Аптамеры для интраоперационного окрашивания глиобластомы и способ их применения Российский патент 2024 года по МПК C12N15/115 C12Q1/68 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к средствам для визуализации глиобластомы человека и к способам диагностики опухолей головного мозга человека, в частности, к визуализации глиобластомы человека.

Уровень техники

Мультиформная глиобластома, или глиобластома, принадлежит к группе опухолей головного мозга, известных как астроцитомы. Глиобластома - самая опасная и наиболее распространенная среди всех первичных опухолей мозга у взрослых. Данный тип опухоли характеризуется агрессивным биологическим поведением, выражающимся в неконтролируемой клеточной пролиферации, резистентности к апоптозу и повышенном ангиогенезе; а также прогрессирующей инвазией в нормальную паренхиму мозга и крайней нестабильностью генома. Глиобластома также характеризуется значительной неоднородностью на цитопатологическом, транскрипционном, и геномном уровнях.

Особенностью глиобластомы является инфильтративный рост и отсутствие четких границ. Часто встречаются терапевтически резистентные опухоли.

Среди проблем интраоперационной визуализации глиальных опухолей выделяют сложность определения их истинных границ. Участки тканей, трактуемые как отек белого вещества головного мозга, зачастую представляют собой зону инфильтрации опухолевыми клетками, тогда как контрастное усиление опухоли отражает только рентгенологически видимую (макроскопическую) распространенность поражения мозга, а не истинную величину опухолевой инвазии (Использование перфузионной КТ в динамическом наблюдении за результатами комбинированного и комплексного лечения глиом головного мозга Журавлева М.А., Шершевер А.С., Бенцион Д.Л. Лучевая диагностика и терапия. 2012. № 2. С. 58-64.).

Для точного определения локализации опухолевых клеток был предложен метод интраоперационной визуализации (fluorescent-guided surgery), который может обеспечить визуализацию новообразований в режиме реального времени с помощью специфических или неспецифических флуоресцентных красителей и хирургического флуоресцентного микроскопа или другого аналогичного оборудования. На сегодняшний день в медицинских центрах наиболее распространенным хирургическим микроскопом является OPMI Pentero (Carl Zeiss), имеющий в полной комплектации три флуоресцентных модуля:

Blue 400 с рабочим диапазоном 405-650 нм;

• Yellow 560 (540-690 нм);

• Infrared 800 (820-900 нм).

Указанные флуоресцентные модули предназначены для регистрации трех зарегистрированных веществ, использующихся для интраоперационной визуализации глиобластомы: “Аласенса”, флуоресцеина и индоцианина зеленого.

Наиболее широкое распространение в хирургической практике получил препарат “Аласенс” на основе 5-аминолевулиновой кислоты, являющейся предшественником протопорфирина (ПП) IX в организме человека (Stummer, W. Intraoperative Detection of Malignant Gliomas by 5-Aminolevulinic Acid-induced Porphyrin Fluorescence/ W. Stummer, S. Stocker, S. Wagner, H. Stepp, C. Fritsch, C. E. Alwin, R. Kiefmann, H. Reulen // Neurosurgery. 1998 - V. 42 - I.3 - P. 518-526).

Спектр флуоресценции ПП IX характеризуется двумя максимумами: на 635 и 710 нм, возбуждение происходит на 405 нм. К недостаткам препарата относится отсутствие адресности доставки, что может приводить к ложноположительным и ложноотрицательным результатам, а также повышению фонового шума из-за накопления 5-аминолевулиновой кислоты в зонах с повышенным метаболизмом.

Флуоресцеин натрия испускает в видимой области спектра (450-600 нм) и при достаточно высоких дозах красителя удаление окрашенной ткани возможно даже без использования специального флуоресцентного микроскопа (https://doi.org/10.3171/2016.7.JNS16232). К недостаткам препарата является большой фоновый шум из-за аутофлуоресцении, поскольку биологическая ткань сама испускает в этом диапазоне длин волн.

Еще одним веществом, способным пассивно накапливаться в опухолевой ткани является индоцианин зеленый (760-820 нм), который применяется в нейрохирургии с 2003 г. для интраоперационной оценки аневризм, артериовенозных мальформаций и кортикальной перфузии (Applications of indocyanine green in brain tumor surgery: review of clinical evidence and emerging technologies. Clare W. Teng, Vincent Huang, Gabriel R. Arguelles, Cecilia Zhou, Steve S. Cho, Stefan Harmsen, John Y.K. Lee.Neurosurg Focus 50 (1): E4, 2021).

