ПОЛИМЕРНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ СОСТАВА ФЕРМЕНТ-ПОЛИКАТИОН-ПОЛИАНИОН, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИОКСИДАНТНЫЙ ФЕРМЕНТ, ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК A61K38/00 A61K38/43 B82B1/00 A61K47/30 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к химической энзимологии, к способу создания дисперсии, содержащей полимерные наночастицы с инкапсулированным антиоксидантным ферментом, в частности к получению водной дисперсии наночастиц состава супероксиддисмутаза/поликатион/полианион, которая предназначена для медицинского применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Активные формы кислорода (АФК) являются естественными продуктами метаболизма клеток. Избыток АФК и их производных образуется в результате ряда заболеваний: болезнь Альцгеймера, Паркинсона, инфаркт, инсульт, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника и т.д. Отдельно стоит упомянуть про процессы воспаления вообще и роль, которую играют в них АФК. Источниками свободных радикалов в зоне воспаления служат: дыхательный взрыв фагоцитов при их стимуляции, каскад арахидоновой кислоты, ферментные процессы в эндоплазматическом ретикулуме и пероксисомах, митохондриях, цитозоле, а также самоокисление катехоламинов, лейкофлавинов, гидрохинонов [Петрович Ю.А., Гуткин Д.В. Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса // Патол. физиолог, и эксперимент, терапия, 1986, Т.5, С.85-92]. В очаге воспаления процессы, связанные со свободными радикалами, значительно активируются. Например, в случае контузионной травмы спинного мозга (КТСМ), известно, что Свободнорадикальное окисление является одним из основополагающих факторов в патогенезе постравматической нейродегенерации и клеточной смерти [Hall E.D., Yonkers P.A., Andrus P.K., Сох J.W., Anderson D.K. Biochemistry and pharmacology of lipid antioxidants in acute brain and spinal cord injury // J Neurotrauma, 1992, V.9., P.425-442]. Взрывообразное высвобождение свободных радикалов в области травмы приводит к истощению эндогенных антиокисдантов, что способствует постравматической клеточной смерти путем неконтролируемого перекисного окисления. Это является важным фактором воспаления и сопутствующего отека, который оказывает давление на нервные волокна и приводит к дегенерации и демиелинизации нервных проводников, гибели части аксонов и глии. Предполагается, что введение антиоксидантных препаратов непосредственно после травмы, в остром периоде, способно привести к уменьшению перекисного окисления и таким образом уменьшить объем повреждения. К числу факторов антиоксидантной защиты тканей относятся ферменты: каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, а также витамин K, α-токоферол, метионин и др.

Ферменты обладают высокой специфичностью и, как следствие, их антиоксидантная эффективность на порядок выше по сравнению с витаминами. Поэтому введение именно антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, каталаза) позволит нейтрализовать АФК в зоне травмы, способствуя уменьшению отека и нейродегенерации. Так как супероксид радикал лежит в основе цепочки превращений, приводящей к появлению самых различных АФК, в первую очередь использование супероксиддисмутазы (СОД) является приоритетным направлением.

Однако введение в организм нативных ферментов крайне нерационально, так как они подвергаются протеолизу и быстро выводятся из организма. Для увеличения времени жизни фермента и эффективности его транспорта в организме были разработаны самые разные подходы: конъюгация с полимерными цепями, включение в наноконтейнеры и др. Время циркуляции и стабильность ферментов в чужеродной среде может быть увеличена до нескольких часов путем их ПЭГилирования - модификации белка ПЭГ цепями [J.S. Beckman, R.L. Minor Jr., C.W. White, J.E. Repine, G.M. Rosen, B.A. Freeman. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.6884-6892; F.M. Veronese, P. Caliceti, O. Schiavon, M. Sergi. Polyethylene glycol-superoxide dismutase, a conjugate in search of exploitation // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V.54. P.587-606.]. Однако, такая модификация значительно понижает проницаемость ферментов через микрососуды в область повреждения [Francis JW, Ren J, Warren J, Brown RH Jr, Finklestein SP. Postischemic infusion of Cu/Zn superoxide dismutase or SOD:Tet451 reduces cerebral infarction following focal ischemia/reperfusion in rats. Exp Neurol. 1997; 146: 435-443]. Кроме того, ПЭГилирование СОД ведет к образованию гетерогенных продуктов из-за большого количества доступных аминогрупп на поверхности фермента (20 лизинов для димера). Длинна ПЭГ чрезвычайным образом влияет на биораспределение и времена циркуляции СОД-ПЭГ в организме, а также на антигенные и иммуногенные свойства конструкции [K. Knop, R. Hoogenboom, D. Fischer, U.S. Schubert. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives // Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 6288-6308].

