ПРЕПАРАТ В ВИДЕ ТВЕРДЫХ ЧАСТИЦ ДИСПЕРСНОЙ ФАЗЫ, СОДЕРЖАЩИЙ БЕЗВОДНУЮ КРИСТАЛЛИЧЕСКУЮ 2-О-α-D-ГЛЮКОЗИЛ-L-АСКОРБИНОВУЮ КИСЛОТУ, СПОСОБ ЕГО ПРОИЗВОДСТВА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК C07H1/06 C07H17/04 C07D307/62 A61K31/375 

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники

Настоящее изобретение относится к дисперсной композиции (препарату в виде твердых частиц дисперсной фазы), содержащей безводную кристаллическую 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, способу ее производства и ее применениям, конкретнее, к почти не способной твердеть дисперсной композиции, содержащей безводную кристаллическую 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, способу ее производства и ее применениям в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лекарственных препаратов.

Известный уровень техники

Вследствие своих полезных физиологических активностей и антиоксидантного действия L-аскорбиновую кислоту использовали для различных целей, в том числе для пищевых продуктов и косметических средств. Однако L-аскорбиновая кислота является неустойчивой из-за ее способности к прямому восстановлению, и она подвержена окислительной деградации и утрате своей физиологической активности в качестве крупного недостатка. Для преодоления этого недостатка заявитель настоящего изобретения, в качестве одного из созаявителей патентной литературы 1, описал 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, которая состоит из одной молекулы D-глюкозы, связанной с гидроксильной группой в положении C-2 L-аскорбиновой кислоты (в дальнейшем на всем протяжении описания сокращенно «2-глюкозид аскорбиновой кислоты»). В качестве характерных особенностей, 2-глюкозид аскорбиновой кислоты не проявляет способность к прямому восстановлению, а характеризуется удовлетворительной устойчивостью, и он проявляет физиологические активности, присущие L-аскорбиновой кислоте, после распада в живых организмах на L-аскорбиновую кислоту и D-глюкозу под действием in vivo фермента, внутренне существующему в живых организмах. В соответствии со способом, описанным в патентной литературе 1, 2-глюкозид аскорбиновой кислоты образуется в результате обеспечения действия переносящего сахарид фермента, такого как цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза (в дальнейшем сокращенно «CGTase») или α-глюкозидаза, на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и соединение в виде α-глюкозилсахарида.

В патентной литературе 2 заявителю настоящего изобретения удалось кристаллизовать 2-глюкозид аскорбиновой кислоты из насыщенного раствора 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и он описал кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты и содержащую его дисперсную композицию. До сих пор было известно, что кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты существует лишь в безводной кристаллической форме. В патентной литературе 1 и 2 опубликованы данные рентгеноструктурного анализа кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

В патентной литературе 3 и 4 тот же заявитель, что и заявитель настоящего изобретения, описал способ получения фракции с высоким содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, включающий подвергание раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, образованный в результате ферментативной реакции, хроматографии на колонке с сильнокислотным катионитом и сбор фракции. В патентной литературе 5 тот же самый заявитель описал способ получения продукта с высоким содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, включающий подвергание раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, образованный в результате ферментативной реакции, электродиализу, используя анионообменную мембрану, для удаления примесей, таких как L-аскорбиновая кислота и сахариды, из этого раствора; а в патентной литературе 6 тот же самый заявитель описал способ получения продукта с высоким содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, включающий подвергание раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, хроматографии на анионообменной смоле и выборочное десорбирование ингредиентов, адсорбированных на смоле, для получения фракции, обогащенной 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты.

В патентной литературе 7 тот же заявитель, что и заявитель настоящего изобретения, описал способ получения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, включающий допуск действия образующего α-изомальтозилглюкосахарид фермента или образующего α- изомальтозилглюкосахарид фермента в комбинации с цикломальтодекстрин-глюканотрансферазой на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и соединение в виде α-глюкозилсахарида, для образования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. В патентной литературе 8 и 9, поданной тем же заявителем, что и заявитель настоящего изобретения, описывается, что образующий α-изомальтозилглюкосахарид фермент и переносящий α-изомальтозил фермент катализируют перенос сахарида на L-аскорбиновую кислоту с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

В отношении применений 2-глюкозида аскорбиновой кислоты было сделано множество предложений, как указано, например, в патентной литературе 10-29. В зависимости от своих полезных свойств 2-глюкозид аскорбиновой кислоты обычно использовался в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики или лекарственных препаратов; и он широко использовался в случае других применений, при которых L-аскорбиновая кислота не могла использоваться вследствие своей неустойчивости, не говоря уже о традиционных применениях L-аскорбиновой кислоты.

Как описано выше, 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, как известно в настоящее время, получают посредством использования L-аскорбиновой кислоты и крахмальных веществ в качестве материалов и различных переносящих сахариды ферментов. Согласно данным, уже полученным заявителем настоящего изобретения до сих пор, способ обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы в качестве переносящего сахарид фермента на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, является эффективным в промышленном масштабе способом из-за самого высокого выхода при его использовании продукции - 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. На основе этих данных заявитель настоящего изобретения изготовил дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с помощью способа обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, и превратил в источник прибыли дисперсные композиции в качестве материалов для косметических средств/лечебно-профилактической косметики и пищевых продуктов, которые запущены в серийное производство под названием продуктов таких дисперсных композиций, соответственно, «AA2G» и «ASCOFRESH» Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, и Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Япония, соответственно (в дальнейшем используют сокращение для этих традиционных дисперсных композиций, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которые были превращены в источник прибыли в качестве материалов для косметических средств/лечебно-профилактической косметики и пищевых продуктов, - «порошки с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством).

Хотя порошки с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством характеризуются, в качестве уровня качества, относительно высокой степенью чистоты вплоть до 98,0% в весовом отношении или более по показателю степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и сохраняют удовлетворительное свойство сыпучести порошка (на протяжении всего описания «порошок (порошки)» значит «дисперсная композиция(и)», кроме особо оговоренных случаев) сразу после получения, они имеют недостаток, состоящий в том, что они могут твердеть вследствие их собственного веса или поглощения влаги, при допуске нахождения при относительно высокой температуре и во влажных условиях в течение относительно длительного периода времени. Учитывая такой недостаток, в серийное производство были запущены традиционные порошки с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, которые по частям, каждая составляющая 10 кг, упаковывали в полиэтиленовые мешки, и их помещали, вместе с десикантами, в стальные тары с крышками. Даже несмотря на такую форму продукта, с порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, однако, все еще существует проблема, связанная с возможностью их твердения время от времени и потери их применимости в качестве порошков после хранения в течение относительно длительного периода времени. Твердение дисперсных композиций, которые содержат безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, используемых в качестве материала для косметических средств, лечебно-профилактической косметики или пищевых продуктов, может обычно вызывать трудность на этапах, например, транспортировки, просеивания или смешивания материалов, когда промышленное предприятие спроектировано на исходных условиях использования материалов с удовлетворительным свойством сыпучести.

Относящаяся к известному уровню техники литература

i) Патентная литература

[Патентная литература 1] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 139288/91

[Патентная литература 2] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 135992/91

[Патентная литература 3] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 183492/91

[Патентная литература 4] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 117290/93

[Патентная литература 5] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 208991/93

[Патентная литература 6] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 2002-088095

[Патентная литература 7] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 2004-065098

[Патентная литература 8] публикация международной заявки на патент с № WO 02010361

[Патентная литература 9] публикация международной заявки на патент с № WO 01090338

[Патентная литература 10] публикация международной заявки на патент с № WO 05087182

[Патентная литература 11] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 046112/92

[Патентная литература 12] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 182412/92

[Патентная литература 13] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 182413/92

[Патентная литература 14] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 182419/92

[Патентная литература 15] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 182415/92

[Патентная литература 16] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 182414/92

[Патентная литература 17] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 333260/96

[Патентная литература 18] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 2005-239653

[Патентная литература 19] публикация международной заявки на патент с № WO 06033412

[Патентная литература 20] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 2002-326924

[Патентная литература 21] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 2003-171290

[Патентная литература 22] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 2004-217597

[Патентная литература 23] публикация международной заявки на патент с № WO 05034938

[Патентная литература 24] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 2006-225327

[Патентная литература 25] публикация международной заявки на патент с № WO 06137129

[Патентная литература 26] публикация международной заявки на патент с № WO 06022174

[Патентная литература 27] не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии с № 2007-063177

[Патентная литература 28] публикация международной заявки на патент с № WO 06132310

[Патентная литература 29] публикация международной заявки на патент с № WO 07086327

ii) Непатентная литература

[Непатентная литература 1] Carbohydrate Research, Takahiko MANDAI et al., Vol. 232, pp. 197-205, 1992

[Непатентная литература 2] International Journal of Pharmaceutics, Yutaka INOUE et al., Vol. 331, pp. 38-45, 2007

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача настоящего изобретения

Настоящее изобретение, которое было сделано для разрешения вышеуказанного недостатка, нацелено на обеспечение дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая значительно менее способна твердеть, чем традиционные дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с качеством, подходящим для применения в лечебно-профилактической косметике, и на обеспечение способа ее производства и ее применений.

Средства для решения поставленной задачи

Чтобы решить вышеуказанные задачи, авторы настоящего изобретения продолжили изучение твердения дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, и установили, что «ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999», название продукта в виде дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, для применения в качестве стандартного реагента для анализа, кодовый № AG124, превращенной в источник прибыли Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Япония (в дальнейшем сокращенно «порошок с качеством реагента»), не твердеет даже в условиях, при которых действительно твердеет порошок с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, и сохраняет свойства порошка. Подобно порошку с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, вышеуказанный порошок качества реагента представляет собой порошок, полученный посредством очистки раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный благодаря стадии обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, концентрирования очищенного раствора и кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с получением безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Однако вышеуказанный порошок качества реагента отличается от порошка с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством тем, что, помимо обычных стадий производства, в его случае требуется стадия рекристаллизации - растворения некогда полученных кристаллов, а затем опять его кристаллизация и стадия промывки - повторные промывки рекристаллизованных кристаллов водой высокого качества, и т.д., для увеличения степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до степени, составляющей 99,9% в весовом отношении или более. Таким образом, даже порошок с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством можно превратить в почти не способную твердеть дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, когда степень чистоты можно увеличить до 99,9% в весовом отношении или более.

Однако для увеличения степени чистоты безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до более высокой степени чистоты вплоть до по меньшей мере 99,9% в весовом отношении, отмеченной выше, помимо обычных стадий производства потребуются необязательные стадии: стадия рекристаллизации и стадия промывки водой высокого качества, приводящие к нежелательному увеличению времени и работы, требуемых для его производства, вызывающие потерю 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на стадиях рекристаллизации и промывки, понижающие выход продукции и значительно увеличивающие производственные затраты. Следовательно, просто увеличение чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до степени, составляющей 99,9% в весовом отношении или более, для получения менее способной твердеть дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, чем порошок с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, не является практичным вариантом выбора.

Авторы настоящего изобретения продолжили изучение твердения дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, и осуществили неоднократные исследования методом проб и ошибок, и они установили, что, по сравнению с традиционными порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, значительно менее способная твердеть дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, является композицией, которая имеет либо увеличенную степень кристалличности, составляющую 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, или уменьшенный уровень динамического поглощения паров для дисперсной композиции, составляющий 0,01% в весовом отношении или менее, даже если дисперсная композиция имеет ту же степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, что и традиционные порошки с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, или имеет степень чистоты, меньшую таковой в порошке качества реагента.

Авторы настоящего изобретения, кроме того, продолжили изучение способа производства в промышленном масштабе дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с определенной выше степенью кристалличности и характеризующейся определенным выше уровнем динамического поглощения паров, при установлении, что дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, приготовленный с помощью следующих стадий, можно относительно легко приготовить посредством превращения порошка, содержащего безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, кристаллизованного из следующего раствора, в дисперсную композицию со степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и уровнем динамического поглощения паров для дисперсной композиции, составляющим 0,01% в весовом отношении или менее, а именно стадии обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и глюкоамилазы в этом порядке на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, для образования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с высоким выходом продукции, составляющим 35% в весовом отношении или более, стадии очистки результирующего раствора для увеличения содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты вплоть до более 86% в весовом отношении, на основе сухого остатка.

Авторы настоящего изобретения установили, что дисперсная композиция, имеющая степень кристалличности, составляющую 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, или характеризующаяся уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% в весовом отношении или менее, значительно менее способна твердеть по сравнению с традиционными порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством; в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лекарственных препаратов ею легко манипулировать; и она имеет исключительное значение и ценность. Таким образом, они завершили это изобретение.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПРИЛАГАЕМЫХ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой пример дифракционной картины рентгеновских лучей, полученной с использованием характеристического рентгеновского излучения, для порошка в виде дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Фиг.2 представляет собой пример дифракционной картины рентгеновских лучей, полученной с использованием характеристического рентгеновского излучения, для порошка в виде дисперсной композиции, содержащей 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая по существу состоит из аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Фиг.3 представляет собой пример дифракционной картины рентгеновских лучей, полученной с использованием синхротронного излучения, для порошка в виде дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Фиг.4 представляет собой пример дифракционной картины рентгеновских лучей, полученной с использованием синхротронного излучения, для порошка в виде дисперсной композиции, содержащей 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая по существу состоит из аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Фиг.5 является схематическим представлением структуры высшего порядка цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, происходящей из микроорганизма рода Geobacillus.

Фиг.6 является схематическим представлением остатков, формирующих каталитический участок, и консервативных районов цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, происходящей из микроорганизма рода Geobacillus.

Фиг.7 является изображением структуры и распознаваемых рестрикционными ферментами сайтов рекомбинантной ДНК «pRSET-iBTC12», содержащей ген цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы (CGTase), происходящий из микроорганизма рода Geobacillus, используемый в настоящем изобретении.

Трактовка обозначений

На фиг.5 и 6 обозначения «A»-«D» означают домен A цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, домен В цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, домен C цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и домен D цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, соответственно.

На фиг.5 «спираль» означает α-спиральную структуру; "пластинчатая стрелка" - структуру β-складчатого листа; и «тонкая нить» - петлеобразную структуру.

На фиг.6 обозначения [1]-[4] означают консервативные районы 1-4, обычно присутствующие в семействе α-амилаз, соответственно; обозначение «●» - формирующий каталитический участок остаток; «D225» - остаток аспарагиновой кислоты в положении 225 в качестве одного из остатков, формирующих каталитический участок цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы; «D253» - остаток глютаминовой кислоты в положении 253 в качестве одного из остатков, формирующих каталитический участок цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы; и «D324» - остаток аспарагиновой кислоты в положении 324 в качестве одного из остатков, формирующих каталитический участок цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы.

На фиг.7, обозначение «pUC ori» означает начало репликации плазмиды pUC; «T7» - промотор T7; «белая стрелка (Amp)» - ген устойчивости к ампициллину; и «черная стрелка» - ген цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение решает вышеуказанные задачи в результате обеспечения дисперсной композиции, которая содержит 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве, которое больше 98,0% в весовом отношении, но меньше 99,9% в весовом отношении, на основе сухого остатка, и имеет степень кристалличности, составляющую 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, при расчете на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для порошка - дисперсной композиции.

Настоящее изобретение решает вышеуказанные задачи в результате обеспечения дисперсной композиции, содержащей 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве, которое больше 98,0% в весовом отношении, но меньше 99,9% в весовом отношении, на основе сухого остатка, и характеризуется уровнем динамического поглощения паров для дисперсной композиции, составляющим 0,01% в весовом отношении или менее, после хранения при 25ºC при относительной влажности, составляющей 35%, в течение 12 часов после удаления воды в потоке газообразного азота.

В качестве предпочтительного варианта осуществления согласно настоящему изобретению, дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения содержит частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 70% в весовом отношении или более относительно всей дисперсной композиции, и частицы с размером частиц, составляющим по меньшей мере 53 мкм, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 40-60% в весовом отношении относительно всей дисперсной композиции. В качестве другого предпочтительного варианта осуществления дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу и характеризуется восстановительной способностью всей дисперсной композиции, составляющей менее одного процента в весовом отношении. В более предпочтительном варианте осуществления дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения содержит L-аскорбиновую кислоту в количестве, составляющем 0,1% в весовом отношении или менее, на основе сухого остатка.

Вышеупомянутая дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения обычно представляет собой дисперсную композицию, полученную из раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный благодаря стадии обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество.