Несмотря на широкое применение и доказанную эффективность, препараты, пассивно накапливающиеся в тканях, имеют существенные недостатки (Quicker, deeper and stronger imaging: A review of tumor-targeted, nearinfrared fluorescent dyes for fluorescence guided surgery in the preclinical and clinical stages. Jianhua Jiao, Jingliang Zhang, Fa Yang, Wei Song, Donghui Han, Weihong Wen, Weijun Qin. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 152 (2020) 123-14):

• неспецифическое поглощение препарата клетками может привести к тому, что участки ткани с повышенным метаболизмом (например, очаги воспаления) будут испускать флуоресценцию так же, как и раковые ткани;

• из-за ангиогенеза и васкуляризации солидных опухолей, которые приводят к разрастанию и “запутанности” сосудов, доступ препарата в раковые клетки может быть затруднен, и как итог, они останутся неокрашенными;

• неспецифическое накопление препарата в тканях может приводить к фоновому шуму, который будут испускать прилегающие здоровые клетки в незначительном количестве “поглотившие” препарат.

Чтобы избежать перечисленных проблем неспецифические флуорофоры должны быть конъюгированы с опухолеспецифическими лигандами, такими как антитела, пептиды или аптамеры (Quicker, deeper and stronger imaging: A review of tumor-targeted, nearinfrared fluorescent dyes for fluorescence guided surgery in the preclinical and clinical stages. Jianhua Jiao, Jingliang Zhang, Fa Yang, Wei Song, Donghui Han, Weihong Wen, Weijun Qin. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 152 (2020) 123-14).

Аптамеры - небольшие (5-30 кДа) одноцепочечные молекулы ДНК или РНК, которые несут в своей первичной последовательности буквенный код нуклеотидов, поэтому их можно легко синтезировать и модифицировать.

К настоящему времени уже получены различные аптамеры, специфичные к опухолевым маркерам глиобластомы (The Role of RNA and DNA Aptamers in Glioblastoma Diagnosis and Therapy: A Systematic Review of the Literature. Silvia Nuzzo, Valentina Brancato, Alessandra Affinito, Marco Salvatore, Carlo Cavaliere, Gerolama Condorelli. Cancers 2020, 12, 2173; doi:10.3390/cancers12082173). Среди них ДНК- и РНК-аптамеры специфичные к таким маркерам как нуклеолин, EGFR, VEGF, PDGFR, Tenascin-C. Основными ограничениями для использования аптамеров в клинической практике называют их чувствительность к нуклеазам жидкостей организма и вероятность непроникновения через ГЭБ.

Аналогом настоящего изобретения является документ RU 2654665, описывающий способ визуализации глиобластомы человека с помощью аптамеров, включающий обработку ткани мозга ДНК-аптамером, полученным с использованием технологии cell-SELEX с чередованием позитивной и негативной селекции и связанным с флуоресцентной меткой, отличающийся тем, что обработку ткани мозга осуществляют ДНК-аптамером.

Еще одним аналогом изобретения являются ДНК аптамеры (Gli-233, Gli-55), раскрытые в документе Anna S Kichkailo et al/ Development of DNA aptamers for visualization of glial brain tumors and detection of circulating tumor cells/ Mol Ther Nucleic Acids, 2023, 32: 267-288 (doi: 10.1016/j.omtn.2023.03.015). В данном документе раскрыты ДНК-аптамеры (Gli-233, Gli-55), способные специфически связываться с глиальными опухолевыми клетками in vitro, ex vivo и in vivo для визуализационной диагностики опухолей центральной нервной системы.

Таким образом, интраоперационная визуализации глиобластомы является востребованной и развивающейся областью, а разработка новых решений для интраоперационной визуализации глиобластомы является актуальной задачей.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка и создания средства для интраоперационного окрашивания клеток опухоли головного мозга, а также повышение специфичности и аффинности способа визуализации ткани глиобластомы человека при проведении операции.

Поставленная задача решается путем получения ДНК-аптамера, специфичного к клеткам опухоли головного мозга и имеющего последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2.

В частных вариантах воплощения изобретения опухоль представляет собой глиобластому.

В частных вариантах воплощения изобретения ДНК-аптамер конъюгирован с флуоресцентной меткой. Более конкретно флуоресцентная метка представляет собой краситель инфракрасного диапазона или краситель диапазона в пределах 400-700 нм. В некоторых вариантах воплощения изобретения флуоресцентная метка представляет собой Cy 7.5, фотодитазин, FAM, Cy 5 или Cy 5.5.

Предметом настоящего изобретения также является комбинация ДНК-аптамеров, специфичных к клеткам опухоли головного мозга и имеющих последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Предметом настоящего изобретения также является применение ДНК-аптамера по изобретению или комбинации ДНК-аптамеров по изобретению для интраоперационного окрашивания клеток опухоли головного мозга.

Кроме того, настоящее изобретение включает композицию для интраоперационного окрашивания клеток опухоли головного мозга, включающую эффективное количество, по меньшей мере, одного ДНК-аптамера по изобретению, и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В частных вариантах воплощения изобретения фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой буфер. Более конкретно буфер представляет собой фосфатный буфер, содержащий ионы Ca²⁺ и Mg²⁺.

В частных вариантах воплощения изобретения ДНК-аптамер конъюгирован с флуоресцентной меткой. Более конкретно флуоресцентная метка представляет собой краситель инфракрасного диапазона или краситель диапазона в пределах 400-700 нм. В некоторых вариантах воплощения изобретения флуоресцентная метка представляет собой Cy 7.5, фотодитазин, FAM, Cy 5 или Cy 5.5.