Другой подход заключается во включении СОД в биоразлагаемые и биосовместимые полилактогликолевые (ПЛГ) наночастицы на основе сополимера D,L-лактид-гликоля [M.K. Reddy, V. Labhasetwar. Nanoparticle-mediated delivery of superoxide dismutase to the brain: an effective strategy to reduce ischemia-reperfusion injury // FASEB J. 2009. V.23. P.1384-1395.]. Однако, ПЛГ матрица затрудняет доступ субстрата к активному центру фермента и имеет достаточно большие размеры (гидродинамический диаметр 290 нм, таблица 1). Кроме того, гидролиз полилактогликоля может быстро дезактивировать ферменты в матрице [W. Jiang, S.P. Schwendeman. Stabilization of tetanus toxoid encapsulated in PLGA microspheres. Mol. Pharm. 2008. V.5. P.808-817.]

Для увеличения времени жизни ферментов в крови была разработана технология их включения в липосомы [M.L. Corvo, О.С. Boerman, W.J. Oyen, L. Van Bloois, M.E. Cruz, D.J. Crommelin, G. Storm. Intravenous administration of superoxide dismutase entrapped in long circulating liposomes; in vivo fate in a rat model of adjuvant arthritis // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V.1419. P.325-334; B.A. Freeman, S.L. Young, J.D. Crapo. Lipo some-mediated augmentation of superoxide dismutase in endothelial cells prevents oxygen injury // J. Biol. Chem. 1983. V.258. P.12534-12542]. Внутривенное введение катионных липосом, содержащих СОД, привело к частичному уменьшению объема повреждения при ишемии головного мозга у крыс, однако, липосомы оказались нестабильными (период полураспада 4,2 ч) и потенциально токсичными. [Imaizumi, S., Woolworth, V., Fishman, R.A., and Chan, P.H. Liposome-entrapped superoxide dismutase reduces cerebral infarction in cerebral ischemia in rats. Stroke, 1990, V.21, P.1312-1317; Sinha J, Das N, Basu MK. Liposomal antioxidants in combating ischemia-reperfusion injury in rat brain. Biomed Pharmacother. 2001, V.55, P.264-271.]. Кроме того, СОД может постепенно высвобождаться из липосом, в зависимости от их размеров, и быстро выводиться из организма (период полувыведения свободной СОД - 6 мин).

С помощью генной инженерии были разработаны конъюгаты PEP-1-СОД 1 и РЕР-1-каталаза для лечения последствий инсульта [W.S. Eum, D.W. Kim, I.K. Hwang, K.Y. Yoo, T.C. Kang, S.H. Jang, H.S. Choi, S.H. Choi, Y.H., Kim, S.Y. Kim, H.Y. Kwon, J.H. Kang, O.S. Kwon, S.W. Cho, K.S. Lee, J. Park, M.H. Won, S.Y. Choi. In vivo protein transduction: biologically active intact pep-1-superoxide dismutase fusion protein efficiently protects against ischemic insult // Free Radic. Biol. Med. 2004. V.37. P.1656-1669.]. Однако эти конъюгаты относительно нестабильны в кровотоке и могут вызывать иммунный ответ у пациентов.

Группой проф. А.В. Кабанова была разработана методика получения наночастиц (нанозимов) на основе полиэлектролитных комплексов ферментов и блок-сополимеров, основанная на самопроизвольной сборке противоположно заряженных полиионов [заявка WO 2012162490 А1, опубл 29.11.2012; заявка US 2013/0052154 А1, опубл. 28.02.2013]. Авторами была показана биологическая активность полученных препаратов в модели гипертензии, вызванной ангиотензином-II. [E.G. Rosenbaugh, J.W. Roat, L. Gao, R.F. Yang, D.S. Manickam, J.X. Yin, H.D. Schultz, Т.K. Bronich, E.V. Batrakova, A.V. Kabanov, I.H. Zucker, M.C. Zimmerman. The attenuation of central angiotensin II-dependent pressor response and intra-neuronal signaling by intracarotid injection of nanoformulated copper/zinc superoxide dismutase // Biomaterials. 2010. V.31. P.5218-5226.] Для увеличения стабильности блок-иономерного комплекса при разведении в структуру комплекса фермент/полимер вводили ковалентные сшивки, что приводило к существенной потери активности фермента: например, для комплекса СОД/полилизин-ПЭГ выход по удельной активности СОД составил 45% [Devika S. Manickam, Anna M. Brynskikh, Jennifer L. Kopanic, Paul L. Sorgen, Natalia L. Klyachko, Elena V. Batrakova, Tatiana K. Bronich, Alexander V. Kabanov. Well-defined cross-linked antioxidant nanozymes for treatment of ischemic brain injury // Journal of Controlled Release. 2012. V.162. P.636-645.]. Чтобы как можно меньше затрагивать активность СОД при конъюгации, авторы вводили небольшое количество ковалентных сшивок, что в итоге привело к низкому выходу по белку (около 10%). В итоге выход по суммарной активности СОД (суммарная активность фермента вычисляется как произведение удельной активности фермента и выхода по белку) составил только 5%. Поэтому актуальной является проблема получения нанозимов без существенной потери активности ферментов и с высоким выходом по белку.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, является получение нового продукта - наночастиц антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы для применения в качестве лекарственного средства, и, в частности, разработка способа создания дисперсии, содержащей полимерные наночастицы с инкапсулированным антиоксидантным ферментом супероксиддисмутазой, в которых фермент покрыт оболочками, которые состоят из положительно и отрицательно заряженных полимеров.