Настоящее изобретение решает вышеуказанные задачи в результате обеспечения способа производства дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, характеризующегося тем, что он содержит стадии обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и глюкоамилазы в этом порядке на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, для получения раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с выходом продукции, составляющим 35% в весовом отношении или более 2-глюкозида аскорбиновой кислоты; очистки результирующего раствора для увеличения содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до уровня, превышающего 86% в весовом отношении, на основе сухого остатка; кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в очищенном растворе; сбора кристаллизованного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты; и выдерживания и высушивания собранных кристаллов; и необязательно измельчения полученных в результате кристаллов.

Примеры цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, используемой в способе настоящего изобретения, включают любые из встречающихся в природе ферментов цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз и те, которые приготовлены с помощью технологии рекомбинантных ДНК, независимо от их происхождений и источников, если они образуют 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продукции, составляющим 35% в весовом отношении или более, когда обеспечивают действие цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и глюкоамилазы в этом порядке на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество. Однако, с учетом выхода продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, предпочтительными являются позже описываемые цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, происходящие из штамма Tc-62 Geobacillus stearothermophilus и штамма Tc-27 Geobacillus stearothermophilus, и мутантные цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, полученные в результате мутирования цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, происходящей из штамма Tc-91 Geobacillus stearothermophilus, с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Среди них цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза из штамма Tc-62 Geobacillus stearothermophilus является наиболее предпочтительно используемой из-за относительно высокого выхода продукции ею 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Используемая в настоящем изобретении глюкоамилаза не должна особо ограничиваться, и любые из встречающихся в природе и рекомбинантных ферментов могут использоваться независимо от их происхождений и источников, если они образуют 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продукции, составляющим 35% в весовом отношении или более, когда обеспечивают действие цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и глюкоамилазы в этом порядке на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество.

С помощью изменения в зависимости от типа крахмального вещества, используемого в качестве материала при допуске действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, выход продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты можно увеличить с помощью обеспечения действия на раствор разветвляющего крахмал фермента, такого как изоамилаза и пуллуланаза, наряду с цикломальтодекстрин-глюканотрансферазой.

В предпочтительном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретения, стадию очистки вышеуказанного раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, для увеличения содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до более 86% в весовом отношении, на основе сухого остатка, осуществляют посредством обеспечения контакта раствора ферментативной реакции после фильтрации и обессоливания с анионообменной смолой для адсорбции на ней 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и L-аскорбиновой кислоты, удаления сахаридов, таких как D-глюкоза, с помощью воды высокого качества, подачи в качестве элюента водного раствора с составляющей менее 0,5 н концентрацией соляной кислоты или ее соли(ей) для элюирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и L-аскорбиновой кислоты, концентрирования полученного в результате элюата, подачи сконцентрированного элюата на хроматографическую колонку с катионообменной смолой или пористой синтетической смолой и подачи элюента для осуществления элюирования. Особенно предпочтительными в качестве хроматографии на колонке с катионообменной смолой являются хроматографии системы с псевдодвижущимся слоем, используя сильнокислотный катионит в качестве наполнителя, поскольку с их помощью требуемую фракцию с составляющим более 86% в весовом отношении содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты предпочтительно получают с удовлетворительной эффективностью и выходом продукции.

Настоящее изобретение решает вышеуказанные задачи в результате обеспечения порошкового материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лекарственных препаратов, который состоит из дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения.

Примеры материалов для пищевых продуктов, преимущественно используемых в настоящем изобретении, включают повышающие содержание витамина C средства, усилители продукции коллагена, отбеливающие кожу средства, средства для улучшения вкуса, средства для улучшения качества, средства для предотвращения темнения, подкислители, наполнители, передающиеся организму средства и антиоксиданты. Примеры материалов для косметических средств, преимущественно используемых в настоящем изобретении, включают отбеливающие кожу средства, средства для активации клеток, усилители продукции коллагена, повышающие содержание витамина C средства, средства для улучшения вкуса, средства для улучшения качества, средства для предотвращения темнения, подкислители, наполнители, передающиеся организму средства, стабилизаторы и антиоксиданты. Примеры материалов для лечебно-профилактической косметики, преимущественно используемых в настоящем изобретении, включают отбеливающие кожу средства, средства для активации клеток, усилители продукции коллагена, повышающие содержание витамина C средства, средства для улучшения вкуса, средства для улучшения качества, средства для предотвращения темнения, подкислители, наполнители, передающиеся организму средства, стабилизаторы и антиоксиданты. Кроме того, примеры материалов для лекарственных препаратов, преимущественно используемых в настоящем изобретении, включают отбеливающие кожу средства, средства для активации клеток, усилители продукции коллагена, средства для предохранения органов, ингибирующие разрушение радикалами средства, повышающие содержание витамина C средства, средства для предотвращения темнения, наполнители, вспомогательные средства, стабилизаторы и антиоксиданты.

Детальными объяснениями настоящего изобретения является следующее:

Определение терминов

На протяжении всего описания следующие термины означают следующее:

«Степень кристалличности»

Термин «степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты», упоминаемый в описании, означает значение, определяемое согласно следующей формуле [1].

Формула [1]:

H₁₀₀: значение степени кристалличности, определенное аналитическим способом на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для содержащего безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты порошкообразного стандартного образца, который по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

H₀: значение степени кристалличности, определенное аналитическим способом на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты порошкообразного стандартного образца, который по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Hs: значение степени кристалличности, определенное аналитическим способом на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты порошка в качестве исследуемого образца.

В случае формулы [1] дифракционные картины рентгеновских лучей для порошков, используемые в качестве основы для определения аналитическим способом значений H₁₀₀, H₀ и Hs, обычно определяют с помощью порошкового рентгеноструктурного анализатора, оснащенного отражательной оптической системой или оптической системой пропускающего типа. Дифракционные картины рентгеновских лучей для порошков содержат данные об углах дифракции и интенсивностях дифракции для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, содержащегося в исследуемом или стандартном образце. Примеры аналитических способов определения значений степени кристалличности таких образцов включают метод Харманса, Вонка и т.д. Среди них метод Харманса является предпочтительным из-за его простоты и точности. Поскольку эти аналитические способы предоставляются в настоящее время в виде компьютерных программных обеспечений, могут соответственно использоваться любые порошковые рентгеноструктурные анализаторы, оснащенные аналитическим блоком, установленным вместе с любым из вышеуказанных компьютерных программных обеспечений.

В качестве «содержащего безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты порошкообразного стандартного образца, который по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты», для определения аналитическим способом значения H₁₀₀ должен использоваться безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в форме дисперсной композиции или отдельного кристалла, которая характеризуется степенью чистоты, составляющей 99,9% в весовом отношении или более (на всем протяжении этого описания используют сокращение термина «% в весовом отношении» - «%», кроме особо оговоренных случаев, но «%», относящийся к степени кристалличности, не должен ограничиваться этим термином), демонстрирует характерные дифракционные пики, присущие безводному кристаллическому 2-глюкозиду аскорбиновой кислоты, и по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Примеры безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в форме дисперсной композиции или отдельного кристалла включают безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в форме дисперсной композиции любого определенного выше порошка качества реагента, дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный в результате рекристаллизации порошка качества реагента, или безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в форме отдельного кристалла. Для справки, после анализа с помощью компьютерного программного обеспечения для метода Харманса, на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для определенного выше порошкообразного стандартного образца содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты дисперсной композиции, которая по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, определяют аналитическим способом значение H₁₀₀, обычно находящееся в диапазоне от приблизительно 70,2% до приблизительно 70,5%.

В качестве «содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты порошкообразного стандартного образца, который по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты», для определения аналитическим способом значения H₀, должен использоваться 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в форме дисперсной композиции, которая характеризуется степенью чистоты, составляющей 99,1% или более, демонстрирует дифракционную картину рентгеновских лучей для порошка в виде лишь гало, присущего его аморфной форме, и по существу не демонстрирует какой-либо дифракционный пик безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Примеры такой дисперсной композиции включают дисперсные композиции, которые получены посредством растворения определенного выше порошкообразного стандартного образца для определения аналитическим способом значения H₁₀₀ в соответствующем количестве воды высокого качества, концентрирования раствора, сушки сублимацией концентрата и высушивания продукта в вакууме вплоть до достижения содержания влаги, составляющего 2,0% или менее, при определении по методу Карла Фишера. При использовании этих обработок, как известно по опыту, получают дисперсную композицию, по существу состоящую из аморфной формы. Для справки, после анализа с помощью компьютерного программного обеспечения для метода Харманса, на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для определенного выше порошкообразного стандартного образца содержащей 2-глюкозид аскорбиновой кислоты дисперсной композиции, которая по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, определяют аналитическим способом значение H₀, обычно находящееся в диапазоне от приблизительно 7,3% до приблизительно 7,6%.

В качестве стандартного образца для определения аналитическим способом значения H₀, само собой разумеется, что предпочтительным является 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с более высокой степенью чистоты, однако степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты стандартного образца, используемого для определения аналитическим способом значения H₀, приготовленного из стандартного образца, используемого для определения аналитическим способом значения H₁₀₀, как указано выше, ограничивается 99,1%, даже если степень чистоты стандартного образца, используемого для определения аналитическим способом значения H₁₀₀, бесспорно составляет вплоть до 99,9% или более, как продемонстрировано в позже описываемом эксперименте 1-1. Таким образом, степень чистоты «содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты порошкообразного стандартного образца, который по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислот», установлена на 99,1% или более, как отмечено выше.

«Уровень динамического поглощения паров»

Упоминаемый в описании термин «уровень динамического поглощения паров» означает значение, рассчитываемое согласно следующей формуле [2] на основе двух значений веса, определяемых в анализаторе сорбции/десорбции влаги следующим образом: при удалении несвязанной воды из образца с помощью обеспечения его нахождения при 25ºC и относительной влажности 0% в потоке газообразного азота в течение 12 часов и взвешивании результирующего образца; или при допуске нахождения образца при 25ºC и относительной влажности 35% в потоке газообразного азота в течение 12 часов и незамедлительном повторном взвешивании результирующего образца.

Формула [2]:

W_0%: вес исследуемого образца, определяемый сразу же после его нахождения при 25ºC и относительной влажности 0% в потоке газообразного азота в течение 12 часов.

W_35%: вес исследуемого образца, определяемый сразу же после того, как исследуемому образцу, для которого было определено значение W_0%, позволили находиться при 25ºC и относительной влажности 35% в потоке газообразного азота в течение 12 часов.

«Восстановительная способность»

Упоминаемый в описании термин «восстановительная способность всей дисперсной композиции» означает процент (%) - содержание восстанавливающих сахаров относительно общего содержания сахаров в исследуемом образце, рассчитываемый согласно следующей формуле [3] на основе содержания восстанавливающих сахаров и общего содержания сахаров, исходя из D-глюкозы, определяемых по методу Шомоди-Нельсона и методу с использованием антрона в серной кислоте, широко используемым в данной области техники, причем D-глюкоза используется в качестве стандартного вещества.

Формула [3]:

«Распределение по размеру частиц»

В этом описании распределение по размеру частиц дисперсной композиции определяют следующим образом. Металлические сита с размерами отверстий, составляющими 425, 300, 212, 150, 106, 75 и 53 мкм, изготовленные Kabushiki Gaisha Iida Seisaku-sho, которые соответствуют промышленным стандартам Японии (JIS Z 8801-1), точно взвешивают, укладывают рядами в определенном выше порядке и устанавливают на «R-1», приборе для ситового анализа - ротапе, изготовленном Kabushiki Gaisha Tanaka Kagaku Kikai Seisaku-sho. Заданное количество взвешенного образца помещают в самое верхнее сито (с размером отверстий 425 мкм) среди уложенных рядами сит, с последующим встряхиванием сит в течение 15 мин при сохранении пакетированных состояний. Впоследствии каждое из уложенных рядами сит точно взвешивали, и вес образца, собранного на каждом из сит, определяли посредством вычитания веса каждого из сит до загрузки образца из веса соответствующего сита после встряхивания. Распределение по размеру частиц отражали посредством расчета весового процента (%) - веса дисперсной композиции, собранной на каждом из сит, относительно веса загруженного образца.

«Выход продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты»

Упоминаемый в этом описании термин «выход продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты» означает содержание (%) 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, на основе сухого остатка, в растворе ферментативной реакции, полученном в результате обеспечения действия фермента, такого как цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза, на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество.

«Содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, на основе сухого остатка»

Термин «содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на основе сухого остатка» означает процент (%) в весовом отношении 2-глюкозида аскорбиновой кислоты от общего веса образца, содержащего его, рассчитанного с исключением воды. Например, значением содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, на основе сухого остатка, в растворе является процент (%) в весовом отношении 2-глюкозида аскорбиновой кислоты от общего содержания сухого остатка, исключая воду, содержащуюся в растворе. В то время как значением содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, на основе сухого остатка, в дисперсной композиции является процент (%) в весовом отношении - вес 2-глюкозида аскорбиновой кислоты относительно общего веса дисперсной композиции, рассчитанный при рассматривании общего веса дисперсной композиции в качестве веса с исключение воды, содержащейся в дисперсной композиции.

«Цикломальтодекстрин-глюканотрансферазная активность»

Упоминаемый в этом описании термин «цикломальтодекстрин-глюканотрансферазная активность» определяют следующим образом. К пяти миллилитрам водного раствора субстрата, содержащего 0,3% (в отношении веса к объему) растворимого крахмала, 20 мМ ацетатный буфер (pH 5,5) и 1 мМ хлорид кальция, добавляют 0,2 мл раствора фермента, разбавленного соответствующим образом, и результирующий раствор держат при 40ºC, и из него отбирают в момент 0 мин и через 10 мин после инициации ферментативной реакции образцы в количествах, соответствующих 0,5 мл, с последующим незамедлительным добавлением в каждый образец 15 мл 0,02 н раствора серной кислоты для прекращения ферментативной реакции. Каждый из результирующих растворов смешивают с 0,2 мл 0,2 н раствора йода для развития окраски, и спустя 10 мин соответственно измеряют оптическую плотность окрашенных растворов при длине волны 660 нм с помощью спектрофотометра, а затем рассчитывают цикломальтодекстрин-глюканотрансферазную активность, используя следующую формулу [4], как активность в отношении гидролиза крахмала. Одну единицу активности цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы определяют как количество фермента, которое полностью устраняет окраску йодом раствора, содержащего 15 мг крахмала.

Формула [4]:

Примечание: «Aa» означает оптическую плотность при длине волны 660 нм реакционного раствора в момент времени 0 мин после инициации ферментативной реакции.

«Ab» означает оптическую плотность при длине волны 660 нм реакционного раствора через 10 мин после инициации ферментативной реакции.

«Изоамилазная активность»

Упоминаемый в этом описании термин «изоамилазная активность» определяют следующим образом:

К трем миллилитрам водного раствора субстрата, содержащего 0,83% (в отношении веса к объему) растворимого крахмала восковидной кукурузы Линтнера и 0,1 М ацетатный буфер (pH 3,5), добавляют 0,5 мл соответствующим образом разбавленного раствора фермента, и результирующий раствор держат при 40ºC, и из него отбирают через 0,5 мин и 30,5 мин после инициации ферментативной реакции образцы в количествах, соответствующих 0,5 мл, с последующим незамедлительным добавлением в каждый образец 15 мл 0,02 н раствора серной кислоты для прекращения ферментативной реакции. Каждый из результирующих растворов смешивают с 0,5 мл 0,01 н раствора йода для развития окраски при 25ºC в течение 15 мин, а затем соответственно измеряют оптическую плотность окрашенных растворов при длине волны 610 нм с помощью прибора для измерения оптической плотности, с последующим расчетом изоамилазной активности, используя следующую формулу [5], как активность в отношении гидролиза крахмала. Одну единицу активности изоамилазы определяют как количество фермента, которое увеличивает оптическую плотность при длине волны 610 нм на 0,004 в вышеуказанных условиях измерения.

Формула [5]:

Примечание: «Aa» означает оптическую плотность при длине волны 610 нм реакционного раствора.

«Ab» означает оптическую плотность при длине волны 610 нм контрольного раствора.

Дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения

Степень кристалличности и уровень динамического поглощения паров

Как описано выше, дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения содержит более 98,0%, но менее 99,9%, на основе сухого остатка, 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и имеет степень кристалличности, составляющую 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, при расчете на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для порошка, или характеризуется уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее. Как раскрыто следующими экспериментами, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты дисперсная композиция настоящего изобретения, имеющая вышеуказанную степень кристалличности или уровень динамического поглощения паров, значительно менее способна твердеть по сравнению с порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, даже если она имеет по существу ту же степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, что и порошки с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, или имеет степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, меньшую таковой в порошке качества реагента.