В частных вариантах воплощения композиция по изобретению представляет собой спрей.

В частных вариантах воплощения композиция по изобретению включает два ДНК-аптамера, характеризующихся последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Предметом настоящего изобретения также является способ интраоперационного окрашивания клеток опухоли головного мозга, включающий обработку ткани мозга композицией по изобретению.

В частных вариантах воплощения изобретения обработка ткани мозга осуществляется посредством распыления композиции в виде спрея.

В частных вариантах воплощения изобретения обработку ткани мозга осуществляют после удаления основного некротического очага опухоли.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- получены ДНК-аптамеры, специфичные к клеткам опухоли головного мозга, в частности, глиобластомы, которые могут применяться для интраоперационного окрашивания клеток опухоли головного мозга;

- ДНК-аптамеры, а также их комбинация, по изобретению характеризуются высокой специфичностью и аффинностью ДНК-аптамеров к клеткам опухоли головного мозга, в частности, глиобластомы;

- ДНК-аптамеры по изобретению обеспечивают повышение точности определения истинных границ опухоли головного мозга, в частности, глиобластомы во время операции, и в результате использования указанных ДНК-аптамеров или их комбинации повышается эффективность лечения онкологического заболевания головного мозга;

- ДНК-аптамеры по изобретению не оказывает острого токсического действия;

- получена эффективная композиция для интраоперационного окрашивания клеток опухоли головного мозга, включающая ДНК-аптамеры или их комбинацию, которые позволяет эффективно окрашивать клетки опухоли головного мозга, в частности, глиобластомы, обеспечивает повышение точности определения истинных границ опухоли головного мозга, в частности, глиобластомы, во время операции, и в результате использования указанной композиции повышается эффективность лечения онкологического заболевания головного мозга;

- композиция по изобретению не оказывает острого токсического действия;

- разработан эффективный способ интраоперационного окрашивания клеток опухоли головного мозга, включающий обработку ткани мозга композицией по изобретению, который позволит с высокой точностью определить локализацию опухолевых клеток, обеспечит эффективную визуализацию опухолевых клеток головного мозга в реальном времени.

Подробное раскрытие изобретения

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Вторичные и третичные структуры аптамеров Gli-233, Gli-233nt, Gli-55, Gli-55_3L.

Фигура 2. Анализ специфичности и аффинности аптамеров Gli-233, Gli-233nt, Gli-55, Gli-55_3L: (A) Гистограмма аптамеров, связывающихся с клетками культур глиобластомы и рака молочной железы (РМЖ), а также клетками, выделенными из мозга здоровой мыши. (B) Данные проточной цитометрии клеток глиобластомы и рака молочной железы, инкубированных с меченными FAM (зеленой флуоресцентной меткой) Gli-233nt и Gli-55_3L. (C) Гистограмма связывания аптамеров с астроцитами и нейросферами в культурах глиобластомы.

Фигура 3. Оценка уровня щелочной фосфатазы, АЛТ, альфа-амилазы, билирубина, холестерина и общего белка в плазме крови мышей после введения комбинации аптамеров Gli-233nt и Gli-55_3L.

Фигура 4. Световая (А1, B1, С1) и ИК-микроскопия (А2) головного мозга мышей (А1, стрелка 2), опухоли черепа (А1, стрелка 1), поперечного среза головного мозга (B1) и органов (C1) с ортотопически ксенотрансплантированной глиобластомой после поверхностного нанесения смеси аптамеров. Окрашивание гематоксилином и эозином подтвердило образование глиальных опухолей в мозге мышей (A1.1-A1.4) и внутри черепа (B1.1, B1.2).

Фигура 5. Обоснование применимости аптамеров для флуоресцентной хирургии глиальной опухоли, продемонстрированной на ортотопически ксенотрансплантированной глиобластоме головного мозга кролика и ПЭТ/КТ с ¹¹С-метионином (А3). Первичная культура глиальной опухоли (А1), трансплантированная в мозг кроликов через внутричерепные окна (А2). Световая (В1) и ИК-микроскопия (В2-В3) глиальных опухолей кроликов после поверхностного внутричерепного применения аптамеров по изобретению. Окрашивание гематоксилином и эозином подтвердило образование глиальных опухолей в мозге кроликов (C1, C2). Мозг кролика без глиобластомы не окрасился комбинацией аптамеров, поскольку не излучал в ИК-диапазоне (D1-световая микроскопия, D2-D3-ИК-микроскопия).

Фигура 6. Специфическое окрашивание глиальных опухолевых клеток в хирургически удаленных тканях глиобластомы. На панелях A1 и B1 аптамеры использовались для окрашивания мультиформных тканей глиобластомы (A1) и саркоматоидной области (B1). На панели С1 показано окрашивание неспецифическим олигонуклеотидом (С1), который не связывается с глиальными опухолями. Соседние срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, использовали для сравнения на панелях A2, B2 и C2.

