СИСТЕМА ИНКАПСУЛЯЦИИ Российский патент 2011 года по МПК A61K35/407 A61K9/50 A61P1/16 A61P3/10 A61P25/00 A61P37/04 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к системе инкапсуляции, включающей в себя альгинатные биокапсулы для иммунологической изоляции живых клеток или лекарственных средств. Особенно, но ни в коем случае не исключительно, система инкапсуляции предназначена для использования в случаях алло- и ксенотрансплантации. Изобретение относится также к способам изготовления и применения системы инкапсуляции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трансплантация клеток становится все более успешной, как экспериментально, так и клинически. Один цикл трансплантации клеток пользуется развитием материальной науки, клеточной биологии и доставки лекарственных средств для разработки основных принципов лечения микро- и макроинкапсулированными клетками. Они включают в себя сконструированные двухмерные и трехмерные тканевые структуры, состоящие из неразлагаемых термопластичных полимеров, биологически разлагаемых материалов и гибридных комбинаций. Указанные конструкции позволяют осуществлять контролируемую доставку терапевтических молекул для лечения острых и хронических заболеваний, но их широкому применению препятствует необходимость частого введения в случае разлагаемых материалов и проблемы с извлечением и постоянной биологической совместимостью в случае неразлагаемых материалов. В случае биологически разлагаемых материалов успех терапии инкапсулированными клетками в большой степени будет зависеть от понимания стабильности материала после трансплантации и, в конечном итоге, от того, как указанная стабильность влияет на способность трансплантата обеспечивать выживание клеток, секрецию и диффузию белка, иммунологическую изоляцию, биологическую совместимость, физическое расположение и фиксацию, деградацию и эффективность и фармакодинамику секретируемого продукта. Одним из наиболее распространенных материалов, используемых для указанных биокапсул для клеточной терапии, является альгинат, биологически разлагаемый углевод.

Альгинат долго изучался как биологический материал для широкого применения в области физиологии и терапии. Его возможности в качестве биологически совместимого имплантируемого материала впервые были изучены в 1964 г. в области хирургии в качестве плазмозаменителя (1). Спустя более десяти лет возможности альгината в качестве матрикса для носителя клеток были реализованы in vitro в серии экспериментов, которые показали выживание микробных клеток в течение 23 дней (2). В течение последних двадцати лет отмечался значительный прогресс в области альгинатной микроинкапсуляции клеток для лечения диабета (3-10), хронической боли (11), гемофилии (12, 13), заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) (14-24) и т.п. Несмотря на успешность при использовании многочисленных моделей на экспериментальных животных и в ограниченных клинических аллотрансплантациях, наблюдалась изменчивая кинетика деградации, влияющая на диффузию, иммунологическую изоляцию и, в конечном итоге, приводящая к гибели и отторжению трансплантата. Было проведено несколько хорошо разработанных экспериментов для изучения свойств и контроля определенных аспектов деградации альгината in vitro (25-30) и in vivo (31, 32), однако общее понимание стабильности альгинатно-поликатионных капсул in vivo с точки зрения перспективы использования определенных материалов остается ограниченным, и это, в свою очередь, ограничивает их использование.

Целью настоящего изобретения является продвинуться по пути дальнейшего понимания стабильности альгинатно-поликатионных биокапсул для изготовления более стабильных биокапсул для применения in vivo и/или обеспечения эффективного выбора для общества.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к композиции длительного использования в биологическом окружении, включающей в себя альгинат, который имеет высокое содержание маннуроновой кислоты, и поликатион, не являющийся поли-L-лизином, имеющий среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности < 1,5, для изготовления микрокапсул. Указанные микрокапсулы можно изготавливать стандартными способами. Композиция по настоящему изобретению имеет преимущества перед известными композициями, поскольку ее можно использовать для изготовления микрокапсул, которые являются более долговечными, чем известные микрокапсулы, и, таким образом, могут обеспечивать более длительную защиту от иммунной системы хозяина, в случае, когда в них инкапсулированы дискордантные клетки. Это продемонстрировано в настоящем документе уменьшенной скоростью разложения in vivo микрокапсул, составленных из композиции по настоящему изобретению. Микрокапсулы также имеют усиленную морфологию поверхности, и их можно вводить в области, которые ранее отличались повышенной склонностью к воспалению, как описано ниже.

В первом аспекте изобретение относится к композиции, включающей в себя альгинат, содержащий приблизительно от 50 до95%, предпочтительно, приблизительно от 50 до 90%, более предпочтительно приблизительно от 50 до 70% и наиболее предпочтительно приблизительно от 60 до 70% остатков маннуроновой кислоты, и поликатион, не являющийся поли-L-лизином. Предпочтительно, поликарбон представляет собой поли-L-орнитин. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соотношение альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты и поликатиона составляет приблизительно от 5:1 до 10:1, предпочтительно приблизительно 7:1. Помимо этого, композиция по настоящему изобретению может включать в себя хлорид кальция и хлорид натрия. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция может включать в себя альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты в концентрации приблизительно от 80 до 90% и предпочтительно приблизительно от 85 до 90% и более предпочтительно приблизительно 87%; поли-L-оринитин в концентрации приблизительно от 10 до 15%, предпочтительно приблизительно 13%; хлорид кальция в концентрации приблизительно менее 1%; и хлорид натрия в концентрации приблизительно менее 1%.

Поликатион, например поли-L-оринитин, присутствует в композиции в относительно чистой форме, причем пределы видов с различной молекулярной массой ограничен, а индекс полидисперсности (т.е., средняя ММ + медиана ММ) составляет менее 1,5, предпочтительно менее 1,2, наиболее предпочтительно менее 1,1.

Во втором аспекте изобретение относится к биологически совместимым микрокапсулам, изготовленным с использованием композиции по настоящему изобретению и включающим в себя ядерный слой из альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты, поперечно сшитой с использованием сшивающего агента, такого как ионы кальция, промежуточный слой из поликатионов, имеющих индекс полидисперсности < 1,2, формирующих полупроницаемую мембрану, и внешний слой из альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты. Ядерный слой и внешний слой могут включать в себя один и тот же или разные альгинаты с высоким содержанием маннуроновой кислоты.

Микрокапсулы могут дополнительно включать в себя живые клетки в ядерном слое. Клетки могут включать в себя нативные или полученные методами генной инженерии клетки, которые могут быть в форме отдельных клеток или клеточных кластеров, выбранные из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток, таких как клетки хороидного сплетения, гипофизарные клетки, хромаффинные клетки, хондроциты, и любого другого типа клеток, способных секретировать факторы, которые будут пригодными для лечения заболевания или состояния.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления биологически совместимых микрокапсул, включающему в себя этапы:

а) растворение альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты в изотоническом солевом растворе;

b) распыление раствора альгината с этапа а) посредством воздушного или частотного генератора капель в перемешиваемый раствор избыточного количества сшивающего агента, такой как, например, приблизительно от 15 до 120 мМ, более предпочтительно приблизительно от 40 до 110 мМ и еще более предпочтительно приблизительно от 90 до 110 мМ хлорид кальция, в течение приблизительно от 5 до 30 минут, предпочтительно, от 5 до 10 минут, с получением гелевых капсул;

с) нанесение на гелевые капсулы с этапа b) поликатиона, не являющегося поли-L-лизином, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности < 1,5, в концентрации приблизительно от 0,02 до 0,01% (мас./об.), предпочтительно, 0,05% (мас./об.), в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, в течение приблизительно 10 минут);

d) нанесение окончательного покрытия из альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты на капсулу с этапа с) в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, в течение приблизительно от 5 до 10 минут); и

е) сбор микрокапсул;

в котором альгинат, используемый на этапах а) и d), представляет собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, предпочтительно приблизительно от 50 до 90%, более предпочтительно приблизительно от 50 до 70% и наиболее предпочтительно приблизительно от 60 до 70% остатков маннуроновой кислоты.

Альгинатный раствор с этапа а) имеет концентрацию альгината приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.

Альгинатный раствор с этапа d) имеет концентрацию альгината приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения микроинкапсулированных клеток, включающему в себя этапы:

а) инкубирование живых клеток с раствором альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты, растворенного в изотоническом солевом растворе;

b) распыление раствора клеток-альгината с этапа а) посредством воздушного или частотного генератора капель в перемешиваемый раствор избыточного количества сшивающего агента, такой как, например, приблизительно от 15 до 120 мМ хлорид кальция (предпочтительно, 110 мМ), в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, 5-10 минут), с получением содержащих клетки гелевых капсул;

с) нанесение на содержащие клетки гелевые капсулы с этапа b) поликатиона, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности <1,5, такого как поли-L-оринтин, в концентрации приблизительно от 0,02 до 0,1% (мас./об.) (предпочтительно, 0,05% мас./об.), в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, в течение приблизительно 10 минут);

d) нанесение окончательного альгинатного покрытия на содержащие клетки капсулы с этапа с) в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, в течение приблизительно 10 минут); и

е) сбор содержащих клетки микрокапсул;

в котором альгинат, используемый на этапах а) и d), представляет собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, предпочтительно приблизительно от 50 до 90%, более предпочтительно приблизительно от 50 до 70% и наиболее предпочтительно приблизительно от 60 до 70% остатков маннуроновой кислоты, и в котором поликатион не является поли-L-лизином.

Альгинатный раствор с этапа а) имеет концентрацию альгината приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.

Альгинатный раствор с этапа d) имеет концентрацию альгината приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об.

Пятая особенность настоящего изобретения относится к способу нанесения покрытия на неразлагаемые конструкции для доставки клеток, включающему в себя этапы: а) погружение неразлагаемых конструкций для доставки клеток в раствор альгината, содержащего приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты (предпочтительно приблизительно от 50 до 90%, более предпочтительно, приблизительно от 50 до 70% и наиболее предпочтительно приблизительно 60 и 70% маннуроновой кислоты), и изотонического солевого раствора; b) поперечная сшивка остатков маннуроновой кислоты посредством инкубирования с избыточным количеством сшивающего агента, таким как от 15 до 120 мМ раствор хлорида кальция (предпочтительно, 110 мМ), в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, приблизительно от 5 до 10 минут), с получением гелевого покрытия; с) дополнительное нанесение на гелевые конструкции с этапа b) поликатиона, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности менее 1,5, например поли-L-орнитина, в концентрации приблизительно от 0,02 до 0,1% мас./об. (предпочтительно, 0,05% мас./об.), в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, в течение приблизительно 10 минут); d) нанесение окончательного альгинатного покрытия в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, приблизительно 10 минут), с получением покрытых иммуноизолирующей мембраной неразлагаемых конструкций для доставки клеток; и е) выделение окончательных покрытых иммуноизолирующей мембраной неразлагаемых конструкций для доставки клеток; в котором поликатион не является поли-L-лизином.

Альгинатный раствор с этапа а) имеет концентрацию альгината приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.