Предлагаемая полимерная наночастица состава фермент/поликатион/полианион содержит антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу и характеризуется тем, что фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона, при этом оболочки ковалентно сшиты друг с другом или внутри себя с помощью линкера, при этом наночастица имеет гидродинамический диаметр в диапазоне 40-80 нм.

Такие полимерные наночастицы могут быть получены, в частности, способом, согласно которому к раствору супероксиддисмутазы (СОД) добавляют по каплям при перемешивании раствор поликатиона, затем смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего по каплям при перемешивании добавляют раствор полианиона, и выдерживают смесь при температуре 4°C в течение 30 минут, после чего по каплям при перемешивании добавляют раствор линкера, реакционную смесь оставляют на 8-12 часов при 4°C, после чего побочные продукты и непрореагировавшие реагенты удаляют многократным центрифугированием, используя фильтрующие системы с пределом пропускания ультрафильтрационной мембраны 50000 Да, с получением дисперсии, содержащей наночастицы супероксиддисмутазы в виде фермента, инкапсулированного в систему типа фермент/поликатион/полианион. При этом фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона, оболочки ковалентно сшиты друг с другом или внутри себя с помощью линкера. Получаемые наночастицы имеют гидродинамический диаметр в диапазоне 40-80 нм.

Предлагается также новый продукт, представляющий собой дисперсию, содержащую полимерные наночастицы состава фермент/поликатион/полианион, содержащие антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу, где фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона и где оболочки ковалентно сшиты друг с другом или внутри себя с помощью линкера.

Предлагается также применение вышеуказанной дисперсии в качестве лекарственного средства.

Технический результат заявленной группы изобретений заключается в повышении стабильности фермента в чужеродной среде, увеличении выхода реакции по белку, сохранении удельной активности фермента, увеличении суммарной активности фермента и в понижении токсичности дисперсии наночастиц по сравнению с известными запатентованными однослойными сшитыми наночастицами типа фермент/поликатион (заявки WO 2012162490 A1, US 2013/0052154 A1).

Поставленная задача решается тем, что фермент покрывается послойно положительными и отрицательно заряженными полимерными цепями, образуя полиэлектролитный комплекс (фермент/поликатион/полианион). Затем полимерные оболочки комплекса ковалентно сшиваются линкерами (сшивающий агент) между собой или внутри себя, тем самым заключая фермент внутри комплекса, с образованием сшитых наночастиц состава фермент/поликатион/полианион. Первый слой - поликатион - защищает активный центр фермента от линкера. Поэтому можно в разы увеличивать количество сшивающего агента, что приводит к увеличению выхода по белку за счет получения стабильных внешних оболочек. Второй слой - полианион - уменьшает токсичность препарата. При таком подходе достигается высокий выход реакции по белку и большее сохранение суммарной активности фермента, по сравнению с запатентованной системой фермент/поликатион (WO 2012162490 A1, US 2013/0052154 A1). Кроме того, для уменьшения скорости опсонизации и увеличения времени циркуляции в крови полученных сшитых наночастиц, в качестве полианиона для получения внешнего слоя может быть использован полианион, конъюгированный с полиэтиленгликолем или другим полярным незаряженным полимером (например, введение в состав блок-сополимера полианион-полиэтиленгликоль).

В качестве первого (поликатионного) слоя могут быть использованы полиаминокислоты (например, полилизин, полиаргинин, полигистидин), спермин, протамин, хитозан, и другие положительно заряженные полимеры, которые основаны на мономерных звеньях, включающие: аминокислоты (например, лизин, аргинин, гистидин), виниловые мономеры (винилкапролактам, винилпиридин и др.), алкиленимины (например, этиленимин, пропиленимин, бутеленимин и др), первичные, вторичные или третичные амины, которые могут быть полностью или частично в виде аммониевой соли, и другие.

