АПТАМЕР, СПЕЦИФИЧНЫЙ К ОПУХОЛЕВЫМ ТКАНЯМ ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2014 года по МПК C12N15/115 C12Q1/68 

Изобретение относится к диагностике онкологических заболеваний, в частности к выявлению рака легкого с помощью аптамеров.

Среди всех видов онкозаболеваний рак легкого является наиболее распространенной формой злокачественных новообразований. Он затрагивает более миллиона людей по всему миру и составляет около 25% всех смертей от рака (Е.В. Артамонова. Основные достижения в биологии, скрининге, диагностике и лечении немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Практическая онкология. - 2011. - Т.12. - №1. - С.26-35; Sunil К. Arya, Shekhar Bhansali. Lung Cancer and Its Early Detection Using Biomarker-Based Biosensors. Chem. Rev. - 2011. - V.111. - P.6783-6809).

Относительная пятилетняя выживаемость пациентов при раке легкого очень низка, она составляет 13-15% для развитых стран (Francesco Paolo Fiorentino, Marcella Macaluso, Fabrizio Miranda, Micaela Montanari, Antonio Russo, Luigi Bagella, Antonio Giordano. CTCF and BORIS Regulate Rb2/p130 Gene Transcription: A Novel Mechanism and a New Paradigm for Understanding the Biology of Lung Cancer. Molecular cancer research. - 2011. - V.9. - P.225-233; B.E. Шевченко, H.E. Арноцкая, О.П. Трифонова, A.C. Дашкевич, B.A. Юрченко, Д.Г. Заридзе. Профилирование низкомолекулярного протеома плазмы крови для обнаружения потенциальных маркеров рака легкого. Масс-спектрометрия. - 2007. - Т.4. - №4. - С.245-253) и 9% - для развивающихся (Е.В. Левченко. Скрининг рака легкого. Практическая онкология. - 2010. - T.11. - №2. - С.88-95).

Однако несмотря на разнообразие существующих методов диагностики выявляемость больных с I-II стадиями рака легкого составляет 26,5%, а больных с III-IV стадиями - около 66,4%. При этом 5-летняя выживаемость после лечения I стадии РЛ соответствует 70%, а IV стадии - менее 5% (Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Состояние онкологической помощи населению России в 2009 году. - М.: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий». - 2010. - 196 с.).

Наиболее распространенными гистологическими типами рака легкого по классификации ВОЗ являются плоскоклеточный рак легкого, аденокарцинома и мелкоклеточный рак легкого.

Для клинической диагностики онкозаболеваний могут использоваться аптамеры, одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды, которые благодаря уникальным конформациям и пространственному расположению зарядов имеют высокую специфичность и сродство к заданным мишеням. Кроме того, аптамеры обладают пикомолярным уровнем чувствительности, поэтому могут использоваться для диагностики ранних стадий развития заболеваний.

Потенциальную возможность применения аптамеров для детекции мелкоклеточного рака легкого продемонстрировал Weihong Tan et at. (Hui William Chen, Colin D. Medley, Kwame Sefah, Dihua Shangguan, Zhiwen Tang, Ling Meng, Josh E. Smith, and Weihong Tan. Molecular Recognition of Small-Cell Lung Cancer Cells Using Aptamers. ChemMedChem. 2008). Описанные аптамеры были получены методом cell-SELEX к клеточным культурам мелкоклеточного рака легкого (МРЛ). Для доказательства возможности использования выбранных аптамеров в клинической практике клетки из культуры МРЛ смешивались с образцами цельной крови человека с последующим исследованием образца с помощью проточной цитометрии.

Известны изобретения, в которых описаны способы выявления рака легкого с помощью аптамеров, подобранных к рекомбинантными поверхностным белкам или клеточным культурам рака легкого.