Кроме того, как показано в следующих экспериментах, среди дисперсных композиций, содержащих более 98,0%, но менее 99,9%, на основе сухого остатка, 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, композиции со степенью кристалличности в пределах вышеуказанного диапазона характеризуются уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее, в то время как композиции с уровнем динамического поглощения паров в пределах вышеуказанного диапазона имеют степень кристалличности, составляющую 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Таким образом, характеристику дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения можно дать согласно либо степени кристалличности для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, либо уровня динамического поглощения паров для дисперсной композиции, и, при необходимости, ее можно дать согласно и тому, и другому.

Под динамической сорбцией (поглощением) паров подразумевается явление, при котором уровень паров, содержащихся в образце, изменяется по мере изменения влажности вокруг образца при постоянной температуре. Хотя, в отличие от степени кристалличности, уровень динамического поглощения паров в качестве характерного показателя подверженности сорбции паров не является показателем, который напрямую зависит от кристаллической структуры порошка в качестве образца, можно полагать, что явление поглощения влаги связано с твердением дисперсной композиции и может значительно изменяться в зависимости от сахаридного состава, а также степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и размера частиц дисперсной композиции. Поэтому считают, что уровень динамического поглощения паров мог бы быть значительным показателем для оценки твердения дисперсной композиции по поглощению влаги.

Как установлено в следующих экспериментах, дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с уровнем динамического поглощения паров, превышающим 0,05%, твердеет относительно легко в экспериментальных условиях исследования, в то время как композиции с уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее, по существу не твердеют в тех же самых условиях. Этот факт означает, что уровень динамического поглощения паров вместе со степенью кристалличности являются значительными показателями при реализации по существу не способной твердеть дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты.

Стандартный образец, используемый для определения аналитическим способом значения H₀ при определении степени кристалличности, т.е. «содержащий 2-глюкозид аскорбиновой кислоты порошкообразный стандартный образец, который по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты», демонстрировал уровень динамического поглощения паров, составляющий 1,7%, как установлено в позже описываемом эксперименте 3; в то время как стандартный образец, используемый для определения аналитическим способом значения H₁₀₀ при определении степени кристалличности, т.е. «содержащий безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты порошкообразный стандартный образец, который по существу состоит из безводной кристаллической формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты», демонстрировал уровень динамического поглощения паров, который ниже предела обнаружения, и по существу не демонстрировал какую-либо динамическую сорбцию паров, как установлено аналогичным образом в эксперименте 3.

Распределение по размеру частиц

В предпочтительном варианте осуществления дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения она содержит частицы с размером частиц меньше 150 мкм в количестве, составляющем 70% или более от всей дисперсной композиции, и содержит частицы с размером частиц, составляющим 53 мкм или более, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 40-60% от всей дисперсной композиции. Поскольку дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения можно, например, легко регулировать в рамках определенного выше распределения по размеру частиц, требуемого в материалах для пищевых продуктов, она обладает тем преимуществом, что ее можно использовать в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лекарственных препаратов аналогично традиционным композициям без изменения обычных стадий производства или правил для материалов.

Реакционные примеси и восстановительная способность

В предпочтительном варианте осуществления дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения она содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу и характеризуется восстановительной способностью всей дисперсной композиции, составляющей менее одного процента. Как хорошо известно, L-аскорбиновая кислота и D-глюкоза обладают способностью к прямому восстановлению и приводят к бурой окраске после нагревания при сосуществовании соединения, имеющего аминогруппу внутри молекулы, такого как аминокислоты и белки, и поэтому предпочтительно они не должны присутствовать в дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, в качестве продукта. Однако, например, при производстве дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный благодаря стадии обеспечения действия фермента, такого как цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза, на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, реакционные примеси, такие как уцелевшая L-аскорбиновая кислота и D-глюкоза, получаемая из материала в виде крахмального вещества, будет неизбежно сосуществовать в получаемой таким образом дисперсной композиции в какой-либо степени. Например, в традиционных порошках с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством количества L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, содержащиеся в них, могли достигать приблизительно одно процента, на основе сухого остатка, всего, и они могут приводить к непредсказуемой реакции темнения при использовании в качестве материалов для пищевых продуктов и т.д.

Таким образом, в настоящее изобретении, при допуске неизбежного включения L-аскорбиновой кислоты и/или D-глюкозы, восстановительную способность всей дисперсной композиции в случае дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, устанавливают на уровне, составляющем менее одного процента. Как установлено в описываемых позже экспериментах, при производстве дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения способом согласно настоящему изобретению восстановительную способность всей дисперсной композиции можно легко установить на уровне, составляющем менее одного процента. Если восстановительная способность всей дисперсной композиции составляет менее одного процента, дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которые хотя и содержат L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу, по существу не приводят к бурой окраске даже после нагревания в присутствии соединения с аминогруппой внутри молекулы, такого как аминокислоты и белки. Соответственно, любые дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которые содержат L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу и характеризуются восстановительной способностью всей дисперсной композиции, составляющей менее одного процента, обладают тем преимуществом, что их можно включить в пищевые продукты, косметические средства, лечебно-профилактическую косметику и лекарственные препараты, как правило, без опасения вызова окрашивания и изменения цвета. В этой связи, когда восстановительная способность всей дисперсной композиции составляет менее одного процента, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы составляет 0,2% или менее, на основе сухого остатка, от дисперсной композиции.

В более предпочтительном варианте осуществления дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения характеризуется содержанием L-аскорбиновой кислоты, составляющим 0,1% или менее, на основе сухого остатка. Используемая в пищевых продуктах или т.п. в качестве антиоксиданта или поглотителя кислорода L-аскорбиновая кислота высокой активностью вступления в реакцию с кислородом. Из-за этого считают, что L-аскорбиновая кислота не только приводит к бурой окраске после нагревания в присутствии соединений, имеющих аминогруппы внутри молекул, но также определено имеет отношение к окрашиванию дисперсных композиций как таковых. На самом деле, как установлено в описываемом позже эксперименте, в соответствии с данными, полученными авторами настоящего изобретения, порошки с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, которые содержат приблизительно 0,2% L-аскорбиновой кислоты, изредка вызывают феномен, состоящий в том, что они сами принимают бледно-бурую окраску после хранения в вышеотмеченной форме в течение относительно длительного периода времени. Напротив, в том случае, когда дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, характеризуется содержанием L-аскорбиновой кислоты, составляющим 0,1% или менее, нет опасения вызова бледно-бурой окраски в ней самой даже после хранения в форме продукта, одинаковой с порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством. Для справки, в соответствии со способом производства настоящего изобретения, содержание L-аскорбиновой кислоты в дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения можно относительно легко сделать равняющимся 0,1% или менее без увеличения производственных затрат благодаря стадии очистки - последовательного проведения хроматографии на колонке с анионообменной смолой для удаления таких сахаридов, как D-глюкоза и т.д., а затем хроматографии на колонке с катионообменной или пористой смолой, в частности, используя хроматографию с псевдодвижущимся слоем на колонке с катионообменной смолой в качестве хроматографии на колонке с катионообменной смолой.

Способ производства дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения

Дисперсной композицией, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения может быть композиция, приготовленная с помощью любого способа производства, и она не должна ограничиваться конкретной композицией, изготовленной конкретным способом производства, до тех пор, пока она является дисперсной композицией, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая содержит 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве свыше 98,0%, но ниже 99,9%, на основе сухого остатка, и характеризуется либо степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, либо уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее.

Однако дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения относительно легко приготовить согласно следующему способу настоящего изобретения; способ в основном содержит следующие стадии (1)-(5):

(1) обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и глюкоамилазы в этом порядке на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, для получения раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с выходом продукции, составляющим 35% или более;

(2) очистки результирующего раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, для увеличения содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до более 86%, на основе сухого остатка;

(3) подвергания результирующего очищенного раствора с содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, превышающим 86%, на основе сухого остатка, кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с образованием безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты;

(4) сбора образованного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты; и

(5) выдерживания, высушивания и необязательно измельчения собранного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Вышеприведенные стадии соответственно объяснены ниже:

Стадия (1)

Стадия (1) предназначена для образования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из L-аскорбиновой кислоты и крахмального вещества благодаря ферментативной реакции. Используемые материалы и ферменты и используемая ферментативная реакции пояснены в последовательном порядке.

A. Используемые материалы и ферменты

L-Аскорбиновая кислота

Примеры L-аскорбиновой кислоты, используемой в настоящем изобретении, включают любую L-аскорбиновую кислоту в форме оксикислоты или соли металла и ее, такой как соли щелочных металлов и соли щелочноземельных металлов, и даже без затруднения можно использовать их смеси.

Крахмальное вещество

Примеры крахмального вещества, используемого в настоящем изобретении, включают картофельный крахмал, крахмал сладкого картофеля, маниоковый крахмал, кукурузный крахмал, крахмал пшеницы и т.д. Среди них предпочтительными являются те, которые по существу не имеет какую-либо разветвленную структуру внутри молекулы, а характеризуются стандартной степенью полимеризации глюкозы; особенно предпочтительными являются цикломальтодекстрины, циклоамилозы, синтезированные амилозы, поскольку они характеризуются степенью полимеризации глюкозы, равной 6-100, и имеют неразветвленную структуру или неразветвленную циклическую структуру. При использовании в качестве крахмального вещества ожиженных крахмалов в общем и продуктов частичного гидролиза крахмала степени полимеризации глюкозы в них предпочтительно нормируют путем гидролиза в местах разветвления таких крахмалов посредством использования цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы в комбинации, например, с разветвляющим крахмал ферментом(ами), таким как изоамилаза (EC 3.2.1.68) и пуллуланаза (EC 3.3.1.41). В качестве такого разветвляющего крахмал фермента особенно предпочтительной является изоамилаза, поскольку ею можно легко манипулировать в зависимости от ее ферментативной активности, субстратной специфичности и т.д.

Цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза

Примеры цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы (EC 2.4.1.19), используемой в настоящем изобретении, включают любую цикломальтодекстрин-глюканотрансферазу природного происхождения или те, которые получены с помощью рекомбинантной технологии, без особого ограничения их происхождениями и источниками, если они образуют 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продукции вплоть до приблизительно 35% или более, после обеспечения ее действия последовательно вместе с глюкоамилазой в этом порядке на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество. Примеры таких ферментов природного происхождения включают цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, происходящие из штамма Tc-62 Geobacillus stearothermophilus и штамма Tc-27 Geobacillus stearothermophilus, которые являются предпочтительными вследствие получаемого при их использовании относительно высокого выхода продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты; среди них первая из двух названных - цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза, происходящая из штамма Tc-62 Geobacillus stearothermophilus, является самой предпочтительной по показателю выхода продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Примеры цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, полученной благодаря технологии рекомбинантных ДНК, включают, например, ту, которая имеет аминокислотную последовательность, которая является результатом замещения в аминокислотной последовательности цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, продуцируемой штаммом Tc-91 Geobacillus stearothermophilus, т.е. аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, остатка лизина в положении 228 остатком глютаминовой кислоты. Для получения такой мутантной цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, как хорошо известно, ген, кодирующий аминокислотную последовательность, которая является результатом замещения в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 остатка лизина в положении 228 остатком глютаминовой кислоты, вводят в соответствующую клетку-хозяина, такую как E. coli, Bacillus subtilis и т.д., для трансформации хозяина с последующей экспрессией гена в трансформанте.

Идентифицированные выше штаммы Tc-27, Tc-62 и Tc-91 Geobacillus stearothermophilus являются микроорганизмами, описанными в не прошедшей экспертизу заявке на патент Японии с № 63189/75 (публикации патента Японии с № 27791/78), поданной тем же заявителем, что заявитель настоящего изобретения, и они были депонированы в National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-1-1, Chuo-6, Tsukuba-shi, Ibaraki, Япония, с входящими номерами FERM BP-11142, FERM BP-11143 и FERM P-2225 (в соответствии с процедурой международного депонирования с входящим номером FERM ABP-11273), после подтверждения 14 июля 2009 года. Микроорганизмы, которые когда-то были включены в группу под названием микроорганизмы вида Bacillus stearothermophilus, теперь все перенесены в группу под названием микроорганизмы вида «Geobacillus stearothermophilus», однако название микроорганизмы рода «Bacillus» до сих пор использовалось в качестве такового для названия микроорганизмов независимого рода. В этих обстоятельствах, во избежание путаницы, микроорганизмы видов «Bacillus stearothermophilus» и «Geobacillus stearothermophilus» описываются как микроорганизмы вида «Geobacillus stearothermophilus» на протяжении всего этого описания.

Глюкоамилаза

Могут использоваться любые глюкоамилазы (EC 3.2.1.3) без особого ограничения, независимо от их происхождений и источников, и они включают глюкоамилазы в форме встречающегося в природе фермента и глюкоамилазы, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК, при условии, что цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза и глюкоамилаза, после обеспечения их действия в этом порядке на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, образуют 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продукции вплоть до 35% или более.

Поскольку глюкоамилазу обычно добавляют к ферментативной реакции после нагревания раствора для прекращения осуществляемой цикломальтодекстрин-глюканотрансферазой реакции переноса сахарида, предпочтительными являются глюкоамилазы, которые могут проявлять желаемую ферментативную активность, подходящую для фактического применения при относительно высокой температуре, например, от приблизительно 40 до приблизительно 60ºC, с тем, чтобы сэкономить энергию и время, необходимые для охлаждения ферментативной реакции после нагревания. При использовании глюкоамилазы, которая содержит α-глюкозидазу, результирующий 2-глюкозид аскорбиновой кислоты будет подвергаться гидролизу под действием последней, и поэтому желательно использовать глюкоамилазу, по существу не содержащую α-глюкозидазу. Любые глюкоамилазы можно использовать независимо от их происхождений и источников, если они удовлетворяют вышеуказанным требованиям, например, коммерциализированный препарат глюкоамилазы, происходящей из микроорганизма рода Rhizopus, название продукта «GLUCOZYME #20000», фермент, превращенный в источник прибыли Nagase ChemteX, Corp., Osaka, Япония; и могут предпочтительно использоваться другие глюкоамилазы, происходящие из микроорганизма рода Aspergillus, название продукта «GLUCZYME AF6», превращенного в источник прибыли Amano Enzyme Inc., Aichi, Япония.

B. Ферментативная реакция

Следующее описание поясняет реакцию переноса сахарида на L-аскорбиновую кислоту. Цикломальтодекстрин-глюканотрансферазе позволяют действовать на раствор, обычно, водный раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество. Когда цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза действует на такой водный раствор, один или более остатков D-глюкозы переносится на гидроксильную группу в положении C-2 L-аскорбиновой кислоты, приводя к образованию 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с одним остатком D-глюкозы, связанным с гидроксильной группой в вышеуказанном положении C-2, и других α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, таких как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота, которые имеют по меньшей мере два остатка D-глюкозы, связанных с гидроксильной группой в вышеуказанном положении C-2.

Обычно обеспечивают действие цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы в количестве от 1 до 500 единиц/г крахмального вещества на водный раствор, предварительно приготовленный с растворением L-аскорбиновой кислоты и крахмального вещества для достижения концентрации субстрата, составляющей 1-40%, с последующей ферментативной реакцией при pH, составляющем от приблизительно 3 до приблизительно 10, и температуре от 30 до 70ºC в течение по меньшей мере шести часов, предпочтительно от приблизительно 12 до приблизительно 96 часов. Поскольку L-аскорбиновая кислота подвержена окислению, предпочтительно раствор следует держать в анаэробных или восстанавливающих условиях во время ферментативной реакции, при защите от света и необязательно сосуществовании, например, восстанавливающего агента, такого как тиомочевина или сероводород.

Весовое соотношение, на основе сухого остатка, крахмального вещества и L-аскорбиновой кислоты в растворе должно предпочтительно составлять от 8:2 до 3:7. Когда соотношение крахмального вещества и L-аскорбиновой кислоты выходит за пределы вышеуказанного диапазона в сторону повышения, перенос сахарида на L-аскорбиновую кислоту эффективно происходит; однако выход продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты ограничивается исходной концентрацией L-аскорбиновой кислоты, что приводит к относительно низкому уровню. Тогда как, когда соотношение крахмального вещества и L-аскорбиновой кислоты выходит за пределы вышеуказанного диапазона в сторону понижения, уцелевшая L-аскорбиновая кислота будет оставаться в значительном количестве, и это не является предпочтительным при производстве в промышленном масштабе. Соответственно, определенное выше соотношение считается наилучшим.