Фигура 7. Флуоресцентная микроскопия аптамеров (А1-А3) в концентрациях 0 мкМ (1); 1 мкМ (2) и 2 мкМ (3). Ткани глиальной опухоли, инкубированные с аптамерами, меченными Cy 7.5 (№1 - Gli-233nt, №2 - Gli-55_3L) в концентрациях 1-8 мкМ под ИК-модулем хирургического микроскопа Zeiss Kinevo 900. На панели А аптамеры меченый Cy 7.5 были во флаконах по 1,5 мл. На панели B образцы тканей находились в 96-луночном планшете.

Фигура 8. Ткани глиобластомы проинкубированные аптамерами в концентрациях 0 мкМ (А), 1 мкМ (B), 2 мкМ (С), 3 мкМ (D), 5 мкМ (Е) и 8 мкм (F) и визуализированные с использованием ИК-модуля хирургического микроскопа Zeiss Kinevo 900.

Фигура 9. Распределение аптамеров с ИК-красителем у здоровых мышей после внутривенного введения в световом поле и ИК-флуоресценции. Мыши до инъекции (A1-A2), через 5 минут (B1-B2), 40 минут (C1-C2), 90 минут (D1-D2) и 24 часа (E1-E2) после инъекции в хвостовую вену. Накопление аптамеров в органах (F): головной мозг, почки, селезенка, печень, кишечник, желчный пузырь, легкие, сердце.

Фигура 10. Распределение аптамеров с ИК-меткой у здоровых мышей с внутричерепным окном после подкожной инъекции, зарегистрированном в световом поле (A1-D1) и ИК-флуоресценции (A2-D2). Мыши 5 минут (А1-A2), 40 минут (B1-B2), 90 минут (С1-C2). Накопление аптамеров в органах (D1-D2): 1 - головной мозг, 2 - почки, 3 - селезенка, 4 - печень, 5 - кишечник, 6 - желчный пузырь, 7 - легкие, 8 - сердце, 9 - брюшинная клетчатка.

Фигура 11. Распределение аптамеров с ИК-меткой у мышей после инъекции в хвостовую вену, зарегистрированном в световом поле (A1-E1) и ИК-флуоресценции (A2-E2). Мыши 5 минут (А1-A2), 40 минут (B1-B2), 90 минут (C1-C2, D1-D2). Накопление аптамеров в органах (E1-E2): головной мозг опухоль внутри черепа, почки, селезенка, кишечник, печень, легкие, сердце.

Определения (термины)

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины и аббревиатуры, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, например такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать, как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «ДНК-аптамер» в контексте настоящего изобретения относится к однонитевым олигонуклеотидам, принимающим специфическую третичную структуру, позволяющую им связываться с молекулярными мишенями с высокими специфичностью и аффинностью. Последовательности аптамеров по изобретению следующие:

Номера последовательностей нуклеотидов, упоминаемых в настоящем документе, соответствуют номеру в Перечне последовательностей (SEQ ID NO) согласно Стандарту ST.26, являющемуся частью настоящего описания изобретения. В случае наличия разночтений в структуре последовательностей между упоминанием в тексте описания и соответствующей последовательностью в Перечне последовательностей согласно стандарту ST.26, приоритетными являются данные, приведенные в тексте описания.

Получение аптамера согласно настоящему изобретению может проводиться с применением стандартных для данной области техники способов. Неограничивающие примеры техник для получения аптамеров включают селекцию аптамеров in vitro, in vivo c последующими секвенированием и химическим синтезом, которые являются коммерчески доступными, молекулярное моделирование или селекцию in silico (c применением компьютерных технологий) с последующим химическим синтезом.

Детектируемые реагенты (метки) для оптической визуализации включают, например, флуоресцеин, производное флуоресцеина, и ряд других флуоресцентных соединений, таких как Cy3, Cy2, Cy5, Cy 7, Cy7.5, семейство флуоресцентных меток Alexa Fluor® (Molecular Probes, Inc.), карбоксифлуоресцеин (FAM) и флуоресцеин -изотиоцианат (ФИТЦ) фотодитазин, флуоресцентные нанокластеры, Brillrant Violet и другие флуоресцентные метки со спектрами излучения и испускания в диапазоне 400-700 нм, 700-900 нм.

Связывание аптамера согласно настоящему изобретению и метки для получения меченного аптамера согласно настоящему изобретению может осуществляться с применением техник конъюгации, хорошо известных специалисту в данной области техники. Результат представляет собой ковалентную связь между аптамером согласно настоящему изобретению и метки. Конъюгация может включать связывание первичных аминов на 5'-конце аптамера согласно настоящему изобретению с меткой во время химического синтеза аптамера. Также конъюгация может осуществляться за счет взаимодействий стрептавидин-биотин, аминогруппа-карбоксильная группа, в зависимости от того какие модификации имеют аптамер и краситель, или через холестерин в случае, если краситель заключен в липосому, а аптамер имеет холестерин для связывания.

