СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИСТЕМНОГО АМИЛОИДОЗА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике амилоидоза.

В настоящее время существует ряд способов диагностики амилодоза. Это гистологическое исследование биоптата пораженного органа в сочетании с гистохимическими окрасками и микрокопированием под поляризационным микроскопом [1]. Данный метод точен, но имеет ряд недостатков. Во-первых, это сложность получения образца исследуемой ткани. Во-вторых, это осложнения, присущие методу биопсии. Третий, и ключевой недостаток, это время исследования, которое занимает несколько суток.

Другой способ диагностики амилоидоза - функциональная проба с конго красным или метиленовым синим. Сущность пробы заключается в том, что введенный внутривенно краситель должен фиксироваться с патологическим белком (амилоидом) и не выводиться с мочой [1, 2]. Но красители обладают тропностью ко многим белкам, и именно это может быть причиной частых ложных результатов. Также возможно развитие токсических и аллергических реакций у больного, так как данные красители не совсем инертны к живым тканям. Большое отрицательное значение имеет психологический фактор, так как данная процедура воспринимается не всегда положительно пациентом.

Еще одним из способов диагностики является определение аминокислотной последовательности амилоидного белка иммуноферментным анализом [3]. Недостатком данного способа является вариабельность состава аминокислот у различных подвидов амилоидных белков, и при этом постоянно появляются разные по химическому составу разновидности патологических белков, что мешает диагностическому поиску. К существенным недостаткам относится необходимость сбора большого количества сывороток для заполнения стрипов при проведении анализа, что делает экономически нецелесообразным проведение единичных анализов. К относительным недостаткам относится дороговизна наборов антител, промывочных жидкостей и большие временные затраты на проведение реакций.

В результате проведенного патентно-информационного поиска ближайший аналог выявлен не был.

Задачей изобретения является создание способа диагностики амилоидоза, простого в осуществлении, не требующего больших материальных затрат и который проводиться в короткие сроки.

Сущность изобретения заключается в заборе сыворотки крови у животных, смешивании ее в объеме 100 мкл с 50 мкл изотонического раствора NaCl и нанесении на предварительно обезжиренное предметное стекло в объеме 20 мкл, далее помещении предметного стекла в чашку Петри на 1 час при температуре 22°C и влажности воздуха 55-75%, после чего проводят анализ фации под микроскопом при увеличении в 100 раз с использованием количественных параметров в качестве критериев, таких как количество центров кристаллизации в квадранте, количество вторичных лучей и исчерченность периферического белкового валика.

Способ был отработан на 30 беспородных белых крысах - самцах. Данные крысы были разделены на 2 группы: экспериментальную с первичным системным амилоидозом AL и интактную. Условия содержания, пищевой рацион идентичен. Для получения модели системного амилоидоза нами использовалась модель с введением неполного адъюванта Фрейнда. Адъювант в сочетании с нативным яичным альбумином вводился внутрибрюшино в течении 7 дней через день по 1 мл на 300 г массы тела После этого на 14 день все крысы были выведены с эксперимента с забором сыворотки крови и органов (печень, почки, селезенка, легкие, сердце).

Для метода клиновидной дегидратации бралось 100 мкл сыворотки крови и 50 мкл 0,9% раствора NaCl, далее два раствора смешивались, и полученный субстрат в объеме 20 мкл наносился на предварительно обезжиренное предметное стекло. Стекло помещалось в чашку Петри на один час при температуре, равной 22°C и влажности воздуха, равной 55-75%. После этого полученная путем клиновидной дегидратации фация анализировалась под микроскопом с увеличением в 100 раз.

Температура кристаллизации была выбрана из-за двух явлений: первое - именно при этой температуре мы получили наиболее точные и детализированные изображения кристаллизации; изменение температуры на 4 градуса Цельсия выше или ниже 22 градусов демонстрировало намного худшие результаты; второе - данная температура равна комнатной температуре, и для своего воссоздания не требует никаких специальных приборов.

В роли кристаллизатора использовался 0,9% раствор NaCl, так как он является изотоническим к биологическим средам организма и не вызывает в них структурных и количественных сдвигов, другие же кристаллизаторы, которые часто фигурируют в других работах (CuSO₄, глицин), индуцируют изменения кристаллогеных свойств жидкости и искажают истинную кристаллограмму. Кроме того, преимущество изотонического раствора NaCl - это его дешевизна и доступность.

