тяжесть метаболических и морфологических нарушений печени при ее остром поражении, моделирующем вирусный гепатит, на фоне снижения ксенобиотической нагрузки на организм.

Цитируемая литература

1. Венгеровский А.И. Эффективность и механизм действия гепатопротекторов при экспериментальном токсическом повреждении печени: Дисс... доктора мед. наук. - Томск, 1991. - С.4-57.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т. 1. - М.: Медицина, 1996. - 624 с.

3. Патент (RU) на изобретение №2444569 «Гепатопротекторное средство» (опубл. 10.03.2012, Бюл. №7). Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Удут В.В.

4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.

5. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С.4-8.

6. Зборовский А.Б., Тюренков И.Н. Осложнения фармакотерапии. - М.: Медицина, 2003.-543 с.

7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева - 2-изд., перераб. и доп.- М., ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.

Таблица 1 Влияние иммобилизированной гиалуронидазы на морфометрические показатели печени крыс с острым поражением печени D-галактозамином, (X±m) Группа животных Степень жировой инфильтрации, баллы Количество апоптозных гепа-тоцитов, % Относительная площадь инфильтрации, % Митотический индекс, % РНК усл. ед. опт.плотн. Гликоген усл. ед. опт плотн 2 3,00±0,45 10,14±0,8* 9,00±0,71 0,20±0,04 0,16±0,01 0,21±0,01 3 2,44±0,17 10,06±0,75* 8,60±1,08 0,24±0,07 0,16±0,01 0,22±0,01 4 2,16±0,12 2,04±0,10# 8,60±0,51 0,38±0,08 0,16±0,01 0,22±0,01 5 2,08±0,10 3,76±0,10# 8,40±0,75 0,28±0,04 0,16±0,01 0,22±0,01

* - достоверность различий при сравнении с группой «интактные животные» (группа 1) при р<0,05.

# - достоверность различий при сравнении с группой 2 при р<0,05.

Таблица 2 Влияние иммобилизированной гиалуронидазы на биохимические показатели сыворотки крови крыс с острым поражением печени D-галактозамином, (X±m) Груп Весовой АсТ АлТ Коэффициент Щелочная Общий па коэффициент (мккат/л) (мккат/л) Де Ритиса фосфа- билирубин живот печени       таза (мкмоль/л) ных         (Е/Л)   1 44,9±1,9 0,51±0,02 0,52±0,02 0,99±0,04 136,8±16,0 4,50±1,06 2 57,9±1,8* 0,61±0,03* 0,72±0,04* 0,88±0,09 170,5±23,7 9,86±1,34* 3 52,1±2,4* 0,54±0,03 0,60±0,03 * 0,90±0,04 146,5±20,2 7,62±1,32 4 48,3±2,7 0,48±0,02# 0,51±0,04# 0,95±0,08 162,4±11,4 4,50±0,70 5 49,5±3,1 0,53±0,03# 0,57±0,03# 0,99±0,06 165,6±12,5 5,97±0,84

* - достоверность различий при сравнении с группой «интактные животные» (группа 1) при р<0,05.

# - достоверность различий при сравнении с группой 2 при р≤0,05.

Таблица 3 Влияние иммобилизированной гиалуронидазы на время тиопенталового сна крыс с острым поражением печени D-галактозамином
(мин, Х±ш) Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 44,50±1,34 57,90±3,68* 51,70±2,50* 49,00±1,46*# 51,60±1,93*#

* - достоверность различий при сравнении с группой «интактные животные» (группа 1) при р≤0,05.

# - достоверность различий при сравнении с группой 2 при р≤0,05.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии и гепатологии, и касается терапии гепатитов, изучаемой в эксперименте. Для этого у лабораторных животных (крыс) моделируют вирусный гепатит с помощью D-галактозамина. Лечение гепатита проводят путем однократного перорального введения иммобилизированной гиалуронидазы в дозе 25 ЕД/кг. Введение осуществляют перед моделированием, либо одновременно с началом моделирования. Способ позволяет эффективно снижать тяжесть метаболических и морфологических нарушений печени при моделировании гепатита, идентичного вирусному гепатиту у человека, на фоне снижения ксенобиотической нагрузки на организм. 1 пр., 3 табл.

Способ терапии острого гепатита, индуцированного в эксперименте введением D-галактозамина, путем однократного перорального введения животному иммобилизированной гиалуронидазы в дозе 25 ЕД/кг перед моделированием, либо одновременно с началом моделирования.