Под «эффективным количеством» подразумевается такое количество ДНК-аптамера (или комбинации ДНК-аптамеров), наносимого на опухолевые клетки, при котором с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция. Точное требуемое количество может меняться в зависимости от различных факторов.

Термин «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» при использовании в настоящем описании относится к веществам, которые не нарушают биологической активности и свойств ДНК-аптамеров и являются приемлемыми для использования в медицине. В частных вариантах воплощения изобретения фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой носитель и/или растворитель. Более конкретно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой буфер, например фосфатный буфер, содержащий ионы Ca²⁺ и Mg²⁺.

Термин «интраоперационно» в настоящем документе означает «во время проведения операции».

Осуществление изобретения

Способ визуализации глиобластомы человека по изобретению осуществляют следующим образом. После удаления центрального некротического очага опухоли во время проведения операции ткань мозга обрабатывают ДНК-аптамером, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 (далее Gli-233nt и Gli-55_3L соответственно) или их комбинацией, связанных с ИК-красителем или другими флуоресцентными метками, в частности, с Cy 7.5, в конечных концентрациях 50 нМ - 7 мкМ в зависимости от выбора красителя и регистрирующего оборудования. При этом указанные ДНК-аптамеры или их комбинация могут применяться в составе композиции, в которой указанные ДНК-аптамеры или их комбинация разведены в фосфатно-солевом буфере, содержащем, в частности, 10 г/л Са²⁺ и 10 г/л Mg²⁺, pH 7.4. После локализации очагов свечения, окрашенные участки удаляют, а затем снова наносят композицию по изобретению, в частности в виде спрея. Процедуру повторяют несколько раз в зависимости от глубины прорастания опухоли. Визуализацию ткани глиобластомы осуществляют с помощью ИК-модуля хирургического флуоресцентного микроскопа или другого аналогичного оборудования.

Аптамеры по изобретению были синтезированы с использованием автоматизированного фосфорамидитного (аминофосфатного) метода, который основан на использовании фосфорамидитных мономеров нуклеотидов с защитными группами, чувствительными к кислоте. В этом процессе активирующий агент связывает каждый мономер с растущей олигонуклеотидной цепью на твердой подложке. После каждого этапа связывания фосфатная связь нестабильного фосфорамидитного мономера окисляется, превращаясь в фосфатный мономер. Затем происходит деблокирование, что готовит олигонуклеотид к следующему циклу синтеза. По завершении всех циклов, олигонуклеотид с желаемой последовательностью отщепляется от твердого подложки. В результате были получены олигонуклеотиды с заданной последовательностью.

Вторичные структуры аптамеров были предсказаны с использованием программы mFold (10.1093/nar/gkg595), учитывая температуру сворачивания и наличие ионов в растворе. Третичные структуры аптамеров были построены с использованием программ SimRNA (10.1093/nar/gkv1479) и VMD (10.1016/0263-7855(96)00018-5, https://doi.org/10.1038/s41598-017-01348-5). Молекулярные динамические симуляции продолжительностью 200 нс были выполнены с использованием пакета GROMACS 2019.8 (https://doi.org/10.1016/j.softx.2015.06.001). Для симуляций были использованы силовое поле Amber14sb (10.1021/acs.jctc.5b00255) и модель TIP3P (10.1063/1.445869) для воды. Аптамер был растворен в периодической кубической ячейке с водой. Отрицательный заряд аптамеров был скомпенсирован ионами Na+. Дополнительные ионы Na⁺ и Cl^- были добавлены в систему для достижения концентрации 0,15 M. Молекулярно-динамические симуляции были выполнены в ансамбле NPT (при постоянном числе частиц N, давлении P и температуре T) при 310 К и 1 атм давлении с использованием термостата с регулировкой скорости (10.1063/1.2408420) и при 1 бар давлении с использованием баростата Парринелло-Рамана (doi.org/10.1063/1.328693). Анализ кластеризации полученных траекторий был выполнен с использованием алгоритма порогового качества, реализованного в программе VMD (10.1101/gr.9.11.1106).

Вторичная и третичная структуры аптамеров по изобретению (В, D фиг.1), а также их аналогов (A, C фиг.1), представлены на фигуре 1.

Для аптамеров по изобретению были проведены молекулярно-динамические симуляции, чтобы имитировать условия in vitro: раствор, температуру и присутствие ионов. Третичные структуры аптамеров, полученные в результате кластерного анализа 200 нс траекторий MD (молекулярной динамики), представляют структуру аптамеров в растворе и показаны на фигуре 1.

Связывание аптамеров Gli-233, Gli-233nt, Gli-55, Gli-55_3L оценивали с помощью проточной цитометрии. Для эксперимента использовали культуры, полученные из тканей глиобластомы, рака молочной железы и клеток, выделенных из мозга здоровой мыши (фигура 2 А). Как показано на фигуре 2 B, клетки глиобластомы, полученные из культур, состояли из двух типов: астроцитов и нейросфер, которые представляют собой скопления нейрональных стволовых клеток. Во всех случаях аптамеры демонстрировали лучшее связывание с астроцитами, чем с нейросферами, хотя наблюдалось связывание с нейросферами (Фиг. 2 C).