В случае использования, помимо цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, изоамилазы в качестве разветвляющего крахмал фермента, такой изоамилазе должно быть предпочтительно позволено действовать на крахмальное вещество при сосуществовании с цикломальтодекстрин-глюканотрансферазой в растворе, содержащем L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, причем количество добавляемой изоамилазы обычно составляет 200-2500 единиц/г крахмального вещество, и этот фермент вступает в ферментативную реакцию при температуре 55ºC или ниже, которая изменяется в зависимости от оптимальной температуры и pH для используемой изоамилазы. При использовании пуллуланазы в качестве разветвляющего крахмал фермента ее можно использовать в соответствии со случаем использования изоамилазы.

После завершения в целом ферментативной реакции с использованием цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы только или вместе с разветвляющим крахмал ферментом результирующий раствор ферментативной реакции незамедлительно нагревают для инактивации цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза только или в комбинации с разветвляющим крахмал ферментом и для прекращения ферментативной реакции, с последующим допуском действия глюкоамилазы на результирующий раствор. Под действием глюкоамилазы цепь из двух или более остатков D-глюкозы, связанных с гидроксильной группой в положении C-2 L-аскорбиновой кислоты, расщепляется с превращением α-гликозил-L-аскорбиновой кислоты, такой как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота, в 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с увеличением выхода продукции вплоть до 35% или более, предпочтительно 37-45%, 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

В случае выхода продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющего 35% или более, предпочтительно 37-45%, он способствует получению благодаря последующим стадиям (2)-(5) дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, характеризующейся степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, или уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее для дисперсной композиции. Причиной того, почему верхний предел предпочтительного выхода продукции установлен на 45%, является следующее. Очень трудно превысить верхний предел ввиду технологического уровня разработки ферментов на сегодняшний день, хотя даже если выход продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты превысит 45%, степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в результирующей дисперсной композиции и уровень динамического поглощения паров для нее не улучшатся до такой степени.

В случае выхода продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющего менее 35%, трудно получить дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, характеризующуюся степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, или уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее для дисперсной композиции, даже если она получена благодаря последующим стадиям (2)-(5). Хотя причина этого неясна, можно предположить, что вышеуказанная трудность зависит от относительного содержания 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты и 6-O-α-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты в качестве побочных продуктов, которые неизбежно образуются при допуске действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество.

Обычно 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновая кислота и 6-O-α-глюкозил-L-аскорбиновая кислота, в которых остаток D-глюкозы связан с гидроксильной группы в положении C-5 или C-6 L-аскорбиновой кислоты, расценивают в качестве ингибирующих кристаллизацию веществ, которые ингибируют кристаллизацию 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и эти 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновая кислота и 6-O-α-глюкозил-L-аскорбиновая кислота неизбежно образуются в качестве побочных продуктов вместе с 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты и вышеотмеченными α-гликозил-L-аскорбиновыми кислотами. Содержание вышеуказанных побочных продуктов обычно составляет только приблизительно один процент, на основе сухого остатка, всего; однако их удаление является обычно затруднительным, поскольку эти продукты с перенесенным сахаридом подвергаются элюированию по существу в том же месте обычной стадии очистки с использованием колонки, что и 2-глюкозид аскорбиновой кислоты. Однако когда 2-глюкозид аскорбиновой кислоты образуется с выходом продукции вплоть до 35% или более, предпочтительно 37-45%, в результате обеспечения действия вышеупомянутой природной или рекомбинантной цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, выход продукции 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты и 6-O-α-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты не превышает 0,5%, на основе сухого остатка, всего. В результате, можно предположить, что последующая кристаллизация 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в дисперсную композицию безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты будет проходить более равномерно.

Кроме того, можно допустить, что к вышеотмеченной теории относится следующее; при использовании цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы в качестве переносящего сахарид фермента видом связи между остатками D-глюкозы в α-гликозил-L-аскорбиновой кислоте, такой как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и т.д., является α-1,4-связь, даже в случае переноса двух или более остатков D-глюкозы на гидроксильную группу в положении C-2 L-аскорбиновой кислоты. Поэтому связь между вышеуказанными остатками D-глюкозы легко расщепляется с помощью последующего действия глюкоамилазы для превращения гликозил-L-аскорбиновой кислоты в 2-глюкозид аскорбиновой кислоты; и, например, нет опасения сохранения ингибирующих кристаллизацию веществ, таких как α-гликозил-L-аскорбиновая кислота, имеющая разветвленную структуру, такую как α-1,6-связь, точно после обработки глюкоамилазой, как и в случае использования образующего α-изомальтозилглюкосахарид фермента, например.

Стадия (2)

Стадия (2) предназначена для очистки раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученного на вышеуказанной стадии (1), для увеличения содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до более 86%, на основе сухого остатка; раствор, содержащий 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный на стадии (1), обесцвечивают и фильтруют с использованием активированного угля, и т.д., с последующим обессоливанием результирующего фильтрата с помощью катионообменной смолы и использованием подвергнутого обессоливанию раствора для хроматографии на колонке для очистки раствора для достижения содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, превышающего 86%, предпочтительно 88% или более, на основе сухого остатка. В качестве используемой для очистки хроматографии на колонке по существу могут использоваться любые хроматографии на колонках при условии, что они увеличивают содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в растворе до более 86%, на основе сухого остатка, однако предпочтительным примером такой хроматографии является хроматография на колонке с катионообменной смолой или пористой смолой, которая следует за хроматографией на колонке с анионообменной смолой для удаления сахаридов, таких как D-глюкоза. Примеры анионообменных смол, требуемых для удаления сахаридов, таких как D-глюкоза, включают «AMBERLITE IRA411S» и «AMBERLITE IRA478RF» (обе из которых превращены в источник прибыли Rohm & Hass Company, Philadelphia, США); и «DIAION WA30» (которая превращена в источник прибыли Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Япония). Примеры катионообменных смол, требуемых для отделения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты от L-аскорбиновой кислоты, включают «DOWEX 50WX8» (которая превращена в источник прибыли Dow Chemical Co., Midland, США); «AMBERLITE CG120» (которая превращена в источник прибыли Rohm & Hass Company, Philadelphia, США); «XT-1022E» (которая превращена в источник прибыли Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Япония); и «DIAION SK104» и «DIAION UBK 550» (обе из которых превращены в источник прибыли Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Япония). Примеры требуемых пористых смол включают «TOYOPEARL HW-40» (которая превращена в источник прибыли Tosoh Corp., Tokyo, Япония); и «CELLFINE GH-25» (которая превращена в источник прибыли Chico Corp., Tokyo, Япония). В случае проведения хроматографий на колонках с катионообменными смолами или пористыми смолами предпочтительными условиями являются следующие условия. Концентрация раствора материала - сухого остатка, подаваемого на колонку, составляет от приблизительно 10% до приблизительно 50%, объем загрузки на смолу составляет приблизительно 1/1000-1/20 часть от объема влажной смолы, и вода высокого качества в количестве, приблизительно равном объему влажной смолы, подается с линейной скоростью, составляющей 0,5-5 м/час. Среди них, в случае использования в качестве хроматографии на колонке с катионообменной смолой хроматографии с псевдодвижущимся слоем на колонке, такая хроматография на колонке является предпочтительной, поскольку она увеличивает степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в результирующем очищенном продукте и снижает содержание сопутствующих веществ, таких как L-аскорбиновая кислота и D-глюкоза, в частности, она снижает содержание L-аскорбиновой кислоты и приводит к образованию дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с содержанием L-аскорбиновой кислоты, составляющим 0,1% или менее, на основе сухого остатка. Для справки, при изменении в зависимости от рабочей температуры/установки скорости потока, предпочтительными условиями элюирования при хроматографии с псевдодвижущимся слоем на колонке, в качестве наполнителя которой используется катионобменная смола, являются следующие условия. Концентрация раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, подаваемого в вышеуказанную колонку для хроматографии, составляет 60% или менее, объем загрузки содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты раствора составляет 1/20 часть или менее от объема влажной смолы, а объем воды высокого качества, используемой в качестве элюента, не превышает 30, обычно 5-20, вышеуказанных объемов загрузки.

Когда содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в растворе составляет 86% или менее, на основе сухого остатка, трудно получить дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, характеризующуюся или степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, или уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее для дисперсной композиции, даже после обработки с использованием последующих стадий (3)-(5). Предполагаемой причиной этого является то, что, когда содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в растворе составляет 86% или менее, на основе сухого остатка, степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в результирующей дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученной благодаря последующим стадиям, является относительно низкой, и это служит препятствием его равномерной кристаллизации.

Раствор, очищенный до достижения содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, превышающего 86%, предпочтительно 88% или более, на основе сухого остатка, концентрируют для достижения заданной концентрации, обычно концентрации, составляющей от приблизительно 65 до приблизительно 85% 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, перед стадией кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Температуру концентрата обычно устанавливают на уровне, составляющем от приблизительно 30 до приблизительно 45ºC. Концентрат с этой концентрацией и этой температурой соответствует содержащему 2-глюкозид аскорбиновой кислоты раствору со степенью насыщения, составляющей 1,05-1,50.

Стадия (3)

Стадия (3) предназначена для кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из раствора, содержащего более 86%, предпочтительно 88% или более, на основе сухого остатка, 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты; раствор, содержащий 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, предварительно очищенный и сконцентрированный для достижения заданной степени чистоты и концентрации и установленный на заданной температуре на стадии (2), переносят в кристаллизатор, смешивают с 0,1-5% затравочного кристалла безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и осторожно перемешивают, а затем постепенно снижают температуру раствора до 5-20ºC в течение 6-48 часов для кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с образованием безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Если затравочный кристалл безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты уже присутствует в кристаллизаторе, и т.д., нет необходимости отдельно добавлять такой затравочный кристалл. Во всех случаях кристаллизацию безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из вышеуказанного концентрата предпочтительно осуществляют в присутствии такого затравочного кристалла. При необходимости, концентрирование очищенного раствора и кристаллизацию безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в растворе можно выполнять одновременно посредством процесса с кипячением.

Стадия (4)

Стадия (4) предназначена для сбора кристаллизованного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты; утфельную массу собирают из кристаллизатора, а затем с помощью центрифугирования собирают безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты.

Стадия (5)

Стадия (5) предназначена для выдерживания собранного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, высушивания продукта и необязательно измельчения высушенного продукта; безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, собранный с помощью центрифугирования, промывают небольшим количеством воды высокого качества, такой как деионизированная вода и дистиллированная вода, для смыва примесей, адсорбировавшихся на поверхностях кристаллов. Количество используемой для промывки воды не должно особо ограничиваться, однако ее избыточное количество растворяет кристаллы как таковые, а также примеси, приводя к снижению выхода продукции и увеличению затрат на промывку. Поэтому обычно поверхности кристаллов предпочтительно промывают водой в количестве вплоть до 30%, предпочтительно 15-25%, от веса кристаллов. Промывку предпочтительно проводят при действии центробежной силы посредством помещения кристаллов в центрифугу с подвешивающимися стаканами. Собранные и промытые таким образом кристаллы выдерживают и высушивают, храня их в атмосфере с заданной температурой и влажностью в течение заданного периода времени, для превращения результирующих кристаллов в дисперсную композицию со степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, или уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее.

Хотя температура продукта - дисперсной композиции, содержащей кристаллы, на стадиях выдерживания и высушивания, относительная влажность атмосферы и период времени выдерживания и высушивания не должны особо ограничиваться до тех пор, пока получают дисперсную композицию с требуемой степенью кристалличности или уровнем динамического поглощения паров, однако предпочтительно следует сохранять температуру продукта на уровне 20-55ºC, а относительную влажность - на уровне 60-90% на стадиях выдерживания и хранения. Общее время для стадий выдерживания и высушивания предпочтительно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 24 часов. Дисперсную композицию, содержащую кристаллы, полученную благодаря стадиям выдерживания и высушивания, непринудительно охлаждают до температуры окружающей среды с превращением в дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, со степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, или уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее. Кристаллическую дисперсную композицию, полученную таким образом, превращают в конечный продукт с помощью необязательного измельчения.

За исключение выхода продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на вышеуказанной стадии (1) и содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в любом из растворов на вышеуказанных стадиях (2) и (3), вышеуказанные стадии (1)-(5) по существу являются одинаковыми со стадиями производства порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, и они не содержат каких-либо стадий рекристаллизации и многократных промывок кристаллов, которые необходимы в способе производства порошков качества реагента.

Полученную таким образом дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, довольно быстро превращают в по существу не гигроскопическую дисперсную композицию с улучшенной свойством сыпучести посредством непринудительного охлаждения после стадий выдерживания и высушивания, однако степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты не увеличивается до 90% или более, а уровень динамического поглощения паров для дисперсной композиции не снижается до 0,01% или менее, когда период времени непринудительного охлаждения является слишком коротким. Когда дисперсную композицию, приготовленную с использованием короткого периода времени непринудительного охлаждения, непосредственно превращают в конечный продукт, получают лишь дисперсную композицию, которая может твердеть в обычных условиях хранениях, подобно порошкам с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством. Считается, что требуемый для получения почти не способной твердеть дисперсной композиции настоящего изобретения возможный самый короткий период времени непринудительного охлаждения, на который оказывает влияние температура атмосферы и влажность, а также изменяющий в зависимости от размера и строения устройств/оборудований, используемых для сушки, является неизменным при неизменных условиях. Таким образом, если связь между (i) периодом времени непринудительного охлаждения, требуемым для установки степени кристалличности на уровне, составляющем 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и установки уровня динамического поглощения паров для дисперсной композиции до 0,01% или менее, и (ii) температурой атмосферы и влажностью, однажды исследована, в конкретных устройствах и оборудованиях для фактического применения, нет необходимости в каждом случае исследовать степень кристалличности и уровень динамического поглощения паров для дисперсной композиции каждый раз после производства, а дисперсную композицию настоящего изобретения можно получать, используя вышеуказанный период времени непринудительного охлаждения в качестве показателя.

Авторы настоящего изобретения, кроме того, установили, что, например, в результате непринудительного охлаждения с помощью дутья чистого воздуха приблизительно с температурой окружающей среды на дисперсную композицию для понижения температуры до приблизительно температуры окружающей среды, вместо непринудительного охлаждения дисперсной композиции, содержащей кристаллы, после определенных выше стадий выдерживания и высушивания, происходит равномерная кристаллизация безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в дисперсную композицию со степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее, за относительно короткий период времени. Предпочтительно воздух при дутье имеет температуру, колеблющуюся от приблизительно 15 до приблизительно 30ºC, более предпочтительно 18-28ºC. Кроме того, обычно период времени дутья предпочтительно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 60 мин, более предпочтительно 10-30 мин. Изменяющийся в зависимости от температуры воздуха при дутье эффект принудительного охлаждения не так четко отмечается при использовании периода времени дутья, составляющего менее пяти минут, хотя увеличенный прирост степени кристалличности не ожидается даже при использовании периода времени дутья, превышающего 60 мин, и поэтому такой период времени дутья не является предпочтительным. В случае дутья воздуха эффект охлаждения должен предпочтительно вызываться во всей дисперсной композиции, содержащей кристаллы, что достигается либо с помощью соответствующего перемешивания, либо качания дисперсной композиции.

Полученная таким образом дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, является композицией настоящего изобретения, которая содержит 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве более 98,0%, но менее 99,9%, на основе сухого остатка, и характеризуется либо степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, при расчете на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для порошка - дисперсной композиции, либо уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее, после хранения при 25ºC при относительной влажности, составляющей 35%, в течение 12 часов после удаления несвязанной воды в потоке газообразного азота. По сравнению с традиционными порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, дисперсная композиция является значительно менее способной твердеть дисперсной композицией, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, даже в условиях, в которых традиционные порошки будут твердеть.