Частными вариантами настоящей группы изобретений являются упомянутые выше наночастицы и способ, согласно которым в качестве поликатиона используется протамин.

Частными вариантами настоящей группы изобретений являются упомянутые выше наночастицы и способ, согласно которым в качестве поликатиона используется полиаргинин.

В качестве второго (полианионного) слоя могут быть использованы отрицательно заряженные полимеры или блок-сополимеры состава А-В или В-А-В, где А - полярный отрицательно заряженный блок и В - полярный незаряженный блок (например, B-полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полиоксазолин, полисахариды и др). В качестве отрицательно заряженного блока могут выступать следующие полимеры и их производные: полиаминокислоты (например, полиглутаминовая кислота, полиаспарагиновая кислота), полиметакриловая кислота, полиакриловая кислота, полилактид, карбоксилированные декстраны и другие.

Частными вариантами настоящей группы изобретений являются упомянутые выше наночастицы и способ, согласно которым в качестве полианиона используется поли(глутаминовая кислота)-полиэтиленгликоль (ПГ-ПЭГ).

В качестве сшивающего агента (линкера) могут выступать химические вещества, способные образовывать ковалентные или ионные связи/сшивки между веществами (например, между карбоксильными группами внутри одного полимера, или между амингруппами и карбоксильными группами разных полимеров). В качестве сшивок могут быть использованы диамины (например, этилендиамин, пропилендиамин, 1,5-диаминопентан, и Др.), водорастворимые гомобифункциональные и гетеробифункциональные короткие полимеры (например, 2,2′-(этилендиокси) бис(этиламин), NH₂-(полиэтиленгликоль)_х-NH₂, COOH-(полиэтиленгликоль)_x-COOH, малеимид-(полиэтиленгликоль)_x-карбоксилат, и др.), двухосновные предельные карбоновые кислоты и альдегиды (например, малоновая кислота, янтарная кислота, глутаровый альдегид и др), биссульфосукцинимидил суберат (BS³), сукциминидил-4-(N-малеимидметил) циклохексан-1-карбоксилат), 3,3′-дитиобис(сульфосукцинимидил пропионат) (DTSSP), водорастворимые карбодиимиды (например, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид), цистамин и другие.

Частными вариантами настоящей группы изобретений являются упомянутые выше наночастицы и способ, согласно которым в качестве сшивающего агента используется глутаровый альдегид (ГА), образующий ковалентные связи. При этом образуются сшитые наночастицы с очень прочным ядром СОД-поликатион и электростатически связанной с ним внешней оболочкой, состоящей из поли(глутаминовой кислоты)-полиэтиленгликоля.

Частными вариантами настоящей группы изобретений являются упомянутые выше наночастицы и способ, согласно которым в качестве линкера используется водорастворимый карбодиимид (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, ЭДК), позволяющий ковалентно сшить оба полимерных слоя.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАЦИЙ

На рисунке 1 представлены результаты электрофореза полученных образцов в денатурирующих условиях. Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса; 2 - контроль, нативная СОД; 3 - дисперсия наночастиц СОД/протамин/ПЭГ-ПГ с сшивкой ГА; 4 - дисперсия наночастиц СОД/протамин/ПЭГ-ПГ с сшивкой ЭДК.

На рисунке 2 представлена микрофотография полимерных наночастиц СОД/протамин/ПГ-ПЭГ, где слои полимеров протамина и ПГ-ПЭГ ковалентно сшиты с помощью ЭДК.

На рисунке 3 представлены результаты МТТ-теста для дисперсий, содержащих наночастицы с инкапсулированной супероксиддисмутазой, полученных при помощи глутарового альдегида и ЭДК. Результаты МТТ-теста на культуре эмбриональных клеток почек человека (НЕК 293). Образцы: 1 - дисперсия наночастиц состава СОД/протамин/ПГ-ПЭГ, полученная с использованием ЭДК; 2 - дисперсия наночастиц состава СОД/протамин/ПГ-ПЭГ, полученная с использованием ГА.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Синтез системы фермент/поликатион/полианион на примере получения дисперсии наночастиц, содержащих фермент - супероксиддисмутазу, с использованием поликатиона - протамина или полиаргинина, полианиона - блок-сополимера полиглутаминовой кислоты и полиэтиленгликоля. сшивающего агента - глутарового альдегида или карбодиимида.