В клетках рака молочной железы диаграмма рассеяния показала равномерное распределение. На фигуре 2В в качестве примера показана проточная цитометрия аптамеров Gli-233nt и Gli-55_3L. На фиг. 2 С представлена гистограмма, полученная для аптамеров Gli-233, Gli-55, Gli-233nt и Gli-55_3L в сравнении с неспецифическим олигонуклеотидом (AG FAM) и ДНК-библиотекой олигонуклеотидов.

Как видно из полученных данных, Gli-233nt и Gli-55_3L имели более высокий процент связывания с клетками глиобластомы и меньший процент связывания с клетками рака молочной железы и клетками, выделенными из мозга здоровой мыши, по сравнению с другими аптамерами-аналогами.

Для разработки композиции по изобретению (в частности, в виде спрея), включающей аптамеры по изобретению, синтезированных с меткой Cy 7.5, для интраоперационного окрашивания использованы аптамеры Gli-233nt и Gli-55_3L по изобретению.

Кроме того, было показано, что аптамеры Gli-233nt и Gli-55_3L по изобретению, в частности, меченые Cy 7.5, не оказывают острого токсического действия (фиг.3). Острую токсичность Gli-233nt и Gli-55_3L, меченных Cy 7.5, оценивали по изменению биохимических показателей крови: уровня общего белка, уровня холестерина и уровня билирубина; активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), активность щелочной фосфатазы и активность альфа- амилазы. Данные параметры выбраны потому, что они отражают функции поджелудочной железы, почек и печени. Уровень общего белка свидетельствует о белковом обмене в организме, а также о функции печени и почек. Билирубин - желчный пигмент, образующийся при распаде белков, содержащих гем (гемоглобин, миоглобин, цитохром), может свидетельствовать о чрезмерном разрушении эритроцитов (гемолитическая желтуха и др.) и нарушении выведения билирубина из организма. Альфа-амилаза, пищеварительный фермент, секретируемый в первую очередь поджелудочной железой и слюнными железами, в минимальных количествах обнаруживаемый в других тканях, может проявлять изменения активности при отравлении, дисфункции поджелудочной и слюнных желез, а также почечной недостаточности. Аланинаминотрансфераза, фермент, присутствующий в клетках печени, проявляет повышенную активность при повреждении клеток печени. Щелочная фосфатаза - фермент, обнаруженный в большинстве тканей с преимущественной локализацией в печени, костях и плаценте, проявляет более высокую активность при повреждении ткани печени, костей и почек. Холестерин, важный метаболит, синтезируемый в печени и используемый для синтеза гормонов, производства желчных кислот и синтеза витамина D, также играет роль в регуляции проницаемости клеточных мембран. Концентрация холестерина дает представление о функции печени и широком спектре метаболических путей. Исследования показали, что все измеренные биохимические показатели сыворотки крови у мышей как в контрольной, так и в опытной группах оставались в пределах нормы (Miroshnikov M.V., Makarova M.N. Variability of blood biochemical parameters and establishment of reference intervals in preclinical studies. Part 4: Mice. Laboratory Animals for Science. 2021; 3. https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-03-08; Krasnikova E.S., Karmeeva Y.S., Aledo M.M., Krasnikov A.V., Kalganov S.A. Hemato-biochemical status of laboratory mice with a GM corn based diet 2019 IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci. 315 042005).

Таким образом, показано, что аптамеры Gli-233nt и Gli-55_3L по изобретению, меченные Cy 7.5, а также композиция по изобретению их содержащая, не оказывают острого токсического действия на организм мышей.

Пример 1. Интраоперационное окрашивание глиобластомы на животной модели (мыши)

Для проведения исследования мышам с иммуносупрессией трансплантировали глиобластому. Первой группе мышей препарат вводили через хвостовую вену за 30 минут до вскрытия, а второй группе мышей препарат наносили непосредственно на мозг под ингаляционной анестезией. Мозг и органы мышей, фиксированные в формалине, исследовали под операционным микроскопом с инфракрасным модулем.

На фигуре 4 показаны фотографии мозга и органов мышей, которым проводили интраоперационное модельное окрашивание глиобластомой с помощью аптамеров по изобретению, нанесенных непосредственно на мозг (фиг. 4 A1-А2) и тех, кому препарат вводили внутривенно (фиг. 4 B1-B2). Как видно на фотографиях, поверхностного нанесения препарата достаточно для визуализации под хирургическим микроскопом с ИК-модулем. Допускается визуализация участков опухоли (А2) при хорошем контрастировании. Кроме того, на поперечном разрезе видно, что аптамеры проникли в мозг на 3-4 мм за 3 минуты. Он также метаболизируется в печени (фиг. 4 C2).

Пример 2. Интраоперационное окрашивание глиобластомы на животной модели (кролик)

Для мониторинга развития ортотопически ксенотрансплантированной глиомы человека в головном мозге кроликов использовали ПЭТ/КТ-визуализацию с ¹¹С-метионином (фиг. 5 А3). Накопление ¹¹С-метионина наблюдалось в области трепанационных отверстий головного мозга кролика, а именно в обоих участках трансплантированной глиомы (фиг. 5 А3).

