СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА Salmonella К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ Российский патент 2014 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение касается определения антибактериальной устойчивости рода Salmonella с помощью аптамеров.

В настоящее время растет количество высокопатогенных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, эффективность лечения которых напрямую зависит от резистентности бактерий к применяемым в лечении антибиотикам.

Инфекции, вызываемые резистентными микроорганизмами, чаще приводят к летальному исходу и затрудняют борьбу с инфекционными заболеваниями, поскольку пациенты остаются носителями заболевания на протяжении длительного времени, что способствует передаче устойчивых штаммов другим людям. В связи с постоянным повышением лекарственной устойчивости бактерий медицина нуждается в быстрых, обладающих высокой точностью методиках определения степени резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

На сегодняшний день, чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам определяют следующими известными способами.

Способ серийных разведений основан на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего активность антибактериального препарата, т.е. величины его минимальной подавляющей концентрации [Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04). Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004, Т.6, №4].

Данный способ можно осуществлять с использованием жидких питательных сред путем последовательного разведения антибактериальных препаратов в два раза, получая количество образцов, равное количеству разведений. Микроорганизмы инкубируются с полученными пробами в равных концентрациях примерно 10⁶ КОЕ/мл, после чего результат оценивается визуально по мутности проб (либо с помощью спектрофлуориметра в случае проведения анализа в иммунологическом планшете). Способ серийных разведений можно осуществлять также путем высева микроорганизмов на чашки Петри с агаром, содержащим последовательные двойные разведения антибиотиков. Однако результат можно учитывать только при подтверждении чистоты культуры. Кроме того, дополнительных временных затрат требует подготовка чашек Петри, высев на них микроорганизмов, культивирование и подсчет колоний.

Известен диско-диффузионный способ, основанный на способности антибактериальных препаратов диффундировать из пропитанных бумажных дисков в питательную среду с угнетением роста микроорганизмов, посеянных на поверхности агара (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04). Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004, Т.6, №4].

Для осуществления диско-диффузионного способа требуется особая подготовка чашек Петри, поскольку толщина агара должна иметь определенное значение, а поверхность, на которой производят заливку расплавленного агара в чашки должна быть строго горизонтальной. Кроме того, для осуществления способа требуются только стандартизованные качественные диски, пропитанные антибактериальными препаратами, изготовление которых в лабораторных условиях невозможно.

Помимо известных способов и выработанных на их основе стандартных методик определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам известны также способы, описанные в заявках и патентах на изобретения.

Известен способ определения антибиотикорезистентности микроорганизмов, включающий идентификацию микроорганизмов (WO/2009/095258, C12Q 1/04; G01N 33/58, 08.06.2009). Способ включает изготовление меченого антибиотика, инкубацию меченого антибиотика с исследуемыми микроорганизмами в условиях, позволяющих микроорганизмам связаться с антибиотиком, и детекцию меченого антибиотика в микроорганизмах. Меченый антибиотик также инкубируют с микроорганизмами того же вида, чувствительных к данному антибиотику. Количество анитибиотика в исследуемых организмах сравнивают с количеством антибиотика в чувствительных к нему микроорганизмах. Посредством этого определяют чувствительность микроорганизмов к антибактериальному препарату.

Описанный способ требует дополнительных временных затрат для изготовления меченого антибиотика и инкубации с чувствительными к нему микроорганизмами, помимо инкубации с исследуемыми микроорганизмами. А также требует дополнительного наличия чувствительных к данному антибиотику микроорганизмов того же вида.

Известен способ определения антибиотикорезистентного профиля бактерии и лечения пациента терапевтически эффективными антибиотиками (WO/2009/137139, C12Q 1/68; C12N 1/20, 11.12.2009). Способ определения антибиотикорезистентности включает: получение нуклеиновой кислоты бактерии, визуализацию нуклеиновой кислоты бактерии, получение рестрикционной карты нуклеиновой кислоты, сравнение рестрикционной карты нуклеиновой кислоты с базой данных рестрикционных карт и определение антибиотикорезистентности бактерий путем сопоставления регионов заданной нуклеиновой кислоты с соответствующими регионами в указанной базе данных. Описанный способ является достаточно трудозатратным, поскольку включает выделение нуклеиновой кислоты бактерий.