Так, известен способ диагностики рака легкого человека, а также профилактики и лечения рака легкого с помощью иммуногенных пептидов (WO 2004015390 А2, C07K 14/47, G01N 33/574, 2004.02.19), по которому пять целевых белков экспрессируются разными типами тканей рака легкого. В качестве агентов, связывающихся с описанными белками, могут быть использованы аптамеры.

Известен способ выявления и дифференцировки различных подтипов немелкоклеточного рака легкого (CN 101538570, C12N 15/10, C12N 15/11, 2009.09.23), заключающийся в подборе аптамеров к поверхностным маркерам различных типов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Аптамеры, связываясь с маркерами разных гистологических типов немелкоклеточного рака легкого, позволяют проводить их дифференцировку. Описанный в изобретении способ позволяет осуществлять раннюю диагностику НМРЛ, а также проводить более точное генотипирование.

Аптамеры, используемые в диагностике рака в описанных выше способах, были подобраны к рекомбинантым белкам. Поскольку конформации рекомбинантных (очищеных) и нативных (находящихся на клеточной мембране) белков могут значительно различаться, специфичность выявления рака легкого с помощью таких аптамеров может быть недостаточно высока.

Известен способ диагностики мелкоклеточного рака легких (US 2009239762 А1, С07Н 21/04, C12Q 1/68, 2009.09.24), по которому аптамеры подбирали к клеточным культурам МРЛ методом cell-SELEX. Полученные аптамеры обладали способностью с высоким сродством связываться с тканями МРЛ. При смешивании культур различных гистологических типов рака легкого клетки культур МРЛ экстрагировались из смеси с помощью аптамеров, связанных с магнитными и флуоресцентными частицами.

Способ выявления рака легкого с помощью аптамеров, подобранных к клеточным культурам, является более чувствительным по сравнению со способами, в которых аптамеры подбирали к рекомбинантным белкам, поскольку аптамеры, подобранные к целым клеткам, являются более специфичными к нативным клеточным рецепторам и, кроме того, могут связываться с большим количеством мишеней на поверхности клетки. Однако растущие в культуре клетки могут трансформироваться и отличаться от опухолевых клеток, растущих в организме, вследствие разного микроокружения, что может давать ложноотрицательные результаты при выявлении циркулирующих клеток в образцах крови. Кроме того, поскольку описанные аптамеры не являются специфичными к продуктам распада опухоли и многим внутриклеточным мишеням, то с их помощью можно выявлять лишь циркулирующие раковые клетки. Вследствие этого чувствительность методов выявления онкозаболеваний с помощью аптамеров к целым клеткам будет недостаточно высока.

Задачей настоящего изобретения является селекция аптамеров, которые позволят с высокой чувствительностью выявлять продукты распада опухоли и циркулирующие раковые клетки в периферической крови больных раком легкого наиболее распространенных гистологических типов (плоскоклеточный рак легкого, железистая карцинома, мелкоклеточный рак легкого).

Поставленная задача решается тем, что аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека, полученный в результате селекции аптамеров, согласно изобретению получен в процессе селекции, включающей чередование раундов позитивной селекции аптамеров к измельченным опухолевым тканям легкого человека, забиравшимся после операции у онкологических больных, и негативной селекции к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей, с выявлением пула аптамеров с наибольшей аффинностью, его клонирования, секвенирования, проверки на специфичность связывания с опухолевыми клетками легкого, имеет установленную нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 34.

Пул аптамеров с наибольшей аффинностью к заданным мишеням, полученный в одном из раундов селекции, может быть выявлен с помощью проточной цитометрии.

Аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека, обладающий наибольшей аффинностью, характеризуется установленной нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 5.

Технический результат изобретения выражается в более высокой специфичности полученных аптамеров к опухолевым тканям легкого человека за счет возможности выявления олухолеспецифичных мишеней в клинических образцах больных раком легкого.