С заметкой в скобках, твердение материалов обуславливает опасение нанесения различным образом ущерба промышленным предприятиям. Например, в области пищевой промышленности, в которой используются порошкообразные материалы, такие материалы часто тонко измельчают с помощью валковых дробилок, транспортируют на производственные линии с помощью воздуходува и транспортируют с помощью движущихся зигзагообразно винтовых транспортеров. В таких случаях, если порошкообразные материалы затвердеют, будут возникать следующие трудности. Могут повредиться или сгореть вальцы валковых дробилок, или могут быть заблокированы сита и трубки для транспортировки, установленные на производственных линиях. Также подверженные твердению порошкообразные материалы обуславливают высокий риск возникновения эксплуатационных трудностей при их растворении и их смешивании или замесе с другими материалами. Трудности на стадиях производства, вызванные твердением таких порошков, подробно описаны, например, в "Funryutai-Trouble-Shooting" (Trouble shooting of powderous particles), edited by Tsutomu Shibata, published by Kogyo Chosakai Publishing Co., Ltd., Tokyo, Japan, pp. 15-19, 2006.

Поскольку дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения значительно менее способна твердеть по сравнению с традиционными порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, она обладает преимущественным качеством, состоящим в том, что ее можно включить в один или более других порошкообразных материалов для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лекарственных препаратов в области производств пищевых продуктов, включающих напитки, а также косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лекарственных препаратов, которые изготавливают на промышленных предприятиях, которые спроектированы на исходных условиях использования материалов с удовлетворительным свойством сыпучести.

Примеры определенных выше порошкообразных материалов для пищевых продуктов включают хлебную муку, крахмалы, сахарную пудру, порошкообразные приправы, порошкообразные специи, порошковые соки, порошковые жиры и масла, порошковые пептиды, порошковые яичные желтки, порошковое молоко, порошки из снятого молока, порошковый кофе, порошковое какао, порошковый мисо и превращенные в порошок овощи. Примеры порошкообразных материалов для косметических средств включают пудры, тальк, каолин, слюду, серицит, крахмалы, бентонит, шелковые пудры, целлюлозные порошки, нейлоновые порошки, соли для ванн, мыльные рецептуры, диоксид титана, диоксид кремния (кремнезем) и оксид цинка. Примеры порошкообразных материалов для лечебно-профилактической косметики включают соли аминокислот, витаминные препараты, кальциевые препараты, формообразующие средства, наполнители, фунгициды и ферментные препараты. Примеры порошкообразных материалов для лекарственных препаратов включают порошковые эффективные ингредиенты; формообразующие средства и наполнители, такие как олигосахариды, лактоза, крахмалы, декстрины, сахар-песок, кристаллические целлюлозы, сложные эфиры сахарозы и сложные эфиры жирных кислот; и покровные средства, такие как шеллак. Полученные таким образом дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, обычно содержат L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу и характеризуются восстановительной способностью всей дисперсной композиции, составляющей менее одного процента. Подробно, они являются дисперсными композициями, удовлетворительными в том плане, что, несмотря на содержание обычно либо одного из двух или обоих соединений из L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы на уровне, выявляемом с помощью аналитических способов, таких как жидкостная хроматография высокого разрешения, в частности, в количестве, составляющем 0,01% или более, но не более 0,2%, на основе сухого остатка, они обладают восстановительной способностью всей дисперсной композиции, составляющей менее одного процента, и поэтому, как установлено в позже описываемом эксперименте, они по существу не вызывают опасение изменения цвета (темнения) даже после нагревания в присутствии соединения(й) с аминогруппой внутри молекулы, такого как аминокислоты и белки. Предпочтительно полученные таким образом дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, содержат L-аскорбиновую кислоту в количестве, составляющем 0,1% или менее. Когда дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, характеризуется содержанием L-аскорбиновой, составляющим только 0,1% или менее, нет опасения изменения цвета дисперсной композиции как таковой, даже после хранения в течение относительно длительного периода времени в форме продукта, одинаковой с таковой традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством.

Кроме того, полученные таким образом дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, можно превратить сами по себе в продукты дисперсных композиций, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, поскольку они обычно содержат частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 70% или более от всей дисперсной композиции, и частицы с размером частиц, составляющим по меньшей мере 53 мкм, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 40-60% от всей дисперсной композиции. В случае содержания относительно большого количества порошковых частиц с размером частиц, превышающим определенный выше размер частиц, или с распределением частиц, отличающимся от требуемых уровней, их можно соответствующим образом измельчить для уменьшения размера частиц или рассортировать с помощью просеивания или т.п. для нормирования размера частиц.

Следующие эксперименты служат конкретным пояснением настоящего изобретения.

Эксперимент 1: Влияние степени кристалличности на твердение дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

Дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с различными степенями кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, находящимися в диапазоне от 0 до 100%, были приготовлены и проверены на твердение для исследования связи между степенью кристалличности и способностью твердеть. Деталями является следующее:

Эксперимент 1-1: Приготовление образцов

Исследуемый образец № 1

Названный исследуемым образец № 1 «2-ГЛЮКОЗИД АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ 999» (кодовый № AG124, степень чистоты 99,9% или более), дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, использовали в качестве стандартного образца, по существу состоящего из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Исследуемый образец № 2

Дисперсную композицию, приготовленную посредством растворения исследуемого образца № 1 в соответствующем количестве воды высокого качества, лиофилизации результирующего раствора в течение трех дней и высушивания продукта в вакууме при температуре, составляющей 40ºC или менее, в течение ночи, использовали в качестве другого стандартного образца, по существу состоящего из аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и назвали «исследуемым образцом № 2». Исследуемый образец № 2 характеризовался содержанием влаги, составляющим 2,0% при определении по методу Карла Фишера.

Исследуемые образцы №№ 3 и 4

В качестве исследуемых образцов №№ 3 и 4 со степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, находящейся между таковыми исследуемых образцов №№ 1 и 2, следующие образцы были приготовлены следующим образом. Дисперсную композицию, по существу состоящую из аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, приготовленную способом, сходным со способом приготовления исследуемого образца № 2, распределяли по поверхности металлического лотка и подвергали частичной кристаллизации, держа в камере с постоянной температурой, установленной на 25ºC, и постоянной относительной влажности, составляющей 90%, в течение 24 или 72 часов для ускорения кристаллизации. Впоследствии металлический лоток вынимали из камеры, сушили в вакууме при 38ºC в течение ночи для получения двух типов дисперсных композиций, причем одну композицию, приготовленную с использованием составляющего 24 часа периода время выдерживания в камере с установленной температурой и влажностью, назвали «исследуемым образцом № 3», тогда как другую композицию, приготовленную с использованием составляющего 72 часа периода время выдерживания, назвали «исследуемым образцом № 4». Исследуемые образцы №№ 3 и 4 соответственно помещали в пузырьки, закупориваемые крышками, и хранили вместе с десикантом в эксикаторе в герметически закрытом состоянии непосредственно до подвергания исследованию для проверки.

Эксперимент 1-2: Степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и его степени кристалличности в исследуемых образцах №№ 1-4

Степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты

Степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемых образцах №№ 1-4 определяли следующим образом. Используя воду высокого качества, каждый исследуемый образец превращали в 2% водный раствор, который затем фильтровали через 0,45 мкм мембранный фильтр. Фильтрат подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в следующих условиях, с последующим расчетом степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, на основе сухого остатка, в каждом исследуемом образце на основе площади пика каждой хроматограммы показателя преломления. Результаты представлены в таблице 1.

Условия исследования

Система ВЭЖХ: «LC-10AD», превращенная в источник прибыли Shimadzu Corp., Kyoto, Япония;

Дегазатор: «DGU-12AM», превращенный в источник прибыли Shimadzu Corp., Kyoto, Япония

Колонка: «WAKOPAK WAKOBEADS T-330», H⁺-форма, превращенная в источник прибыли Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Япония;

Объем инъекции образца: 10 мкл;

Элюент: 0,01% (в объемном отношении) водный раствор азотной кислоты;

Скорость потока: 0,5 мл/мин;

Температура: 25ºC;

Детектор показателя преломления: «RID-10A», превращенный в источник прибыли Shimadzu Corp., Kyoto, Япония;

Оборудование для обработки данных: "CHROMATOPAK C-R7A", превращенный в источник прибыли Shimadzu Corp., Kyoto, Япония.

Степень кристалличности

Степени кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в каждом исследуемом образце №№ 1-4 определяли посредством подвергания каждого исследуемого образца исследованию с использованием «X' Pert PRO MPD», название продукта - имеющегося в продаже порошкового рентгеновского дифрактометра, оснащенного отражательной оптической системой, превращенного в источник прибыли Spectris Co., Ltd., Tokyo, Япония; испускающего CuK α-излучение (используемый для получения рентгеновских лучей электрический ток: 40 мА, электрическое напряжение: 45 кВ, длина волны: 1,5405 Å), в качестве характеристического рентгеновского излучения, испускаемого из материала-мишени - Cu, на образец для получения дифракционной картины рентгеновских лучей для порошка; и определения аналитическим способом значения степени кристалличности для каждого исследуемого образца №№ 1-4 по методу Харманса, используя компьютерное программное обеспечение для метода Харманса, установленное только в дифрактометре. Перед вышеуказанным исследованием в программном обеспечении соответственно осуществляли установку размерности частиц и начальную установку фактора изгиба на соответствующие уровни для получения базиса, который в соответствии с оценкой является самым предпочтительным, с учетом взаимно перекрывающихся пиков, интенсивности дифракции и интенсивности рассеяния в соответствующих дифракционных картинах рентгеновских лучей для порошков. Метод Харманса подробно описан в P. H. Harmans and A. Weidinger, "Journal of Applied Physics, Vol. 19, pp. 491-506 (1948) и P. H. Harmans and A. Weidinger, "Journal of Polymer Science", Vol. 4, pp. 135-144 (1949).

Степень кристалличности каждого исследуемого образца рассчитывали посредством подстановки следующих данных в вышеприведенную формулу 1: Hs в качестве значения степени кристалличности каждого исследуемого образца; H₁₀₀, определенное аналитическим способом значение степени кристалличности исследуемого образца № 1; и H₀, определенное аналитическим способом значение степени кристалличности исследуемого образца № 2. В случае исследования по методу Харманса определенное аналитическим способом значение степени кристалличности исследуемого образца № 1 (определенное аналитическим способом значение H₁₀₀) и определенное аналитическим способом значение степени кристалличности исследуемого образца № 2 (определенное аналитическим способом значение H₀) составили соответственно 70,23% и 7,57%. Результаты также представлены в таблице 1. Дифракционные картины рентгеновских лучей для порошков в виде исследуемых образцов №№ 1 и 2, в качестве стандартных образцов, представлены соответственно на фиг.1 и 2.

Как показано на фиг.1, были обнаружены четкие и резкие дифракционные пики, характерные для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в диапазоне углов дифракции (2θ) 4-65º на дифракционной картине рентгеновских лучей для порошка в виде исследуемого образца № 1, но не обнаружен какой-либо гало, характерный для аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. В то время как, как показано на фиг.2, в отличие от дифракционной картины рентгеновских лучей для порошка, представленной на фиг.1, гало, характерный для аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, был четко установлен в виде выпуклого базиса на дифракционной картине рентгеновских лучей для порошка в виде исследуемого образца № 2, но не был обнаружен какой-либо дифракционный пик, характерный для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Эксперимент 1-3: Рентгеноструктурные анализы порошков в виде исследуемых образцов №№ 1 и 2 с использованием синхротронного излучения

Этот эксперимент был проведен для дополнительного подтверждения того, что исследуемые образцы №№ 1 и 2 являются стандартными образцами, подходящими для определения аналитическим способом значений H₁₀₀ и H₀. Эти образцы подвергали порошковой рентгеновской дифрактометрии с использованием оптической системой пропускающего типа, которая выявляет слабую дифракцию и рассеяние, используя синхротронное излучения (в дальнейшем называемое «излучением») в качестве источника рентгеновского излучения. Условиями исследования были следующие условия.

Условия исследования

Порошковый рентгеновский дифрактометр: модель «PDS-16», быстродействующий порошковый рентгеновский дифрактометр (тип Дебая-Шеррера, длина камеры: 497,2 мм), превращенный в источник прибыли Kohzu Precision Co., Ltd., Kanagawa, Япония;

Источник рентгеновского излучения: «Beam line of Hyogo Prefecture (BL08B2)», излучение из отклоняющих электромагнитов;

Длина волны: 0,7717 Å (16,066 кэВ);

Интенсивность: 10⁹ фотонов/сек;

Угол измерения: 2-40º;

Время экспозиции: 600 сек;

Запись изображений: «IMAGING PLATE BAS-2040», рентгенографическая пластина, превращенная в источник прибыли Fujifilm Corp., Tokyo, Япония; и

Анализатор изображений: «BIO-IMAGE ANALYZER BAS-2500», превращенный в источник прибыли Fujifilm Corp., Tokyo, Япония.

Определение осуществляли, используя «Beam line of Hyogo Prefecture (BL08B2)», размещенный в оборудовании для синхротронного излучения «SPring-8», 1-1-1 Koto, Sayo-cho, Sayo, Hyogo, Япония.

Перед порошковым рентгеноструктурным анализом исследуемые образцы №№ 1 и 2 соответственно размельчали в ступе и просеивали через 53 мкм сито. Затем каждую результирующую дисперсную композицию, пропущенную через сито, равномерно вносили в «MARKTUBE No. 14», название продукта в виде стеклянной капиллярной трубки для порошковый дифракции рентгеновских лучей (с диаметром: 0,6 мм, стекло Линдемана), превращенной в источник прибыли Toho KK, Tokyo, Япония, до достижения длины внесенного образца, составляющей приблизительно 30 мм. Впоследствии капиллярную трубку разрезали на конце внесенного образца, и открытый конец герметизировали клейким веществом. Затем капиллярную трубку закрепляли на опоре для образца с помощью глины, и опору для образца устанавливали в порошковый рентгеновский дифрактометр так, чтобы продольное направление капиллярной трубки было перпендикулярно оптической оси порошкового рентгеновского дифрактометра.

Для исключения неблагоприятного эффекта ориентации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на дифракционную картину рентгеновских лучей для порошка, определение порошковой дифракции рентгеновских лучей выполняли, обеспечивая движения взад и вперед опоры для образца с постоянной скоростью по продольному направлению капиллярной трубки на расстояние ±1,5 мм и с продолжительностью цикла раз/60 сек, и одновременно обеспечивая вращение опоры для образца с постоянной скоростью по оси вращения в продольном направлении капиллярной трубки с продолжительностью цикла дважды/сек.

В процессе исследования дифракционных картин рентгеновских лучей для порошков и подготовки дифракционных картин рентгеновских лучей для порошков в виде исследуемых образцов №№ 1 и 2, фоновые сигналы, присущие порошковому рентгеновскому дифрактометру, исключали из каждой дифракционной картины рентгеновских лучей для порошка общепринятым образом для увеличения точности определения. Результирующие дифракционные картины рентгеновских лучей для порошков в виде исследуемых образцов №№ 1 и 2 представлены на фиг.3 и 4, соответственно.

Как показано на фиг.3, на дифракционной картине рентгеновских лучей для порошка в виде исследуемого образца № 1, определенной с использованием синхротронного излучения, казались четкими и резкими дифракционные пики, характерные для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в диапазоне углов дифракции (2θ) 2-40ºC. Поскольку длина волны синхротронного излучения (0,7717 Å) отличалась от таковой характеристического рентгеновского излучения (1,5405 Å), каждый дифракционный пик на фиг.3 появлялся за счет приблизительно половины угла дифракции (2θ) каждого соответствующего пика на фиг.1. Однако дифракционные картины рентгеновских лучей для порошков, представленные на фиг.1 и 3, очень хорошо соответствовали друг другу. Несмотря на то, что ширина пика с 1/2 высоты каждого дифракционного пика на фиг.3 была, несомненно, меньше такой на фиг.1, разрешение каждого дифракционного пика на фиг.3 было большим, чем на фиг.1, хотя острота пика на фиг.3 была больше почти в 100 раз таковой на фиг.1. На дифракционной картине рентгеновских лучей, представленной на фиг.3, не обнаруживалось гало, характерное для аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, обнаруживаемое на следующей фиг.4. Это результат означает, что степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемом образце № 1 является очень высокой, и исследуемый образец № 1 по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Как показано на фиг.4, на дифракционной картине рентгеновских лучей для порошка в виде исследуемого образца № 2, полученной, используя синхротронное излучение, обнаруживается заметное гало, характерное для аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в виде выпуклого базиса, но не какой-либо дифракционный пик, характерный для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Этот результат означает, что исследуемый образец № 2 по существу состоит из аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Вышеприведенные результаты, полученные, используя синхротронное излучение в качестве источника рентгеновских лучей, служит поддержкой того, что исследуемые образцы №№ 1 и 2 являются стандартными образцами, подходящими для определения аналитическим способом значений H₁₀₀ и H₀, соответственно, используемых в формуле 1.