Известен также «Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (RU 2321855, G01N 33/48, G01N 21/00, 12.10.2006), заключающийся в том, что на пробы с различными антимикробными препаратами воздействуют лазерным излучением, измеряя интенсивность флюоресценции проб в различные интервалы времени. На пробы без антимикробных препаратов воздействуют лазерным излучением в те же интервалы времени и измеряют интенсивность флюоресценции проб без антимикробных препаратов. Затем осуществляют сравнение интенсивности флюоресценции проб с антимикробными препаратами, нормированных на соответствующие интенсивности флюоресценции проб без антимикробных препаратов. При уменьшении нормированной интенсивности флюоресценции проб с антимикробными препаратами на определенную величину диагностируют ингибирующее воздействие антимикробных препаратов на микроорганизмы.

Данный способ определения чувствительности микроорганизмов является трудозатратным и занимает достаточно много времени, поскольку включает облучение проб лазером в различные последовательные периоды времени, повторное измерение интенсивности флуоресценции и сравнение с образцами, не содержащими антимикробные препараты.

Известен «Способ определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью к сочетаниям антибактериальных препаратов» (RU 2388827, C12Q 1/04, C12N 1/00, 10.05.2010), принятый за прототип, заключающийся в том, что посев исследуемой культуры микроорганизмов осуществляют в пробирку с мясопептонным бульоном, а затем вносят пропитанные антибактериальным препаратом стандартные бумажные диски и инкубируют в течение 12-18 часов при температуре 36±1°C. Чувствительность микроорганизмов к сочетанию антибактериальных препаратов оценивают визуально по прозрачности содержимого пробирки. Отсутствие мутности говорит о чувствительности микроорганизмов к сочетанию антибактериальных препаратов.

Данный способ определения антибактериальной чувствительности, несмотря на уменьшение трудозатрат по сравнению со стандартными методиками определения, обладает невысокой точностью, поскольку не может дать количественной оценки. А также требует наличия специальных стандартных дисков, пропитанных антибактериальными препаратами.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности способа определения чувствительности микроорганизмов рода Salmonella к антибактериальным препаратам.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения чувствительности микроорганизмов рода Salmonella к антибактериальным препаратам, включающем инкубирование проверяемого вида микроорганизмов с исследуемым антибактериальным препаратом, согласно изобретению, антибактериальный препарат в известной ранее установленной для каждого антибактериального препарата концентрации, оптимальной для воздействия на заданный вид микроорганизмов, инкубируют с микроорганизмами заданного вида, взятыми в конечной концентрации около 1000 клеток/мл, при температуре 37°C в течение 24-х часов, после инкубирования к образцам добавляют аптамеры, меченные флуоресцентной меткой, в конечной концентрации 100 нМ специфичные к проверяемым видам живых микроорганизмов, и вторично инкубируют в течение 20 минут, образец исследуют с помощью проточной цитометрии, по уровню флуоресценции аптамеров, определяемому по графикам, построенным с помощью проточного цитометра с использованием программы, позволяющей выводить в процентном соотношении значения, показывающие долю связавшихся или не связавшихся бактерий с аптамерами, меченными флуоресцентной меткой, определяют количество в образце живых или неживых микроорганизмов.

В заявляемом изобретении описывается способ определения чувствительности микроорганизмов рода Salmonella к антибактериальным препаратам с помощью аптамеров, способных специфически связываться с живыми микроорганизмами и не связываться с неживыми (т.е. подвергшимися действию антибактериальных препаратов). Способ принципиально отличается тем, что для определения антибактериальной чувствительности микроорганизмов используются аптамеры.

Технический результат изобретения достигается за счет осуществления возможности получать количественную оценку живых и неживых микроорганизмов по уровню флуоресценции аптамеров и тем самым повысить точность определения антибиотикорезистентности бактерий к тому или иному антибактериальному препарату. Кроме того, способ исключает влияние человеческого фактора в виде визуальной оценки чувствительности бактерий по мутности образца.