Изобретение иллюстрируется графическими материалами. На фиг.1 показаны гистограммы сравнения аффинности исходной библиотеки одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов и полученного в ходе селекции пула аптамеров к опухолевым клеткам легкого. Цифрой 1 на фиг.1 отмечена гистограмма интактных клеток, цифрой 2 - гистограмма клеток рака легкого с библиотекой аптамеров, цифрой 3 - гистограмма клеток рака легкого с пулом аптамеров 10 раунда селекции. На фиг.2 представлены образцы периферической крови людей, анализ которой проведен с помощью аптамеров, имеющих наибольшую аффинность к опухолевым клеткам легкого. На виде А. фиг.2 представлен образец периферической крови больного раком легкого, проинкубированной с аптамерами, мечеными флуоресцентной меткой; на виде В показан образец периферической крови здорового человека, проинкубированной с аптамерами, мечеными флуоресцентной меткой; на виде С представлен образец периферической крови больного раком почек, проинкубированной с аптамерами, мечеными флуоресцентной меткой.

При осуществлении подбора аптамеров к опухолевым тканям наиболее распространенных гистологических типов рака легкого человека использовалась технология SELEX с чередованием позитивной и негативной селекции (Ellington. A.D. and Szostak. J.W. (1990) In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346, 818-822).

Позитивная селекция аптамеров проводилась к опухолевым тканям легкого человека, забиравшимся после операции онкологических больных. Негативная селекция проводились к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей.

Ткань измельчали с помощью скальпеля с целью увеличения количества сайтов для связывания аптамеров. Мишенями для подбора аптамеров являлись целые клетки, некротические клетки, продукты распада опухоли, высвобожденные белки и внутриклеточное содержимое.

Селекция аптамеров проводилась на протяжении 13 раундов селекции с использованием библиотеки одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов. В результате селекции были получены аптамеры, специфичные к опухолевым тканям легкого.

В процессе селекции аффинность аптамеров к мишеням увеличивается до определенного раунда селекции, после чего остается постоянной либо может уменьшаться. Поэтому для проведения дальнейших исследований был выбран пул аптамеров с наибольшей аффинностью к заданным мишеням, полученный в ходе одного из раундов селекции. Для выявления наиболее аффинного пула аптамеров, полученного в результате селекции, использовали метод проточной цитометрии. Флуоресценцию исследуемых пулов аптамеров, связавшихся с мишенью, определяли на проточном цитометре FC-500 (Beckman Coulter Inc.. USA). Результаты проточной цитометрии показали, что наибольшей аффинностью к опухолевой ткани легкого человека обладают аптамеры 10 раунда селекции.

Из гистограмм, приведенных на фиг.1, видно, что уровень флуоресценции аптамеров, проинкубированных с опухолевыми клетками легкого, выше уровней флуоресценции библиотеки одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов, проинкубированной с клетками рака легкого и интактных клеток рака легкого, что свидетельствует о специфичности связывания аптамеров 10 раунда селекции с опухолевыми клетками легкого.

Пул аптамеров 10 раунда селекции клонировали с помощью набора «M13mp18 Perfectly Blunt Cloning Kit» (Novagen, Gemany) и секвенировали с целью определения искомых последовательностей аптамеров. Аптамеры были химически синтезированы. В результате было получено 34 уникальных аптамеров, связывающихся с опухолевыми тканями легкого человека, представленных как SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 34. Каждый из синтезированных аптамеров проверяли на специфичность связывания с опухолевыми клетками легкого.

Специфичность аптамеров к опухолевым клеткам легкого человека проверяли с помощью проточного цитометра. Для этого клетки рака легкого инкубировали в течение 15 минут с маскирующей РНК из дрожжей (конечная концентрация 0,1 мг/мл) для уменьшения неспецифического связывания, после чего в инкубационную смесь добавляли аптамеры с флуоресцентной меткой FAM и инкубировали еще 30 минут при комнатной температуре, анализ связывания аптамеров проводили с помощью проточного цитометра. В результате было выявлено 5 наиболее специфичных последовательностей к опухолевыми тканям легкого, представленных как SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 5.

