АДГЕЗИВНЫЕ КОМПЛЕКСНЫЕ КОАЦЕРВАТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК A61L24/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной патентной заявки США № 61/023173, поданной 24 января 2008 г. Тем самым данная заявка включена в настоящий документ путем ссылки в своем полном объеме в отношении всего содержания.

Уровень техники

Переломы костей вызывают серьезную озабоченность здравоохранения в современном обществе. В дополнение к перелому как таковому с переломом связан ряд дополнительных факторов риска для здоровья. Например, внутрисуставные переломы представляют собой травмы костей, которые распространяются на поверхность сочленения и разрывают хрящевую поверхность сустава на кусочки. Повреждения хрящевой поверхности часто приводят к инвалидизирующему посттравматическому артриту. Основными определяющими факторами развития посттравматического артрита считается количество энергии, сообщаемой во время травмы, генетическая предрасположенность пациента (или ее отсутствие) к посттравматическому артриту, обеспечение репозиции и тщательность ее осуществления. Из трех прогностических факторов только достижение и обеспечение репозиции является фактором, поддающимся контролю со стороны врачей-ортопедов. Особенно трудно поддерживать в репозиционном (выпрямленном) положении оскольчатые травмы суставной поверхности (хрящевой) и метафиза (части кости, непосредственно прилегающей к хрящу). Такие трудности связаны с характерными особенностями и типом кости в данной области. Они также связаны с ограничениями фиксации с помощью имплантов из титана или нержавеющей стали.

В настоящее время использование имплантов из нержавеющей стали и титана является основным способом фиксации, но их размер и необходимость просверливания костей при их установке часто препятствуют точной обработке и репозиции более мелких кусочков кости и хряща. В качестве альтернатив механической фиксации испытано множество костных адгезивов. Они делятся на четыре категории: полиметилметакрилаты (PMMA), клеи на основе фибрина, кальцийфосфатные (CP) цементы и CP-полимерные композиты. PMMA-цементы, применяемые для фиксации протезов, имеют хорошо известные недостатки; один из наиболее серьезных недостатков состоит в том, что тепло, выделяемое в результате экзотермической реакции отверждения, может разрушать примыкающую костную ткань. Также недостаточное сцепление с костью приводит к асептическому расшатыванию - главной причине поломки протеза, фиксируемого с помощью PMMA-цемента.

С 1970-х г. для фиксации костных трансплантатов и восстановления хряща испытывались фибриновые клеи, основанные на фибриногене - белке системы свертывания крови, но до сих пор они не нашли широкого применения. Один из недостатков фибриновых клеев заключается в том, что их производят из смешанной донорской крови (от нескольких доноров). По этой причине они несут с собой риск передачи инфекций, и их применение потенциально может быть ограничено поставкой.

CP-цементы представляют собой порошки, состоящие из одной или нескольких форм CP, например, тетракальцийфосфата, ангидрида дикальцийфосфата и β-трикальцийфосфата. Когда порошок смешивают с водой, он образует пасту, которая отверждается и становится твердой за счет переплетения одной или нескольких форм кристаллов CP, включая гидроксиапатит. Преимущества CP-цементов включают изотермическое отверждение, доказанную биологическую совместимость, остеокондуктивность, и они выполняют функцию резервуара ионов Ca и PO₄ для образования гидроксиапатита во время процесса срастания кости. Наиболее важные недостатки заключаются в том, что CP-цементы крошатся, обладают низкой механической прочностью и, следовательно, не являются идеальными для стабильной репозиции мелких суставных сегментов. Чаще всего CP-цементы применяются в качестве материала для заполнения пустот в кости. Недостаточные механические свойства CP-цементов привели к появлению композитных цементов на основе CP-частиц и полимеров. Путем изменения объемных долей фазы, присутствующей в виде частиц, и полимерной фазы модуль (упругости) и прочность клея можно доводить почти до модуля и прочности природной кости - путь, который также открыт для нас.

Принимая во внимание воздействие, которое переломы костей оказывают на общее самочувствие пациента, и несовершенное состояние принятых в настоящее время способов фиксации необходимы новые способы фиксации.

Сущность изобретения

В настоящей заявке описан синтез адгезивных комплексных коарцеватов. Адгезивные комплексные коарцеваты состоят из смеси одного или нескольких поликатионов, одного или нескольких полианионов и одного или нескольких многовалентных катионов. Поликатионы и полианионы при отверждении сшиваются друг с другом ковалентными связями. Адгезивные комплексные коарцеваты обладают несколькими необходимыми признаками по сравнению с традиционными адгезивами, которые эффективны в областях применения, основанными на воде. Описанные здесь адгезивные комплексные коарцеваты при нанесении на субстрат обладают низким межфазным поверхностным натяжением в воде (то есть они растекаются по поверхности раздела вместо того, чтобы собираться в капли). Кроме того, способность комплексного коарцевата к межмолекулярной кросс-сшивке повышает когезионную прочность (прочность сцепления) адгезивного комплексного коарцевата. Адгезивные комплексные коарцеваты находят применение в многочисленных биологических областях в качестве биоадгезивов и средств доставки лекарственных средств. В частности, описанные здесь адгезивные комплексные коарцеваты особенно применимы в областях, связанных с применением в подводных условиях, и в ситуациях, где присутствует вода, например, таких как физиологические условия.

Преимущества изобретения частично будут изложены в описании, которое следует ниже, и частично будут очевидны из описания или с ними можно ознакомиться на практике при осуществлении описанных ниже вариантов изобретения. Описанные ниже преимущества будут реализованы и достигнуты посредством элементов и комбинаций, в частности перечисленных в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что как вышеизложенное общее описание, так и последующее подробное описание являются только иллюстративными и поясняющими, но не ограничительными.

Краткое описание чертежей

Сопроводительные чертежи, которые включены в данное описание и составляют часть данного описания, иллюстрируют несколько описанных ниже вариантов изобретения.

На фигуре 1 показана модель pH-зависимой структуры коацервата и механизмы адгезии. (A) Полифосфат (черный) с низкой плотностью заряда, спаренный с полиамином (красный), образует комплексы размером порядка нм. Комплексы обладают суммарным положительным зарядом. (B) Вытянутые полифосфаты с высокой плотностью заряда образуют сетчатую структуру, связанную более компактными полиаминами с более низкой плотностью заряда и двухвалентными катионами (зеленые символы), в случае их присутствия. Суммарный заряд на сополимерах является отрицательным. (C) Окисление 3,4-дигидроксифенола (D) кислородом (O₂) или добавленным окислителем инициирует кросс-сшивку между хиноном (Q) и боковыми цепями из первичного амина. Коацерват может присоединяться к гидроксиапатитной поверхности (кости) посредством электростатических взаимодействий, боковых цепей 3,4-дигидроксифенола и ковалентного связывания с белками матрикса, опосредованного хиноном.

На фигурах 2-7 показано несколько белковых последовательностей, продуцируемых червями P. Californica, которые могут применяться в настоящем изобретении в качестве поликатионов и полианионов, а также синтетические поликатионы и полианионы, применимые в настоящем изобретении.

На фигуре 8 показаны различные механизмы DOPA-сшивания.

На фигуре 9 показаны системы парных шприцов, предназначенные для нанесения тонких "швов точечной сварки" из описанных здесь комплексных коарцеватов на подлежащие заживлению переломы (A), мелкие повреждения костей (B) или для сцепления трехмерных синтетических подложек-носителей с костной тканью (C).

На фигуре 10 показаны структура и характеристика миметических сополимеров в видимой и УФ-областях. (A) Pc3-аналог (1) содержал 88,4 мол.% фосфата, 9,7 мол.% допамида и 0,1 мол.% боковых цепей FITC. Pc1-аналог (2) содержал 8,1 мол.% аминсодержащих боковых цепей. В обоих случаях существует баланс акриламидных субъединиц. (B) В спектре 1 присутствовал единичный пик при 280 нм, характеристический для катехиновой формы 3,4-дигидроксифенола. После окисления под действием NaIO₄ появлялся пик при 395 нм, соответствующий хиноновой форме, подтверждая ожидаемый окислительно-восстановительный характер полимера, содержащего 3,4-дигидроксифенол.

На фигуре 11 показана pH-зависимая комплексная коацервация смешанных полиэлектролитов. (A) При низком pH смесь 1 и 2 (50 мг/мл), содержащая равные количества аминсодержащих и фосфатсодержащих боковых цепей, образует стабильный коллоидный раствор PEC. По мере повышения pH полимеры конденсировались в густую жидкую фазу, содержащую комплексный коарцеват. При pH 10 сополимеры переходили в раствор и сшивались при окислении в прозрачный гидрогель. (B) Суммарный заряд боковых цепей сополимера как функцию pH рассчитывали из плотностей боковых цепей сополимера. (C) Диаметр PEC (колец) увеличивался почти в три раза в пределах диапазона pH 2-4. При pH выше 4 комплексы коагулировали, и их размер нельзя было измерить. Дзэта-потенциал (квадраты) равнялся нулю около pH 3,6 в соответствии с рассчитанным суммарным зарядом.

На фигуре 12 показан жидкий характер адгезивного комплексного коарцевата. Раствор 1 и 2 содержал равные количества аминсодержащих и фосфатсодержащих боковых цепей при pH 7,4.

На фигуре 13 показана фазовая диаграмма полиэлектролитов и двухвалентных катионов. Отношения аминсодержащей боковой цепи к фосфатсодержащей боковой цепи и фосфатсодержащей боковой цепи к двухвалентному катиону меняли при фиксированном значении pH 8,2. Состояние растворов представлено на серой шкале. Масса (мг) фазы коацервата указана в темно-серых квадратах. Композиции, помеченные звездочкой, применяли для испытания адгезионной прочности.