Аптамеры - синтетические однонитевые молекулы РНК или ДНК, получаемые с помощью технологии SELEX и способные к специфичному связыванию практически с любой биологической мишенью. Аптамеры обладают высокой чувствительностью и специфичностью и имеют низкую себестоимость, поскольку синтезируются химически.

Принцип способа основан на том, что аптамеры, подобранные методом cell-SELEX, использующим в качестве позитивных мишеней живые микроорганизмы, а в качестве негативных мишеней неживые микроорганизмы, подобраны к тем видам микроорганизмов, антибактериальную устойчивость которых нужно определить, в данном способе это виды рода Salmonella, способны специфически «отличать» в образце живые микроорганизмы от неживых.

У микроорганизмов, чувствительных к воздействию антибиотика, изменяется структура клеточной стенки, тогда как резистентные к антибактериальному препарату микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность, и структура их клеточной стенки не изменяется. Поэтому при воздействии на микроорганизм антибактериальными препаратами можно определять их антибиотикорезистентность с помощью анализа связываемости с аптамерами, специфичными к данному виду живых микроорганизмов.

Способ иллюстрируется графиками, на фиг.1 показан график определения антибактериальной чувствительности Salmonella Enteritidis к трем антибактериальным препаратам; на фиг.2 показан график определения антибактериальной чувствительности Salmonella Typhimurium к трем антибактериальным препаратам.

Для осуществления способа используют следующие реактивы:

1. Пул ДНК-аптамеров (или ДНК-аптамер), подобранных к заданному виду живых микроорганизмов, негативными мишенями к подбору которого служили неживые микроорганизмы заданного вида.

2. Жидкая питательная среда.

3. Бидистиллированная вода.

4. Фосфатный буфер с Ca²⁺ и Mg^2+.

5. Микроорганизмы заданного вида.

6. Антибактериальный препарат, чувствительность микроорганизмов к которому необходимо определить.

Способ осуществляют следующим образом.

Антибактериальный препарат (в том случае если он находится в твердой или порошковой форме) сначала разводят в воде, а потом в питательной среде. Затем добавляют заданный вид микроорганизмов в количестве приблизительно 1000 клеток/мл. Конечная концентрация антибактериального препарата должна быть оптимальной для воздействия на заданный вид микроорганизмов (оптимальная концентрация обычно указывается в аннотации к данному антибактериальному препарату).

Пробы инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 24-х часов.

Температура 37°C выбрана для приближения эксперимента к реальным условиям воздействия антибактериальных препаратов на бактерии в организме человека. Продолжительность инкубации 24 часа обусловлена возможностью оценить эффективность воздействия антибактериального препарата на патогенные микроорганизмы.

После инкубации к образцам добавляют флуоресцентно меченые аптамеры, специфичные к данному виду микроорганизмов р. Salmonella, и инкубируют в течение 20 минут.

Образец исследуют с помощью проточной цитометрии.

По уровню флуоресценции аптамеров, связавшихся с бактериями, говорят о количестве находящихся в образце живых или неживых микроорганизмов, а следовательно, об их чувствительности к проверяемому антибиотику. Уровень флуоресценции определяют по графикам, построенным с помощью проточного цитометра с использованием программы, позволяющей выводить в процентном соотношении значения, показывающие долю связавшихся или не связавшихся бактерий с аптамерами, меченными флуоресцентной меткой. Приведенные в описании графики были получены при обработке данных, полученных при анализе образцов с помощью проточного цитометра FC-500 (Beckman Coulter Inc., USA) с использованием программы Kaluza 1.1. Графики были построены программой автоматически.

Ниже приведен пример осуществления способа определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, в частности к антибиотикам.

Пример. Определяли чувствительность Salmonella Typhimurium и Salmonella Enteritidis к следующим антибиотикам: «Флемоксин Солютаб», «Азитромицин» и «Цефотаксим». Для определения чувствительности были использованы следующие реактивы:

1. ДНК-аптамер, меченный флуоресцентной меткой, специфичный к Salmonella Typhimurium, негативной мишенью для селекции которого служили неживые Salmonella Typhimurium, а также бактерии некоторых других видов. ДНК-аптамер, меченный флуоресцентной меткой, специфичный к Salmonella Enteritidis, негативной мишенью для селекции которого служили неживые Salmonella Enteritidis, а также бактерии некоторых других видов.