Фермент СОД растворяли в XEITEC-NaCl-буфере для получения раствора концентрацией 5 мг/мл. Затем по каплям при перемешивании добавляли раствор поликатиона (протамин или полиаргинин) концентрацией 5 мг/мл. Количество поликатиона считали как кратный избыток аминогрупп по отношению к карбоксильным группам в молекуле СОД (частным вариантом является соотношение 2:1). Смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем по каплям при перемешивании добавляли раствор полианиона (ПГ-ПЭГ) концентрацией 5 мг/мл. Количество полианиона считали как кратный избыток карбоксильных групп по отношению к карбоксильным группам в молекуле СОД (частным вариантом является соотношение 2:1). Смесь оставляли в течение 30 минут при температуре 4°C. Затем по каплям при перемешивании добавляли сшивающий агент: раствор глутарового альдегида (ГА) или карбодиимида (ЭДК). Количество ГА считали как 2-10-кратный мольный избыток по отношению к аминогруппам поликатиона. Количество ЭДК считали как 5-10-кратный мольный избыток по отношению к карбоксильным группам ПГ-ПЭГ. Реакционную смесь оставляли на 8-12 часов (например, на ночь) при 4°C. При использовании ГА после прохождения реакции добавляли 10 мкл 1 мг/мл раствора боргидрида натрия. Далее побочные продукты и непрореагировавшие реагенты удаляли многократным центрифугированием (2-3 раза), используя фильтрующие системы с пределом пропускания ультрафильтрационной мембраны 50000 Да (800 g, 4°C, ХЕПЕС-NaCl). Полученную водную дисперсию, содержащую полимерные сшитые наночастицы, собирали в эппендорф, анализировали и хранили при 4°C.

Характеризация полученной дисперсии, содержащей сшитые полимерные наночастицы с инкапсулированным антиоксидантным ферментом.

Таблица 1 Физико-химические характеристики сшитых полимерных наночастиц состава супероксиддисмутаза/поликатион/ПГ-ПЭГ. Наночастицы по изобретению(соотношение СОД/поликатион/ ПГ-ПЭГ) Линкер Выход по белку Выход по активности Суммарная активность Гидродинамический диаметр, нм Индекс полидисперсности Поверхностный потенциал, мВ СОД/полиаргинин/ ПГ-ПЭГ(1:2:2) ГА 69±4% 40±5% 28±2% 49±5 0,2±0,05 -1,6 СОД/полиаргинин/ ПГ-ПЭГ(1:2:2) ЭДК 53±5% 52±7% 29±2% 45±3 0,1±0,04 -2,8 СОД/протамин/ ПГ-ПЭГ(1:2:2) ГА 79±1% 45±4% 35±3% 40±3 0,12±0,03 -3,7 СОД/протамин/ ПГ-ПЭГ(1:2:2) ЭДК 73±2% 34±3% 25±3% 48±5 0,21±0,04 0,1 Известные препараты               СОД/полилизин (US 2013/ 0052154Al) BS³ DTSSP 10% 45% 4,5% 30±1 0,17±0,03 -1±1 наночастицы ПЛГ/СОД   - - 75% 290 0,12 -24,5±1,8 липосомы/СОД   10-30% 50-70% 5-20% 200-300 0,2-0,3 30-50

В Таблице 1 представлены выход по белку и выход по активности для исследованных дисперсий наночастиц. Также указана суммарная активность - произведение выхода по белку и выхода по активности, которая отражает эффективность всего процесса. Видно, что полученная дисперсия наночастиц имеет более высокую суммарную активность (в 5-7 раз) по сравнению с системой СОД/полилизин. Размер и полидисперсность наночастиц СОД/поликатион/ПГ-ПЭГ близки к соответствующим характеристикам препарата СОД/полилизин, и значительно меньше по сравнению с ПЛГ наночастицами или липосомами, что благоприятно сказывается на биораспределении в организме. Считается, что оптимальные размеры наночастиц варьируются от 20 до 100 нм [F. Alexis, Е. Pridgen, L.K. Molnar, О.С. Farokhzad, Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics., 2008. V.5, P.505-515; S.V. Vinogradov, T.K. Bronich, A.V. Kabanov, Nanosized cationic hydrogels for drug delivery: preparation, properties and interactions with cells. Adv. Drug Deliv. Rev., 2002. V.54, P.135-147].

Определение белка проводилось с помощью набора Micro BCA™ Protein Assay Kit в соответствии с инструкцией производителя. Метод основан на колориметрическом определении комплекса бицинхониновой кислоты с ионами Cu⁺, образующегося путем восстановления Cu²⁺ белками. Предел обнаружения белка - 0,5 мкг/мл.

Анализ активности СОД в образцах проводили с использованием двух методов, в основе которых лежат реакции ингибирования автоокисления кверцетина (а) и пирогаллола (б) по известным методикам.