Эксперимент 1-4

Исследование твердения

Следующий эксперимент предназначался для исследования твердения соответствующих исследуемых образцов №№ 1-4. Один грамм каждого из исследуемых образцов №№ 1-4, приготовленных в эксперименте 1-1, помещали в «FALCON TUBE 2059», название продукта в виде 14-мл цилиндрической пробирки из полипропилена (с диметром 1,7 см, высотой 10 см) с дном в форме полусферы и с крышкой, превращенного в источник прибыли Becton, Dickinson and Company, New Jersey, США. Пробирки устанавливали вертикально в штатив для пробирок и позволяли им стоять в течение 24 часов, затем штатив для пробирок помещали в «IC-410», название продукта - термостата, превращенного в источник прибыли Advantec Toyo Kaisha, Ltd., Tokyo, Япония, с установкой значения 50ºC. После инкубации пробирки вынимали из термостата, с последующим снятием всех крышек, извлечением каждого образца из каждой пробирки с помещением его на пластину из черной пластмассы посредством медленного переворачивания пробирок вверх дном и макроскопическим изучением состояний образцов.

О степенях твердения каждого исследуемого образца судили на основе следующих критериев:

«затвердевший», (+): образец, безусловно, сохранял полусферическую форму дна пробирки даже на пластине;

«слегка затвердевший», (±): образец слегка демонстрировал полусферическую форму дна пробирки;

«незатвердевший», (-): форма образца искажалась, и он не демонстрировал полусферическую форму дна пробирки. Результаты представлены в графе «Твердение» таблицы 1.

Таблица 1 № исследуемого образца 1 2 3 4 Степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (%) 99,9 99,1 99,1 99,1 Степень кристалличности (%) 100,0 0,0 88,3 93,1 Твердение - + + -

Как показано в таблице 1, в соответствии с оценкой исследуемый образец № 1, в качестве стандартного образца для определения аналитическим способом значения H₁₀₀ (степени кристалличности: 100,0%), был «незатвердевшим» (-), поскольку его форма легко нарушалась, и он не сохранял полусферическую форму дна пробирки после извлечения из пробирки и помещения на пластину. В отличие от него, в соответствии с оценкой исследуемый образец № 2, в качестве другого стандартного образца для определения аналитическим способом значения H₀ (степени кристалличности: 0,0%), был «затвердевшим» (+), поскольку он все еще сохранял полусферическую форму дна пробирки после извлечения из пробирки и помещения на пластину. Полусферическая форма исследуемого образца № 2 не нарушалась даже после легкого качания пластины.

Исследуемый образец № 3 со степенью кристалличности, составляющей 88,3%, сохранял полусферическую форму дна пробирки даже после извлечения из пробирки и помещения на пластину, и в соответствии с оценкой он был «затвердевшим» (+), подобно исследуемому образцу № 2. Однако форма исследуемого образца № 4 со степенью кристалличности, составляющей 93,1%, нарушалась, как и форма исследуемого образца № 1, сразу после извлечения из пробирки и помещения на пластину, и в соответствии с оценкой он был «незатвердевшим» (-).

Как описано выше, хотя исследуемые образцы №№ 2-4 были приготовлены на основе исследуемого образца № 1 со степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющей 99,9%, исследование с помощью вышеотмеченной ВЭЖХ показало, что степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в них не увеличивались до уровня, превышающего 99,1%. Причина этого не ясна, но можно предположить, что незначительное количество 2-глюкозида аскорбиновой кислоты могло бы быть утрачено в результате деградации или т.п. во время приготовления.

На основе вышеприведенных результатов, в случае дисперсных композиций, содержащих 99,1% или более, на основе сухого остатка, безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, композиции с более высокой степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты обычно обладали меньшей способностью к твердению; и данные, что исследуемый образец № 3 со степенью кристалличности, составляющей 88,3%, был в соответствии с оценкой «затвердевшем» (+), а исследуемый образец № 4 со степенью кристалличности, составляющей 93,1%, был в соответствии с оценкой «незатвердевшим» (-), означают, что граница смены оценки «затвердевший» (+) на оценку «незатвердевший» (-) в вышеприведенном исследовании твердения лежит между степями кристалличности 88,3% и 93,1%.

Эксперимент 2

Связь между твердением и степенью кристалличности дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

В этом эксперименте, на основе результатов эксперимента 1, использовали семь типов дисперсных композиций, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, имеющих степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в диапазоне от 0 до 100% и степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в диапазоне от 99,1 до 99,9%, и их твердение исследовали способом, сходным с таковым, используемым в эксперименте 1, для более детального исследования связи между твердением и степенью кристалличности.

Эксперимент 2-1

Приготовление исследуемого образца

Дисперсные композиции исследуемых образцов №№ 5-9 в таблице 2 были приготовлены посредством отвешивания соответствующих количеств исследуемых образцов №№ 1 и 2, которые были приготовлены в эксперименте 1-1, соответственно, и перемешивания их до однородности. В таблице 2 представлены степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и степени кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемых образцах №№ 5-9, определенные способом, описанным в эксперименте 1-2. Результаты для исследуемых образцов №№ 1 и 2 в таблице 2 скопированы из таблицы 1.

Эксперимент 2-2

Исследование твердения

Исследуемые образцы №№ 5-9 были подвергнуты исследованию твердения, используемому в эксперименте 1-4. Результаты представлены в графе «Твердение» таблицы 2. Результаты твердения исследуемых образцов №№ 1 и 2 в таблице 2 были скопированы из таблицы 1.

Таблица 2 № исследуемого образца 1 2 5 6 7 8 9 Степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (%) 99,9 99,1 99,8 99,7 99,6 99,5 99,4 Степень кристалличности (%) 100,0 0,0 99,8 92,6 91,5 89,2 29,9 Твердение - + - - - ± +

Исходя из результатов, представленных в таблице 2, исследуемый образец № 9 со степенью кристалличности, составляющей 29,9%, был в соответствии с оценкой «затвердевшем» (+), в исследуемый образец № 8 со степенью кристалличности, составляющей 89,2%, был в соответствии с оценкой «слегка затвердевшем» (±). В отличие от них, исследуемые образцы №№ 7, 6 и 5 со степенями кристалличности, соответствующими 91,5%, 92,6% и 99,8%, были в соответствии с оценкой «незатвердевшими», подобно исследуемому образцу № 1. Эти результаты означают, что, среди дисперсных композиций, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которые содержат 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве, равном 99,1% или более, но менее 99,9%, на основе сухого остатка, композиции со степенью кристалличности, составляющей 90% или более для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, не твердеют в условиях этого эксперимента.

Эксперимент 3

Влияние уровня динамического поглощения паров на твердение дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

Поскольку гигроскопичность дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, как полагают, связана с твердением дисперсной композиции, в этом эксперименте определяли уровень динамического поглощения паров, который, как предполагают, является показателем, применимым для оценки гигроскопичности, исследуемых образцов №№ 1 и 2 и исследуемых образцов №№ 5-9, и исследовали влияние уровня динамического поглощения паров на твердение дисперсных композиций, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, посредством подтверждения результатов исследования твердения, полученных в эксперименте 2-2.

Эксперимент 3-1

Определение уровня динамического поглощения паров

Приблизительно 50-мг аликвоты соответствующих исследуемых образцов №№ 1 и 2, приготовленных в эксперименте 1-1, и исследуемых образцов №№ 5-9, приготовленных в эксперименте 2-1, помещали соответственно в сетчатые ковши для образцов, и обеспечивали их нахождение в «IGA SORP», устройстве для динамической сорбции паров, превращенном в источник прибыли Hiden Isocheme Corp., когда сетчатые ковши для образцов были установлены в держатели образцов (изготовленные из нержавеющей стали). Исследуемые образцы обезвоживали, сохраняя при температуре, составляющей 25ºC, и относительной влажности, составляющей 0%, в течение 12 часов, в потоке газообразного азота со скоростью потока, составляющей 200 мл/мин, и сразу же взвешивали. Кроме того, исследуемые образцы хранили при температуре, составляющей 25ºC, и относительной влажности, составляющей 35%, в течение 12 часов в потоке газообразного азота и снова взвешивания. Уровень динамического поглощения паров (%) каждого исследуемого образца рассчитывали посредством подстановки в вышеприведенную формулу 2 веса каждого исследуемого образца, влага из которых была удалена, и веса того же образца сразу после гидратирования при температуре 25ºC и относительной влажности, составляющей 35%, в течение 12 часов. Данные, относящиеся к уровням динамического поглощения паров исследуемых образцов №№ 1 и 2, а также исследуемых образцов №№ 5-9, полученные в этом эксперименте, представлены в таблице 3. Параллельно в таблице 3 представлены степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, полученные в эксперименте 2-1, и результаты исследования их твердения, полученные в эксперименте 2-2.

Таблица 3 № исследуемого образца 1 2 5 6 7 8 9 Степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (%) 99,9 99,1 99,8 99,7 99,6 99,5 99,4 Уровень динамического поглощения паров (%) <0,01 1,70 <0,01 <0,01 0,01 0,05 0,13 Твердение - + - - - ± +

Как показано в таблице 3, уровни динамического поглощения паров исследуемых образцов №№ 2 и 5-9 варьировали от менее 0,01% (что соответствует «<0,01» в таблице 3, и это распространяется на это описание в дальнейшем), т.е. значения, которое меньше предела обнаружения, до 1,70%, и это означает, что даже дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который содержат 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве, составляющем 99,1% или более, но менее 99,9%, на основе сухого остатка, могут характеризоваться значительно отличающимися уровнями динамического поглощения паров. Каждый из исследуемых образцов №№ 1, 5 и 6 характеризовался уровнем динамического поглощения паров, который ниже предела обнаружения. Напротив, исследуемые образцы №№ 2, 8 и 9 характеризовались уровнем динамического поглощения паров, превышающим 0,05%, в частности, исследуемый образец № 2 характеризовался уровнем динамического поглощения паров, равным 1,70%, превышающим в 10 раз уровни динамического поглощения паров исследуемых образцов №№ 8 и 9.

При сравнении вышеприведенных результатов и результатов, представленных в графе «Отвердение» в таблице 3 выявляется существование четкой связи между твердением дисперсных композиций, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, и их уровнями динамического поглощения паров; исследуемые образцы №№ 1, 5, 6 и 7, характеризующиеся уровнем динамического поглощения паров, который ниже предела обнаружения или равен лишь 0,01%, были в соответствии с оценкой «незатвердевшими» (-), в то время как исследуемые образцы №№ 2, 8 и 9, характеризующиеся уровнем динамического поглощения паров, достигающим 0,05-1,70%, были в соответствии с оценкой «затвердевшими» (+) или «слегка затвердевшими» (±). Результаты этого эксперимента означают, что, помимо степени кристалличности, уровень динамического поглощения паров для дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, должен быть показателем, применяемым при реализации почти не способной твердеть композиции. Вышеприведенные результаты также означают, что дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющим 99,1% или более, но менее 99,9%, на основе сухого остатка, и с уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее, не твердеет в условиях этого эксперимента.

Тот факт, что исследуемый образец № 2 продемонстрировал, несомненно, высокий уровень динамического поглощения вплоть до 1,70% в этом эксперименте, наводит на мысль, что сорбцию паров вызывает в основном аморфный 2-глюкозид аскорбиновой кислоты. С другой стороны, тот факт, что исследуемый образец № 1 продемонстрировал уровень динамического поглощения паров, который ниже предела обнаружения, говорит о том, что образец по существу не содержит аморфный 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, наподобие исследуемому образцу № 2. Эти результаты полностью соответствовали дифракционным картинам рентгеновских лучей для порошка в виде исследуемого образца № 1, представленным на фиг.1 и 3, и они служат подтверждением того, что исследуемый образец № 1 является стандартным образцом, подходящим для определения аналитическим способом значения H₁₀₀ для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в качестве основы при расчете степени кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в соответствии с формулой 1.

Эксперимент 4

Влияние принудительного охлаждения на степень кристалличности, уровень динамического поглощения паров и твердение дисперсной композиции

На основе результатов вышеприведенных экспериментов было установлено, что в дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, как степень кристалличности, так и уровень динамического поглощения паров дисперсной композиции тесно связаны с их твердением. Соответственно, в этом эксперименте было исследовано следующее: влияние принудительного охлаждения дисперсной композиции, содержащей кристаллы, после стадий выдерживания и высушивания при ее производстве на степень кристалличности, уровень динамического поглощения паров и твердение дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты.

Эксперимент 4-1

Приготовление исследуемого образца

Дисперсные композиции, приготовленные способом, сходным с таковым для приготовления исследуемого образца № 2 в эксперименте 1-1, распределяли по поверхности металлического лотка и держали в камере с постоянной температурой, установленной на 25ºC, и постоянной относительной влажности, составляющей 90%, в течение 16 часов для ускорения кристаллизации и частичной кристаллизации результирующей дисперсной композиции. Впоследствии металлический лоток вынимали из камеры, сушили при 40ºC в течение восьми часов и впоследствии подвергали непринудительному охлаждению в течение приблизительно двух часов с получением исследуемого образца № 10 или подвергали принудительному охлаждению после высушивания с помощью дутья воздуха с температурой 20ºC в течение 15 или 40 мин на дисперсную композицию в лотке с получением исследуемых образцов №№ 11 и 12, соответственно. Исследуемые образцы №№ 10-12 размещали герметично соответственно в пузырьках с крышками и хранили вместе с десикантом в эксикаторе непосредственно до подвергания исследованиям для проверки.

Эксперимент 4-2

Определение степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты

Степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемых образцах №№ 10-12 определяли способом, описанным в эксперименте 1-2, и результаты представлены в таблице 4. Степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемом образце № 1 скопирована из таблицы 1.

Эксперимент 4-3

Определение степени кристалличности и уровня динамического поглощения паров

Степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и уровни динамического поглощения паров дисперсных композиций исследуемых образцов №№ 10-12 определяли с помощью способов, описанных в экспериментах 1 и 3, соответственно. Результаты представлены в таблице 4. Результаты для исследуемого образца № 1 в таблице 4 скопированы из таблиц 1 и 3.

Эксперимент 4-4

Исследование твердения

Исследуемые образцы №№ 10-12 подвергали исследованию твердения, как в эксперименте 1-4. Результаты представлены в графе «Твердение» в таблице 4 вместе с результатом исследования твердения исследуемого образца № 1, представленным в таблице 1.

Таблица 4 № исследуемого образца 1 10 11 12 Степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (%) 99,9 99,1 99,1 99,1 Условие охлаждения кристалличес кого порошка - Непринудительное охлаждение Дутье воздуха с температурой 20ºC в течение 15 мин Дутье воздуха с температурой 20ºC в течение 40 мин Степень кристалличности (%) 100,0 88,1 91,5 94,1 Уровень динамического поглощения паров (%) <0,01 0,06 <0,01 <0,01 Твердение - + - -

Как видно из таблицы 4, исследуемый образец № 10, приготовленный посредством непринудительного охлаждения после стадий выдерживания и высушивания дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный в результате кристаллизации, характеризовался степенью кристалличности, составляющей 88,1% для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,06%, и он в соответствии с оценкой при использовании исследования твердения был «затвердевшим» (+). Напротив, исследуемый образец № 11, приготовленный благодаря принудительному охлаждению посредством дутья воздуха с температурой 20ºC в течение 15 мин после выдерживания и высушивания дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, характеризовался степенью кристалличности, составляющей 91,5% для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и уровнем динамического поглощения паров, которым был ниже уровня выявления, и он в соответствии с оценкой при использовании исследования твердения был «незатвердевшим» (-). Так же исследуемый образец № 12, приготовленный благодаря принудительному охлаждению посредством дутья воздуха с температурой 20ºC в течение 40 мин после выдерживания и высушивания дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, характеризовался степенью кристалличности, составляющей 94,1% для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и уровнем динамического поглощения паров, которым был ниже уровня выявления, и он в соответствии с оценкой при использовании исследования твердения был «незатвердевшим» (-). Эти результаты означают, что кристаллизации дисперсной композиции может способствовать принудительное охлаждение, а не непринудительное охлаждение, проводимое после стадий выдерживания и высушивания дисперсной композиции, что означает, что принудительное охлаждение предпочтительнее непринудительного охлаждения при приготовлении дисперсной композиции с более высокой степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и более низким уровнем динамического поглощения паров, т.е. почти не способной твердеть дисперсной композиции.