2. Жидкая питательная среда, приготовленная с использованием порошка Мюллера-Хинтона.

3. Фосфатный буфер с Са²⁺ и Mg^2+.

4. Бидистиллированная вода для разведения антибактериальных препаратов.

Каждый из исследуемых антибактериальных препаратов «Флемоксин Солютаб», «Азитромицин» и «Цефотаксим» разводили в бидистиллированной воде, а затем в жидкой питательной среде, в конечной концентрации, рекомендуемой в аннотации к данным антибактериальным препаратам. Затем в среду вносили Salmonella Typhimurium и Salmonella Enteritidis, в конечной концентрации около 1000 клеток/мл. В качестве контроля использовали живые Salmonella Typhimurium и Salmonella Enteritidis, смешанные с жидкой питательной средой. А также Salmonella Typhimurium и Salmonella Enteritidis, подвергшиеся воздействию температуры 95°C в течение 15 минут.

Всего было получено 10 проб:

1. Питательная среда + «Цефотаксим» + Salmonella Typhimurium

2. Питательная среда + «Цефотаксим» + Salmonella Enteritidis

3. Питательная среда + «Азитромицин» + Salmonella Typhimurium

4. Питательная среда + «Азитромицин» + Salmonella Enteritidis

5. Питательная среда + «Флемоксин Солютаб» + Salmonella Typhimurium

6. Питательная среда + «Флемоксин Солютаб» + Salmonella Enteritidis

7. Питательная среда + Salmonella Typhimurium после 15 мин воздействия температуры 95°C

8. Питательная среда + Salmonella Enteritidis после 15 мин воздействия температуры 95°C

9. Питательная среда + Salmonella Typhimurium

10. Питательная среда + Salmonella Enteritidis

Все пробы инкубировали в CO₂-инкубаторе течение 24-х часов при температуре 37°C, после чего образцы разводили до получения количества бактерий примерно 1000 клеток/мл. После этого добавляли аптамеры, меченные флуоресцентной меткой в конечной концентрации 100 нМ, и инкубировали около 30 минут. Затем образцы центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут, снимали надосадок, а к осадку добавляли фосфатный буфер с Са²⁺ и Mg²⁺. Полученные образцы исследовали на проточном цитометре FC-500 (Beckman Coulter Inc., USA). Для обработки данных использовали программное обеспечение Kaluza 1.1.

Результаты, полученные с помощью проточной цитометрии, отражены на фиг.1 и 2.

На фиг.1 показано определение антибактериальной чувствительности Salmonella Enteritidis с помощью аптамеров.

При проведении анализа связывания аптамеров с образцами, содержащими Salmonella Enteritidis после суточной инкубации с «Флемоксином», «Цефотаксимом» и «Азитромицином», флуоресценции не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии в образце живых бактерий, а, следовательно, о чувствительности Salmonella Enteritidis к данным антибактериальным препаратам (фиг.1 кривые 1, 2, 3). Аптамеры, проинкубированные с нежизнеспособными Salmonella Enteritidis, подвергшимися воздействию температуры 95°C в течение 15 минут, не связывались с бактериями (фиг.1, кривая 5). Это подтверждает то, что аптамеры не обладают сродством к неживым бактериям.

Флуоресценция Salmonella Enteritidis, связанных с аптамерами, характерна только для бактерий, не обработанных антибактериальными препаратами (кривая под номером 4), при этом количество живых бактерий составляет 39% от общего числа, что, по-видимому, связано с недостаточной устойчивостью данного вида бактерий к каким-либо условиям проведения эксперимента.

При этом полное отсутствие флуроресценции после суточной инкубации образцов с «Флемоксином», «Цефотаксимом» и «Азитромицином» подтверждает, что Salmonella Enteritidis обладает высокой чувствительностью к выбранным антибактериальным препаратами в рекомендуемой концентрации.

На фиг.2 показано определение антибактериальной чувствительности Salmonella Typhimurium с помощью аптамеров.