Альгинатный раствор с этапа d) имеет концентрацию альгината приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к способу инкапсулирования лекарственного средства, представляющего собой малую молекулу, белок или ДНК, включающему в себя этапы: а) диспергирование лекарственного средства в растворе альгината, содержащего большую долю остатков маннуроновой кислоты, растворенного в изотоническом солевом растворе; b) поперечная сшивка остатков маннуроновой кислоты посредством инкубирования с избыточным количеством сшивающего агента, таким как от 15 до 120 мМ раствор хлорида кальция (предпочтительно, 110 мМ), в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, приблизительно 10 минут), с получением содержащих лекарственное средство гелевых капсул; с) нанесение на содержащие лекарственное средство гелевые капсулы поликатиона, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности менее 1,5, например поли-L-оринтина, в концентрации приблизительно от 0,02 до 0,1% мас./об. (предпочтительно, 0,05% мас./об.), в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, 10 минут); d) нанесение окончательного альгинатного покрытия на содержащие лекарственное средство капсулы с этапа с) в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, приблизительно 10 минут), и е) сбор содержащих лекарственное средство микрокапсул; в котором поликатион не является поли-L-лизином.

Альгинат, используемый на этапах а) и d), представляет собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до95% остатков маннуроновой кислоты, предпочтительно, приблизительно от 50 до 90%, более предпочтительно приблизительно от 50 до 70% и наиболее предпочтительно приблизительно от 60 до 70% остатков маннуроновой кислоты.

Альгинатный раствор с этапа а) имеет концентрацию альгината приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.

Альгинатный раствор с этапа d) имеет концентрацию альгината приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об.

В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к способу облегчения или лечения заболевания или состояния у животного, включая человека, предусматривающему трансплантацию эффективного количества содержащих клетки микрокапсул по настоящему изобретению указанному животному, в котором указанные клетки секретируют лекарственное средство, которое является эффективным для облегчения или лечения указанного заболевания или состояния.

В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к способу облегчения или лечения заболевания или состояния у животного, включая человека, предусматривающему трансплантацию эффективного количества содержащих лекарственное средство микрокапсул по настоящему изобретению указанному животному, в котором указанное лекарственное средство является эффективным для облегчения или лечения указанного заболевания или состояния.

В девятом аспекте настоящее изобретение относится к применению альгината, содержащего приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, и поликатиона для изготовления препарата микрокапсул для применения в случаях алло- и ксенотрансплантации.

Препараты микрокапсул по настоящему изобретению можно вводить субъекту. Термин «субъект», используемый в настоящем документе, означает человека или позвоночное млекопитающее, включая, без ограничения, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу или примата, например обезьяну. Препараты микрокапсул включают в себя клетки, которые секретируют терапевтические агенты, или содержат сами терапевтические агенты, и вводятся в количестве, достаточном для обеспечения субъекту эффективного количества терапевтического агента. Эффективное количество конкретного агента будет зависеть от таких факторов, как тип агента, цель введения, тяжесть заболевания, если осуществляют лечение заболевания, и т.п. Специалисты будут способны определить эффективные количества.

Термин «включающий в себя (содержащий)», используемый в настоящем описании и формуле изобретения, означает «состоящий, по меньшей мере, частично, из»; иначе говоря, при интерпретации пунктов формулы изобретения, включающих указанный термин, признаки, предваряемые указанным термином в каждом пункте, обязательно должны присутствовать, но также могут присутствовать и другие признаки.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Изобретение далее будет описано с использованием прилагаемых фигур, на которых:

Фигура 1 показывает белковый ЯМР-спектр альгината при 90°С, на котором пики сдвинуты книзу, благодаря температуре и химической структуре альгината (см. вставку в рамке), с расположением протонов, ответственных за пики ЯМР;

Фигура 2а показывает инфракрасную спектроскопию компонентов материала до инкапсуляции и поглощение карбонильной области с большим увеличением (см. вставку в рамке);

Фигура 2b показывает смеси альгинатов с различными концентрациями поли-L-оринитина (PLO), где выделенная область представляет поглощение амида II PLO;

Фигура 2с показывает количественную инфракрасную спектроскопию, измеряющую соотношение поглощения амида PLO и поглощения альгината.

Фигура 3 показывает фазово-контрастное изображение капсул VPMG с 5-кратным увеличением перед имплантацией;

Фигура 4 показывает фазово-контрастные микрофотографии с 5-кратным увеличением образцов 60-дневных эксплантатов различных типов альгинатов;

Фигура 5 показывает однородность на поперечном срезе (А) и % исходного диаметра (В) для образцов 60-дневных эксплантатов с фигуры 4, средний ISD. (∆) VPMG; (◊) VPLG; (-) pKel; (□) pFlu; (●) pMan;

Фигура 6 показывает инфракрасную спектроскопию, пики 1590 см^-1 и 1550 см^-1 для каждой группы капсул за 90-дневный период исследований;

Фигура 7 показывает индекс стабильности количественной инфракрасной спектроскопии как единицу измерения пика альгината карбоновой кислоты по отношению к амидному пику II орнитина (∆) VPMG; (◊) VPLG; (-) pKel; (□) pFlu; (●) pMan;

Фигура 8 показывает микрофотографии поверхностей лиофилизированных альгинатных капсул для каждого из типов альгината VPMG, VPLG, pKel, pFlu и pMan за 90-дневный период исследований; и

Фигура 9 показывает более сильное увеличение микрофотографии, чтобы показать точечную коррозию поверхности микрокапсулы pKel на 30 день.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к системе инкапсуляции для живых клеток и лекарственных средств, которая имеет улучшенную биологическую стабильность, когда инкапсулированные клетки и лекарственные средства имплантируют субъекту. Указанная улучшенная биологическая стабильность дает возможность инкапсулированным клеткам и лекарственным средствам оставаться в живом организме в течение более продолжительных периодов времени, чем это происходит в настоящее время, что улучшит доставку лекарственных средств и, таким образом, эффективность лечения.

Система инкапсуляции включает в себя композицию длительного использования в биологическом окружении, включающую в себя альгинат, который имеет высокое содержание маннуроновой кислоты.

Альгинат представляет собой полисахарид, состоящий из гулуроновой (G) и маннуроновой (М) кислоты, связанных посредством (1,4)-α- и -β-гликозидных связей (см. вставку в рамке на фигуре 1). Соотношение указанных мономеров вносит свой вклад непосредственно в конкретные физические характеристики полисахарида. Впервые было установлено, что после катионной поперечной сшивки альгинаты с высоким содержанием G, благодаря более сетчатой структуре, возникающей из-за α(1-4) связей, являются более хрупкими, с более высоким модулем упругости, в то время как те, у которых имеется высокое содержание М, с более линейными β(1-4) связями, демонстрируют пониженную трехмерную сшивку и более высокую упругость и образуют очень стабильные при испытании in vivo микрокапсулы.

Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции, включающей в себя альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты, конкретно, содержащий приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, и поликатион, не являющийся поли-L-лизином и имеющий среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности < 1,5. Предпочтительно, поликатион представляет собой поли-L-оринитин. Предпочтительно, альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты содержит приблизительно от 50 до 90% остатков маннуроновой кислоты, более предпочтительно приблизительно от 50 до 70% остатков маннуроновой кислоты и наиболее предпочтительно приблизительно от 60 до 70% остатков маннуроновой кислоты. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения массовое соотношение альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты и поликатиона составляет приблизительно от 5:1 до 10:1, предпочтительно приблизительно 7:1. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может включать в себя хлорид кальция и хлорид натрия. Предпочтительно, композиция включает в себя альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты в концентрации приблизительно от 80 до 90%, предпочтительно приблизительно 87%, поли-L-орнитин в концентрации приблизительно от 10 до 15%, предпочтительно приблизительно 13%, хлорид кальция в концентрации менее приблизительно 1% и хлорид натрия в концентрации менее приблизительно 1%.

Средняя молекулярная масса альгината составляет более приблизительно 400 кДа, предпочтительно более приблизительно 600 кДа.

Альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты, используемый в пропорциях по настоящему изобретению, может включать в себя глюкуроновую кислоту в количестве приблизительно от 10 до 40%. Таким образом, соотношение M:G в альгинате, пригодном для настоящего изобретения, составляет приблизительно от 1,25:1 до 9,5:1.

Источник альгината очищен и содержит менее 1 эндотоксиновой единицы/мл 1,7% (мас./об.) альгината. Примеры имеющихся в продаже альгинатов, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают в себя Keltone LVCR и Pronova SLM20. Однако любой другой альгинат с подходящим высоким содержанием маннуроновой кислоты (или подходящими соотношениями M:G) можно использовать в качестве исходного материала для использования в настоящем изобретении.

Альгинат может иметь рН 7,0±0,4 после растворения в 1,7% (мас./об.) солевом растворе.

Молекулярная масса поликатиона также играет важную роль в структурном и функциональном составе микрокапсул по настоящему изобретению. Впервые было установлено, что при использовании поликатиона, имеющего индекс полидисперсности менее приблизительно 1,2, более предпочтительно менее приблизительно 1,1, вместе с альгинатом с высоким содержанием маннуроновой кислоты можно получить превосходные микрокапсулы, которые имеют высокую стабильность и могут оставаться in vivo в течение длительных периодов времени, и, с определенностью, более одного месяца.

При использовании поликатионных агентов, имеющих высокий индекс полидисперсности и, таким образом, включающих в себя широкий ряд видов ММ, как было показано, получают худшие по качеству микрокапсулы. Полагают, что это происходит из-за более крупных по ММ молекул, которые неспособны диффундировать в альгинатное покрытие, что приводит к образованию слабого покрытия. Более маленькие по ММ молекулы, с другой стороны, могут диффундировать слишком быстро в альгинатное покрытие и могут проникать в ядерный слой и вытеснять из него клетки или гранулы. Поликатион с ограниченным рядом видов ММ, как было показано, обеспечивает получение превосходных микрокапсул.

Например, когда поликатион представляет собой поли-L-оринитин, предпочтительная средняя ММ поликатиона составляет приблизительно от 10 до 40 кДа, более предпочтительно приблизительно от 15 до 30 кДа и наиболее предпочтительно приблизительно 20-25 кДа.

Предпочтительно, поли-L-оринитин будет содержать < приблизительно 20% молекул, имеющих ММ 10 кДа или менее, и, более предпочтительно, < приблизительно 10% молекул, имеющих ММ 10 кДа или менее.

Изобретение относится также к биологически совместимым микрокапсулам, изготовленным с использованием композиции по настоящему изобретению и включающим в себя ядерный слой из альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты, сшитого катионным сшивающим агентом, промежуточный слой поликатионов, имеющих индекс полидисперсности менее приблизительно 1,2, образующий полупроницаемую мембрану, и внешний слой из альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты.

Альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты может включать в себя приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, предпочтительно приблизительно от 50 до 90%, более предпочтительно приблизительно от 50 до 70% и наиболее предпочтительно приблизительно от 60 до 70% остатков маннуроновой кислоты.

Альгинат, используемый в ядерном слое и во внешнем слое, может быть одним и тем же или это могут быть разные альгинаты.

Ядерный слой может включать в себя альгинат, состоящий из 50-70% остатков маннуроновой кислоты, а внешний слой может включать в себя альгинат, состоящий из 10-40% остатков глюкуроновой кислоты.

Катионный сшивающий агент может быть выбран из группы, состоящей из Ag⁺, Al³⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, H⁺, K⁺, Li⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺, NH⁴⁺, Ni²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺ и Zn²⁺. Предпочтительно, катионный сшивающий агент представляет собой хлорид кальция. Сшивающий агент предпочтительно находится в избытке, например, от 15 мМ до 120 мМ хлорида кальция. Более предпочтителен 110 мМ хлорид кальция.