Пример 1. Для доказательства возможности потенциального использования аптамеров для выявления рака легкого человека по анализу образцов периферической крови больных был использован метод проточной цитометрии.

Для выявления продуктов распада опухоли и циркулирующих раковых клеток в образцах крови были использованы следующие реактивы.

1. ДНК-аптамеры, специфичные к тканям рака легкого человека, меченые флуоресцентной меткой FAM.

2. Лизируюший раствор OptiLyse.

3. Фосфатный буфер с Са²⁺ и Mg²⁺.

4. Маскирующая дрожжевая РНК.

Для осуществления примера были использованы следующие образцы периферической крови людей, забиравшейся из вены с добавлением антикоагулянта.

1. Образец периферической крови больного раком легкого.

2. Образец периферической крови здорового человека.

3. Образец периферической крови больного раком почек.

Образцы крови инкубировали с маскирующей дрожжевой РНК в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем к образцам были добавлены синтетические аптамеры, выбранные из SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 5, меченых флуоресцентной меткой, после чего образец инкубировали в течение еще 20 минут в темном месте. Затрудняющие анализ эритроциты, находящиеся в образце, были разрушены с помощью лизируюшего раствора. Образец был доведен до 300 мкл фосфатным буфером с Са²⁺ и Mg²⁺, после чего флуоресценцию аптамеров, связавшихся с мишенью, определяли на проточном цитометре FC-500 (Beckman Coulter Inc., USA).

Результаты анализа образцов периферической крови людей, проведенные с использованием аптамеров, имеющих нукмеотидные последовательности, представленные как SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 5, меченых флуоресцентной меткой, показали, что в крови больного раком легкого присутствуют молекулярные мишени, связывающиеся с аптамерами (фиг.2, вид А), что свидетельствует о наличии в периферической крови больного опухолевых клеток легкого и продуктов распада опухоли легкого. Таким образом, анализ образца периферической крови больного раком легкого с помощью аптамеров подтвердил установленный клинико-лабораторными и гистологическими методами диагноз.

В крови здорового человека (фиг.2, вид В) не было обнаружено связывающихся с аптамерами молекулярных мишеней, что свидетельствует об отсутствии в крови опухолевых клеток легкого и продуктов распада опухоли легкого.

В крови больного раком почек (фиг.2, вид С) также не обнаружено связывающихся с аптамерами молекулярных мишеней, что показывает специфичность аптамеров к раковым клеткам и продуктам распада опухоли легочного происхождения.

Полученные результаты доказывают потенциальную возможность использования аптамеров заявленных последовательностей SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 34 для выявления рака легкого.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выявлению рака легкого с помощью аптамеров, и может быть использовано в диагностике. Аптамеры получают в результате селекции, включающей чередование раундов позитивной селекции аптамеров к измельченным опухолевым тканям легкого человека, забиравшимся после операции у онкологических больных, и негативной селекции к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей, с выявлением пула аптамеров с наибольшей аффинностью, его клонирования, секвенирования, проверки на специфичность связывания с опухолевыми клетками легкого. Полученные аптамеры обладают высокой чувствительностью к продуктам распада опухоли и циркулирующим раковым клеткам в периферической крови больных раком легкого, что позволяет повысить эффективность диагностики рака легкого человека. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

1. Аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека, полученный в результате селекции аптамеров, включающей чередование раундов позитивной селекции аптамеров к измельченным опухолевым тканям легкого человека, забиравшимся после операции у онкологических больных, и негативной селекции к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей, с выявлением пула аптамеров с наибольшей аффинностью, его клонирования, секвенирования, проверки на специфичность связывания с опухолевыми клетками легкого, имеет установленную нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 34.

2. Аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека, по п.1, отличающийся тем, что выбран из пула аптамеров с наибольшей аффинностью к заданным мишеням, выявленного с помощью проточной цитометрии.

3. Аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека, по п.1, отличающийся тем, что обладающий наибольшей аффинностью аптамер характеризуется установленной нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 5.