Ткань мозга, не затронутая глиобластомой, и область мозга с растущей опухолью окрашивалась комбинацией аптамеров по изобретению и фиксировалась в формалине для анализа с помощью хирургического флуоресцентного микроскопа (фиг. 5 B1-B3). В результате анализа выявлена инфракрасная флуоресценция глиобластомы кролика под хирургическим флуоресцентным микроскопом. Неокрашенная ткань головного мозга и здоровая ткань головного мозга, окрашенная аптамерами, не излучали флуоресценцию в этом диапазоне длин волн (фиг. 5 D1-D3). Ткань головного мозга с глиомой, окрашенная аптамерами, демонстрировала стабильную флуоресценцию в инфракрасной области спектра.

Окрашивание гематоксилином и эозином подтвердило наличие глиальных опухолевых образований в головном мозге и черепе кролика (фиг. 5 C1-C2).

Результаты подтверждают потенциал применения аптамеров, меченных инфракрасным красителем, в качестве интраоперационного красителя для обнаружения и визуализации глиомы человека на модели кролика. Таким образом, метод может иметь существенное значение для повышения хирургической точности и удаления опухолей у пациентов с глиомой.

Пример 3. Окрашивание послеоперационной ткани глиобластомы с помощью аптамеров, связанных с меткой FAM.

Послеоперационные ткани человека инкубировали с 1 нг/мл дрожжевой РНК в течение 30 минут на шейкере. После этого его промывали два раза и инкубировали с 50 нМ FAM-меченным Gli-233nt или Gli-55_3L в течение 30 минут на шейкере и фиксировали в 10% забуференном растворе формалина. Объем фиксатора в 10 раз превышал размер погруженной ткани. Образцы подвергались стандартной гистологической обработке на основе изопропилового спирта с дальнейшей пропиткой парафином.

Далее, на стекла наносились срезы из парафиновых блоков. Одну часть срезов оставляли на конфокальную микроскопию без дополнительного окрашивания; следующий окрашивали красителями гематоксилином и эозином для подтверждения морфологии ткани.

Гистологические срезы тканей головного мозга мышей и кроликов, которым перевивали клетки глиобластомы человека, фиксировали в растворе формалина, окрашивая красителями гематоксилином и эозином для подтверждения морфологии тканей.

Для конфокальной визуализации использовали Nexcope NIB900 (Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd., Китай) и конфокальный микроскоп LSM 780 NLO (Carl Zeiss, Германия); изображения были обработаны с помощью программного обеспечения ZEN2.

По сравнению с гистологическим анализом гематоксилина и эозина показано, что аптамеры по изобретению специфически связываются с глиобластомой. Меченные FAM Gli-233nt и Gli-55_3L в концентрации 50 нМ объединяли вместе и использовали для окрашивания тканей ex vivo. Гистологический анализ показал, что аптамеры действительно окрашивали глиальные опухоли (фиг.6 A1-A2, B1-B2) по сравнению с FAM-неспецифическим олигонуклеотидом, который не окрашивал (фиг. 6 C1-C2) ткани опухоли головного мозга.

Аптамеры по изобретению специфически связывались с глиальными опухолевыми клетками, о чем свидетельствует отчетливый рисунок окрашивания мультиформной области глиобластомы (фиг. 6 А1-A2), а также четко различимая саркоматоидная область глиальной опухоли (фиг. 6 В1-B2).

Пример 4. Исследование аптамеров по изобретению в различных концентрациях

Различные концентрации аптамеров по изобретению, меченых Cy 7.5 для хирургии, оценивали с помощью флуоресцентного хирургического микроскопа. На фигурах 7 и 8 показаны послеоперационные ткани глиобластомы, на которые наносили аптамеры в концентрациях от 1 до 8 мкМ.

Частным вариантом концентрации аптамеров Gli-233nt и Gli-55_3L является 5 мкМ.

Пример 5. Оценка механизма и времени выведения аптамеров из организма мышей.

Основной целью эксперимента по моделированию интрацоперционного окрашивания был выбор стратегии введения аптамеров: внутривенная инъекция или поверхностное нанесение. Поверхностное нанесение позволяет снизить дозу препарата и потенциальное токсическое воздействие на пациента, а также снизить риск деградации олигонуклеотидов в крови под действием нуклеаз. Внутривенное введение позволяет окрасить весь участок опухоли непосредственно перед операцией, что может помочь хирургу. Однако существует риск того, что препарат может не проникнуть через гематоэнцефалический барьер.

Для определения оптимальной стратегии введения аптамеров использовались здоровые мыши и мыши с ортотопически трансплантированной глиобластомой человека.

Время циркуляции аптамеров в крови оценивали на здоровых мышах при внутривенном и подкожном введении (фиг. 9) возле трепанационного отверстия черепа (фиг. 10).