Поликатионный агент может быть выбран из группы, состоящей из глутамата хитозана, хитозангликоля, модифицированного декстрана, лизоцима, поли-L-орнитина, сальмин-сульфата, протамин-сульфата, полиакрилимида, сополимера полиакрилимида и бромида метакрилоксиэтилтриметиламмония, полиаллиламина, полиамида, полиамина, полибрена, сополимера полибутилакрилата и бромида метакрилоксиэтилтриметиламмония (80/20), хлорида поли-3-хлор-2-гидроксипропилметакрилоксиэтилдиметиламмония, полидиаллилдиметиламмония, хлорида полидиаллилдиметиламмония, сополимера хлорида полидиаллилдиметиламмония и акриламида, сополимера хлорида полидиаллилдиметиламмония и N-изопропилакриламида, сополимера полидиметиламина и эпихлоргидрина, сополимера полидиметиламиноэтилакрилата и акриламида, полидиметиламиноэтилметакрилата, полиэтиленимина, модифицированного полиэтиленимин-эпихлоргидрина, полиэтиленимина, хлорида поли-2-гидрокси-3-метакрилоксипропилтриметиламмония, поли-2-гидрокси-3-метакрилоксиэтила, хлорида триметиламмония, хлорида полигидроксипропилметакрилоксиэтилдиметиламмония, полиимидазолина (четвертичного), бромида поли-2-метакрилоксиэтилтриметиламмония, бромида/хлорида полиметакрилоксиэтилтриметиламмония, сополимера полиметилдиэтиламиноэтилметарилата и акриламида, бромида поли-1-метил-2-винилпиридиния, бромида поли-1-метил-4-винилпиридиния, сополимера полиметилена и гидрохлорида гуанидина, поливиниламина, сополимера поли-N-винилпирролидона и диметиламиноэтилметакрилата и хлорида поли-4-винилбензилтриметиламмония.

Предпочтительно, поликатионный агент представляет собой поли-L-орнитин в концентрации от 0,02 до 0,1% мас./об.

Поли-L-орнитин предпочтительно очищают для удаления видов с более высокой или низкой ММ, чтобы получить индекс полидисперсности предпочтительно менее 1,1. Конкретно, средняя ММ для поликатионного агента поли-L-орнитина составляет от 10 до 40 кДа, более предпочтительно от 15 до 30 кДа и наиболее предпочтительно приблизительно от 20 до 25 кДа. Любые молекулы с молекулярной массой менее 10 кДа и более 40 кДа можно удалить диализом и другими известными способами. Предпочтительно, поли-L-орнитин, используемый в настоящем изобретении, включает в себя менее приблизительно 20% молекул, имеющих ММ 10 кДа или менее, и более предпочтительно менее 10% молекул, имеющих ММ 10 кДа или менее.

Промежуточный слой, который формируют из поликатионов вокруг ядерного слоя, включает в себя полупроницаемую мембрану толщиной приблизительно от 10 до 80 мкм.

Альгинат ядерного слоя может быть твердым или может быть деполимеризован хелатирующим агентом с образованием полого ядра. Примерами подходящих хелатирующих агентов являются цитрат натрия и EDTA.

Полагают, что хелатирование альгинатного ядра (дежелатинизация) солюбилизирует внутреннюю структурную поддержку капсулы, что неблагоприятно влияет на долговечность микрокапсулы. Ранее указанная проблема была решена тем, что не осуществляли этап хелатирования так, что ядро оставалось твердым (см., например, патент США № 6 365 385). Однако использование альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты в микрокапсулах по настоящему изобретению, вместе с использованием поликатиона, имеющего индекс полидисперсности менее 1,2, значимо увеличивает долговечность микрокапсул, даже если ядро превращено в жидкость хелатированием. Микрокапсулы по настоящему изобретению могут также иметь твердое ядро для дополнительного повышения стабильности и долговечности.

Массовое соотношение ядерного слоя альгината и поликатионного агента составляет приблизительно от 7:1 до 8:1.

Массовое соотношение внешнего слоя альгината и поликатионного агента составляет приблизительно от 1,2:1 до 1,4:1.

Полученные микрокапсулы набухают приблизительно на 10% или более по объему, когда их помещают in vitro в физиологические условия приблизительно на один месяц или более. Набухание микрокапсул, как полагают, вызывается избытком двухвалентных катионов, которые обеспечивают осмотический градиент, приводящий к поглощению воды. Это может представлять собой проблему и приводит к деградации микрокапсул. Указанную проблему можно преодолеть ликвидацией избытка катионов с использованием анионов (как, например, в патенте США № 6 592 886). Однако в настоящем изобретении использование альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты вместе с использованием поликатионного агента, имеющего индекс полидисперсности менее 1,2, обеспечивает меньший избыток катионов, и микрокапсулы по настоящему изобретению имеют высокую стабильность и меньшую вероятность деградации, хотя, как было описано, имеет место некоторое ограниченное набухание.

Поверхность микрокапсулы после формирования является нейтральной в ионном отношении.

Микрокапсулы могут дополнительно включать в себя живые клетки внутри ядерного слоя. Клетки могут включать в себя нативные или полученные методами генной инженерии клетки, которые могут быть в форме отдельных клеток и/или клеточных кластеров, выбранные из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток, таких как клетки хороидного сплетения, гипофизарные клетки, хромаффинные клетки, хондроциты, и любого другого типа клеток, способных секретировать факторы, которые будут пригодными для лечения заболевания или состояния.

Например, клетки могут представлять собой островковые клетки, способные секретировать инсулин, пригодный для лечения диабета.

Клетки могут, альтернативно, включать в себя гепатоциты и клетки, не являющиеся гепатоцитами, способные секретировать секреторные факторы печени, пригодные для лечения заболеваний или нарушений функции печени.

Клетки могут, альтернативно, включать в себя нейрональные клетки, такие как клетки хороидного сплетения, гипофизарные клетки, хромаффинные клетки, хондроциты, и любые другие клетки, способные секретировать нейрональные факторы, пригодные для лечения нейрональных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, эпилепсия, болезнь Хантингтона, инсульт, заболевание моторных нейронов, боковой амиотрофический склероз (ALS), рассеянный склероз, старение, сосудистое заболевание, синдром курчавых волос Менкеса, болезнь Вильсона, травма или повреждение нервной системы.

Микрокапсулы по настоящему изобретению могут иметь диаметр от 50 до 2000 микрон. Предпочтительно, микрокапсулы имеют диаметр приблизительно от 100 до 1000 микрон и более предпочтительно приблизительно от 500 до 700 микрон.

Ожидается, что микрокапсулы по настоящему изобретению будут способны оставаться функциональными in vivo в организме субъекта в течение значительного периода времени и, с определенностью, в течение периодов времени, превышающих один месяц.

Функциональную долговечность микрокапсул можно контролировать одним или более из следующих способов:

путем варьирования полидисперсности ряда альгинатов, используемых во внутреннем и/или внешнем слоях микрокапсулы;

путем варьирования общего содержания белка во внутреннем и/или внешнем альгинатных слоях;

путем индуцирования кальцификации альгинатных слоев;

путем варьирования пределов и распределения молекулярной массы поликатионного агента;

путем варьирования концентрации поликатионного непрореагировавшего контаминанта с концентрациями приблизительно от 0,01 до 0,25% (мас./мас.);

путем варьирования однородности концентрации поликатиона, что создает градиент вдоль промежуточного слоя микрокапсулы;

путем варьирования количества взаимодействия клетка-поверхность нанесением покрытия на внешнюю поверхность из ингибирующих агентов, таких как поверхностно-активные агенты, включая типы Рluronic F127, антифиброзных агентов и других подходящих агентов.

Настоящее изобретение также относится к способу изготовления биологически совместимых микрокапсул по настоящему изобретению, включающему в себя этапы:

а) растворение альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты в изотоническом солевом растворе;

b) распыление раствора альгината с этапа а) посредством воздушного или частотного генератора капель в перемешиваемый раствор избыточного количества сшивающего агента в течение приблизительно 5-30 минут (предпочтительно, от 5 до 10 минут), с получением гелевых капсул;

с) нанесение на гелевые капсулы с этапа b) поликатиона, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности менее приблизительно 1,5, такого как поли-L-орнитин, в концентрации от 0,01 до 0,2% мас./об. (предпочтительно, 0,05% мас./об.), в течение 5-30 минут (предпочтительно, 10 минут);

d) нанесение окончательного покрытия из альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты на капсулу с этапа с) в течение приблизительно 5-30 минут (предпочтительно, в течение приблизительно от 5 до 10 минут); и

е) сбор микрокапсул;

в котором альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты, используемый на этапах а) и d), представляет собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, предпочтительно от 50 до 90%, более предпочтительно приблизительно от 50 до 70% и наиболее предпочтительно приблизительно от 60 до 70% остатков маннуроновой кислоты, и в котором поликатион не является поли-L-лизином.

Альгинатный раствор с этапа а) имеет концентрацию альгината приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.

Альгинатный раствор с этапа d) имеет концентрацию альгината приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об.

Сшивающий агент может быть выбран из группы, перечисленной выше, и предпочтительно представляет собой хлорид кальция в концентрации приблизительно 110 мМ.

Окончательное альгинатное покрытие предпочтительно содержит приблизительно от 10 до 40% остатков глюкуроновой кислоты.

Альгинат ядерного слоя может быть твердым или может быть деполимеризован хелатирующим агентом с образованием полого ядра, как описано выше.

Настоящее изобретение также относится к способу получения микроинкапсулированных клеток, включающему в себя этапы:

а) инкубирование живых клеток с раствором альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты, растворенного в изотоническом солевом растворе;

b) распыление раствора клеток-альгината с этапа а) посредством воздушного или частотного генератора капель в перемешиваемый раствор избыточного количества катионного сшивающего агента, такой как, например, приблизительно от 15 до 120 мМ хлорид кальция (предпочтительно, 110 мМ), в течение приблизительно 5-30 минут (предпочтительно, от 5 до 10 минут), с получением содержащих клетки гелевых капсул;

с) нанесение на содержащие клетки гелевые капсулы с этапа b) поликатиона, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности менее 1,5, предпочтительно, поли-L-оринтина, в концентрации приблизительно от 0,02 до 0,1% мас./об. (предпочтительно, 0,05% мас./об.), в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, приблизительно 10 минут);

d) нанесение окончательного альгинатного покрытия на содержащие клетки капсулы с этапа с) в течение от 5 до 30 минут (предпочтительно, приблизительно 10 минут); и

е) сбор содержащих клетки микрокапсул;

в котором альгинат, используемый на этапах а) и d), представляет собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, предпочтительно приблизительно от 50 до 90%, более предпочтительно приблизительно от 50 до 70% и наиболее предпочтительно, приблизительно от 60 до 70% остатков маннуроновой кислоты, и в котором поликатион не является поли-L-лизином.

Альгинатный раствор с этапа а) имеет концентрацию альгината приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.

Альгинатный раствор с этапа d) имеет концентрацию альгината приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об.

Клетки могут представлять собой нативные или полученные методами генной инженерии клетки, которые могут быть в форме отдельных клеток и/или клеточных кластеров, выбранные из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток, таких как клетки хороидного сплетения, гипофизарные клетки, хромаффинные клетки, хондроциты, и любого другого типа клеток, способных секретировать факторы, которые будут пригодными для лечения заболевания или состояния.