На фигуре 14 показана адгезионная прочность, модуль упругости при сдвиге и стабильность размеров костей, склеенных коацерватом. (A) Адгезионная прочность в месте поломки повышалась на ~50%, и коэффициент жесткости возрастал вдвое, по мере того как отношение двухвалентного катиона к фосфатсодержащим боковым цепям менялось от 0 до 0,4. В качестве эталона применяли влажные образцы, склеенные коммерческим цианоакрилатным адгезивом (n=6 для всех условий). (B) Места соединений в образцах склеенных костей, полностью погруженных в ФСБ на четыре месяца (pH 7,2), набухали незначительно.

На фигуре 15 показаны спектры допаминовых сополимеров в диапазоне УФ - видимая область до и после окисления (pH 7,2). Пик катехина, присутствующий до окисления, подвергался превращению в пик, соответствующий хиноновой форме. Верхний чертеж, слева: p(DMA[8]-Aam[92]). Нижний чертеж, слева: p(AEMA[30]-DMA[8]). Справа: образование гидрогеля при окислительной кросс-сшивке допаминовых сополимеров. (A) p(DMA[8]-Aam[92]). (B) p(EGMP[92]-DMA[8]). (C) Смесь p(DMA[8]-Aam[92]) и p(AEMA[30]-Aam[70]). (D) Смесь p(EGMP[92]-DMA[8]) и p(AEMA[30]- Aam[70]). Числа, заключенные в скобки, указывают мол.% боковых цепей. Области спектров, указанные стрелками, меняются со временем.

На фигуре 16 показана pH-зависимость окисления допамина в поли-(EGMP[92]- DMA[8]). Области спектров, указанные стрелками, меняются со временем. Верхний чертеж: pH 5,0, на вставке - зависимость от времени. Нижний чертеж: pH 6,0.

На фигуре 17 показан прямой контакт (A) фибробластов крайней плоти человека, (B) трахеальных фибробластов человека и (C) первичных астроцитов крыс с адгезивом (автофлуоресцирующие красным фрагменты, белые звездочки). Морфология клеток, секреция фибронектина и мотильность клеток не отличаются от клеток, растущих при отсутствии клея. Зеленый = промежуточные филаментные белки. Красный = секретируемый фибронектин. Синий = окрашенные DAPI ядра.

На фигуре 18 показана многофрагментарная модель повреждения свода черепа крысы. (A) - образование повреждения. (B) - фрагментация костного утолщения. (C) - вправление фрагментов в повреждение. (D) - нанесение костного клея. (E-F) - отверждение (затемнение) клея. На E и F фрагменты прочно зафиксированы.

На фигуре 19 показано влияние pH и нормированного суммарного заряда на образование адгезивных комплексных коарцеватов.

Подробное описание

Перед тем как будут раскрыты и описаны настоящие соединения, композиции, продукты, средства и/или способы, следует понимать, что описанные ниже варианты не ограничиваются конкретными соединениями, способами синтеза или применениями, которые, конечно, могут меняться. Также следует понимать, что применяемая здесь терминология отвечает только цели описания конкретных вариантов изобретения и не подразумевается, что она подлежит ограничению.

В данном описании и в следующей за ним формуле изобретения будет сделана ссылка на ряд терминов, которые должны быть определены и иметь следующие значения.

Следует заметить, что применяемые в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают обозначение множества объектов, за исключением тех случаев, когда в контексте ясно предписывается иное. Таким образом, например, обозначение "фармацевтический носитель" включает смеси двух или более таких носителей и т.п.

"Необязательный" или "необязательно" означает, что описываемые далее случай или условия могут осуществляться или могут не осуществляться, и что описание включает примеры, когда случай или условия осуществляются и примеры, когда случай или условия не осуществляются. Например, фраза "необязательно замещенный низший алкил" означает, что низшая алкильная группа может быть замещенной или может быть незамещенной, и что описание включает как незамещенный низший алкил, так и низший алкил, в котором имеется замещение.

Диапазоны могут выражаться здесь как от "приблизительно" одного конкретного значения и/или до "приблизительно" другого конкретного значения. Если такой диапазон обозначен, еще один вариант изобретения включает диапазон от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Аналогично, когда значения выражены как приблизительные величины, путем применения предшествующего слова "приблизительно", будет понятно, что конкретное значение образует еще один вариант. Кроме того, следует понимать, что предельные значения каждого из диапазонов достоверны как относительно другого предельного значения, так и независимо от другого предельного значения.

В описании и итоговой формуле изобретения упоминания типа "частей по массе" для конкретного элемента или компонента композиции или продукта означают массовое соотношение между элементом или компонентом и любыми другими элементами или компонентами композиции или продукта, для которых применяется выражение "частей по массе". Таким образом, в соединении, содержащем 2 части по массе компонента X и 5 частей по массе компонента Y, X и Y присутствуют в массовом отношении 2:5, и присутствуют в таком отношении независимо от того, содержатся ли в соединении дополнительные компоненты.

Если специально не установлено иначе, массовый процент компонента рассчитывается на основе общей массы препарата или композиции, в которую включен компонент.

Такие переменные, как R¹, R², R³, R⁴, R⁵, X, m и n, применяемые на всем протяжении заявки, представляют собой те же переменные, которые определены выше, если не установлено иначе.

Применяемый здесь термин "алкильная группа" относится к насыщенной углеводородной группе с разветвленной или неразветвленной цепью, содержащей от 1 до 25 атомов углерода, такой как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, пентил, гексил, гептил, октил, децил, тетрадецил, гексадецил, эйкозил, тетракозил и т.п. Примеры алкильных групп с более длинными цепями включают, но не ограничиваются перечисленным, олеатную группу или пальмитатную группу. "Низшая алкильная" группа представляет собой алкильную группу, содержащую от одного до шести атомов углерода.

Любые из описанных здесь соединений могут представлять собой фармацевтически приемлемую соль. При одном из вариантов изобретения фармацевтически приемлемые соли получают обработкой свободной кислоты подходящим количеством фармацевтически приемлемого основания. Типичные фармацевтически приемлемые основания представляют собой гидроксид аммония, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид железа(II), гидроксид цинка, гидроксид меди, гидроксид алюминия, гидроксид железа(III), изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, 2-диметиламиноэтанол, 2-диэтиламиноэтанол, лизин, аргинин, гистидин и т.п. При одном из вариантов изобретения реакцию проводят в воде как таковой или в комбинации (смеси) воды и инертного, смешивающегося с водой органического растворителя при температуре приблизительно от 0°C до приблизительно 100°C, такой как комнатная температура. При определенных вариантах изобретения, где это уместно, молярное отношение описанных здесь соединений к применяемому основанию выбирают таким образом, чтобы обеспечить необходимое отношение для любых конкретных солей. Для получения, например, аммониевых солей из исходного материала в виде свободной кислоты исходный материал можно обрабатывать приблизительно одним эквивалентом фармацевтически приемлемого основания, получая при этом нейтральную соль.

При еще одном варианте изобретения, если соединение обладает основной группой, его можно протонировать кислотой, например, такой как HCl, HBr или H₂SO₄ с образованием катионной соли. При одном из вариантов изобретения реакцию соединения с кислотой или основанием проводят в воде как таковой или в комбинации (смеси) воды и инертного смешивающегося с водой органического растворителя при температуре приблизительно от 0°C до приблизительно 100°C, такой как комнатная температура. При определенных вариантах изобретения, где это уместно, молярное отношение описанных здесь соединений к применяемому основанию выбирают таким образом, чтобы обеспечить необходимое отношение для любых конкретных солей. Например, для получения аммониевых солей из исходного материала в форме свободной кислоты исходный материал можно обрабатывать приблизительно одним эквивалентом фармацевтически приемлемого основания, получая при этом нейтральную соль.

Здесь описаны адгезивные комплексные коарцеваты и области их применения. В общем случае комплексы представляют собой смесь катионов и анионов, взятых в сбалансированных пропорциях, для образования стабильных водных комплексов при необходимом значении pH. Адгезивный комплексный коарцеват содержит, по меньшей мере, один поликатион, по меньшей мере, один полианион и, по меньшей мере, один многовалентный катион, где, по меньшей мере, один поликатион или полианион представляет собой синтетическое соединение, и поликатион и/или полианион при отверждении комплексного коарцевата сшиваются друг с другом. Каждый из компонентов коацервата и способы его получения описаны ниже.

Адгезивный комплексный коарцеват представляет собой ассоциированную жидкость с динамической структурой, в которой отдельные полимерные компоненты диффундируют по всему объему сплошной фазы. Реологически комплексные коарцеваты ведут себя подобно вязким дисперсиям частиц, а не вязкоупругому полимерному раствору. Как описано выше, при нанесении на субстраты либо под водой, либо при увлажнении адгезивные комплексные коарцеваты обладают низким межфазным поверхностным натяжением в воде. Другими словами, комплексный коарцеват равномерно растекается по поверхности раздела вместо того, чтобы собираться в капли. Кроме того, при межмолекулярной кросс-сшивке адгезивный комплексный коарцеват образует прочный, нерастворимый, когезивный материал.

С другой стороны, полиэлектролитные комплексы (PEC), которые могут быть предшественником описанных здесь адгезивных комплексных коарцеватов, представляют собой мелкие коллоидные частицы. Например, как показано на фигуре 11A, раствор PEC при pH 3,1 и 4,2 находится в виде молочно-белого раствора коллоидных частиц с диаметром приблизительно 300 нм. При повышении pH до 7,2 и 8,1 PEC образует жидкую фазу, состоящую из концентрированных полимеров (коацерватная фаза), и разбавленную равновесную фазу. С учетом такого аспекта PEC можно превращать в описанный здесь адгезивный комплексный коарцеват.