А) Определение активности СОД по кверцетину [Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопр. мед. химии. 1990. Т.36. С.88-91]. В одноразовую спектрофотометрическую кювету объемом 1 мл вносили 0-40 мкл образца и 930-970 мкл рабочего буферного раствора (0,02 М фосфатный буфер, pH 7,4 с добавлением 0,08 мМ ЭДТА и 0,125% ТМЭДА). Реакцию инициировали добавлением 30 мкл раствора кверцетина в ДМСО (0,15 мг/мл) и сразу же измеряли оптическую плотность при длине волны 406 нм (D₀), образец инкубировали в течение 20 мин и вновь измеряли оптическую плотность при длине волны 406 нм (D₂₀). В контрольной кювете (без добавления анализируемого раствора) проводили аналогичные измерения - (^кD₀) и (^кD₂₀).

Процент ингибирования реакции автоокисления кверцетина в анализируемых пробах рассчитывали по формуле:

Варьировали объем анализируемого образца в кювете или разбавляли анализируемый раствор фосфатным буфером так, чтобы процент ингибирования реакции автоокисления кверцетина находился в диапазоне 30-55%. Концентрацию СОД, при которой наблюдалось 50% ингибирование реакции автоокисления кверцетина в реакционной среде, принимали за 1 Ед/мл. Для результатов в пределах 30-55% ингибирования проводили расчет активности. Учитывали разведение образца, если оно производилось.

Б) Определение активности по пирогаллолу [X. Yi., M.C. Zimmerman, R. Yang, J. Tong, S. Vinogradov, A.V. Kabanov, Pluronic-modified superoxide dismutase 1 (SOD1) attenuates angiotensin II-induced increase in intracellular superoxide in neurons // Free Radic. Biol. Med. 2010. V.49. P.548-58]. Измерения проводили в 96-луночном планшете. Для одного образца использовали 12 лунок (один ряд). Последовательным разбавлением получали 12 точек объемом 20 мкл с концентрациями от 400 до 0,2 мкг/мл. Добавляли 160 мкл Трис-буфера и 20 мкл раствора пирогаллола (раствор пирогаллола в ацетоне 5 мг/мл, затем разбавляли в 10 раз водой). Строили график зависимости скорости окисления пирогаллола от концентрации СОД в логарифмическом масштабе. С помощью программного обеспечения Origin 8.1 полученную зависимость аппроксимировали кривой «доза-ответ» и находили концентрацию, соответствующую 50% ингибированию (ЕС₅₀, мкг/мл). Далее рассчитывали активность по формуле:

Определение размеров и поверхностного заряда образцов проводили на установке динамического лазерного светорассеяния - Zetasizer Nano ZS «Malvem Instrument», Великобритания. Аликвоту раствора исследуемого образца разбавляли до концентрации 10 мкг/мл и фильтровали через 0,2 мкм фильтр (Coming, Германия). Затем проводили измерения при комнатной температуре. Программное обеспечение, предоставленное производителем, использовали для расчета значений гидродинамического диаметра, ζ-потенциала и относительной ширины распределения частиц по размерам, равной среднеквадратичному отношению ширины распределения к среднему значению размера частиц. Средние значения гидродинамического диаметра и ζ-потенциала для всех образцов рассчитывали, как минимум, из трех измерений, данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение.

Дисперсионную стабильность наночастиц фермент/поликатион/полианион изучали методом динамического светорассеяния в физиологическом растворе (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, pH 7,4) во времени. Найдено, что сшитые наночастицы фермент/поликатион/полианион, в частности СОД/протамин/ПГ-ПЭГ и СОД/полиаргинин/ПГ-ПЭГ с ковалентными сшивками ГА или ЭДК, обладают высокой стабильностью и не агрегируют в течение, как минимум, 15 дней при 37°C. Более того, полученная дисперсия более стабильна при хранении (4°C, 3 месяца) по сравнению со свободной СОД. Например, дисперсия наночастиц СОД/протамин/ПГ-ПЭГ с ГА сшивкой потеряла активность фермента в 4-5 раз меньше, чем нативная СОД. Таким образом, нано-СОД характеризуется повышенной устойчивостью при хранении по сравнению с нативной СОД, что важно для дальнейшего практического использования полученной дисперсии наночастиц фермент/поликатион/полианион.