Из приведенных на фиг.2 графиков следует, что флуоресценция Salmonella Typhimurium, связанных с аптамерами, характерна как для бактерий, не обработанных антибактериальными препаратами (кривая под номерам 9), при этом количество живых бактерий, как показывают результаты, сформированные программой, составляет 97,4%, так и для бактерий, обработанных Флемоксином (кривая 6) и Цефотаксимом (кривая 7), живыми остаются соответственно 10,8 и 12.0% микроорганизмов. В образцах, проинкубированных с Азитромицином, флуоресценции не наблюдалось, то есть живых бактерий в них нет. При этом несродство аптамеров к неживым бактериям и их специфичность к живым, так же как и в опыте с Salmonella Enteritidis, подтверждает факт отсутствия флуоресценции в результате инкубирования аптамеров с Salmonella Typhimurium, подвергшимися пятнадцатиминутному воздействию температуры 95°C (фиг.2 кривая 10).

Таким образом, Salmonella Typhimurium недостаточно чувствительна к препаратам Флемоксин и Цефотаксим в рекомендуемых известных дозах, в то время как наблюдается 100% гибель бактерий при воздействии на них Азитромицина, в установленной для данного препарата дозе.

Таким образом, в ходе проведения анализа антибактериальной чувствительности было установлено, что Salmonella Enteritidis обладает чувствительностью к любому из исследуемых антибактериальных препаратов «Флемоксин Солютаб», «Азитромицин» и «Цефотаксим» в установленных для них концентрациях, оптимальных для воздействия на данный вид микроорганизма. Salmonella Typhimurium является более устойчивой к препаратам «Флемоксин Солютаб» и «Цефотаксим» и обладает чувствительностью к препарату «Азитромицин».

Использование аптамеров в заявляемом способе позволяет с высокой степенью точности определить чувствительность микроорганизмов р. Salmonella к антибактериальным препаратам, которые используются в настоящее время в лечении болезней, вызываемых данными микроорганизмами, и, в свою очередь, позволит выбирать для лечения инфекций из ряда лекарственных средств те препараты, к которым патогенные микроорганизмы более чувствительны, то есть ускорить процесс излечения больного.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Инкубируют проверяемый вид микроорганизмов рода Salmonella, взятый в конечной концентрации около 1000 клеток/мл, с исследуемым антибактериальным препаратом в известной, ранее установленной для каждого антибактериального препарата концентрации, оптимальной для воздействия на заданный вид микроорганизмов. Инкубирование проводят при температуре 37°C в течение 24-х часов. К образцам добавляют специфичные к проверяемым видам живых микроорганизмов аптамеры, меченные флуоресцентной меткой, в конечной концентрации 100 нМ. Вторично инкубируют в течение 20 минут. Образец исследуют с помощью проточной цитометрии. По графикам, построенным с помощью проточного цитометра с использованием программы, позволяющей выводить в процентном соотношении значения, определяют уровень флуоресценции аптамеров. Определяют долю связавшихся или не связавшихся бактерий с аптамерами, меченными флуоресцентной меткой. Определяют количество в образце живых или неживых микроорганизмов. Способ позволяет с высокой степенью точности определить чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам. 2 ил., 1 пр.

Способ определения чувствительности микроорганизмов рода Salmonella к антибактериальным препаратам, включающий инкубирование проверяемого вида микроорганизмов с исследуемым антибактериальным препаратом, отличающийся тем, что антибактериальный препарат в известной ранее установленной для каждого антибактериального препарата концентрации, оптимальной для воздействия на заданный вид микроорганизмов, инкубируют с микроорганизмами заданного вида, взятыми в конечной концентрации около 1000 клеток/мл, при температуре 37°C в течение 24-х часов, после инкубирования к образцам добавляют аптамеры, меченные флуоресцентной меткой в конечной концентрации 100 нМ, специфичные к проверяемым видам живых микроорганизмов, и вторично инкубируют в течение 20 минут, образец исследуют с помощью проточной цитометрии, по уровню флуоресценции аптамеров, определяемому по графикам, построенным с помощью проточного цитометра с использованием программы, позволяющей выводить в процентном соотношении значения, показывающие долю связавшихся или не связавшихся бактерий с аптамерами, меченными флуоресцентной меткой, определяют количество в образце живых или неживых микроорганизмов.