Эксперимент 5

Влияние степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на твердение дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты.

На основе вышеприведенных экспериментов было установлено, что в дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, со степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты вплоть до 99,1% или более, как степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, так и уровень динамического поглощения паров, соответственно, тесно связаны с твердением дисперсной композиции. В этом эксперименте дополнительно исследовалась связь между твердением дисперсной композиции и степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ней.

Эксперимент 5-1

Приготовление исследуемого образца

Исследуемые образцы №№ 13-18, представленные в таблице 5, имеющие различные степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, были приготовлены из водных растворов, содержащих L-аскорбиновую кислоту и декстрин, разновидность крахмального вещества, как описано ниже; и подвергнуты исследованию твердения способом, сходным с таковым, описанным в эксперименте 1-4.

Четыре весовые части «PINEDEX #100», декстрина, превращенного в источник прибыли Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Япония, растворяли в 15 весовых частях воды посредством нагревания. Затем с раствором смешивали три весовые части L-аскорбиновой кислоты. Впоследствии 100 единиц/г декстрина цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы из штамма Tc-62 Geobacillus stearothermophilus и 250 единиц/г декстрина изоамилазы, превращенной в источник прибыли Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Япония, смешивали с вышеуказанным раствором и подвергали ферментативной реакции при сохранении рН результирующего раствора на значении 5,5, а температуры на значении 55ºC в течение 50 часов с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Можно предположить, что в реакционном растворе должны образовываться α-гликозил-L-аскорбиновые кислоты, такие как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота и т.д.

После инактивации ферментов посредством нагревания рН реакционного раствора доводили до pH 4,5, раствор смешивали с 50 единицами/г декстрина «GLUCZYME AF6», название продукта в виде образца глюкоамилазы, превращенного в источник прибыли Amano Enzymes Inc., Aichi, Япония, и подвергали ферментативной реакции в течение 24 часов для гидролиза вышеуказанных α-гликозил-L-аскорбиновых кислот с превращением их в 2-глюкозид аскорбиновой кислоты и гидролиза остальных сопутствующих олигосахаридов с превращением их в D-глюкозу. После реакции реакционный раствор содержал 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продукции, составляющим 39%.

Реакционный раствор нагревали для инактивации глюкоамилазы, обесцвечивали и фильтровали с использованием активированного угля, подвергали хроматографии на колонке с катионообменной смолой (H⁺-формой) для обессоливания, а затем подвергали хроматографии с использованием анионообменной смолы (OH^--формы) для адсорбции L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, с последующей промывкой смолы водой для удаления D-глюкозы и подачей 0,5 н раствора соляной кислоты для осуществления элюирования. Элюат концентрировали до достижения содержания сухого остатка, составляющего приблизительно 50%, а затем подвергали хроматографии на колонке с «DOWEX 50WX4» (Ca²⁺-формой), название продукта в виде сильнокислотного катионита, превращенного в источник прибыли Dow Chemical Company. Элюат, сконцентрированный до достижения содержания сухого остатка, составляющего приблизительно 50%, загружали на колонку в объеме, составляющем приблизительно 1/50 часть объема влажной смолы в колонке, а воду высокого качества подавали в 50-кратном объеме относительно объема загрузки элюата, с линейной скоростью 1 м/час, с последующим разделение результирующего элюата на фракции в виде аликвот объемом 5/100 частей от объема колонки. Впоследствии состав каждой фракции определяли с помощью ВЭЖХ, описанной в эксперименте 1-1, и шесть фракций с содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющим 80%, на основе сухого остатка, или более, собирали и концентрировали в вакууме до достижения концентрации сухого остатка, составляющей приблизительно 76%. Результирующий концентрат помещали в кристаллизатор, смешивали с исследуемым образцом № 1, полученным в эксперименте 1-1, в качестве затравочного кристалла, в количестве, составляющем два процента от содержания сухого остатка, с последующим снижением температуры раствора с 40ºC до 15ºC в течение двух дней в условиях осторожного перемешивания для кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с образованием безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Впоследствии обычным способом готовили исследуемые образцы №№ 13-18, представленные в таблице 5, посредством сбора кристаллов из утфельной массы с помощью центрифуги с подвешивающимися стаканами, промывки кристаллов небольшим количеством дистиллированной воды, выдерживания и высушивания промытых кристаллов, дутья воздуха с температурой, равной 25ºC, в течение 30 мин на подвергнутые выдерживанию и высушиванию кристаллы ради охлаждения и измельчения продукта.

Таблица 5 № исследуемого образца 1 2 13 14 15 16 17 18 19 Степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (%) 99,9 99,1 97,4 98,0 98,6 99,1 99,5 99,7 98,9 Степень кристалличности (%) 100,0 0,0 88,7 89,0 91,6 94,8 99,4 99,5 88,9 Уровень динамического поглощения паров (%) <0,01 1,70 0,07 0,04 0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,03 Твердение - + + ± - - - - ± Устойчивость при хранении -   + + - - - - +

Исследуемые образцы №№ 1 и 2 в таблице 5 были такими же, как исследуемые образцы №№ 1 и 2 в эксперименте 1-1, и степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновая кислота, степени кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и их уровни динамического поглощения паров были скопированы из предыдущих экспериментальных результатов. Кроме того, «AA2G», название продукта в виде дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, превращенной в источник прибыли Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, которая представляет собой традиционный порошок с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, использовался в качестве исследуемого образца № 19. В соответствии со способами, описанными в предыдущих экспериментах, определяли степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, степени кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и уровни динамического поглощения паров исследуемых образцов №№ 13-19, и результаты представлены в таблице 5.

Эксперимент 5-2

Исследование твердения

Твердение исследуемых образцов №№ 13-19, полученных в эксперименте 5-1, исследовали с помощью способа, сходного с таковым, использованным в эксперименте 1-4. Результаты представлены в таблице 5. Результаты исследований твердения исследуемых образцов №№ 1 и 2 в таблице 5 скопированы из таблицы 1.

Эксперимент 5-3

Исследование устойчивость при хранении

Для подтверждения того, что исследование твердения, проводимое в эксперименте 1-4 и т.д., является исследованием, подходящим для оценки способности к твердению дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, в условиях реального хранения, исследуемый образец № 1, полученный в эксперименте 1-1, исследуемые образцы №№ 13-18, полученные в эксперименте 5-1, и исследуемый образец № 19 подвергали исследованию устойчивости при хранении, которое разработано с принятием во внимание условий, окружающей обстановки и периода времени фактического хранения дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты.

Части весом десять килограммов любого из исследуемых образцов №№ 1 и 13-19 помещали соответственно в полиэтиленовые двухслойные мешки (80 мм на 600 мм). Затем каждый мешок помещали в 18-литровую стальную тару способом, который обеспечивает установку открытой части мешка вертикально, обеспечивая нахождение стальной тары без закупоривания и храня в течение 45 дней в условиях температуры окружающей среды и без контролирования влажности. После хранения в течение 45 дней, каждый полиэтиленовый мешок с любым из исследуемых образцов вынимали из тары, и исследуемые образцы извлекали из мешков и помещали на пластину из черной пластмассы для макроскопического исследования их сыпучестей и степеней твердения.

О твердении исследуемых образцов судили по следующим критериям: «затвердевший» (+); слипшаяся масса(ы) выявляется в исследуемом образце, и сыпучесть исследуемого образца уменьшалась по сравнению с таковой в начале исследования. «Незатвердевший» (-); слипшаяся масса(ы) не выявляется в исследуемом образце, и сыпучесть исследуемого образца не изменялась по сравнению с таковой в начале исследования. Форма хранения каждого исследуемого образца при исследовании устойчивости при хранении является формой, одинаковой с таковыми порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством при их коммерческой дистрибуции и хранении, за исключением не закрытия открытой части мешка с помощью резиновой ленты, не помещения в какой-либо десикант и не хранения в стальной таре с крышкой на ней. Вышеуказанные три различия предусматривались для установки условий окружающей среды в случае исследования хранения, которые немного жестче условий при реальной коммерческой дистрибуции и хранении дисперсных композиций. Результаты также представлены в таблице 5.

Как показано в таблице 5, за исключением исследуемого образца № 2, по существу состоящего из аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и исследуемого образца № 19, порошка с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, степени кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в остальных исследуемых образцах №№ 1 и 13-18 обычно увеличивались по мере увеличения степеней чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. При исследовании твердения исследуемые образцы №№ 13 и 14 со степенями чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, соответствующими 97,4% и 98,0%, были в соответствии с оценкой «затвердевшими» (+) или «слегка затвердевшими» (±). Напротив, исследуемые образцы №№ 15-18 со степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющей 98,6-99,7%, были в соответствии с оценкой «незатвердевшими» (-). Эти результаты означают, что пороговое значение степени чистоты 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая влияет на способность твердеть, находится приблизительно у значения 98,0%, и из этого следует вывод, что степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, превышающая 98,0%, не должна требоваться для получения дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая является в соответствии с оценкой при исследовании твердения «незатвердевшей» (-).

Твердение не наблюдалось в исследуемых образцах №№ 15-18, как и в исследуемом образце № 1, хотя степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемых образцах №№ 15-18 равнялись значениям от 98,6% до 99,7%, которые почти равнялись степени чистоты исследуемого образца № 19, порошка с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, со степенью чистоты, составляющей 98,9%, и значительно меньше степени чистоты исследуемого образца № 1, порошка качества реагента, по существу состоящего из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Для справки, степени кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемых образцах №№ 15-18 составляли от 91,6% до 99,5%, а в исследуемом образце № 19, порошке с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, 88,9% до 90%. На основе этих результатов можно заключить, что степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты должно составлять 90% или более, для получения требуемой дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая значительно менее способна твердеть, чем исследуемый образец № 19, порошок с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством.

В случае исследуемых образцов №№ 1 и 13-18 установлена тенденция уменьшения их уровней динамического поглощения паров по мере увеличения степеней чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в них. Исследуемый образец № 13 с уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,07%, был в соответствии с оценкой «затвердевшем» (+), а образцы №№ 14 и 19 с уровнями динамического поглощения паров, соответствующими 0,04% и 0,03%, были в соответствии с оценкой «слегка затвердевшими» (±). Напротив, исследуемый образец № 15 с уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01%, и исследуемые образцы №№ 16-18 с уровнями динамического поглощения паров, которые были ниже предела обнаружения, были в соответствии с оценкой «незатвердевшими» (-). Эти результаты означают, что уровень динамического поглощения паров дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, должен составлять 0,01% или менее для получения дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая значительно меньше способна твердеть, чем исследуемый образец № 19, порошок с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством.

Как представлено в нижней графе таблицы 5, исследуемые образцы №№ 13 и 14 со степенями чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, соответствующими 97,4% и 98,0%, были «затвердевшими» (+) в соответствии с оценкой при исследовании устойчивости при хранении, при котором их хранили в течение 45 дней в мешках в количествах, соответствующих 10 кг/мешок, вроде их фактически коммерциализированной формы продукта. Напротив, исследуемые образцы №№ 15-18 со степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющей от 98,6 до 99,7%, были в соответствии с оценкой «незатвердевшими» (-), аналогично результатам при исследованиях их твердения. Эти данные указывают на то, что исследование твердения, представленное в эксперименте 1-4 и т.д., является исследованием, подходящим для оценки твердения дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, в условиях реального хранения.

Эксперимент 6

Связь между степенью кристалличности и размером кристаллитов дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты.

Как правило, считают, что порошковая частица порошка, содержащего кристаллы, составлена из множества отдельных кристаллов, т.е. порошок состоит из кристаллитов. Предполагается, что чем выше степень кристалличности порошка, тем становится больше размер (диаметр) каждого кристаллита. Считается, что вышеотмеченный размер кристаллита рассчитывают на основе «формулы Шеррера», представленной в виде следующей формулы [6], используя полуширину дифракционного пика и угол дифракции, которые рассчитывают на основе дифракционных картин рентгеновских лучей для порошков. Компьютерное программное обеспечение для расчета такого размера кристаллита установлено в обычном порошковом рентгеноструктурном анализаторе. Были выбраны исследуемый образец № 1, по существу состоящий из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, приготовленный в эксперименте 1; исследуемый образец № 15, дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, приготовленная в эксперименте 5 и характеризующаяся степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и степенью кристалличности его безводной кристаллической формы, которые находятся относительно близко к таковым традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством; и исследуемый образец № 19, используемый в эксперименте 5, традиционный порошок с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, и для них размер кристаллита отдельной порошковой частицы рассчитан с помощью следующего метода.

Формула [6]:

D: размером кристаллита (Å)

λ: длина волны рентгеновских лучей (Å)

β: ширина дифракционной линии (рад)

θ: угол дифракции (º)

K: константа (0,9, когда полуширина (полная ширина на половине максимума) используется для β)

Способ расчета размера кристаллита безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты

Дифракционные картины рентгеновских лучей для порошков, которые использовались для определения аналитическим способом значений для безводных кристаллических 2-глюкозидов аскорбиновой кислоты в соответствующих исследуемых образцах №№ 1, 15 и 19 в эксперименте 1 или 5, использовали в качестве дифракционных картин рентгеновских лучей для порошков ради обеспечения основы для расчета размера кристаллита. Из дифракционных картин, подготовленных в результате исследования вышеуказанных дифракционных картин рентгеновских лучей для порошков, были выбраны дифракционные пики с углами дифракции (2θ), составляющими приблизительно 10,4º, 13,2º, 18,3º, 21,9º и 22,6º, в качестве дифракционных пиков, используемых для расчета размера кристаллита безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и отделимых друг от друга через область с относительно меньшим углом, которая, как признано, оказывает меньшее влияние на ширину дифракционных пиков, явившихся результатом неоднородного напряжения в кристаллите - порошковой частице. Используя «X' pert Highscore Plus», программное обеспечение для аналитической обработки, установленное в порошковом рентгеноструктурном анализаторе, дифракционные картины рентгеновских лучей для порошков в виде соответствующих исследуемых образцов были подвергнуты обработке для определения полуширин и углов дифракции (2θ) пяти выбранных дифракционных пиков, которые затем проверяли на основе определений, полученных с использованием в качестве стандарта кремния («Si640C», стандартного образца для дифракции рентгеновских лучей, предоставляемого National Institute of Standards and Technology (NIST) в США. Используя проверенные по стандарту полуширины и углы дифракции (2θ), размер кристаллита безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в каждом исследуемом образце рассчитывали с помощью программы «формула Шеррера» в компьютерном программном обеспечении. Результаты представлены в таблице 6. Размер кристаллита в каждом исследуемом образце был средним значением расчетных данных для пяти выбранных дифракционных пиков, соответственно. Из таблицы 5 скопированы лишь степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Для правки, поскольку дифракционные картины рентгеновских лучей для порошков в виде исследуемых образцов №№ 15 и 19 характеризовались и та, и другая углами дифракции (2θ) в диапазоне от 4º до 65º в виде четких и резких дифракционных пиков, характерных для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и дифракционные картины достаточно соответствовали дифракционной картине рентгеновских лучей (фиг.1) для порошка в виде исследуемого образца № 1, посчитали целесообразным сравнить исследуемые образцы друг с другом на основе относящихся к ним расчетных данных для размера кристаллита безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, содержащегося в каждом исследуемом образце, на основе дифракционных картин рентгеновских лучей для порошков в виде этих исследуемых образцов.

Таблица 6 № исследуемого образца 1 15 19 Степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (%) 99,9 98,6 98,9 Степень кристалличности (%) 100 91,6 88,9 Размер кристаллита (Å) 1,770 1,440 1,380

Как показано в таблице 6, размер кристаллита безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемом образце № 1 с составляющей 100% степенью кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты составлял в соответствии с расчетом 1770 Å. Размер кристаллита безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемом образце № 15 с составляющей 91,6% степенью кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты составлял в соответствии с расчетом 1440 Å. Кроме того, размер кристаллита безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в исследуемом образце № 19 с составляющей 88,9% степенью кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты составлял в соответствии с расчетом 1380 Å. Чем выше степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, тем становится больше размер кристаллита, и это показывает, что, среди этих трех типов исследуемых образцов, существует связь между степенью кристалличности и размером кристаллита.