Метод электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) в присутствии восстанавливающего агента додецилсульфата натрия по методу Laemmli использовали для анализа полученных дисперсий наночастиц (рисунок 1). Использовали 10% разделяющий полиакриламидный гель (pH 8,8) и 4% концентрирующий гель (pH 6,8). Перед нанесением к образцам добавляли буфер (62,5 мМ Трис-HCl, pH 6,8; 25% глицерина; 2% додецил сульфата натрия; 0,01% бромфенолового синего), затем подвергали 10-минутной инкубации при 100°C для полной денатурации. Электрофорез проводили в режиме постоянного напряжения в Bio-Rad Mini-Protein гель-электрофорезной камере. При прохождении образцов в концентрирующем геле использовали напряжение 60 В, далее увеличивали до 200 В. Области локализации белка были визуализированы красителем (0.25% Кумасси бриллиантовый голубой R-250) в смеси 10% метанол/10% уксусная кислота.

На рисунке 1 представлены данные электрофореза дисперсий, содержащих наночастицы СОД/протамин/ПГ-ПЭГ с ковалентными сшивками с использованием ГА или ЭДК. В качестве контроля использовали свободный фермент СОД (дорожки 1). Сравнение локализации свободных СОД и СОД/протамин/ПГ-ПЭГ с разными линкерами (дорожки 3 и 4) подтверждает успешное покрытие фермента противоположно заряженными полимерами, то есть создание дисперсии наночастиц состава фермент/поликатион/полианион. Видно, что в дисперсии наночастиц нет свободной СОД и наночастицы в основном концентрируются в верхней части геля, что указывает на их высокую молекулярную массу. При этом, в случае использования глутарового альдегида наблюдается формирование более полидисперсных наночастиц (видно размытые полосы с различными молекулярными массами), что согласуется с данными по динамическому светорассеянию (таблица 1).

Морфологию полимерных наночастиц с инкапсулированным ферментом изучали методом просвечивающей (трансмиссионной) электронной микроскопии (рисунок 2). Для визуализации образцов использовали 1% ацетат уранила, pH 4,5. Ацетат уранила смешивали с изучаемой водной дисперсией СОД/протамин/ПГ-ПЭГ со сшивкой ЭДК, затем полученный раствор наносили на подложку и высушивали, после чего проводили съемку. Видно, что полученная дисперсия содержит наночастицы сферической формы с узким распределением по размерам, что согласуется с предыдущими данными (таблица 1, рисунок 1).

Цитотоксичностъ системы СОД/поликатион/полианион проверяли на культуре эмбриональных клеток почек человека (ПЕК 293) с помощью стандартного МТТ-теста (рисунок 3). За 24 часа до начала экспериментов клетки помещали в 96-луночные планшеты с концентрацией 10000 клеток на лунку. Затем клетки инкубировали в DMEM среде в присутствии исследуемых образцов в концентрации от 2 мкг/мл до 5 мг/мл в течение 24 часов. Выживаемость клеток определяли при помощи МТТ-реагента (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида) после дополнительного инкубирования в свежей среде (общее время инкубации составило 72 часа). Затем строили график зависимости оптической плотности от концентрации исследуемого образца в логарифмическом масштабе.

Максимальная нетоксичная концентрация двухслойной системы СОД/поликатион/полианион при использовании ГА составила 180 мкг/мл; при использовании ЭДК - 250 мкг/мл. Для СОД аналогичное значение составляет 220 мкг/мл, а для запатентованной однослойной системы СОД/поликатион составила 100 мкг/мл. Таким образом, дисперсия двухслойных наночастиц состава фермент/поликатион/полианион в отличие от однослойной не обладает токсичностью, что можно объяснить созданием стабильной оболочки из полианиона вокруг комплекса поликатиона с СОД.

Проведенные исследования на изучение восстановления двигательной активности животных после контузионной травмы спинного мозга (крысы породы Wistar, 250-300 г, модель контузионной травмы спинного мозга) показали, что крысы, которым внутривенно вводили препарат, представляющий собой разработанную дисперсию наночастиц в дозе 5000 Ед/кг, восстанавливали двигательную активность быстрее и в большей степени по сравнению с животными, которым вводили в той же дозе препараты СОД или запатентованные наночастицы СОД/полилизин-ПЭГ (WO 2012162490 А1). Так, в группе СОД и СОД/полилизин-ПЭГ наблюдалось частичное восстановление за 6 недель (12 баллов по стандартной шкале ВВВ-теста, где «0» - полный паралич и «21» - нормальная двигательная активность). Для разработанной дисперсии наночастиц это значение было достигнуто за 2 недели, а через 6 недель - 18 баллов, то есть эффективность восстановления двигательной актвности у животных с использованием предлагаемой дисперсии примерно на 30% выше, чем у указанных выше известных препаратов.

Полученные данные демонстрируют возможность применения разработанных наночастиц и дисперсии, содержащей такие частицы, в качестве лекарственного средства.