На основании проведенного ряда опытов нами установлено оптимальное время кристаллизации, которое равно одному часу. Если объект будет кристаллизироваться меньше данного времени, то кристаллогенез не успевает завершиться и на исследуемой фации имеются акристаллические зоны. Увеличение времени свыше одного часа не меняет кристаллограму, так как именно этого времени достаточно для полного прекращения кристаллогенеза.

Главное значение имеют качественные показатели, такие как форма кристаллов, их разветвленность и пространственное соотношение. В экспериментальной группе мы получили большие крестообразные кристаллы, которые уменьшали свой размер и сгущались ближе к центру дегидратированной капли, при этом количество разветвлений было минимально. В интактной же группе кристаллы имеют характерные «нежные линии», которые значительно отличаются от получившихся кристаллов в первой группе. Также был разработан ряд количественных параметров, использующихся в качестве критериев диагностики:

1. Количество центров кристаллизации в квадрате исследования. Размеры последнего были получены экспериментально - мы получили площадь всей капли, а далее разбили ее на 16 квадрантов с площадью, равной 500 условных единиц. В экспериментальной группе количество центров кристаллизации равно 2±1 (р=0,05). В интактной же группе данный показатель равняется 5±1 (р=0,05).

2. Количество вторичных лучей. В группе животных с вызванным AL-амилоидозом данный введенный параметр равен 7±2 (р=0,05). У потенциально здоровых лабораторных животных из интактной группы количество вторичных лучей равняется 13±2 (р=0,05).

3. Исчерченность периферического белкового валика. В группе экспериментальных животных данный параметр равен 9±2 (р=0,05). При этом стоит отметить, что данные трещины имеют неправильный вид и направление. В группе интактных животных количество линий на белковом валике равно 12±2 (р=0,05), и данные линии имеют строго упорядоченный параллельный ход, что также служит диагностическим критерием в отличии от фаций с AL-амилоидозом.

Все полученные и интерпретированные результаты анализа полученных фаций были сравнены с гистологическим исследованием аутоптатов органов (печень, почки, селезенка, легкие, сердце) для подтверждения корреляции параметров и наличия патологии. На основании данного исследования нами получено 100% подтверждение амилоидоза с помощью разработанного способа.

Технический результат использования способа:

1. Минимальные затраты времени.

2. Достоверность, нативность и физиологичность проводимого исследования.

3. Отсутствие аллергических и токсических явлений со стороны пациента.

4. Снижение затрат на проведение диагностики AL-амилоидоза.

5. Доступность аппаратуры для исследования.

Литература

1. Варшавский, В.А., Проскурнева, Е.П. Значение и методы морфологической диагностики амилоидоза в современной медицине. Практическая нефрология. - 1998. - №2, - с.16-23.

2. Houdner, P., Rausing, A., Steen, К., Torp A. Diagnosis of cardiac amyloidosis by Myocardial Biopsy. // Acta med. Scand - 1975 - №6, p.525-528.

3. Skinner M. Amyloidosis Current Therapy in Allergy, Immunology, and Rheumatology. // Mosby-Year Book. - 1996, - p.235-240.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике. Способ диагностики AL-амилоидоза заключается в том, что каплю биологической жидкости с кристаллоиндуктором подвергают клиновидной дегидратации и затем полученную фацию анализируют под микроскопом с использованием количественных критериев. Способ доступен, прост в исполнении, позволяет выявить системный амилоидоз в короткие сроки.

Способ диагностики системного амилоидоза у экспериментальных лабораторных крыс, заключающийся в заборе сыворотки крови, смешивании ее в объеме 100 мкл с 50 мкл изотонического раствора NaCl и нанесении на предварительно обезжиренное предметное стекло в объеме 20 мкл, далее помещении предметного стекла в чашку Петри на 1 час при температуре 22°С и влажности воздуха 55-75%, проведении после этого анализа фации под микроскопом при увеличении в 100 раз с использованием количественных параметров в качестве критериев, таких как количество центров кристаллизации в квадранте, представляющем собой площадь всей капли, разбитой на 16 квадрантов, количество вторичных лучей и исчерченность периферического белкового валика, при этом диагноз «системный амилоидоз» считается установленным, если количество центров кристаллизации в квадранте исследования равно 2±1 (р=0,05), количество вторичных лучей равно 7±2 (р=0,05) и исчерченность периферического белкового валика равна 9±2 (р=0,05), при этом трещины имеют неправильный вид и направление.