ИК-флуоресценцию аптамеров у мышей оценивали с помощью системы визуализации Fluor i In Vivo (Южная Корея). Перед инъекцией у мышей не наблюдалось фоновой ИК-флуоресценции (фиг. 9 A1-А2). Через пять минут после инъекции в хвостовую вену тела мышей также не излучали достаточную флуоресценцию (фиг. 9 B1-B2). Однако через 40 минут аптамеры распределились по всему телу (фиг. 9 С1-C2). Через девяносто минут после инъекции краситель стал виден в брюшной полости (фиг. 9 D1-D2), и накапливались в печени, желчном пузыре, почках и кишечнике (фиг. 9 F1-F2). Через 24 часа остаточная флуоресценция визуализировалась только в хвосте в случае разрыва вены во время инъекции (фиг. 9 E1-E2).

При внутричерепном применении аптамеры визуализировались на голове в месте нанесения в течение как минимум 90 минут (фиг. 10 A1-A2-C1-C2). Он также метаболизировался в печени и селезенке, фильтровался почками и выводился через кишечник. Через 2 часа его все еще можно было увидеть в мозгу в месте нанесения (рис. фиг. 10 D1-D2).

У мышей с ортотопически ксенотрансплантированными глиомами наблюдалось аналогичное распределение этого препарата при внутривенном введении (фиг. 11). Через сорок минут после инъекции комбинации аптамеров Gli-233nt и Gli-55_3L можно было визуализировать в инфракрасных спектрах головного мозга в том месте, где была трансплантирована опухоль. Через 90 минут опухоль оставалась видимой и стала видна в брюшной полости (фиг. 11 D2). Можно было наблюдать, что аптамеры накапливались в печени, желчном пузыре, почках и кишечнике (фиг. 11 E2).

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="4103361.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-12-06">

<ApplicantFileReference>4103361</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

ответственностью «АПТАМЕРЛАБ»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Obschestvo s ogranichennoi otvetstvennostiu

&quot;APTAMERLAB&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Аптамеры для интраоперационного

окрашивания глиобластомы и способ их применения</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttccactgcaacaactgaacggctggaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>44</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..44</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctagcattcctggcgttattaacggagcagtcctgtggagtggg</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к ДНК-аптамеру, специфичному к клеткам глиальной опухоли головного мозга. Указанный аптамер имеет последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Настоящее изобретение также относится к конъюгату указанного ДНК-аптамера с флуоресцентной меткой, композиции, содержащей указанный конъюгат, а также способу интраоперационного окрашивания клеток глиальной опухоли головного мозга, предусматривающему использование такой композиции. Изобретение обеспечивает высокую специфичность и аффинность ДНК-аптамеров к клеткам глиобластомы и повышение точности определения истинных границ указанной опухоли во время операции. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 пр.

1. ДНК-аптамер, специфичный к клеткам глиальной опухоли головного мозга и имеющий последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

2. ДНК-аптамер по п.1, в котором глиальная опухоль представляет собой глиобластому.

3. Конъюгат ДНК-аптамера с флуоресцентной меткой для интраоперационного окрашивания клеток глиальной опухоли головного мозга, в котором ДНК-аптамер, специфичный к клеткам глиальной опухоли головного мозга и имеющий последовательность как определено по п.1.

4. Конъюгат по п.3, в котором флуоресцентная метка представляет собой краситель инфракрасного диапазона или краситель диапазона в пределах 400-700 нм.

5. Конъюгат по п.4, в котором флуоресцентная метка представляет собой Cy 7.5, фотодитазин, FAM, Cy 5 или Сy 5.5.

6. Конъюгат по п.3, в котором флуоресцентная метка расположена на 5'-конце аптамера.

7. Композиция для интраоперационного окрашивания клеток глиальной опухоли головного мозга, включающая эффективное количество, по меньшей мере, одного конъюгата ДНК-аптамера с флуоресцентной меткой по любому из пп.3-6, и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

8. Композиция по п.7, в которой фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой буфер.

9. Композиция по п.8, в которой буфер представляет собой фосфатный буфер, содержащий ионы Ca2+ и Mg2+.

10. Композиция по п.7, в которой флуоресцентная метка представляет собой краситель инфракрасного диапазона или краситель диапазона в пределах 400-700 нм.

11. Композиция по п.10, в которой флуоресцентная метка представляет собой Cy 7.5, фотодитазин, FAM, Cy 5 или Сy 5.5.

12. Композиция по п.7, которая представляет собой спрей.

13. Композиция по п.7, включающая два конъюгата ДНК-аптамера с флуоресцентной меткой, характеризующихся последовательностями ДНК-аптамера SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.

14. Способ интраоперационного окрашивания клеток глиальной опухоли головного мозга, включающий обработку ткани мозга композицией по любому из пп.7-13.

15. Способ по п.14, в котором обработка ткани мозга осуществляется посредством распыления композиции в виде спрея.

16. Способ о п.14, в котором обработку ткани мозга осуществляют после удаления основного некротического очага опухоли.