Клетки могут быть выделены от того же вида, что и реципиент, для использования в качестве аллотрансплантатов, или от других видов, для использования в качестве ксенотрансплантатов.

Клетки предпочтительно содержатся в ядерном альгинатном слое, но могут альтернативно или дополнительно содержаться во внешнем альгинатном слое.

Настоящее изобретение также относится к способу нанесения покрытия на неразлагаемые конструкции для доставки клеток, включающему в себя этапы: а) погружение неразлагаемых конструкций для доставки клеток в раствор альгината, содержащего приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, и изотонического солевого раствора; b) поперечная сшивка остатков маннуроновой кислоты посредством инкубирования с избыточным количеством сшивающего агента, например, с раствором хлорида кальция с концентрацией приблизительно от 15 до 120 мМ (предпочтительно, 110 мМ), в течение приблизительно 5-30 минут (предпочтительно, приблизительно от 5 до 10 минут), с получением гелевого покрытия; с) дополнительное нанесение на гелевые конструкции с этапа b) поликатиона, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности менее 1,5, предпочтительно, поли-L-оринтина, в концентрации приблизительно от 0,02 до 0,1% мас./об. (предпочтительно, 0,05% мас./об.), в течение приблизительно от 5 до 30 минут (предпочтительно, 10 минут); d) нанесение окончательного альгинатного покрытия в течение приблизительно от 5 до 30 минут, с получением покрытых иммуноизолирующей мембраной неразлагаемых конструкций для доставки клеток; и е) выделение окончательных покрытых иммуноизолирующей мембраной неразлагаемых конструкций для доставки клеток; в котором поликатион не является поли-L-лизином.

Альгинатный раствор с этапа а) имеет концентрацию альгината приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.

Альгинатный раствор с этапа d) имеет концентрацию альгината приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об.

Неразлагаемую конструкцию для доставки клеток можно выбрать из группы, состоящей из мембранных устройств из полого волокна, плоских листов, пористых каркасов для прорастания клеток внутрь и других новых каркасных конструкций, что будет понятно специалисту.

Неразлагаемая конструкция для доставки клеток может включать в себя живые клетки, которые могут представлять собой нативные или полученные методами генной инженерии клетки, которые могут быть в форме отдельных клеток и/или клеточных кластеров, выбранные из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток, таких как клетки хороидного сплетения, гипофизарные клетки, хромаффинные клетки, хондроциты, и любого другого типа клеток, способных секретировать факторы, которые будут пригодными для лечения заболевания или состояния.

Настоящее изобретение также относится к способу инкапсулирования лекарственного средства, представляющего собой малую молекулу, белок или ДНК, включающему в себя этапы: а) диспергирование лекарственного средства в растворе альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты, растворенного в изотоническом солевом растворе; b) поперечная сшивка остатков маннуроновой кислоты посредством инкубирования с избыточным количеством сшивающего агента, предпочтительно, в растворе хлорида кальция с концентрацией приблизительно 15 мМ-120 мМ (предпочтительно, 110 мМ), в течение приблизительно от 5 до 30 минут, с получением содержащих лекарственное средство гелевых капсул; с) нанесение на содержащие лекарственное средство гелевые капсулы поликатиона, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности менее 1,5, предпочтительно, поли-L-орнитина, в концентрации приблизительно от 0,02 до 0,1% мас./об. (предпочтительно, 0,05% мас./об.), в течение приблизительно от 5 до 30 минут; d) нанесение окончательного альгинатного покрытия на содержащие лекарственное средство капсулы с этапа с) в течение от 5 до 30 минут; и е) сбор содержащих лекарственное средство микрокапсул; в котором поликатион не является поли-L-лизином.

Альгинатный раствор с этапа а) имеет концентрацию альгината приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.

Альгинатный раствор с этапа d) имеет концентрацию альгината приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об.

Лекарственное средство, представляющее собой малую молекулу, белок или ДНК, предпочтительно содержится в ядерном альгинатном слое, но может альтернативно или дополнительно содержаться во внешнем альгинатном слое.

Альтернативно, лекарственное средство, представляющее собой малую молекулу, белок или ДНК, может быть связано с внешним альгинатным слоем или может содержаться в (поликатионном) промежуточном слое.

Примеры подходящего белкового лекарственного средства включают в себя эритропоэтин, инсулин, CNTF, BDNF, GDNF, GH и другие, что будет понятно специалисту.

В определенных аспектах может быть желательным использование альгината, который содержит приблизительно от 50 до 90% остатков маннуроновой кислоты и в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, в пределах приблизительно от 50 до 70% остатков маннуроновой кислоты и предпочтительно от 60 до 70% остатков маннуроновой кислоты. Подобно этому в определенных аспектах настоящего изобретения может быть желательным нанесение окончательного альгинатного покрытия с концентрацией приблизительно от 0,05 до 0,20% мас./об. Как упоминалось выше, время распыления, нанесения покрытия, а затем нанесения альгинатного покрытия может быть значительно меньше или больше приблизительно 10 минут и может в некоторых случаях потребовать приблизительно от 1 до 45 минут для каждого этапа, в то время как в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения каждый из указанных этапов можно осуществлять в течение периода времени приблизительно от 5 до 20 минут.

Настоящее изобретение также относится к способу облегчения или лечения заболевания или состояния у животного, включая человека, предусматривающему трансплантацию эффективного количества содержащих клетки микрокапсул по настоящему изобретению указанному животному, в котором указанные клетки секретируют лекарственное средство, которое является эффективным для облегчения или лечения указанного заболевания или состояния.

Настоящее изобретение также относится к способу облегчения или лечения заболевания или состояния у животного, включая человека, предусматривающему трансплантацию эффективного количества содержащих клетки, покрытых иммуноизолирующей мембраной, неразлагаемых конструкций для доставки клеток по настоящему изобретению указанному животному, в котором указанные клетки секретируют лекарственное средство, которое является эффективным для облегчения или лечения указанного заболевания или состояния.

Настоящее изобретение также относится к способу облегчения или лечения заболевания или состояния у животного, включая человека, предусматривающему трансплантацию эффективного количества содержащих лекарственное средство микрокапсул по настоящему изобретению указанному животному, в котором указанное лекарственное средство является эффективным для облегчения или лечения указанного заболевания или состояния.

В указанных способах лечения микрокапсулы или конструкции для доставки с покрытием по настоящему изобретению можно вводить в количестве, которое будет доставлять достаточное количество лекарственного средства, которое было бы эффективным для лечения заболевания. Например, при лечении диабета один мл микрокапсул будет содержать приблизительно 10000-60000 β-островковых эквивалентов, и приблизительно 1-10 мл микрокапсул будет имплантироваться на кг массы тела субъекта, чтобы секретировать требующееся количество инсулина для контроля уровней глюкозы в крови.

Специалист будет способен определить скорость секреции конкретного лекарственного средства из микрокапсул in vitro и рассчитать, исходя из потребностей конкретного пациента, количество микрокапсул, которое потребуется для его эффективного лечения.

Микрокапсулы по настоящему изобретению можно изготавливать для алло- или ксенотрансплантации в зависимости от источника живых клеток и/или лекарственного средства.

Микрокапсулы по настоящему изобретению можно трансплантировать в ткани организма или в наполненные жидкостью пространства организма, что является даже более благоприятным с точки зрения доступности и эффективности. Например, если живые клетки в микрокапсулы являются островковыми β-клетками, их можно трансплантировать в перитонеальную полость. Если живые клетки в микрокапсулы являются клетками хороидного сплетения и предназначаются для лечения неврологических расстройств, и любой терапевтический агент, секретируемый клетками, должен быть в контакте с цереброспинальной жидкостью, окружающей головной мозг, то такие микрокапсулы можно имплантировать в головной мозг или на головной мозг.

Альтернативно, микрокапсулы можно изготавливать для перорального или местного введения, особенно, когда они содержат терапевтический биологически активный агент, такой как антибиотик.

Изобретение относится к применению альгината, содержащего приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, и поликатиона для изготовления препарата микрокапсул для использования в случаях алло- и ксенотрансплантации.

Указанные микрокапсулы могут содержать живые клетки, включая нативные или полученные методами генной инженерии клетки, которые могут быть в форме отдельных клеток или клеточных кластеров, выбранные из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток, таких как клетки хороидного сплетения, гипофизарные клетки, хромаффинные клетки, хондроциты, и любого другого типа клеток, способных секретировать факторы, которые будут пригодными для лечения заболевания или состояния.

Альтернативно, микрокапсулы могут включать в себя терапевтический агент.

Также в широком смысле может быть сказано, что настоящее изобретение состоит из частей, элементов и признаков, на которые имеется ссылка, или указанных в описании заявки, по отдельности или коллективно, и любых или всех комбинаций любых двух или более указанных частей, элементов или признаков, а в случае, если в настоящем документе упоминаются конкретные целые величины, которые имеют известные эквиваленты в той области техники, к которой относится настоящее изобретение, то указанные известные эквиваленты считаются включенными в настоящий документ, как если бы они были перечислены по отдельности.

Изобретение заключается в вышеприведенном описании, а также предусматривает конструкции, которые далее приводятся только в примерах.

ПРИМЕРЫ

Изобретение заключается в вышеприведенном описании, а также предусматривает конструкции, которые далее приводятся только в примерах. Следующие примеры включены в настоящий документ для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Специалистам будет понятно, что технология, описанная в следующих примерах, представляет собой технологию, которая, как установил заявитель, хорошо функционирует при практическом осуществлении настоящего изобретения и, таким образом, может рассматриваться как предпочтительные способы его практического осуществления. Однако в свете настоящего описания специалистам будет понятно, что можно осуществлять множество изменений в конкретных вариантах осуществления, которые описаны, и все равно получать сходный или аналогичный результат, не отступая от идеи и объема изобретения.

ПРИМЕР 1

Интраперитонеальная стабильная микрокапсула альгинат-полиорнитин у крыс: анализ с использованием FTIR и SEM

Материалы и методы

План исследования

Монодисперсные альгинат-PLO микрокапсулы изготавливали из 5 различных типов альгината и инъецировали в перитонеальную полость крыс Long-Evans. Перед трансплантацией материалы изучали in vitro на предмет соотношения маннуроновой кислоты и гулуроновой кислоты (соотношение M:G), уровней эндотоксина и белка, вязкости и молекулярной массы. Через 14, 30, 60 и 90 дней у животных капсулы извлекали. Оценивали геометрическую форму возвращенных капсул и проводили их анализ на химическую целостность с использованием преобразования Фурье - инфракрасной спектроскопии (FTIR) и морфологию поверхности с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM).