Типичная модель отличий фазового поведения полиэлектролитного комплекса и адгезивного комплексного коарцевата представлена на фигуре 1. При низком pH противоположно заряженные полиэлектролиты с помощью электростатических сил собираются в нанокомплексы с положительным суммарным поверхностным зарядом, который стабилизирует суспензию с образованием PEC 1. При повышении pH суммарный заряд комплексов изменяется от положительного до отрицательного, но в сумме остается почти нейтральным. PEC может образовывать рыхлую, выпадающую в осадок фазу, которую можно превращать в комплексный коарцеват 2 путем дальнейшего повышения pH (фигура 1). Таким образом, при определенных вариантах изобретения превращение PEC в комплексный коарцеват можно "инициировать" путем регулирования pH и/или концентрации многовалентного катиона. Например, для превращения PEC в комплексный коарцеват PEC можно получать при pH меньше или равном 4, и pH PEC можно повышать до больше или равного 7,0, от 7,0 до 9,0 или от 8,0 до 9,0. Последующая кросс-сшивка между поликатионом и полианионами (например, окисление и ковалентная кросс-сшивка, которые показаны на фигуре 1,c) приводит к образованию описанного здесь адгезивного комплексного коарцевата.

Поликатионы и полианионы содержат группы, которые при отверждении обеспечивают кросс-сшивку между двумя полимерами с образованием новых ковалентных связей и описанного здесь адгезивного комплексного коарцевата. Механизм кросс-сшивки может меняться в зависимости от выбора кросс-сшивающих групп. При одном из вариантов изобретения кросс-сшивающие группы могут представлять собой электрофилы и нуклеофилы. Например, полианион может содержать одну или несколько электрофильных групп, а поликатионы могут содержать одну или несколько нуклеофильных групп, способных к взаимодействию с электрофильными группами с образованием новых ковалентных связей. Примеры электрофильных групп включают, но не ограничиваются перечисленным, ангидридные группы, сложные эфиры, кетоны, лактамы (например, малеимиды и сукцинимиды), лактоны, эпоксидные группы, изоцианатные группы и альдегиды. Примеры нуклеофильных групп приведены ниже.

При одном из вариантов изобретения способная к кросс-сшивке группа включает ароматическую группу, замещенную гидроксилом, способную подвергаться окислению в присутствии окислителя. При одном из вариантов изобретения ароматическая группа, замещенная гидроксилом, представляет собой дигидроксифенольную или галогенированную дигидроксифенольную группу, например такую как DOPA и катехин (3,4 дигидроксифенол). Например, в случае DOPA, она может быть окислена до допахинона. Допахинон представляет собой электрофильную группу, которая способна к взаимодействию либо с соседней DOPA-группой, либо с другой нуклеофильной группой. В присутствии окислителя, такого как кислород или другие добавки, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, пероксиды, периодаты или окислители на основе переходных металлов (например, NaIO₄ или соединение Fe⁺³), ароматическая группа, замещенная гидроксилом, может подвергаться окислению. При еще одном варианте изобретения кросс-сшивка может происходить между поликатионом и полианионом благодаря кросс-сшивке, активированному светом, через посредство азидогрупп. Опять-таки во время кросс-сшивки такого типа образуются новые ковалентные связи.

Стабильность окисленного сшивателя может меняться. Например, описанные здесь фосфоносодержащие полианионы, которые содержат способные окисляться сшиватели, стабильны в растворе и не подвергаются кросс-сшивке сами с собой. Это позволяет нуклеофильным группам, присутствующим на поликатионе, взаимодействовать с окисленным сшивателем. Это является необходимым признаком изобретения, который обеспечивает образование межмолекулярных связей и в конечном итоге образование прочного адгезива. Примеры применимых нуклеофильных групп включают, но не ограничиваются перечисленным, гидроксильные, тиольные и азотсодержащие группы, такие как замещенные или незамещенные аминогруппы и имидазольные группы. Например, в поликатион могут быть встроены и привнесены нуклеофильные группы, остатки лизина, гистидина и/или цистеина. Такой пример показан на фигуре 8. DOPA-остаток 1 можно окислять до образования остатка допахинона 2. Допахинон представляет собой реакционно-способный промежуточный продукт и может сшиваться (то есть взаимодействовать) с DOPA-остатком на другом полимере или на том же самом полимере с образованием ди-DOPA- группы. Альтернативно остаток допахинона может взаимодействовать с нуклеофилом, например таким как амино, гидроксильные или тиольные группы, путем присоединения по типу реакции Михаэля с образованием новой ковалентной связи. Как показано на фигуре 8, лизильная группа, цистеинильная группа и гистидильная группа взаимодействуют с остатком допахинона с образованием новых ковалентных связей. Несмотря на то, что DOPA представляет собой подходящую кросс-сшивающую группу, в настоящем изобретении можно применять другие группы, например, такие как тирозин. Значение кросс-сшивки для применения описанных здесь адгезивных комплексных коарцеватов будет обсуждаться ниже.

При других вариантах изобретения сшиватели, присутствующие на поликатионе и/или полианионе, могут образовывать координационные комплексы с ионами переходных металлов. Например, ион переходного металла можно добавлять к смеси поликатиона и полианиона, где оба полимера содержат кросс-сшивки, способные к образованию координационной связи с ионом переходного металла. Скорость образования координационных связей и степень диссоциации можно регулировать путем выбора кросс-сшивки, иона переходного металла и pH. Таким образом, в добавление к описанной выше ковалентная кросс-сшивка может происходить благодаря образованию электростатических, ионных или других нековалентных связей. В настоящем изобретении можно применять ионы переходных металлов, например, таких как железо, медь, ванадий, цинк и никель.

Поликатион и полианион обычно состоят из главной полимерной цепи с множеством заряженных групп при конкретном pH. Группы могут быть боковыми по отношению к главной полимерной цепи и/или встроенными в пределах главной полимерной цепи. Поликатион представляет собой любой биологически совместимый полимер с катионными группами или группами, которые можно легко превращать в катионные группы путем регулирования pH. При одном из вариантов изобретения поликатион представляет собой полиаминовое соединение. Аминогруппа может быть разветвленной или являться частью главной полимерной цепи. Аминогруппа может представлять собой первичную, вторичную или третичную аминогруппу, которую можно протонировать с образованием катионной аммониевой группы при выбранном pH. Например, аминогруппу можно получать из остатка лизина, гистидина или имидазола, прикрепленного к поликатиону. В ассоциации с катионными полимерами можно применять любые анионные противоионы. Противоионы должны быть физически и химически совместимы с неотъемлемыми компонентами композиции и не слишком ухудшать эксплуатационные качества продукта, стабильность или эстетические свойства каким-либо образом. Неограничивающие примеры таких противоионов включают галогениды (например, хлорид, фторид, бромид, иодид), сульфат и метилсульфат.

Поликатион может представлять собой синтетический полимер или полимер, встречающийся в природе (то есть продуцируемый организмами). При одном из вариантов изобретения, когда поликатион представляет собой полимер, встречающийся в природе, поликатион представляет собой положительно заряженный белок, продуцируемый червями P. californica. На фигурах 2-6 показаны белковые последовательности нескольких "цементирующих" белков, продуцируемых червями P. californica (Zhao и др. "Cement Proteins of the tube building polychaete Phragmatopoma californica", J. Biol. Chem. (2005) 280: 42938-42944). В таблице 1 представлено содержание (мол.%) аминокислот в каждом белке. Как показано на фигурах 2-5, Pc1, Pc2 и Pc4-Pc8 представляют собой поликатионы, где полимеры являются катионными при нейтральном pH. Чтобы достичь необходимых свойств раствора, можно менять тип и число аминокислот, присутствующих в белке. Например, как показано в таблице 1, Pc1 обогащен лизином (13,5 моль %), в то время как Pc4 и Pc5 обогащены гистидином (12,6 и 11,3 мол.%, соответственно).

В том случае когда поликатион представляет собой синтетический полимер, можно применять множество разных полимеров; однако необходимо, чтобы полимер был биологически совместимым и нетоксичным в отношении клеток и тканей. При одном из вариантов изобретения поликатион включает полиакрилат, содержащий одну или несколько боковых аминогрупп. Например, остов может представлять собой гомополимер или сополимер, полученный полимеризацией акрилатных мономеров, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, акрилаты, метакрилаты, акриламиды и т.п. При одном из вариантов изобретения остов поликатиона представляет собой полиакриламид. При других вариантах изобретения поликатион представляет собой блок-сополимер, где сегменты или части сополимера содержат катионные группы, зависящие от выбора мономеров, применяемых для образования сополимера.

При одном из вариантов изобретения поликатион представляет собой полиаминовое соединение. При еще одном варианте изобретения полиаминовое соединение содержит от 10 до 90 мол.% третичных аминогрупп. При дополнительном варианте изобретения поликатионный полимер содержит, по меньшей мере, один фрагмент формулы I

в которой R¹, R² и R³ независимо представляют собой атом водорода или алкильную группу, X представляет собой атом кислорода или NR⁵, где R⁵ представляет собой атом водорода или алкильную группу, m равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль. При еще одном варианте изобретения R¹, R² и R³ представляют собой метил и m равно 2. Как видно из формулы I, главная полимерная цепь состоит из -CH₂-C(R¹)-C(O)X-, который представляет собой остаток акрилата, метакрилата, акриламида или метакриламида. Остальная часть формулы I (CH₂)_m-NR²R³ представляет собой боковую аминогруппу. На фигуре 3 (структуры C и D) и на фигуре 6 (4 и 7) показаны примеры поликатионов, содержащих фрагмент формулы I, где главная полимерная цепь состоит из акриламидных и метакрилатных остатков. При одном из вариантов изобретения поликатион представляет собой продукт свободнорадикальной полимеризации катионного мономера с третичной аминогруппой (2-диметиламиноэтилметакрилата) и акриламида, молекулярная масса которого составляет от 10 до 20 кДа и который содержит третичный мономер в концентрациях от 15 до 30 мол.%. На фигуре 4 (структуры E и F) и на фигуре 6 (5) представлены примеры поликатионов, применимые в настоящем изобретении, где имидазольные группы напрямую прикреплены к главной полимерной цепи (структура F) или прикреплены к главной полимерной цепи опосредованно через линкер (структура E через метиленовый линкер).