Таким образом, полимерные сшитые наночастицы состава фермент/поликатион/полианион, содержащие антиоксидантный фермент (например, суперокиддисмутазу) могут быть использованы для лечения заболеваний, связанных с неконтролируемым выбросом реактивных свободных радикалов. Такое взрывообразное высвобождение активных форм кислорода характерно для таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, инфаркт, инсульт, ревматоидный артрит, онкологические и аутоиммунные заболевания, различные травмы спинного и головного мозга.

Группа изобретений относится к химической энзимологии, к способу создания дисперсии, содержащей полимерные наночастицы с инкапсулированным антиоксидантным ферментом, в частности к получению водной дисперсии наночастиц состава супероксиддисмутаза/поликатион/полианион, которая предназначена для медицинского применения. Технический результат заявленной группы изобретений заключается в повышении стабильности фермента в чужеродной среде, увеличении выхода реакции по белку, сохранении удельной активности фермента, увеличении суммарной активности фермента и в понижении токсичности дисперсии наночастиц. Предлагаемая полимерная наночастица состава фермент/поликатион/полианион содержит антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу и характеризуется тем, что фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона, при этом оболочки ковалентно сшиты друг с другом или внутри себя с помощью линкера, при этом наночастица имеет гидродинамический диаметр в диапазоне 40-80 нм, где в качестве поликатиона использован протамин или полиаргинин, в качестве полианиона использован поли(глутаминовая кислота)-полиэтиленгликоль, в качестве линкера использован глутаровый ангидрид (ГА) или 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбомид (ЭДК). Предлагается также новый продукт, представляющий собой дисперсию, содержащую полимерные наночастицы состава фермент/поликатион/полианион, содержащие антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу, где фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона и где оболочки ковалентно сшиты друг с другом или внутри себя с помощью линкера. Предлагается также применение вышеуказанной дисперсии в качестве лекарственного средства. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.

1. Полимерная наночастица состава фермент/поликатион/полианион, содержащая антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу, характеризующаяся тем, что фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона, при этом оболочки ковалентно сшиты друг с другом или внутри себя с помощью линкера, при этом наночастица имеет гидродинамический диаметр в диапазоне 40-80 нм, где в качестве поликатиона использован протамин или полиаргинин, в качестве полианиона использован поли(глутаминовая кислота)-полиэтиленгликоль, в качестве линкера использован глутаровый альдегид (ГА) или 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид (ЭДК).

2. Способ получения дисперсии, содержащей полимерные наночастицы состава фермент/поликатион/полианион по п. 1, содержащие антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу, характеризующийся тем, что к раствору супероксиддисмутазы (СОД) добавляют по каплям при перемешивании раствор поликатиона, затем смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего по каплям при перемешивании добавляют раствор полианиона, и выдерживают смесь при температуре 4^°C в течение 30 минут, после чего по каплям при перемешивании добавляют раствор линкера, реакционную смесь оставляют на 8-12 часов при 4^°C, после чего побочные продукты и непрореагировавшие реагенты удаляют многократным центрифугированием, используя фильтрующие системы с пределом пропускания ультрафильтрационной мембраны 50000 Да, с получением дисперсии, содержащей наночастицы супероксиддисмутазы в виде фермента, инкапсулированного в систему типа фермент/поликатион/полианион.

3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что используют раствор супероксиддисмутазы с концентрацией 5 мг/мл в ХЕПЕС-NaCl-буфере.

4. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что поликатион используют с концентрацией 5 мг/мл.

5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что поликатион используют в количестве, рассчитанном как двухкратный избыток аминогрупп по отношению к количеству карбоксильных групп в молекуле СОД.

6. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что полианион используют с концентрацией 5 мг/мл.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что полианион используют в количестве, рассчитанном как двухкратный избыток карбоксильных групп по отношению к карбоксильным группам в молекуле СОД.

8. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве линкера используют глутаровый альдегид (ГА).

9. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве линкера используют водорастворимый карбодиимид (ЭДК).

10. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что ГА используют в количестве, рассчитанном как 2-10-кратный мольный избыток по отношению к аминогруппам протамина или полиаргинина.

11. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что ЭДК используют в количестве, рассчитанном как 5-10-кратный мольный избыток по отношению к карбоксильным группам ПГ-ПЭГ.

12. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что полученную дисперсию, содержащую наночастицы супероксиддисмутазы, хранят при 4^°C.

13. Дисперсия, предназначенная для медицинского применения, содержащая полимерные наночастицы, содержащие антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу, состава фермент/поликатион/полианион по п. 1, полученная способом по любому из пп. 2-12.

14. Применение дисперсии полимерных наночастиц состава фермент/поликатион/полианион, содержащих антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу, по п. 13, полученной способом по п. 2, в качестве лекарственного средства.