Материалы для инкапсуляции: источник и очистка

Лиофилизированный альгинат приобретали из 5 источников в неочищенной или в очищенной форме. Два источника поставлялись производителем в очищенной форме (см. ниже), а остальные три получали в неочищенной форме и впоследствии очищали с использованием способа экстракции растворителем (33). Кратко, 1% (мас./об.) раствор растворяли в 1,0 мМ растворе натрий-EGTA и фильтровали через последовательно более рестриктивные мембраны (фильтры 5,0, 1,5, 0,8, 0,45 и 0,22 мкм). рН постепенно понижали до 1,5, и выпавший в осадок альгинат трижды промывали с использованием 0,01Н HCl + 20 мМ NaCl. С помощью хлороформа и бутанола белки экстрагировали 3 раза с 30-минутной экспозицией и энергичным встряхиванием. После возвращения к нейтральной величине рН органическую экстракцию повторяли, а альгинат осаждали в этаноле, фильтровали, промывали диэтиловым эфиром и лиофилизировали в течение по меньшей мере 72 часов. Перед формированием микрокапсул все альгинаты растворяли в 1,5% (мас./об.) растворах в не содержащем кальция и магния физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) (Gibco, США) и пропускали через 0,22 мкм фильтр для стерильности. Альгинаты обозначали как очищенный производителем со средним содержанием G (VPMG), очищенный производителем с низким содержанием G (VPLG), очищенный Keltone LVCR (pKel), очищенный Fluka (pFlu) и очищенный Manucol (pMan), на основании приближенно выраженной G-фракции, описанной поставщиком. Альгинаты Keltone и Manucol получали от компании ISP Corporation (США), в то время как Fluka заказывали у Sigma-Aldrich.

Гидробромид полиорнитина (ММ=5-15 кДа, Sigma-Aldrich, США) растворяли в не содержавшем кальций и магний PBS и фильтровали для стерильности непосредственно перед изготовлением капсул. Все остальные реагенты для инкапсуляции, включая хлорид кальция, цитрат натрия и хлорид натрия, приобретали у Sigma-Aldrich и изготавливали из них стерильные растворы в день инкапсуляции.

Материалы для инкапсуляции: определение свойств альгинатов

Альгинаты изучали с использованием различных методик, чтобы выявить важные химические свойства, включая ядерную магнитно-резонансную спектроскопию (ЯМР), FTIR и гельпроникающую хроматографию (GPC). Относительные уровни белка и эндотоксина также определяли для каждого альгинатного раствора.

ЯMР спектроскопия

ЯMР спектроскопию использовали для определения соотношения остатков маннуроновой кислоты и гулуроновой кислоты в углеводном сополимере. Образцы частично гидролизовали для уменьшения вязкости и осуществляли соответствующее разделение на ЯМР, как описано Grasdalen et al. (34). Кратко, 1,0% (мас./об.) альгинат доводили до рН 3,0 и поддерживали температуру кипения с обратным холодильником 100°С в течение 30 минут. Роторный испаритель Buchi (Швейцария) использовали для удаления большей части воды, в то время как оставшийся материал лиофилизировали до полной сухости. Образцы затем растворяли (2 мг/мл) в оксиде дейтерия и анализировали с использованием ЯМР Bruker (300 МГц при 90°С). Повышенная температура эффективно смещала пик воды книзу, что выявляло пики, представляющие интерес для интеграции. Bruker XWIN-ЯМР использовали для измерения площади под указанными пиками (δ≈5,7 м.д. для G1, 5,3 м.д. для М1 и GМ5 и 4,9 м.д. для GG5). Рассчитывали соотношение площади под G1 и площади под M1/GM5+GG5, с получением G-фракции. Образцы проходили указанный процесс в трех повторностях.

FTIR спектроскопия

Использовали FTIR Perkin-Elmer серии 1600, присоединенный к устройству настроенной по горизонту общей отражательной способности (H-ATR) для всех измерений. Альгинатный порошок или лиофилизированные микрокапсулы помещали на кристалл ZnSe до полного его покрытия, и к образцу применяли давление 100 фунтов/кв.дюйм. Получали циклы сканирования 4000-650 см^-1 (N=32) и к полученным спектрам применяли коррекцию ATR. Количественную оценку производили измерением площади под пиками, представляющими интерес, с использованием компьютерной программы Perkin-Elmer Spectrum (35).

Для того, чтобы охарактеризовать и количественно определить влияние возрастающего количества PLO на получающиеся спектры, PLO:альгинат осаждали вместе, с концентрацией PLO 80%, 60%, 40%, 35%, 30%, 25%, 21%, 17%, 10% и 5% (мас./мас.). Для получения однородного образца раствор PLO в dH₂O помещали на верхушки замороженных альгинатных аликвот. При использовании ультразвуковой насадки PLO постепенно взаимодействовал и выпадал в осадок с тающим альгинатом, до тех пор, пока вся смесь целиком не оттаивала и не становилась непрозрачной. Ультразвуковую обработку осуществляли до получения гомогенно непрозрачного раствора. Затем образцы замораживали жидким азотом и немедленно лиофилизировали. Указанные сухие образцы обрабатывались в трех повторностях при усредненных для N= 32 сканограмм спектрах.

Вискозиметрия

Вязкость измеряли с использованием вискозиметра Brookfield Cone/Plate. Зазор между стаканом и валиком устанавливали 0,013 мм перед каждым циклом работы, чтобы устранить искажение, связанное с уровнем образца. 1 мл 1,0% (мас./об.) образца альгината добавляли в стакан для образцов и распределяли его тонким слоем по дну стакана, избегая образования пузырей. Валик вставляли для оценки сопротивления вращению на различных скоростях от 1 до 20 об./мин. Вращающий момент при различных скоростях варьировал в пределах 25-95% в оптимальном рабочей зоне вискозиметра. Динамическую вязкость рассчитывали по изменению сопротивления относительно скорости зонда. Все измерения осуществляли при комнатной температуре (25°С).

GPC

Образцы альгинатов растворяли до концентрации 0,17% (мас./об.) и 50 мкл инъецировали в ультрагидрогелевую линейную колонку Waters (США), присоединенную к аппарату Perkin-Elmer GPC с изократным насосом 250, печью 101, детектором LC30 RI и интерфейсом серии 900. Использовали калибровочные стандарты поли(этиленоксид) с молекулярными массами 932, 571, 177 и 70 кДа, растворенные в PBS буфере также с концентрацией 0,17% (мас./об.). С помощью компьютерной программы Nelson Turbochrom рассчитывали M_w, M_n и M_z. Индекс полидисперсности или степень полиморфизма в видах молекулярной массы рассчитывали как M_w/M_n.

Содержание белка в альгинате

Общее содержание белка в образцах альгинатов измеряли с использованием Micro BCA Protein Assay (Pierce, США). После экспериментов с получением пиков и восстановлением с приблизительно 100% точностью и линейностью разведения приблизительно 95%, 1 мл 1,7% (мас./об.) образцы альгинатов разбавляли в 2, 5, 10 и 20 раз и инкубировали с рабочим реактивом в течение 2 часов при 37°С для проявления. Проявленный реактив выявляли на 96-луночном планшете с использованием UV-Vis спектрофотометра на 562 нм и определяли количественно с использованием линейной стандартной кривой с бычьим сывороточным альбумином.

Содержание эндотоксина

Для количественного определения общего содержания эндотоксина в альгинатах во время исследования использовали The Limulus Amebocyte Lysate (LAL) CL-1000 Chromogenic LAL Endpoint Assay (Cambrex, США). 1,7% (мас./об.) образцы инкубировали в 10-кратном разведении в dH₂O в течение 18 часов при 50°С для экстракции эндотоксина и проводили взаимодействие в течение определенного периода времени по сравнению со стандартными концентрациями (36). Конечный продукт анализировали с использованием UV-VIS спектрофотометра Beckman-Coulter DTX-880. Анализ имеет пределы обнаружения 1-50 EU/мл.

Альгинатная микроинкапсуляция

Для отбора 30 мл 1,7% (мас./об.) стерилизованного альгинатного раствора 60 см³ использовали шприц, присоединенный к электростатической инкапсулирующей машине Inotech IE-50R (Швейцария). Шприцевой насос с действием приблизительно 8 мл/мин использовали для подачи раствора через сопло, вибрирующее с частотой приблизительно 900 Гц. Из-за различий в вязкости, присущей различным альгинатным растворам, указанные параметры слегка изменяли, как это требовалось для поддержания оптимальной работы машины. Поток жидкости проходил через электростатическое кольцо под током приблизительно 1,5 кВ в баню 300 мл 100 мМ CaCl₂ с 50 мМ NaCl, перемешиваемой без образования воронки. После сшивки в течение 5 минут капсулы удаляли, и они немедленно взаимодействовали со 100 мл 0,05% (мас./об.) PLO в течение 10 минут, с последующими 2 промываниями в буфере 3-(N-морфолин)пропансульфоновой кислоты (MOPS). Затем наносили внешнее альгинатное покрытие путем перемешивания капсул в 0,05% альгинате в течение 5 минут, и капсулы с нанесенным покрытием вновь дважды промывали в буфере MOPS. Капсулы изготавливали без консервантов и содержали при 37°С в 1 мл аликвотах стерильного PBS до имплантации. Аликвоты сохраняли для анализа, который проводили до имплантации.

Изучение свойств капсул: микроскопия и анализ изображений

Геометрическую форму капсул изучали с использованием фазово-контрастного светового микроскопа совместно с имиджевой морфометрией Scion (США). Капсулы, суспендированные в PBS, помещали в 24-ячеечные чашки, и убеждались, что только один слой капсул остается на дне ячейки. С помощью 5Х линзы с фазовым контрастом получали изображения с большими полями и ясными очертаниями капсул. При том же разрешении получали изображение гемоцитометра для калибровки относительно известного расстояния. При визуализации Scion калибровочное изображение использовали для выставления подходящего масштаба, и диаметры капсул измеряли, приближая максимальный диаметр и минимальный диаметр в случае сферического отклонения. Для упрощения до двухмерного параметра измеряли % однородности на поперечном срезе как площадь на основе более маленького радиуса, деленную на площадь на основе большего радиуса, Х 100. По меньшей мере 100 капсул измеряли в каждой группе в каждую отсечку времени.

Использование животных

Самцов крыс Long-Evans с массой тела 250-350 г размещали парами и содержали в условиях контролируемого окружения, при цикле свет-темнота 12:12 часов. Использование животных и обращение с ними осуществляли по строгим стандартам, которые соответствовали или превосходили инструкции NIH. Помимо этого, все процедуры были заблаговременно согласованы с руководством Brown University IACUC. В каждой материальной группе (N=5), для каждой отсечки времени (N=4) было по 5 животных всего 100 животных в исследовании.

Крысам давали кратковременный наркоз 3% газом изофлюраном, и 1 мл объем капсул, суспендированных в 1 мл не содержащего кальций и магний PBS (общий объем 2 мл), вводили посредством иглы диаметром 16G в перитонеальную полость по срединной линии. По окончании процедуры животные пробуждались после наркоза и их возвращали в клетки. Материал в отсечку времени 0 (до имплантации) и группы для анализа изображений также проходили через иглу 16G.

Через 14, 30, 60 и 90 дней животных умерщвляли с использованием передозировки СО₂, и капсулы извлекали под контролем микроскопа с использованием неградуированной пипетки и PBS, для сбора свободно плавающих капсул из всех квадрантов. Расположение, множество и макроскопическую картину документировали. Затем объединенные образцы охарактеризовывали с использованием анализа изображений, промывали и замораживали для лиофилизации.