Аналогично поликатиону полианион может представлять собой синтетический полимер или полимер, встречающийся в природе. При одном из вариантов изобретения, когда полианион представляет собой полимер, встречающийся в природе, полианион представляет собой отрицательно заряженный белок, продуцируемый червями P. californica. На фигурах 2 и 7 показаны последовательности двух белков (Pc3a и Pc3b), продуцируемых червями P. californica (Zhao и др. "Cement Proteins of the tube building polychaete Phragmatopoma californica", J. Biol. Chem. (2005), 280: 42938-42944). Как видно из таблицы 1, Pc3a и Pc3b в основном состоят из полифосфосерина, который является анионным при нейтральном pH.

Когда полианион представляет собой синтетический полимер, обычно им является любой биологически совместимый полимер с анионными группами или группами, которые можно легко превращать в анионные группы путем регулирования pH. Примеры групп, которые можно превращать в анионные группы, включают, но не ограничиваются перечисленным, карбоксилат, сульфонат, фосфонат, боронат, сульфат, борат или фосфат. В ассоциации с анионными полимерами можно применять любые катионные противоионы, если удовлетворяются обсуждаемые выше соображения.

При одном из вариантов изобретения полианион представляет собой полифосфат. При еще одном варианте изобретения полианион представляет собой полифосфатное соединение, содержащее от 10 до 90 мол.% фосфатных групп. При дополнительном варианте изобретения полианион включает полиакрилат, содержащий одну или несколько боковых фосфатсодержащих групп. Например, остов может представлять собой гомополимер или сополимер, полученный полимеризацией акрилатных мономеров, включая, но не ограничиваясь перечисленным, акрилаты, метакрилаты, акриламиды и т.п. При одном из вариантов изобретения остов полианиона представляет собой полиакриламид. При других вариантах изобретения полианион представляет собой блок-сополимер, где сегменты или части сополимера содержат анионные группы, зависящие от выбора мономеров, применяемых для образования сополимера. При дополнительном варианте изобретения полианион может представлять собой сульфат гепарина, гиалуроновую кислоту, хитозан и другие биологически совместимые и биоразлагаемые полимеры, обычно применяемые в данной области.

При одном из вариантов изобретения полианион представляет собой полифосфат. При еще одном варианте изобретения полианион представляет собой полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы II

в которой R⁴ представляет собой атом водорода или алкильную группу, и n равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль. При еще одном варианте изобретения R⁴ представляет собой метил и n равно 2. Аналогично формуле I главная полимерная цепь формулы II состоит из остатка акрилата или метакрилата. Остальная часть формулы II представляет собой боковую фосфатную группу. На фигуре 7 (структура B) показан пример полианиона, применимого в настоящем изобретении, который содержит фрагмент формулы II, где главная полимерная цепь состоит из остатков акриламида и метакрилата. При одном из вариантов изобретения полианион представляет собой продукт полимеризации этиленгликольметакрилатфосфата и акриламида, молекулярная масса которого составляет от 10000 до 50000, предпочтительно 30000 и который содержит фосфатные группы в количестве от 45 до 90 мол.%.

Как описано выше, поликатион и полианион содержат группы, способные к кросс-сшивке. Например, полианион может включать одну или несколько групп, которые могут подвергаться окислению, а поликатион содержит один или несколько нуклеофилов, которые могут взаимодействовать с окисленным сшивателем с образованием новых ковалентных связей. Полимеры 3 и 7 на фигуре 6 представляют собой примеры DOPA-остатков, встроенных в полианион и поликатион соответственно. В каждом из указанных полимеров акрилат, содержащий DOPA-остаток в боковой цепи, подвергается полимеризации с подходящими мономерами с образованием полианиона 3 и поликатиона 7 с DOPA-остатками в боковых цепях.

Предполагается, что поликатион может представлять собой соединение, встречающееся в природе (например, белок, продуцируемый червями P. californica), а полианион представляет собой синтетическое соединение. При еще одном варианте изобретения поликатион может представлять собой синтетическое соединение, а полианион представляет собой соединение, встречающееся в природе (например, белок, продуцируемый червями P. californica). При дополнительном варианте изобретения как полианион, так и поликатион представляют собой синтетические соединения.

Адгезивные комплексные коарцеваты также содержат один или несколько многовалентных катионов (то есть катионов с зарядом +2 или более). При одном из вариантов изобретения многовалентный катион может представлять собой двухвалентный катион, состоящий из одного или нескольких щелочноземельных металлов. Например, двухвалентный катион может представлять собой смесь Ca⁺² и Mg⁺². При других вариантах изобретения в качестве многовалентного катиона можно применять ионы переходных металлов с зарядом +2 или более. В дополнение к pH скорость и степень образования коацерватов могут определяться концентрацией многовалентных катионов. Без связи с какой-либо теорией, слабые силы сцепления между частицами в жидкости могут быть опосредованы многовалентными катионами, образующими мостиковые связи с избыточными отрицательными поверхностными зарядами. Применяемое в настоящем изобретении количество многовалентного катиона может меняться. При одном из вариантов изобретения такое количество основано на числе анионных групп и катионных групп, присутствующих в полианионе и поликатионе. В разделе "Примеры" выбор количества многовалентных катионов рассматривается в связи с получением адгезивных комплексных коарцеватов и других физических состояний.

Адгезивный комплексный коарцеват можно синтезировать с помощью ряда различных способов. При одном из вариантов изобретения поликатион, полианион и, по меньшей мере, один многовалентный катион можно смешивать друг с другом, получая при этом адгезивный комплексный коарцеват. Адгезивный комплексный коарцеват можно получать путем добавления подходящего количества многовалентного катиона к смеси полианиона и поликатиона. При еще одном варианте изобретения адгезивный комплексный коарцеват можно получать способом, включающим

(a) получение полиэлектролитного комплекса, содержащего смесь, по меньшей мере, одного поликатиона, по меньшей мере, одного полианиона и, по меньшей мере, одного многовалентного катиона, в которой, по меньшей мере, один поликатион или полианион представляет собой синтетическое соединение, и поликатион и/или полианион содержит, по меньшей мере, одну группу, способную к кросс-сшивке друг с другом; и (b) регулирование pH полиэлектролитного комплекса, концентрации, по меньшей мере, одного многовалентного катиона или их комбинации для образования адгезивного комплексного коарцевата.

При таком варианте изобретения полиэлектролитный комплекс превращается в адгезивный комплексный коарцеват. Способы получения адгезивного комплексного коарцевата in situ описаны ниже.

Что касается применения коацерватов в качестве биологических цементов и средств доставки, описанные здесь адгезивные комплексные коарцеваты обладают многочисленными преимуществами. Например, коацерваты обладают низкой исходной вязкостью, относительной плотностью больше единицы и высоким массовым содержанием воды, низким межфазным поверхностным натяжением в водной окружающей среде; все это отражается на их способности присоединяться к увлажненной поверхности. Дополнительное преимущество, связанное с механизмом химической связи (то есть кросс-сшивке) адгезивных комплексных коарцеватов, включает низкое выделение тепла во время отверждения, которое предотвращает повреждение живой ткани. Для того чтобы избежать выделения тепла при экзотермической полимеризации in situ, компоненты можно подвергать предварительной полимеризации. В основном, такая возможность обусловлена способностью адгезивных комплексных коарцеватов к межмолекулярной кросс-сшивке в очень мягких условиях, которые описаны выше.

Описанные здесь адгезивные комплексные коарцеваты можно наносить на ряд различных биологических субстратов. Субстрат можно подвергать контактированию in vitro или in vivo. Скорость кросс-сшивки адгезивного комплексного коарцевата можно регулировать, например, с помощью pH и присутствия окислителя или других агентов, которые облегчают кросс-сшивку. Один из подходов к нанесению адгезивного комплексного коарцевата на субстрат можно найти на фигуре 9. Способы, представленные на фигуре 9, упоминаются здесь как "точечная сварка", при которой адгезивный комплексный коарцеват наносится на различные и конкретные участки субстрата. При одном из вариантов изобретения адгезивный комплексный коарцеват можно получать in situ. Как показано на фигуре 9,A, предварительно образованный, стабильный раствор PEC 1 с низким pH (например, 5), состоящий из поликатионов и полианионов, наносится на субстрат одновременно с отверждающим раствором 2 с более высоким pH (например, 10), состоящим из окислителя, с помощью шприцов. При смешивании отверждающий раствор образует адгезивный комплексный коарцеват одновременно с кросс-сшивкой полимеров на поверхности субстрата.

При еще одном варианте изобретения, упомянутом на фигуре 9,B, раствор полианионов 3 и раствор поликатионов 4 наносят на субстрат одновременно. Для того чтобы образовывался адгезивный комплексный коарцеват, один из растворов имеет значение pH, более высокое, чем другой. Как показано на фигуре 9,B, раствор полианиона 3 имеет более низкое значение pH, чем раствор поликатиона 4; однако также предполагается, что полианион может находиться в растворе с более высоким значением pH, чем у раствора поликатиона. Для того чтобы облегчить кросс-сшивку, раствор с более высоким значением pH может включать окислитель.