Изучение свойств капсул после культивирования в животной среде

После 72-часового периода лиофилизации капсулы подвергали анализу с использованием FTIR и SEM на предмет химического состава и морфологии поверхности. Аналогичную процедуру использовали для FTIR, как описано ранее для исходных материалов, за исключением того, что лиофилизированные гранулы инспектировали визуально на предмет целостности, с целью ограничить анализ внешней поверхностью капсулы, а не массы, и подтвердить, что прикрепившиеся к субстрату клетки отслоились для минимизации взаимовлияния тканей. Приблизительно 20 капсул помещали на кристалл ATR для полного покрытия и получали спектры при 100 фунтах/кв.дюйм. Получали множество спектров для различных капсул для подтверждения гомогенности популяции образцов и объединяли их.

Образцы для SEM помещали на алюминиевые основы, выстланные углеродными дисками с адгезивным покрытием и напыленные золотом-палладием в условиях вакуума в атмосфере аргона. Образцы с покрытием изучали с использованием Hitachi 2700 при возрастающем напряжении от 5 до 8 кВ. Все время использовали цифровые зафиксированные изображения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение свойств до инкапсуляции

Осуществляли изучение свойств альгинатных материалов до инкапсуляции на основе их соответствующих соотношение M:G, уровней белка и эндотоксина, вязкости и молекулярной массы. Результаты показаны в таблице 1, ниже:

В целом, приблизительная спецификация, представленная производителем, соответствовала результатам, полученным в результате ЯМР, за исключением того, что альгинат pMan имел более высокое содержание гулуроновой кислоты, чем ожидалось. Вязкость, показатель молекулярной массы, в группах была сходной, по результатам измерения динамической вязкости. Два коммерческих очищенных альгината имели самую низкую вязкость при 1,0% и 25° (VPMG: 25 сП; VPLG: 22 сП), в то время как альгинаты, очищенные собственными силами, имели возрастающие более высокие вязкости, соответственно. Содержание белка также было относительно постоянным во всех группах, за исключением pMan, который при 86 мкг/мл имел по меньшей мере в два раза больший показатель, чем у других материалов. Уровни эндотоксина были сходными; при этом самые высокие уровни наблюдались в группах pFlu и pMan.

Пики, интегрированные из спектров ЯМР, полученных при 90°С, показаны на фигуре 1. Указанный спектр, полученный от одного из образцов при 90°С, показал три пика, описанных ранее, где пик А представляет протонный резонанс для G1, пик В - для М1 и GM5, а пик С - для GG5. Пик протонов, присутствующих в растворителе, HDO, показан при 4,7 м.д. Следует отметить, что все спектры целиком при 90°С, за исключением пика HDO, были сдвинуты книзу на 0,8 м.д., по сравнению с условиями комнатной температуры, для дополнительного объяснения альгинатных пиков.

Молекулярные массы оценивали с использованием GPC, и они показаны в таблице 1, выше. В целом, среднемассовая молекулярная масса, M_w, хорошо коррелировала с вязкостью, по прогнозу уравнения Sakurade-Houwink [η=КМ^α]. pMan имел самую высокую молекулярную массу 609 кДа, в то время как другие группы имели молекулярные массы в пределах 317-534 кДа. Как и ожидалось для нативных биополимеров, индекс полидисперсности или M_w/M_n указанных образцов показали некоторую вариабельность полиморфизма образцов. Группы VPMG, VPLG и pKel показали самое узкие пределы распределения по указанному параметру, в то время как pFlu и pMan имели самую высокую полидисперсность.

Для изучения свойств функциональных групп использовали ATR-FTIR. Помимо использования величин поглощения от сообщавшихся ранее данных FTIR для изучения капсул из альгината и поликатиона (35), заявители подтвердили пределы сообщавшихся данных по гомогенным лиофилизированным преципитатам PLO:альгинат, а также по неочищенным исходным материалам. Это осуществляли для того, чтобы охарактеризовать взаимоотношения между двумя компонентами на внешней поверхности капсулы для более правильной оценки изменений поверхности с течением времени. Спектры неочищенных материалов, показанные на фигуре 2а, демонстрируют ряд пиков в обоих образцах. Таблица 2, ниже, представляет некоторые из имеющих отношение к делу пиков, выявленных в указанных образцах, и связанные с ними функциональные группы в альгинате и алгинате-PLO. Фигура 2b показывает различия в критических областях, представляющих интерес, особенно в карбонильной области, связанной с амидной II связью PLO (1550 см^-1), и части карбоновой кислоты уроновых кислот (1590 см^-1). Различия существуют в -NH и -СН₂ поглощениях альгината/PLO по сравнению с только альгинатом, но в меньшей степени.

Влияние увеличения содержания PLO на поверхность образца показано на фигурах 2b и 2c. Спектры, показанные на фигуре 2b, демонстрируют уменьшающуюся амплитуду пика, связанного с поглощением амида II PLO на 1550 см^-1, по мере уменьшения содержания PLO в образце. Количественно указанные взаимоотношения можно выразить соотношением площади под кривой поглощения амида II и поглощения СОО^- альгината. По мере увеличения содержания PLO в образце указанное соотношение линейно возрастает, как показано на фигуре 2c. Указанные образцы не содержат кальция, в то время как эксплантированные капсулы его содержат, что может повлиять на спектральный сдвиг (35) и точное положение пика поглощения. Невзирая ни на что, указанное наблюдение означает, что незначительные изменения в сравнительной композиции могут быть обнаружены указанным способом.

Изучение свойств микрокапсул

Капсулы, собранные непосредственно после инкапсуляции, изучали на предмет их геометрической формы и морфологии до лиофилизации. Измеряли диаметр, однородность на поперечном срезе и толщину стенки с использованием анализа изображений (таблица 3, ниже). Препараты микрокапсул были аналогичны по размеру и имели разницу в диаметре в пределах приблизительно 170 мкм. Подобно этому, пределы толщины стенки были узкими и составляли приблизительно от 18,0 до 19,7 мкм.

Морфология капсул до имплантации отличалась хорошо закругленными, гладкими поверхностями, с однородным распределением по размеру в каждом образце. Толщина на поперечном срезе была постоянной по всему периметру стенки капсулы, и не отмечалось значительных дефектов ни в одной группе образцов. Наиболее монодисперсной популяцией капсул на начало экспериментов была группа VPLG, при вариации всего 0,07%, в то время как группа pMan варьировали более остальных, но лишь на 1,6%. Очевидных морфологических различий, помимо диаметра, между группами не наблюдалось. Репрезентативный образец исходной дозы капсул (VPMG) показан на фигуре 3 в виде фотографии, сделанной с использованием фазово-контрастного микроскопа. На снимке очевидна симметричная и монодисперсная природа препарата капсул. Это весьма показательно для всех групп на начало эксперимента.

Общие наблюдения и геометрия эксплантированных микрокапсул

Было установлено, что капсулы, имплантированные в перитонеальную полость, располагаются на сальнике, в воротах печени, на брыжейке кишечника in vitro тазу, по всех группах и во все отсечки времени. Иногда агрегаты находили в непосредственной близости от печени или на задней стенке брюшной полости. В последнем случае агрегаты капсул существовали в форме плоских лепешек или объемных кластеров. Только капсулы, изъятые в свободно плавающем состоянии, использовали для изучения свойств с использованием FTIR и SEM, которые и составляли массу образцов.

На 14 день у всех животных находили свободно плавающие отдельные капсулы, локализованные в областях, описанных выше. На 14 день наблюдалось выраженное уменьшение четкости очертаний и круглой формы капсул в группах pFlu и pMan, что становилось все более очевидным в каждую последующую отсечку времени.

Через 90 дней после имплантации группу pMan было сложно изъять, поскольку большинство капсул, как оказалось, представляло собой аморфные агрегаты по 1-3, без определенной формы или пространственной архитектуры. pFlu стал более аморфным в тех же временных рамках, но в меньшей степени, чем pMan. Указанное очевидное изменение в морфологии наблюдалось на 60 день в группах pKel и VPLG, в которых часть популяции демонстрировала деформацию, помимо легкого помутнения внутренней части. Напротив, группа VPM сохраняла свою морфологию на всем протяжении эксперимента и даже на 90 день не демонстрировала большой неровности поверхностей, свидетельствующей об утрате стабильности. В указанной группе наблюдалось некоторое внутреннее помутнение, начиная с 60 дня. Для сравнения, характерные микрофотографии, сделанные немедленно после эксплантации на 60 день, показаны на фигуре 4.

Капсулы измеряли, чтобы охарактеризовать изменения диаметра, а также однородности или концентричности на поперечном срезе с течением времени. Данные графически показаны на фигуре 5. Однородность на поперечном срезе, показанная на фигуре 5А, сначала составляла 100% для всех групп, указывая на то, что исходный продукт был полностью концентричным. С течением времени указанная величина заметно уменьшается в каждой группе, хотя группа VPMG сохраняла более 90% в течение указанной продолжительности времени. Изменения в однородности на поперечном срезе можно отнести на счет деформации, которая наблюдается по мере того, как материал разрушается, утрачивая стабильность и становясь более чувствительным к физическому напряжению. Величина указанного изменения была наибольшей в группах pMan, pFlu и VPLG. Изменение диаметра с течением времени показано на фигуре 5В. Во всех группах наблюдалось незначительное увеличение диаметра со временем; в группе pMan наблюдалось наиболее значительное увеличение, до 108% через 60 дней. Изменение диаметра сначала можно отнести на счет набухания гидрогелевого матрикса, но по мере того, как однородность на поперечном срезе уменьшается, а некоторые группы претерпевают деформацию, это тоже влияет на весь диаметр. Это, возможно, является причиной большого увеличения в группе pMan. Наконец, группа pKel, в которой наблюдается уменьшение диаметра между 60 и 90 днями, подтверждает механизм деградации, ведущий к спадению капсул.

Анализ FTIR поверхности эксплантированных капсул

ATR-FTIR осуществляли на поверхности капсул из каждой группы на момент эксплантации, после лиофилизации. Как было подтверждено визуально и с использованием электронной микроскопии, клетки, прикрепившиеся к поверхности, отсоединялись в процессе лиофилизации и, таким образом, не воздействовали на поверхность. Спектры, генерированные исходными материалами, помимо информации, сообщавшейся другим источником (35), использовали для сравнения капсул с течением времени. Конкретно, как упоминалось ранее и как показано в таблице 2, выше, пики на 1590 см^-1/1640 см^-1 и 1550 см^-1 (СОО^- альгината и СОО^- полиорнитина/амида II, соответственно) использовали для дифференцировки химического состава поверхности самого внешнего слоя. Другие пики, связанные с полиорнитином, например, -NH пик на 3062 см^-1 и -СН₂ на 2920 см^-1 пик, имели более низкую интенсивность и, таким образом, было труднее получить воспроизводимые количественные результаты от интеграции.

Имеющие отношение к делу пики показаны в сравнении на фигуре 6. Пики представлены в зависимости от времени от времени 0 (верхняя часть) до 90 дней (нижняя часть). Во всех группах, за исключением группы VPMG, малый выступ, полученный благодаря компоненту амид II полиорнитина на поверхности, превратился в различимый второй пик, и появился пик PLO на 1640 см^-1, указывающий на эрозию поверхности альгината и выступ PLO на поверхности. В случае pMan и pFlu указанное возникновение является очевидным на 30 день и достигает своей максимальной амплитуды на 60 день. pKel и VPLG обеспечивают дополнительную стабильность, поскольку пик амида II не появляется полностью до 60 дня. Важно, что группа VPMG сохраняет постоянный химический состав поверхности, о чем свидетельствует выступ амида II на 90 день. Его амплитуда медленно возрастает со временем, но полностью дискретный пик не наблюдается.