На фигуре 9,C представлен еще один вариант точечной сварки. При таком варианте сначала субстрат обрабатывают раствором поликатиона с конкретным значением pH. Затем на раствор поликатиона наносят раствор полианиона с более высоким значением pH, чтобы получить адгезивный комплексный коарцеват in situ. Также предполагается, что субстрат сначала можно обрабатывать полианионом с последующей обработкой поликатионом. Затем для облегчения кросс-сшивки на комплексный коарцеват можно отдельно наносить окислитель, получая при этом адгезивный комплексный коарцеват. Альтернативно раствор, наносимый после первоначальной обработки субстрата, может содержать окислитель для того, чтобы образовывать и затем сшивать адгезивный комплексный коарцеват in situ.

Описанные здесь адгезивные комплексные коарцеваты можно применять для заживления ряда различных переломов и нарушений костей. Коацерваты приклеиваются к кости (и другим минералам) благодаря нескольким механизмам (см. фигуру 1,c). Поверхность минеральной фазы костей, состоящая из гидроксиапатита (Ca₅(PO₄)₃(OH)), представляет собой упорядоченную структуру как положительных, так и отрицательных зарядов. Отрицательные группы, присутствующие на полианионе (например, фосфатные группы), могут взаимодействовать с положительными поверхностными зарядами непосредственно или могут образовывать мостиковые связи с отрицательными поверхностными зарядами через катионные группы на поликатионе и/или через многовалентные катионы. Аналогично вклад в адгезию (приклеивание) могло бы внести непосредственное взаимодействие поликатиона с отрицательными поверхностными зарядами. Кроме того, когда поликатион и/или полианион содержат катехиновые фрагменты, они могут облегчать адгезию коацервата к полностью увлажненному гидроксиапатиту. Другие механизмы адгезии включают непосредственное образование химических связей неокисленного сшивателя (например, DOPA или других катехинов) с гидроксиапатитом. Альтернативно окисленные сшиватели могут связываться с нуклеофильными боковыми цепями белков костного матрикса.

Примеры таких нарушений включают полный перелом, неполный перелом, линейный перелом, поперечный перелом, косой перелом, компрессионный перелом, спиральный перелом, оскольчатый перелом, перелом компактного слоя или открытый перелом. При одном из вариантов изобретения перелом представляет собой внутрисуставный перелом или перелом черепно-лицевых костей. Переломы, такие как внутрисуставные переломы, представляют собой повреждения костей, которые распространяются на хрящевую поверхность и разрывают хрящевую поверхность на кусочки. Адгезивные комплексные коарцеваты могут помогать в обеспечении репозиции таких переломов, обеспечивать малоинвазивную операцию, снижать время пребывания в операционной, снижать затраты и обеспечивать лучший конечный результат путем снижения риска развития посттравматического артрита.

При других вариантах изобретения описанные здесь адгезивные комплексные коарцеваты можно применять для соединения мелких фрагментов многооскольчатых переломов. При таком варианте изобретения мелкие части сломанной кости можно приклеивать к существующей кости. Это особенно перспективно для обеспечения репозиции мелких фрагментов путем их просверливания механическими фиксаторами. Более мелкие фрагменты и большое число фрагментов представляют собой более значительную проблему. При одном из вариантов изобретения адгезивный комплексный коарцеват или его предшественник можно вводить в небольших объемах для создания швов точечной сварки, как описано выше, для того чтобы зафиксировать перелом вместо того, чтобы заполнять трещину целиком. Небольшие, биологически совместимые швы точечной сварки могут свести к минимуму противодействие процессу заживления окружающей ткани и не обязательно могут подвергаться биоразложению. В этом смысле такой способ может быть подобен металлоконструкциям, имплантируемым на постоянной основе.

При других вариантах изобретения адгезивные комплексные коарцеваты можно применять для прикрепления трехмерных подложек-носителей к кости и другим тканям, например, таким как хрящевая ткань, связки, сухожилия, мягкие ткани, органы и синтетические варианты таких материалов. Применение описанных здесь комплексов и способов "точечной сварки" предполагает разработку трехмерных подложек-носителей. Небольшие прихваточные швы из клея, состоящего из описанных здесь адгезивных комплексных коарцеватов, не могут помешать миграции клеток или транспорту небольших молекул на трехмерную подложку-носитель или с нее. В определенных вариантах изобретения трехмерная подложка-носитель может содержать одно или несколько лекарственных средств, которые облегчают рост или заживление кости и ткани. Например, трехмерная подложка-носитель может быть покрыта лекарственным средством или, в качестве альтернативы, лекарственное средство может быть встроено в трехмерную подложку-носитель для того, чтобы лекарственное средство извлекалось из трехмерной подложки-носителя с течением времени.

Описанные здесь адгезивные комплексные коарцеваты и способы находят многочисленные применения в зубоврачебных областях. Например, адгезивные комплексные коарцеваты можно применять для заживления повреждений или трещин в зубе, для фиксации коронок или установки имплантов и зубных протезов. Применяя описанные здесь способы точечной сварки, можно наносить адгезивный комплексный коарцеват или его предшественник на конкретные точки в полости рта (например, челюсть, участки зуба) с последующим прикреплением имплантата к субстрату.

В других вариантах изобретения с помощью адгезивных комплексных коарцеватов можно приклеивать металлический субстрат к кости. Например, обычно для заживления сломанных костей применяют имплантаты, изготовленные из оксида титана, нержавеющей стали или других металлов. Перед приклеиванием субстрата к кости на металлический субстрат, кость или на то и другое можно наносить адгезивный комплексный коарцеват или его предшественник. В определенных вариантах изобретения сшивающая группа, присутствующая на поликатионе или полианионе, может образовывать прочную связь с оксидом титана. Например, было показано, что DOPA может прочно связываться с увлажненными поверхностями из оксида титана (Lee и др., PNAS 103:12999 (2006)). Таким образом, кроме приклеивания костных фрагментов описанные здесь адгезивные комплексные коарцеваты могут облегчать приклеивание (сцепление) металлических субстратов к кости, которое может облегчать заживление кости и излечение.

Также предполагается, что в описанные здесь адгезивные комплексные коарцеваты можно инкапсулировать один или несколько биологически активных агентов. Биологически активные агенты могут представлять собой любое лекарственное средство, которое будет облегчать рост и заживление кости в то время, когда комплекс нанесен на кость. Скорость высвобождения можно регулировать путем выбора материалов, применяемых для получения комплекса, а также заряда биологически активного агента, если агент представляет собой соль.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предлагаются для того, чтобы обеспечить специалистов в данной области полным раскрытием предмета изобретения и описанием того, как описанные и заявленные здесь соединения, композиции и способы осуществляются и оцениваются; при этом подразумевается, что следующие примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены ограничить объем, который авторы изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Чтобы гарантировать точность в отношении численных значений (например, количеств, температуры и т.д.) были проведены исследования, однако следует принимать во внимание некоторые погрешности и отклонения (от среднего значения). Если не указано иначе, части представляют собой части по массе, температура выражается в °C или равна температуре окружающей среды, и давление равно атмосферному или близко к атмосферному давлению. Существуют многочисленные вариации и комбинации условий реакции, например вариации и комбинации концентраций компонентов, необходимых растворителей, смесей растворителей, температур, давлений и других диапазонов и условий реакции, которые можно применять для оптимизации чистоты и выхода продукта, получаемого описанным способом. Для оптимизации таких условий процесса требуется только обоснованное и плановое проведение экспериментов.

Синтез и характеристика миметических сополимеров

Pc3-аналоги . Мономер допа-аналога (допаминметакриламид, DMA) получали путем незначительной модификации опубликованной процедуры (Lee B.P., Huang K., Nunalee F.N., Shull K.R., Messersmith P.B. Synthesis of 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) containing monomers and their co-polymerization with PEG-diacrylate to form hydrogels. J. Biomater Sci. Polym. Ed. 2004; 15(4):449-464). В нескольких словах, боратдопаминовый комплекс при pH>9 подвергают взаимодействию с метакрилоилхлоридом. После разрыва связи борат-катехин при подкислении продукт промывали этилацетатом, перекристаллизовывали из гексана и контролировали состав с помощью ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-TMS): д8,8-8,58 (2H, (O H )₂-Ar-), 7,92 (1H, -C(=O)-N H -), 6,64-6,57 (2Н, C₆H H ₂(ОН)₂-), 6,42 (1H, C₆H₂ H (ОН)₂-), 5,61 (1H, -С(=О)-С(-СН₃)=C H H), 5,30 (1H, -C(=O)-C(-СН₃)=CH H ), 3,21 (2H, C₆H₃(OH)₂-CH₂-CH₂(NH)-C(=O)-), 2,55 (2H, C₆H₃(OH)₂-CH₂-CH₂(NH)-C(=O)-), 1,84 (3Н, -С(=О)-С(-CH ₃)=СН₂).

Перед полимеризацией моноакрилоксиэтилфосфат (MAEP, Polysciences) разбавляли в MeOH и экстрагировали гексаном для удаления диенов. Сополимер 1 получали путем смешивания 90 мол.% MAEP, 8 мол.% DMA, 2 мол.% акриламида (Aam, Polysciences) и 0,1 мол.% FITC-метакриламида в MeOH при конечной концентрации мономера 5 масс.%. Свободнорадикальную полимеризацию инициировали с помощью азобисизобутиронитрила (AIBN) и продолжали при 60°C в течение 24 часов в запаянных ампулах. Подобную процедуру применяли для получения полимеров 3-7, которые показаны на фигурах 2-7. Сополимер 1 (фигура 10) выделяли с помощью эксклюзионной гель-хроматографии (SEC) в MeOH на колонке Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), концентрировали с помощью ротационного выпаривания, растворяли в деионизованной (DI) воде и подвергали сублимационной сушке.

Молекулярную массу (MW) и индекс полидисперсности (PDI) сополимера 1 определяли с помощью SEC в ДМФА на колонке PLgel (Polymer Labs), соединенной с детектором светорассеяния на малых углах (Brookhaven BI-MWA) и монитором для контроля показателя преломления (Brookhaven BI-DNDC). Колонку калибровали по полистирольным стандартам. Молекулярная масса 1 составляла 245 кДа при PDI 1,9. Концентрацию допаминсодержащих боковых цепей и реакционную способность контролировали с помощью УФ/ВС(видимый свет)-спектроскопии (e₂₈₀=2600 M^-1см^-1). Концентрацию фосфатсодержащих боковых цепей определяли титрованием 0,005M раствором NaOH с применением автоматического титратора (Brinkmann Titrando 808). УФ/ВС-спектр сополимера 1 содержал единичный пик поглощения при 280 нм, характеристический для катехиновой формы допамина (фигура 10B). Добавление NaIO₄ при молярном отношении NaIO₄ к сополимеру 1, равном 1:1, при pH 5,0, как и следовало ожидать, приводило к окислению допакатехина до допахинона с пиком поглощения около 395 нм. Пик допахинона при pH <5 был стабильным в течение нескольких часов.

Pc1 -аналоги . Лизинсодержащие боковые цепи Pc1 моделировали с помощью гидрохлорида N-(3-аминопропил)метакриламида (APMA, Polysciences). Сополимер 2 (фигура 10) синтезировали путем растворения 10 мол.% APMA и 90 мол.% Aam в деионизованной воде, дегазации N₂ и инициирования полимеризации с помощью 2 мол.% персульфата аммония (Polysciences). Полимеризацию продолжали при 50°C в течение 24 часов в запаянных ампулах. Полимер извлекали с помощью диализа относительно воды в течение 3 дней и затем подвергали сублимационной сушке. Содержание (мол.%) боковых цепей с первичным амином определяли с помощью анализа ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-TMS) из отношений дублетов при 13,45 (3H, -C H ₃) и 51,04 (1Н, RC(=О)C H R₂). MW и PDI сополимера 2 определяли с помощью SEC в ФСБ (20 мМ PO₄, 300 мМ NaCl, pH] 7,2) на колонке Superose 6 (Pharmacia). Колонку калибровали по поли-2-гидроксипропилметакрилатным стандартам. MW сополимера 2 составляла 165 кДа и PDI составлял 2,4.

Образование и характеристика коацервата . Водный раствор сополимера 2 (5 масс.%) при перемешивании по каплям добавляли к водному раствору сополимера 1 (5 масс.%) до достижения требуемого отношения амин/фосфат. Общая концентрация сополимеров составляла 50 мг/мл. После перемешивания в течение 30 минут pH регулировали с помощью раствора NaOH (6M). Композиции при значении pH (<4), способствующем образованию полиэлектролитного комплекса (PEC), разбавляли деионизованной H₂O до 1 мг/мл и измеряли дзэта-потенциалы и гранулометрический состав PEC на анализаторе ZetaSizer 3000HS (компании Malvern Instruments). При более высоких значениях pH коацерватные композиции подвергали центрифугированию при 2500 об./мин. на микроцентрифуге (Eppendorf) при 25°C в течение 2 минут, чтобы собрать коацерватную фазу. Измеряли объем обеих фаз. Коацерватные фазы подвергали сублимационной сушке и взвешивали, чтобы определить их массу и концентрацию.

Фазовое поведение смеси сополимеров 1 и 2, смешанных при молярном отношении фосфатсодержащих боковых цепей к аминсодержащим боковыми цепям 1:1 (объединенная концентрация 50 мг/мл), в диапазоне pH 3-10 показано на фигуре 11A. Рассчитанный суммарный заряд сополимера, нормированный относительно общей концентрации способных к ионизации боковых цепей, показан на фигуре 11В. Для замедления окисления допа-групп кислородом добавляли восстановитель аскорбат при молярном отношении к допа-группам 1:5 с последующей кросс-сшивкой при повышенном значении pH. При низком значении pH полиэлектролиты образовывали стабильный молочно-белый раствор коллоидных полиэлектролитных комплексов (PEC). Средний диаметр PEC при pH 2,1, определенный с помощью динамического светорассеяния, составлял 360 нм с незначительным разбросом значений и повышался до 1080 нм при pH 4,0 (фигура 11C). Изменение дзэта-потенциала с положительного на отрицательный при pH 3,6 хорошо согласовывается с расчетным значением pH-зависимого суммарного заряда комплексов (фигура 11B). При значении pH выше 4 размер частиц нельзя было измерить точно, поскольку комплексы коагулировали. По мере того, как суммарный заряд повышался вследствие депротонирования фосфатсодержащих боковых цепей, сополимеры конденсировались в густую вторую фазу. При значении pH 5,1 выделенная фаза имела характер рыхлого осадка низкой плотности. При значениях pH 7,2 и 8,3 густая фаза имела характер жидкого когезивного комплексного коарцевата (фигура 12). Сополимеры концентрировали приблизительно в три раза до 148 и 153 мг/мл, соответственно, в коацерватные фазы. При значении pH 9,5 смесь полиэлектролитов образовывала густой нежидкий ионный гель. При значении pH 10 сополимеры переходили в раствор и самопроизвольно сшивались в прозрачный гидрогель благодаря допахинон- и аминсодержащим боковым цепям.

Экстракция двухвалентных катионов с помощью хелатирующего агента EDTA приводила к 50%-му уменьшению прочности при сжатии трубок червей P. californica, десятикратному уменьшению адгезионных свойств и разрушению пористой структуры клеев. Для создания фазовой диаграммы коацерватов (фигура 13) исследовали влияние двухвалентных катионов на фазовое поведение миметических полиэлектролитов путем смешивания 1 и 2 при отношениях аминсодержащих боковых цепей к фосфатсодержащим боковым цепям в диапазоне от 1:1 до 0:1 с отношениями двухвалентного катиона к фосфатсодержащим боковым цепям в диапазоне от 0:1 до 1:1. Устанавливали значение pH 8,2, равное pH морской воды, и добавляли двухвалентные катионы в виде смеси Mg²⁺ и Ca²⁺ в отношении 4:1, приблизительное отношение Mg²⁺/Ca²⁺ в природном клее определяли с помощью элементного анализа. Максимальная масса коацервата (темно-серые квадраты) присутствовала в смесях с более высокими отношениями аминсодержащих боковых цепей к фосфатсодержащим боковым цепям и более низкими отношениями двухвалентного катиона к фосфатсодержащим боковым цепям. Смеси с более низкими отношениями в полиамине были прозрачными (светлые квадраты) даже при более высоких отношениях двухвалентный катион/фосфатсодержащие боковые цепи. При более высоких отношениях амин/фосфат и двухвалентный катион/фосфат растворы были мутными (светло-серые квадраты) с незначительными осадками, но намного менее мутными, чем растворы, содержащие PEC (средне-серые квадраты).

Испытание механического сцепления . Образцы костей для испытания ~1 см³ нарезали пилой для разрезания гипсовой повязки из бедренной трубчатой бычьей кости, полученной из местного продуктового магазина, шлифовали наждачной бумагой с зерном 320 и хранили при -20°C. NaIO₄ при молярном отношении 1:2 к допа-содержащим боковым цепям равномерно наносили на одну из лицевых сторон каждого из двух увлажненных образцов кости. Пипеткой наносили сорок мл испытуемого раствора коацервата - объем, достаточный для полного заполнения 1 см² площади между поверхностями контакта костей; образцы костей сжимали вместе, выдавливая небольшой избыток адгезива, закрепляли и незамедлительно обертывали марлей, пропитанной ФСБ (20 мМ PO₄, 150 мМ NaCl, pH 7,4). Наносимый коацерват содержал аскорбат в молярном отношении 1:5 к допа для предотвращения преждевременной кросс-сшивки. Связанные образцы инкубировали при 37°C в течение по меньшей мере 24 часов в герметически закрытом контейнере, содержащем пропитанные влагой тампоны для поддержания 100% влажности. Эталонные образцы склеивали с помощью 40 мл суперклея Loctite 401 точно таким же образом. Коммерческий цианоакрилат для немедицинского использования применяли потому, что не существует медицинских адгезивов для твердых тканей, которые можно использовать для сравнения. Механические испытания проводили на сделанной на заказ системе для испытания материалов с применением датчика нагрузки 1 кг. Измерительный прибор регулировали и получали данные, применяя стандартный программный продукт Lab View (National Instruments). Одну из костей склеенной (связанной) пары зажимали в фиксаторе, отступив на 1 мм от связывающей поверхности контакта. На вторую кость давили со скоростью передвижения крейцкопфа (ползуна) 0,02 мм/с относительно затупленных лапок, расположенных на расстоянии 1 мм от связывающей поверхности контакта. Испытания адгезионной прочности проводили при комнатной температуре сразу после снятия с влажных образцов марлевой обертки, чтобы предотвратить высыхание. После испытания исследовали характер разрушения в местах соединения. Площадь сцепления измеряли путем нанесения наружного контура поверхности контакта костей на бумагу, вырезания оставленного следа и определения его площади по весу вырезанной бумаги. Для каждого режима испытывали, по меньшей мере, 6 образцов.