Для количественного описания изменений в указанных химических поглощениях интегрировали площадь под пиками -СОО- альгината и -амида II полиорнитина и сравнивали с течением времени. Вычисляли соотношение площади под пиком альгината и площади под пиком полиорнитина; показано на фигуре 7. Относительный индекс стабильности может быть приписан указанной величине, коррелирующей с количеством деградации альгината на поверхности, если допустить, что количество альгината на поверхности по сравнению с количеством PLO на поверхности связано с соотношением указанных двух пиков, до момента полного исчезновения и возникновения карбоксильного пика PLO на 1640 см^-1. Пригодность использования указанного индекса в качестве меры того, насколько много от каждой стенки присутствует на поверхности, подтверждается тем фактом, что масса образцов PLO:альгинат демонстрирует линейные взаимоотношения между составом и указанным соотношением, а указанные капсулы состоят из различимых стенок из альгината и PLO.

Как показано на фигуре 7, соотношение указанных пиков начинается со сходной величины для всех групп (0,25±0,03) и демонстрирует однородность на момент времени 0. Изменение амплитуды пиков через 90 дней (фигура 6) непосредственно отражается на рассчитанном здесь индексе. Существует 3 группы материалов, те, которые деградируют быстро в течение 30 дней (pMan, pFlu), те, которые сохраняют стабильность до 60 дней (VPLG, pKel), и те, которые являются стабильными на всем протяжении эксперимента (VPMG). Во всех группах, кроме VPMG, наблюдалось сначала умеренное уменьшение, а затем увеличение приблизительно до 0,7-0,8. Индекс стабильности VPMG демонстрировал медленное, постоянное увеличение в течение периода времени до 0,4 до 90 дня. Указанное постепенное увеличение доли функциональных групп полиорнитина относительно функциональных групп альгината является линейным и может служить показателем механизма эрозии поверхности.

Морфологический анализ эксплантированных микрокапсул: SEM анализ морфологии эксплантированных микрокапсул

На лиофилизированные группы было нанесено покрытие, и поверхность сканировали с использованием SEM. Анализ массы капсул сначала проводили с увеличением 100-200Х, с последующим микроанализом поверхности с увеличением 1000-2000Х. Изображения с большим увеличением были получены при 5000-15000Х, как требовалось и позволялось материалом. В случаях деградировавших материалов зачастую было невозможно добиться столь высокого увеличения из-за повреждения материала электронным лучом. В некоторых случаях появление дебриса после процесса лиофилизации было неизбежным, и он был включен в некоторые изображения.

Изображения промежуточного увеличения (1-2К Х) использовали для сравнительного анализа; результаты представлены на фигуре 8. В целом, указанные открытия подтверждают основные морфологические наблюдения с использованием фазово-контрастной световой микроскопии и FTIR анализ стабильности поверхности. Увеличения, применявшиеся далее, позволяли осуществить визуализацию точечной коррозии и незначительных изменений морфологии. Во всех группах наблюдались чрезвычайно гладкие поверхности спустя первые 14 дней, с последующим появлением поверхностных дефектов в различные отсечки времени. pMan и pFlu продемонстрировали чрезвычайно выраженную дегенерацию поверхности через 30 дней, с продолжавшейся эрозией вплоть до 90 дня. Небольшие отверстия на поверхности на 30 день все более и более увеличивались, и отдельные альгинатный и PLO слои разделялись. Начало указанной эрозии, возможно, наблюдалось между 14 и 30 днями, но морфологически не было выявлено. pKel и VPLG показали сходное прогрессирование эрозии поверхности, однако на 30 день было выявлено начало деградации в форме ямок на поверхности. Указанные ямки, показанные при большом увеличении на фигуре 9, прогрессировали до маленьких отверстий, которые продолжали увеличиваться в размерах вплоть до 90 дня. VPMG сохраняли полностью гладкую поверхность на всем протяжении эксперимента, хотя уровень видимого сморщивания поверхности увеличивался к 60 дню и, далее, к 90 дню. Это, возможно, представляет собой артефакт процесса лиофилизации, но может быть связано с физической целостностью капсулы с течением времени. Остальные материалы настолько сильно деградировали в указанные отсечки времени, что, вероятно, столь грубая деформация будет скрыта.

Пример 2: Характеристики поликатиона PLO (поли-L-орнитина)

Полианионное ядро из альгината кальция требует поликатионного покрытия, чтобы внести свой вклад в прочность и свойства полупроницаемости биологически совместимой капсулы. Поликатион существует в форме смешанной популяции молекулярных видов различной длины и, следовательно, различных молекулярных мас. Проводились исследования для определения предпочтительных молекулярных масс PLO. Биокапсулы изготавливали, как описано в примере 1, с использованием различных партий PLO, чтобы получить капсулы, в которых инкапсулированные клетки или гранулы располагаются центрально, а стенка капсулы неповреждена.

Виды с высокой ММ: как суммировано в таблице 4, ниже, биокапсулы были оптимально интактными, когда композиция PLO не содержала видов с высокой молекулярной массой свыше 42 кДа. PLO со средней ММ 42 кДа и 56 кДа давал неприемлемые капсулы, которые прилипали друг к другу, образуя агрегаты.

Таблица 4
Оптимальные капсулы, изготовленные с использованием PLO с низкой молекулярной массой Средняя ММ PLO Положение инкапсулированных клеток Целостность капсулы 23 кДа
Загрузка: SLO1674 Клетки в центральной позиции и не выступают в стенку капсулы, только 6% капсул имели клетки по периферии, но не выступающие в стенку капсулы Карманы отмечены в 2% капсул. Агрегатов капсул нет 42 кДа Клетки в центральной позиции и не выступают в стенку капсулы Есть агрегация капсул 56,4 кДа Клетки в центральной позиции и не выступают в стенку капсулы Есть агрегация капсул

Виды с крайне низкой ММ: плохо работающую партию PLO с ожидавшейся ММ 23 кДа подвергали диализу с использованием диализной кассеты с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10 кДа (Pierce, диализная кассета Slide-A-Lyzer, обработка гамма-лучами, 10K MZCO, 12-30 мл, Rockford, IL 61105, США). Превосходные капсулы были получены с использованием партии PLO, которая подвергалась диализу для удаления полипептидов менее 10 кДа. См. таблицу 5.

Таблица 5
Оптимальные капсулы, изготовленные с использованием PLO без видов с крайне низкой молекулярной массой Средняя ММ PLO Положение инкапсулированных клеток Целостность капсулы 23 кДа
Партия 82К
Загрузка *3К*НК
виды с низкой ММ 50% капсул с клетками по периферии и внедряющимися в стенку капсулы, и в 5% капсул агрегаты клеток выступают в стенку капсулы Карманы отмечены в 40-50% капсул 23 кДа
Партия 82К
Загрузка *3К*НК
после диализа с отсечкой 10 кда Большинство клеток в центральной позиции и не выступают в стенку капсулы. Только 10% капсул имеют клетки по периферии и менее чем в 2% клетки внедрялись в стенку капсулы Карманы отмечены в 10-15% капсул

Полидисперсность молекулярной массы: анализ полидисперсности партий PLO показал, что поликатион поставляется в виде смеси полипептидов ряда молекулярных масс (таблица 6).

На основании качества биокапсул, изготовленных с использованием различных партий PLO, из профиля распределения молекулярных масс партии PLO следует исключать молекулярные виды с крайними размерами. Было сделан вывод о том, что оптимальная композиция PLO имеет соотношение полидисперсности (определенное как соотношение средней ММ и медианой ММ) менее 1,5 и предпочтительно менее 1,1.

ОБСУЖДЕНИЕ

Очищенный альгинат с наибольшими уровнями остатков маннуроновой кислоты (VPMG) и поликатионный агент, имеющий индекс полидисперсности менее 1,5, давали микрокапсулы, которые превосходят другие ранее известные микрокапсулы, а также другие изученные очищенные альгинаты, с точки зрения геометрической формы капсул и их долговечности и функциональности in vivo.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Композиции по настоящему изобретению являются пригодными для изготовления иммуноизолирующих микрокапсул для доставки живых клеток, способных секретировать лекарственные средства, или для доставки самих лекарственных средств, для лечения заболеваний или расстройств.

Приведенные выше примеры не ограничивают объем настоящего изобретения. Специалисту будет понятно, что возможны многочисленные изменения без отступления от объема изобретения, определенного прилагающейся формулой изобретения.

ЛИТЕРАТУРА

Изобретение относится к композиции, включающей альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты и поликатион, имеющий индекс полидисперсности менее 1,5. Композиция является особенно пригодной для изготовления биологически совместимых микрокапсул, содержащих живые клетки для алло- или ксенотрансплантации. Указанные микрокапсулы являются более долговечными и могут сохранять свою структурную и функциональную целостность в течение длительных периодов времени по сравнению с известными альгинатными микрокапсулами. 9 н. и 48 з.п. ф-лы, 11 ил., 6 табл.

1. Композиция для изготовления биосовместимой микрокапсулы, включающая альгинат, содержащий приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, и поликатион, имеющий среднюю молекулярную массу от 10 до 40 кДа и индекс полидисперсности менее приблизительно 1,5; в которой поликатион не является поли-L-лизином.

2. Композиция по п.1, включающая приблизительно от 50 до 90% остатков маннуроновой кислоты.

3. Композиция по п.2, включающая приблизительно от 50 до 70% остатков маннуроновой кислоты.

4. Композиция по п.1, включающая альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты в концентрации приблизительно от 80 до 90%.

5. Композиция по п.4, включающая 87% альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты.

6. Композиция по п.1, в которой поликатион выбран из группы, состоящей из глутамата хитозана, хитозангликоля, модифицированного декстрана, лизоцима, поли-L-орнитина, сальмин-сульфата, протамин- сульфата, полиакрилимида, сополимера полиакрилимида и бромида метакрилоксиэтилтриметиламмония, полиаллиламина, полиамида, полиамина, полибрена, сополимера полибутилакрилата и бромида метакрилоксиэтилтриметиламмония (80/20), хлорида поли-3-хлор-2-гидроксипропилметакрилоксиэтилдиметиламмония, полидиаллилдиметиламмония, хлорида полидиаллилдиметиламмония, сополимера хлорида полидиаллилдиметиламмония и акриламида, сополимера хлорида полидиаллилдиметиламмония и N- изопропилакриламида, сополимера полидиметиламина и эпихлоргидрина, сополимера полидиметиламиноэтилакрилата и акриламида, полидиметиламиноэтилметакрилата, полиэтиленимина, модифицированного полиэтиленимин-эпихлоргидрина, полиэтиленимина, хлорида поли-2-гидрокси-3-метакрилоксипропилтриметиламмония, поли-2-гидрокси-3-метакрилоксиэтила, хлорида триметиламмония, хлорида полигидроксипропилметакриоксиэтилдиметиламмония, полиимидазолина (четвертичного), бромида поли-2-метакрилоксиэтилтриметиламмония, бромида/хлорида полиметакрилоксиэтилтриметиламмония, сополимера полиметилдиэтиламиноэтилметакрилата и акриламида, бромида поли-1-метил-2-винилпиридиния, бромида поли-1-метил-4-винилпиридиния, сополимера полиметилена и гидрохлорида гуанидина, поливиниламина, сополимера поли-N-винилпирролидона и диметиламиноэтилметакрилата и хлорида поли-4-винилбензилтриметиламмония.