Модуль упругости при сдвиге и предел прочности измеряли на образцах трубчатых бычьих костей во влажном состоянии для трех коацерватных композиций, отмеченных на фигуре 13 звездочкой. Плотность коацерватов в трех композициях повышалась с увеличением отношений двухвалентных катионов (до 120, 125 и 130 мг/мл, соответственно). Как модуль, так и адгезионная прочность полностью увлажненных образцов повышались с увеличением концентрации двухвалентных катионов, достигая 37% прочности для увлажненных костей, склеенных коммерческим цианоакрилатным адгезивом (фигура 14A). В качестве точки сравнения применяли цианоакрилатный адгезив, поскольку не существует адгезивов для приклеивания костей, предназначенных для клинического применения, которые можно было бы использовать для сравнения. Прочность (предел прочности) миметического адгезива также составляет приблизительно 1/3 прочности природного клея, продуцируемого червями P. californica и приблизительно равной 350 кПа, и прочности (предела прочности) клея, выделяемого биссусной железой моллюсков, находящейся в диапазоне приблизительно от 320 до 750 кПа в зависимости от сезона. В большинстве случаев, в которых предлагаются композиции, образующие прочные поверхностные связи с гидроксиапатитом, места сцеплений когезионно разрушались, оставляя адгезив на обеих поверхностях контакта костей. Места сцеплений имели стабильные размеры, не давали ни усадки, ни значительного набухания после полного погружения в ФСБ при pH 7,2 на несколько месяцев (фигура 14B). Стабильность размеров во время отверждения и долговременного воздействия воды является важным требованием к адгезиву, применяемому для приклеивания костей.

Допамин-опосредованная кросс-сшивка сополимеров . Добавление NaIO₄ к растворам 3 при молярном отношении 1:1 способствовало незамедлительному и количественному окислению DOPA (280 нм) до допахинона (392 нм). В течение нескольких минут хининовый пик опускался до общей широкой полосы поглощения, так как реакционно-способные хиноны образовывали ковалентные ди-DOPA-сшивающие связи (фигура 15, наверху слева). Кросс-сшивка между хинонами и первичными аминами (на фигуре 15 внизу слева) приводила к более широкой общей полосе поглощения, чем ди-DOPA- кросс-сшивка. Следовательно, в допаминсодержащих сополимерах химия окисления и кросс-сшивка допамина работает, как и ожидалось. В результате окислительной кросс-сшивки допаминсодержащие сополимеры быстро образовывали гидрогели (фигура 15, A&C). Окисленный фосфодопамин 3 сам по себе гель не образовывал (фигура 15B), но после смешивания с 4 быстро переходил в гелеобразное состояние (фигура 15D). Ингибировалась межмолекулярная ди-DOPA-кросс-сшивка между PO₄-содержащими сополимерами, но не межмолекулярная DOPA-аминовая кросс-сшивка. Это обеспечивает механизм регулирования кросс-сшивки, который может быть применим для получения и доставки синтетического адгезива.

Инициированная pH DOPA-опосредованная кросс-сшивка . Для изучения pH-зависимости и кинетики окисления DOPA кросс-сшивку допаминсодержащих сополимеров оценивали с помощью УФ-ВС-спектроскопии. Результаты исследования p(EGMP[92]-DMA[8]) (3) показаны на фигуре 16. УФ-ВС-спектры получали спустя некоторое время после добавления стехиометрического количества NaIO₄. При pH 5,0 (верхний чертеж) поглощение допахинона (398 нм) было максимальным через ~15 мин. и оставалось стабильным в течение нескольких часов (вставка). При pH 6,0 поглощение при 398 нм достигало пика в течение <1 мин и превращалось в широкую полосу поглощения с пиками при 310 и 525 нм. Широкую полосу поглощения нельзя объяснить кросс-сшивкой допахинона, так как гели не образуются (фигура 16). Для сравнения, 6 окисляется при низком значении pH и сшивается, но со значительно более медленной скоростью (не показано).

Результаты показывают, что допахинон стабилен при низком значении pH и что ди-DOPA-кросс-сшивка фосфодопаминсодержащих сополимеров ингибировалась при более высоком значении pH. В присутствии полиамина ковалентная кросс-сшивка была направлена на межмолекулярные связи амин-DOPA. Это важное наблюдение, поскольку оно намечает путь регулируемой доставки и отверждения синтетического адгезива.

Цитотоксичность in vitro. Растворы 3 и 4, каждый при концентрации 40 масс.%, смешивали при низком значении pH до образования полиэлектролитного комплекса. Раствор частично окисляли с помощью NaIO₄ и подщелачивали с помощью NaOH прямо перед нанесением на стерильные стеклянные покровные стекла. Покровные стекла, обработанные адгезивом, помещали на дно лунок культурального планшета и добавляли в отдельные лунки фибробласты крайней плоти человека, трахеальные фибробласты человека и первичные астроциты крысы в среде, содержащей сыворотку в количестве 30 K клеток/лунка (фигура 17). Спустя 24 часа клетки фиксировали 4% раствором параформальдегида, затем окрашивали с использованием иммунной метки для промежуточного филаментного белка виментина для визуализации морфологии клеток (зеленый, A-B), перицеллюлярного фибронектина для определения секреции ECM (красный, B), глиального фибриллярного белка для визуализации морфологии первичных астроцитов (зеленый, C) и DAPI для визуализации ядра (синий, C). Зернистые шарики адгезива, автофлуоресцирующие оранжевато-красным (A-C).

На представленных изображениях (фигура 17) все типы клеток имели морфологию, неотличимую от клеток, выращенных на стекле без адгезива. Клетки обладали нормальной мотильностью, и в нескольких случаях продолжался процесс их развития в местах, которые непосредственно контактировали с адгезивом. Токсичности выявлено не было.

Модель повреждения свода черепа крысы . На фигурах 18A-F показано образование фрагментированного повреждения и заживления с помощью адгезивного комплексного коарцевата. Самцов крыс Sprague Dawley (256-290 г) (Harlan) подвергали анестезии смесью кетамина (65 мг/кг), ксилазина (7,5 мг/кг) и ацепромазина (0,5 мг/кг). При полной анестезии глаза покрывали глазной мазью, голову брили и скальп дезинфицировали изопропанолом и бутадиеном. На подготовленных крыс в стереотаксической рамке опускали пневматический бур, работающий при ~5000 об/мин, применяя стереотаксический мелкозубый манипулятор. На участок, где осуществлялась трепанация черепа, непрерывно наносили стерильный физиологический раствор или ФСБ, в то время как сделанный на заказ трепанационный инструмент опускали на глубину 600 микрон (заранее определенную как толщина черепа крыс, которых применяли в эксперименте, с поправкой на возраст). В результате в черепе получали округленное, аккуратное отверстие с незначительным наблюдаемым воздействием на расположенную под ним твердую мозговую оболочку или сосудистую сеть (фигура 18 A-B). Костный фрагмент извлекали остроконечным изогнутым пинцетом и разбивали на фрагменты, применяя кровоостанавливающее средство и миниатюрные костные кусачки (фигура 18B). Фрагменты костей возвращали на место повреждения (фигура 18C) и с помощью микропипетки (фигура 18D) наносили 5 мкл испытуемого адгезива (3 и 4, смешанные непосредственно перед нанесением перелома). Раствор адгезива низкой вязкости (предварительно образованные PEC, смешанные с отверждающим раствором прямо перед доставкой) легко и точно наносится в переломы. В пределах 5 минут фрагменты достаточно фиксируются настолько, что их можно резко обстукивать пинцетом без смещения. По мере отверждения адгезив продолжал темнеть до рыжевато-бурого (фигура 18E-F).

На всем протяжении данной заявки упоминаются различные публикации. Раскрытие таких публикаций в их полном объеме включено в настоящую заявку путем ссылки для того, чтобы более полно описать описанные здесь соединения, композиции и способы.

Для описанных здесь соединений, композиций и способов можно осуществить различные модификации и вариации. Другие варианты описанных здесь соединений, композиций и способов будут очевидны из рассмотрения описания и практики применения раскрытых здесь соединений, композиций и способов. Подразумевается, что описание и примеры следует рассматривать как иллюстративные.

Изобретение относится к области биоадгезивов и представляет собой адгезивный комплексный коацерват или полиэлектролитный комплекс, содержащий, по меньшей мере, один поликатион, который содержит положительно заряженный белок, продуцируемый P. Californica, или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы I, по меньшей мере, один полианион, который содержит полифосфатное соединение, полифосфосерин или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы II, и, по меньшей мере, один многовалентный катион, при этом, по меньшей мере, один поликатион или полианион представляет собой синтетическое соединение и поликатион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу и/или полианион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу, где указанные кросс-сшивающие группы способны к кросс-сшивке друг с другом. Изобретение обеспечивает получение адгезивных комплексных коацерватов, обладающих низким межфазным натяжением в воде и повышенной когезионной прочностью. 13 н. и 28 з.п. ф-лы, 19 ил., 1 табл.

1. Адгезивный комплексный коацерват для применения в качестве биоадгезива, содержащий, по меньшей мере, один поликатион, по меньшей мере, один полианион и, по меньшей мере, один многовалентный катион, в котором, по меньшей мере, один поликатион или полианион представляет собой синтетическое соединение,
причем, по меньшей мере, один поликатион содержит положительно заряженный белок, продуцируемый P. Californica, или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы I

в которой R¹, R² и R³ независимо представляют собой атом водорода или алкильную группу, X, представляет собой атом кислорода или NR⁵, где R⁵ представляет собой атом водорода или алкильную группу и m равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль;
при этом, по меньшей мере, один полианион содержит полифосфатное соединение, полифосфосерин или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы II

в которой R⁴ представляет собой атом водорода или алкильную группу и n равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль;
и при этом поликатион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу и/или полианион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу и указанные кросс-сшивающие группы способны к кросс-сшивке друг с другом.

2. Коацерват по п.1, в котором каждый из R¹, R² и R³ представляет собой метил, X представляет собой NH и m равно 2.

3. Коацерват по п.1, в котором R⁴ представляет собой метил и n равно 2.

4. Коацерват по п.1, в котором полифосфатное соединение содержит от 10 до 90 мол.% фосфатных групп.

5. Коацерват по п.1, в котором полифосфосерин продуцируется геном P. californica.

6. Коацерват по п.1, в котором многовалентный катион содержит один или несколько ионов переходных металлов, редкоземельных металлов или один или несколько двухвалентных катионов.

7. Коацерват по п.1, в котором многовалентный катион содержит Ca⁺² и Mg⁺².

8. Коацерват по п.1, отличающийся тем, что коацерват является биологически совместимым и биоразлагаемым.

9. Коацерват по п.1, отличающийся тем, что коацерват дополнительно содержит один или несколько биологически активных агентов, инкапсулированных в комплекс.

10. Коацерват по п.1, в котором кросс-сшивающие группы, способные к кросс-сшивке друг с другом, являются одинаковыми или разными.

11. Коацерват по п.1, в котором кросс-сшивающая группа на поликатионе содержит нуклеофильную группу и кросс-сшивающая группа на полианионе содержит электрофильную группу.

12. Коацерват по п.1, в котором кросс-сшивающая группа на поликатионе и полианионе содержит гидроксилсодержащее ароматическое соединение, способное подвергаться окислению.

13. Коацерват по п.1, в котором кросс-сшивающая группа на полианионе содержит DOPA-остаток или катехиновый остаток, и поликатион содержит нуклеофильную группу, способную к взаимодействию с кросс-сшивающей группой с образованием ковалентной связи.

14. Адгезивный комплексный коацерват для применения в качестве биоадгезива, полученный с помощью способа, включающего
(a) получение полиэлектролитного комплекса, включающее смешивание, по меньшей мере, одного поликатиона, по меньшей мере, одного полианиона и, по меньшей мере, одного многовалентного катиона, причем, по меньшей мере, один из поликатиона или полианиона представляет собой синтетическое соединение,
причем, по меньшей мере, один поликатион содержит положительно заряженный белок, продуцируемый P. Californica, или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы I

в которой R¹, R² и R³ независимо представляют собой атом водорода или алкильную группу, X представляет собой атом кислорода или NR⁵, где R⁵ представляет собой атом водорода или алкильную группу и m равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль;
при этом, по меньшей мере, один полианион содержит полифосфатное соединение, полифосфосерин или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы II

в которой R⁴ представляет собой атом водорода или алкильную группу и n равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль; и
при этом поликатион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу и/или полианион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу и указанные кросс-сшивающие группы способны к кросс-сшивке друг с другом; и
(b) регулирование pH полиэлектролитного комплекса, концентрации, по меньшей мере, одного многовалентного катиона или их комбинации для получения адгезивного комплексного коацервата.

15. Коацерват по п.14, который получают in situ.

16. Коацерват по п.14, где стадию (a) осуществляют при pH менее 4 и стадия (b) включает повышение pH.

17. Коацерват по п.14, где стадия (b) включает повышение pH полиэлектролитного комплекса до pH больше или равного 7,0.

18. Коацерват по п.14, где стадия (b) способа дополнительно включает контактирование комплексного коацервата с окислителем для облегчения кросс-сшивки между поликатионом и полианионом.

19. Коацерват по п.18, где окислитель содержит О₂, NaIО₄, пероксид или окислитель на основе переходных металлов.

20. Полиэлектролитный комплекс для применения в качестве биоадгезива, содержащий, по меньшей мере, один поликатион, по меньшей мере, один полианион и, по меньшей мере, один многовалентный катион, в котором, по меньшей мере, один из поликатиона или полианиона представляет собой синтетическое соединение,
причем, по меньшей мере, один поликатион содержит положительно заряженный белок, продуцируемый P. Californica, или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы I

в которой R¹, R² и R³ независимо представляют собой атом водорода или алкильную группу, X представляет собой атом кислорода или NR⁵, где R⁵ представляет собой атом водорода или алкильную группу и m равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль;
при этом, по меньшей мере, один полианион содержит полифосфатное соединение, полифосфосерин или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы II

в которой R⁴ представляет собой атом водорода или алкильную группу и n равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль; и
при этом поликатион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу и/или полианион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу и указанные кросс-сшивающие группы способны к кросс-сшивке друг с другом.

21. Комплексный коацерват для применения в качестве биоадгезива, содержащий, по меньшей мере, один поликатион, по меньшей мере, один полианион и, по меньшей мере, один многовалентный катион, в котором, по меньшей мере, один из поликатиона или полианиона представляет собой синтетическое соединение,
причем, по меньшей мере, один поликатион содержит положительно заряженный белок, продуцируемый P. Californica, или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы I

в которой R¹, R² и R³ независимо представляют собой атом водорода или алкильную группу, X представляет собой атом кислорода или NR⁵, где R⁵ представляет собой атом водорода или алкильную группу и m равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль;
при этом, по меньшей мере, один полианион содержит полифосфатное соединение, полифосфосерин или полимер, содержащий, по меньшей мере, один фрагмент формулы II

в которой R⁴ представляет собой атом водорода или алкильную группу и n равно числу от 1 до 10, или его фармацевтически приемлемую соль; и
при этом поликатион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу и/или полианион содержит, по меньшей мере, одну кросс-сшивающую группу и указанные кросс-сшивающие группы способны к кросс-сшивке друг с другом.

22. Способ нанесения адгезивного комплексного коацервата по п.14 на субстрат, включающий одновременное нанесение на субстрат (1) полиэлектролитного комплекса по п.14 с первым значением pH и (2) раствора, содержащего окислитель, со вторым значением pH, в котором второе значение pH больше, чем первое.

23. Способ нанесения адгезивного комплексного коацервата по любому из пп.1-19 на субстрат, включающий одновременное нанесение на субстрат (1) первого раствора, содержащего, по меньшей мере, один указанный поликатион, с первым значением pH и (2) второго раствора, содержащего, по меньшей мере, один указанный полианион, со вторым значением pH, в котором (i) когда первое значением pH меньше 7, второй pH больше 7; (ii) когда первое значением pH больше 7, второй pH меньше 7; (iii) первый раствор и/или второй раствор содержит, по меньшей мере, один указанный многовалентный катион; и (iv) первый раствор и/или второй раствор содержит окислитель; в котором при смешивании первого раствора и второго раствора полианион и поликатион сшиваются друг с другом с образованием указанного адгезивного комплексного коацервата.

24. Способ нанесения адгезивного комплексного коацервата по любому из пп.1-19 на субстрат, включающий (1) нанесение на субстрат первого раствора, содержащего, по меньшей мере, один указанный поликатион, с последующим (2) нанесением второго раствора, содержащего, по меньшей мере, один указанный полианион и окислитель; в котором первый раствор и/или второй раствор содержит, по меньшей мере, один указанный многовалентный катион, значение pH второго раствора больше значения pH первого раствора и, по меньшей мере, один полианион и, по меньшей мере, один поликатион сшиваются друг с другом с образованием адгезивного комплексного коацервата.

25. Способ нанесения адгезивного комплексного коацервата по любому из пп.1-19 на субстрат, включающий (1) нанесение на субстрат первого раствора, содержащего, по меньшей мере, один указанный полианион, с последующим (2) нанесением второго раствора, содержащего, по меньшей мере, один указанный поликатион и окислитель; в котором первый раствор и/или второй раствор содержит, по меньшей мере, один указанный многовалентный катион, pH второго раствора больше pH первого раствора и, по меньшей мере, один полианион и, по меньшей мере, один поликатион сшиваются друг с другом с образованием адгезивного комплексного коацервата.

26. Способ по любому из пп.22-25, в котором субстрат включает кость или имплантируемое устройство.

27. Способ заживления перелома кости у пациента, включающий контактирование сломанной кости с адгезивным комплексным коацерватом по любому из пп.1-19.

28. Способ по п.27, который представляет собой способ in vitro.

29. Способ по п.27, который представляет собой способ in vivo.

30. Способ по п.27, в котором перелом включает полный перелом, неполный перелом, линейный перелом, поперечный перелом, косой перелом, компрессионный перелом, спиральный перелом, оскольчатый перелом, перелом компактного слоя или открытый перелом.

31. Способ по п.27, в котором перелом включает внутрисуставный перелом.

32. Способ по п.27, в котором перелом включает перелом черепно-лицевых костей.

33. Способ по п.27, в котором способ включает приклеивание отломанного куска кости к существующей кости.

34. Способ по п.27, в котором коацерват отверждается в пределах 60 секунд.

35. Способ приклеивания металлического субстрата к кости пациента, включающий контактирование кости с коацерватом по любому из пп.1-19 и наложение металлического субстрата на покрытую композицией кость.

36. Способ приклеивания трехмерной подложки-носителя для костной ткани к кости пациента, включающий контактирование кости и ткани с коацерватом по любому из пп.1-19 и наложение трехмерной подложки-носителя для костной ткани на кость и ткань.

37. Способ по п.36, в котором ткань включает хрящевую ткань, связку, сухожилие, мягкие ткани, орган или их синтетическое производное.

38. Способ по п.36, в котором трехмерная подложка-носитель содержит одно или несколько лекарственных средств, которые облегчают рост или заживление кости и ткани.

39. Способ заживления трещины в зубе, включающий нанесение на трещину коацервата по любому из пп.1-19.

40. Способ фиксации зубного имплантата, включающий нанесение коацервата по любому из пп.1-19 на стоматологический субстрат и прикрепление зубного имплантата к субстрату.

41. Способ по п.40, в котором зубной имплантат включает коронку или зубной протез.