7. Композиция по п.6, в которой поликатион представляет собой поли-L-орнитин, имеющий среднюю молекулярную массу приблизительно 10-40 кДа.

8. Композиция по п.7, в которой средняя молекулярная масса поли-L-орнитина составляет приблизительно от 15 до 30 кДа.

9. Композиция по п.8, в которой средняя молекулярная масса поли-L-орнитина составляет приблизительно от 20 до 25 кДа и которая содержит менее 20% видов с молекулярной массой 10 кДа или менее.

10. Композиция по любому из пп.1-9, в которой соотношение альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты и поликатиона составляет приблизительно от 5:1 до 10:1.

11. Композиция по п.1, дополнительно включающая менее приблизительно 1% хлорида кальция и/или хлорида натрия.

12. Биологически совместимая микрокапсула для инкапсуляции живых клеток, содержащая композицию по п.1, где микрокапсула включает ядерный слой из альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты, поперечно сшитого с использованием катионного сшивающего агента, промежуточный слой из поликатионов, образующих полупроницаемую мембрану, и внешний слой из альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты, в которой альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты в ядре и во внешних слоях может представлять собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты, в которой поликатионный слой не состоит из поли-L-лизина.

13. Биологически совместимая микрокапсула по п.12, в которой альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты имеет среднюю молекулярную массу более приблизительно 400 кДа, а поликатионный агент имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 10 до 40 кДа.

14. Биологически совместимая микрокапсула по п.13, в которой альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты имеет среднюю молекулярную массу более приблизительно 600 кДа, а поликатионный агент имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 15 до 30 кДа.

15. Биологически совместимая микрокапсула по п.12, в которой сшивающий агент выбран из солей группы, состоящей из Ag⁺, Al³⁺, Ва²⁺, Са²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, H⁺, K⁺, Li⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺, NH⁴⁺, Ni²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺ и Zn²⁺.

16. Биологически совместимая микрокапсула по п.15, в которой сшивающий агент представляет собой хлорид кальция.

17. Биологически совместимая микрокапсула по п.12, в которой промежуточный слой имеет толщину приблизительно от 10 до 80 мкм.

18. Биологически совместимая микрокапсула по п.12, в которой ядерный слой деполимеризован хелатирующим агентом с образованием полого ядра.

19. Биологически совместимая микрокапсула по п.18, в которой хелатирующий агент выбран из цитрата натрия и EDTA.

20. Биологически совместимая микрокапсула по п.12, в которой массовое соотношение ядерного слоя и промежуточного слоя составляет приблизительно от 7:1 до 8:1.

21. Биологически совместимая микрокапсула по п.12, в которой массовое соотношение внешнего слоя и промежуточного слоя составляет приблизительно от 1,2:1 до 1,4:1.

22. Биологически совместимая микрокапсула по п.12, включающая живые клетки в ядерном слое.

23. Биологически совместимая микрокапсула по п.22, в которой клетки выбраны из нативных и генетически измененных клеток.

24. Биологически совместимая микрокапсула по п.23, в которой клетки присутствуют в форме отдельных клеток и/или клеточных кластеров, выбранных из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток и любого другого типа клеток, способных секретировать факторы, пригодные для лечения заболевания или состояния.

25. Биологически совместимая микрокапсула по п.24, в которой нейрональные клетки выбраны из группы, состоящей из клеток хороидного сплетения, гипофизарных клеток, хромаффинных клеток и хондроцитов.

26. Биологически совместимая микрокапсула по п.12, имеющая диаметр от 50 до 2000 мкм.

27. Способ изготовления биологически совместимой микрокапсулы по п.12, предусматривающий этапы:
a) растворение альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты в изотоническом солевом растворе до концентрации приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.;
b) распыление раствора альгината с этапа а) посредством воздушного или частотного генератора капель в перемешиваемый раствор избыточного количества сшивающего агента, с получением гелевых капсул;
c) нанесение на гелевые капсулы с этапа b) поликатиона, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности менее 1,5;
d) растворение альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты в изотоническом солевом растворе до концентрации приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об., и нанесение окончательного покрытия на капсулу с этапа с); и
e) сбор микрокапсул;
в котором альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты с этапов а) и d) представляет собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты и в котором поликатион не является поли-L-лизином.

28. Способ по п.27, в котором этап b) включает перемешивание в хлориде кальция с концентрацией приблизительно от 15 до 120 мМ в течение приблизительно от 5 до 30 мин.

29. Способ по п.28, в котором этап b) включает перемешивание в хлориде кальция с концентрацией приблизительно 110 мМ в течение приблизительно от 5 до 10 мин.

30. Способ по п.27, в котором этап с) включает нанесение на капсулы покрытия из поли-L-орнитина в концентрации приблизительно от 0,02 до 0,10% (мас./об.) в течение приблизительно от 1 до 45 мин.

31. Способ по п.30, в котором поли-L-орнитин имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 10 до 40 кДа.

32. Способ по п.31, в котором поли-L-орнитин имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 15 до 30 кДа.

33. Способ по п.32, в котором поли-L-орнитин имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 20 до 25 кДа и содержит менее 20% видов с молекулярной массой 10 кДа или менее.

34. Способ по любому из пп.30-33, в котором этап с) включает нанесение на капсулы покрытия из поли-L-орнитина с концентрацией приблизительно 0,05% (мас./об.) в течение приблизительно 10 мин.

35. Способ по п.27, в котором на этапе d) окончательный покрывающий раствор альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты наносят в концентрации приблизительно от 0,02 до 1,0% (мас./об.) в течение приблизительно от 5 до 30 мин.

36. Способ по п.35, в котором этап d) включает нанесение окончательного покрывающего раствора альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты в концентрации приблизительно 0,05% мас./об, в течение приблизительно от 5 до 10 мин.

37. Способ по п.27, в котором раствор альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты с этапа а) и этапа d) представляет собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до 70% остатков маннуроновой кислоты.

38. Способ получения инкапсулированных клеток, предусматривающий этапы:
a) инкубирование живых клеток с раствором альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты, растворенного в изотоническом солевом растворе до концентрации приблизительно от 1,0 до 2,0% мас./об.;
b) распыление содержащего клетки раствора альгината с этапа с) посредством воздушного или частотного генератора капель в перемешиваемый раствор избыточного количества сшивающего агента с получением содержащих клетки гелевых капсул;
c) нанесение на содержащие клетки гелевые капсулы с этапа b) поликатиона, имеющего среднюю молекулярную массу 10-40 кДа и индекс полидисперсности менее 1,5;
d) растворение альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты в изотоническом солевом растворе до концентрации приблизительно от 0,01 до 1,7% мас./об., и нанесение окончательного покрытия на содержащие клетки капсулы с этапа с);
и
e) сбор содержащих клетки микрокапсул;
в котором альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты с этапов а) и d) представляет собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до 95% остатков маннуроновой кислоты и в котором поликатион не является поли-L-лизином;
где клетки присутствуют в форме отдельных клеток и/или клеточных кластеров, выбранных из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток и любого другого типа клеток, способных секретировать факторы, пригодные для лечения заболевания или состояния.

39. Способ по п.38, в котором этап b) включает перемешивание в хлориде кальция с концентрацией приблизительно от 15 до 120 мМ в течение приблизительно от 5 до 30 мин.

40. Способ по п.39, в котором этап b) включает перемешивание в хлориде кальция с концентрацией приблизительно 110 мМ в течение приблизительно от 5 до 10 мин.

41. Способ по п.38, в котором этап с) включает нанесение на капсулы покрытия из поли-L-орнитина в концентрации приблизительно от 0,02 до 0,10% (мас./об.) в течение приблизительно от 1 до 45 мин.

42. Способ по п.41, в котором этап с) включает нанесение на капсулы покрытия из поли-L-орнитина в концентрации приблизительно от 0,05% (мас./об.) в течение 10 мин.

43. Способ по п.40 или 41, в котором поли-L-орнитин имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 10 до 40 кДа.

44. Способ по п.43, в котором поли-L-орнитин имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 15 до 30 кДа.

45. Способ по п.44, в котором поли-L-орнитин имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 20 до 25 кДа и содержит менее 20% видов с молекулярной массой 10 кДа или менее.

46. Способ по п.38, в котором на этапе d) окончательный покрывающий раствор альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты наносят в концентрации приблизительно от 0,02 до 1,0% мас./об., в течение приблизительно от 5 до 30 мин.

47. Способ по п.46, в котором этап d) включает нанесение окончательного покрывающего раствора альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты в концентрации приблизительно 0,05% мас./об., в течение приблизительно от 5 до 10 мин.

48. Способ по п.38, в котором раствор альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты с этапа а) и этапа d) представляет собой один и тот же альгинат или различные альгинаты и содержит приблизительно от 50 до 70% остатков маннуроновой кислоты.

49. Биологически совместимая микрокапсула, изготовленная способом по любому из пп.27-37.

50. Содержащая клетки микрокапсула, изготовленная способом по любому из пп.38-48, где клетки присутствуют в форме отдельных клеток и/или клеточных кластеров, выбранных из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток и любого другого типа клеток, способных секретировать лекарственные средства, которые являются эффективными для облегчения или лечения указанного заболевания или состояния.

51. Способ облегчения или лечения заболевания или состояния у субъекта, предусматривающий трансплантацию эффективного количества содержащей клетки микрокапсулы по любому из пп.22-25 или 50 указанному субъекту, где указанные клетки присутствуют в форме отдельных клеток и/или клеточных кластеров, выбранных из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток и любого другого типа клеток, способных секретировать лекарственные средства, которые являются эффективными для облегчения или лечения указанного заболевания или состояния.

52. Способ по п.51, в котором указанные живые клетки включают островковые β-клетки, а указанное заболевание или состояние представляет собой диабет.

53. Способ по п.51, в котором указанные живые клетки включают гепатоциты, а указанное заболевание или состояние представляет собой заболевание или нарушение функции печени.

54. Применение композиции альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты и поликатиона, как определено в п.1, для изготовления препарата микрокапсул для применения в случаях алло- или ксенотрансплантации.

55. Применение композиции альгината с высоким содержанием маннуроновой кислоты и поликатиона, как определено в п.1, и живых клеток для изготовления содержащей клетки биологически совместимой микрокапсулы для лечения или облегчения заболевания или состояния у субъекта, который в этом нуждается, в котором указанные живые клетки присутствуют в форме отдельных клеток и/или клеточных кластеров, выбранных из группы, состоящей из островковых β-клеток, гепатоцитов, нейрональных клеток и любого другого типа клеток, способных секретировать лекарственные средства, которые являются эффективными для облегчения или лечения указанного заболевания или состояния.

56. Применение по п.55, в котором указанные живые клетки включают островковые β-клетки, а указанное заболевание или состояние представляет собой диабет.

57. Применение по п.55, в котором указанные живые клетки включают гепатоциты, а указанное заболевание или состояние представляет собой заболевание или нарушение функции печени.