Эксперимент 7

Связь между восстановительной способностью и темнением дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

Все исследуемые образцы, использованные в вышеприведенных экспериментах, были дисперсными композициями, содержащими безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, приготовленными из растворов, содержащих 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный благодаря стадии обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы на растворы, содержащие L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество. При использовании такого способа производства результирующие дисперсные композиции будут содержать L-аскорбиновую кислоту и D-глюкозу в качестве сопутствующих веществ, специфичных для способа производства, независимо от количества таких сопутствующих веществ. Поскольку и L-аскорбиновая кислота, и D-глюкоза обладают способностью к восстановлению, дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с изменениями в зависимости от количества L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, могут вызывать невыгодное темнение (окрашивание) конечных продуктов в случае их использования в продуктах, содержащих соединения с аминогруппой, такие как белки и аминокислоты. В частности, поскольку L-аскорбиновая кислота обладает относительно высокой активностью вступления в реакцию с кислородом, предполагается, что L-аскорбиновая кислота должна являться причиной вызова не только неблагоприятного окрашивания продуктов, содержащих ее, но также является причиной окрашивания самих традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, которое обычно временами наблюдали, когда традиционные порошки с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством хранили в течение относительно длительного периода времени.

Соответственно, в этом эксперименте, используя исследуемые образцы №№ 1 и 15-19, которые использовались в предыдущих экспериментах, исследовали связь между общим содержанием L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозой, содержанием L-аскорбиновой кислоты, и восстановительной способностью всей дисперсной композиции и окрашиванием с помощью экспресс-испытания термообработки в соответствии со следующими процедурами.

Сто и пятьдесят миллиграмм каждого исследуемого образца отвешивали и помещали в 10-мл пробирку с завинчивающейся крышкой, и пробирки в закрытом состоянии с помощью завинчивающейся крышки помещали в «DRYING-OVEN SA310», название продукта - печи, превращенной в источник прибыли Masuda Corp., Osaka, Япония, и нагревали при 80ºC в течение трех дней. Впоследствии, после снятия завинчивающихся крышек с пробирок, добавляли три миллилитра деионизированной воды в каждую пробирку для растворения образцов. Оптическую плотность результирующих растворов определяли при 400 нм, используя «UV-2400PC», название продукта - спектрофотометра, превращенного в источник прибыли Shimadzu Corp., Kyoto, Япония. О степени окрашивания, вызванного нагреванием, судили на основе следующих двух критериев. Когда оптическая плотность при длине волны, составляющей 400 нм, составляет менее 0,50, образец считается «непотемневшим или по существу не потемневшим» (-); а, когда оптическая плотность при длине волны, составляющей 400 нм, составляет 0,50 или более, образец считается «потемневшим» (+). Результаты представлены в таблице 7.

Общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы в каждом исследуемом образце определяли с помощью ВЭЖХ, описанной в эксперименте 1-1. Восстановительную способность всей дисперсной композиции каждого исследуемого образца определяли посредством измерения количеств восстанавливающих сахаров и всех сахаров по методу Шомоди-Нельсона и методу с использованием антрона в серной кислоте, обычно используемым в данной области техники, соответственно, используя D-глюкозу в качестве стандартного вещества, и расчета восстановительной способности посредством подстановки данных в вышеприведенную формулу 3. Общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, содержание L-аскорбиновой кислоты, и восстановительная способность всей дисперсной композиции для каждого образца представлены в таблице 7.

Таблица 7 № исследуемого образца 1 15 16 17 18 19 Состав (%), на основе сухого остатка 2-глюкозид аскорбиновой кислоты 99,9 98,6 99,1 99,5 99,7 98,9 Общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы (содержание L-аскорбиновой кислоты) 0,0 (0,0) 0,2 (0,1) 0,1 (<0,1) 0. 1 (<0,1) <0,1 (0,0) 0,3 (0,2) Другие компоненты 0,1 1,2 0,8 0,4 0,3 0,8 Восстановительная способность всей дисперсной композиции (%) 0,05 0,98 0,86 0,20 0,12 1,12 Темнение - - - - - +

Как показано в таблице 7, в дисперсных композициях, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, содержания L-аскорбиновой кислоты и D-глюкоза в исследуемом образце № 1, порошке качества реагента, по существу состоящем из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляли до менее чем пределы их обнаружения. Напротив, L-аскорбиновая кислота и/или D-глюкоза были обнаружены во всех исследуемых образцах №№ 12-18 в виде дисперсных композиций, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения и в исследуемом образце № 19, традиционном порошке с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством. В случае таких порошков, как видно из исследуемых образцов №№ 15-18, образцы с общим содержанием L-аскорбиновой кислоты и D-глюкоза, не превышающим 0,2%, на основе сухого остатка, считались «не потемневшими или по существу не потемневшими» (-); тогда как, как видно из исследуемого образца № 19, образец с общим содержанием L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, достигающим 0,3%, на основе сухого остатка, считался «потемневшим» (+). Что касается L-аскорбиновой кислоты, которая, как считается, сильнее связана с окрашиванием порошков, как видно из исследуемых образцов №№ 15-18, образцы, в которых общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы составляет 0,2% или менее, на основе сухого остатка, считались «не потемневшими или по существу не потемневшими» (-); тогда как, как видно из исследуемого образца № 19, образец, в котором общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, достигает 0,3%, на основе сухого остатка, считался «потемневшим» (+). Для справки, как уже отмечалось, поскольку L-аскорбиновая кислота обладает относительно высокой активностью вступления в реакцию с кислородом и связана с окрашиванием дисперсных композиций, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, нет опасения вызова окрашивания в композиции с содержанием L-аскорбиновой кислоты, не превышающим 0,1%, на основе сухого остатка, даже после хранения в течение относительно длительного периода времени в форме продукта в виде традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством.

В смысле восстановительной способности, как видно из исследуемых образцов №№ 15-18, образцы с восстановительной способностью всей дисперсной композиции, составляющей менее одного процента, считались «не потемневшими или по существу не потемневшими» (-). Напротив, как видно из исследуемого образца № 19, исследуемые образцы с восстановительной способностью всей дисперсной композиции, превышающей один процент, считались «потемневшими» (+). Эти результаты полностью соответствовали вышеприведенным результатам, полученным посредством оценки по показателю общего содержания L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы.

Вышеприведенные результаты означают, что дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, без опасения вызова окрашивания можно получить посредством установления восстановительной способности всей дисперсной композиции на уровне, составляющем менее одного процента, даже несмотря на то, что они неизбежно содержат L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу на обнаруживаемом уровне вследствие способов их производства. Учитывая оба аспекта окрашивания не только конечных продуктов, приготовленных с использованием дисперсных композиций, но также дисперсных композиций как таковых, вышеприведенные результаты свидетельствуют о том, что содержание L-аскорбиновой кислоты в дисперсных композициях должно предпочтительно составлять 0,1%, на основе сухого остатка, или менее.

Следующие примеры детальнее поясняют настоящее изобретение, но настоящее изобретение не должно ограничиваться этими примерами.

Пример 1

Приготовление неочищенного раствора цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы

Штамм Tc-62 Geobacillus stearothermophilus (FERM BP-11143, номер депонирования в National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology) культивировали с использованием «NUTRIENT AGAR», среды для культивирования на скошенном агаре, превращенной в источник прибыли Difco Laboratories, Inc., при 50ºC в течение двух дней. Одну петлю подвергнутых культивированию клеток, полученных из среды для культивирования на скошенном агаре, инокулировали в жидкую среду для посевной культуры, содержащую 2% растворимого крахмала, 0,5% хлорида аммония, 0,05% вторичного кислого фосфата калия, 0,025% сульфата магния и 0,5% карбоната кальция, культивировали при 50ºC в течение трех дней со встряхиванием. Результирующую посевную культуру инокулировали в среду для основной культуры, имеющую тот же состав, что и среда для посевной культуры, за исключением замены растворимого крахмала декстрином, и в дальнейшем культивировали при 50ºC в течение трех дней со встряхиванием. Клетки удаляли из результирующей культуры посредством центрифугирования, а результирующий супернатант концентрировали с использованием UF-мембраны вплоть до достижения объема, составляющего приблизительно 1/18 от него, для получения неочищенного раствора цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы.

Приготовление дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

Четыре весовые части ожиженного картофельного крахмала растворяли в 20 весовых частях воды посредством нагревания, и раствор смешивали с тремя весовыми частями L-аскорбиновой кислоты, и доводили до pH 5,5 для использования в качестве раствора субстрата. Раствор субстрата смешивали с вышеуказанным неочищенным раствором фермента цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы в количестве 100 единиц/г сухого остатка ожиженного картофельного крахмала и изоамилазой, производства Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Япония, в количестве 250 единиц/г сухого остатка ожиженного картофельного крахмала и подвергали ферментативной реакции при 55ºC в течение 40 часов с образованием, вместе с 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, таких как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота.

После инактивации фермента посредством нагревания рН раствора доводили до pH 4,5, раствор смешивали с «GLUCZYME AF6», название продукта в виде образца глюкоамилазы (6000 единиц/г), превращенного в источник прибыли Amano Enzymes Inc., Aichi, Япония, в количестве 50 единиц/г сухого остатка ожиженного картофельного крахмала и подвергали реакции при 55ºC в течение 24 часов для деградации α-гликозил-L-аскорбиновых кислот с превращением их в 2-глюкозид аскорбиновой кислоты и деградации сопутствующих сахаридов с превращением их в D-глюкозу. Выход продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционном растворе составлял приблизительно 39%. Реакционный раствор содержал 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту и 6-O-α- глюкозил-L-аскорбиновую кислоту при общем содержании, составляющем приблизительно 0,1%, на основе сухого остатка.

После инактивации фермента посредством нагревания раствор обесцвечивали и фильтровали с использованием активированного угля, и фильтрат обессоливали с использованием катионообменной смолы (H⁺-формы). Затем обеспечивали адсорбцию L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в подвергнутом обессоливанию растворе на анионообменной смоле (OH^--форме), осуществляли промывку смолы водой для удаления D-глюкозы и осуществляли элюирование с помощью 0,5 н раствора соляной кислоты. Элюат концентрировали до достижения концентрации сухого остатка, составляющей приблизительно 50%, и подвергали хроматографии с псевдодвижущимся слоем на 10 колонках, упакованных «DIAION UBK550» (Na⁺-формой), название продукта в виде сильнокислотного катионита, превращенного в источник прибыли Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Япония. Элюат, сконцентрированный до достижения концентрации сухого остатка, составляющей приблизительно 50%, загружали на колонку в объеме, составляющем приблизительно 1/40 часть от объема влажной смолы, а элюент подавали в 15-кратном объеме относительно этого объема, подаваемом для элюирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, с последующим сбором фракции, обогащенной 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, но обедненной в отношении L-аскорбиновой кислоты. Эта фракция содержала 92,2% 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, на основе сухого остатка.

Затем фракцию концентрировали под вакуумом с превращением в приблизительно 72% концентрат, который затем помещали в кристаллизатор и смешивали с «2-ГЛЮКОЗИДОМ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ 999» (кодовый № AG124, степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,9% или более), название продукта в виде дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, превращенной в источник прибыли в качестве аналитического стандартного реактива Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, в качестве затравочного кристалла, в количестве, составляющем два процента от содержания сухого остатка. Затем раствор смеси доводили до 40ºC и постепенно охлаждали до 15ºC в течение двух дней в условиях осторожного перемешивания для кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с образованием безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Кристаллы собирали с использованием центрифуги с подвешивающимися стаканами, промывали посредством разбрызгивания небольшого количества холодной воды высокого качества, выдерживали и высушивали при 38ºC в течение трех часов, охлаждали с помощью дутья воздуха с температурой 25ºC в течение 45 мин и измельчали с получением дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая характеризовалась составляющей 99,5% степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющим 0,1% общим содержанием L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, составляющим менее 0,1% содержанием L-аскорбиновой кислоты, составляющей 97,0% степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и составляющей 0,25% общей восстановительной способностью всей дисперсной композиции. Уровень динамического поглощения паров дисперсной композиции был ниже предела обнаружения. После определения распределения частиц дисперсная композиция содержала частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 91,2%, и частицы с размером частиц, составляющим 53 мкм или более, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 50,2%. После подвергания таким же, как в экспериментах 1-4 и 7, исследованиям твердения и темнения, соответственно, дисперсную композицию считали «незатвердевшей» (-) при исследовании твердения и «непотемневшей или по существу не потемневшей» (-) при исследовании темнения.

Дисперсной композицией легко манипулировать, поскольку она почти не твердеет и характеризуется меньшей окрашиваемостью по сравнению с «AA2G», название продукта - традиционного порошка с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, превращенного в источник прибыли Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, обычно в качестве отбеливающего кожу ингредиента с качеством, подходящим для применения в лечебно-профилактической косметике, и т.д. Поскольку дисперсная композиция не отличается от традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством в том смысле, что она представляет собой дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, как и в случае вышеуказанных традиционных порошков, ее можно использовать отдельно или в комбинации с другими ингредиентами в качестве порошкообразного материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики, лекарственных препаратов и т.д. Поскольку она характеризуется составляющим 0,1% или менее содержанием L-аскорбиновой кислоты, нет опасения вызова окрашивания в дисперсной композиции как таковой даже в случае хранения композиции в течение относительно длительного периода времени в форме продукта, одинаковой с таковыми традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством.

Пример 2

Приготовление неочищенного раствора цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы

Неочищенный раствор цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы готовили так же, как в примере 1, за исключением использования штамма Tc-27 Geobacillus stearothermophilus (FERM BP-11142, номер депонирования в National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology) вместо штамма Tc-62 Geobacillus stearothermophilus.

Приготовление дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

Пять весовых частей кукурузного крахмала добавляли к 15 весовым частям воды и затем растворяли в них посредством нагревания после добавления коммерциализированного разжижающего фермента. Результирующий раствор смешивали с тремя весовыми частями L-аскорбиновой кислоты и доводили до pH 5,5 для обеспечения раствора субстрата. К раствору субстрата добавляли вышеуказанный неочищенный раствор цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и изоамилазу, производства Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Япония, в количествах, составляющих 100 единиц и 1000 единиц/г сухого остатка кукурузного крахмала, соответственно, с последующей ферментативной реакцией при 55ºC в течение 50 часов с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и других α-гликозил-L-аскорбиновых кислот.

После инактивации фермента посредством нагревания рН реакционного раствора доводили до pH 4,5, раствор смешивали с «GLUCOZYME #20000», название продукта в виде образца глюкоамилазы с активностью 20000 единиц/г, превращенного в источник прибыли Nagase ChemteX Corp., Osaka, Япония, в количестве 50 единиц/г сухого остатка кукурузного крахмала и подвергали реакции при 55ºC в течение 24 часов для деградации α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, таких как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота, с превращением их в 2-глюкозид аскорбиновой кислоты и деградации сопутствующих сахаридов с превращением их в D-глюкозу. Результирующий реакционный раствор содержал 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продукции, составляющим приблизительно 37%. Также реакционный раствор содержал 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту и 6-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту при общем содержании, составляющем приблизительно 0,2%.

После инактивации фермента посредством нагревания реакционный раствор обесцвечивали и фильтровали с использованием активированного угля. Фильтрат обессоливали с использованием катионообменной смолы (H⁺-формы) и подавали на анионообменную смолу (OH^--форму) для адсорбции на ней L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, с последующей промывкой анионообменной смолы водой для удаления D-глюкозы и подачей на смолу 0,5 н раствора соляной кислоты для элюирования. Элюат подавали на хроматографическую колонку с «TOYOPEARL HW-40», название продукта - пористой смолы Tosoh Corp., Tokyo, Япония, с получением фракции, обогащенной 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, но обедненной в отношении L-аскорбиновой кислоты. Полученная фракция содержала 89,5%, на основе сухого остатка, 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, на основе сухого остатка.

Фракцию концентрировали под вакуумом с превращением в приблизительно 76% концентрат, который затем помещали в кристаллизатор и смешивали с дисперсной композицией, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, приготовленной в примере 1, в качестве затравочного кристалла, в количестве, составляющем два процента от содержания сухого остатка. Впоследствии результирующую смесь нагревали до 40ºC, а затем постепенно охлаждали до 15ºC в течение двух дней в условиях осторожного перемешивания для кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с образованием безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Кристаллы собирали с использованием центрифуги с подвешивающимися стаканами, промывали посредством разбрызгивания небольшого количества дистиллированной воды, выдерживали и высушивали продукт при 35ºC в течение восьми часов, охлаждали с помощью дутья воздуха с температурой 25ºC в течение 15 мин на продукт и измельчали охлажденный продукт с получением дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая характеризовалась составляющей 99,2% степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющим менее 0,1% общим содержанием L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, составляющим менее 0,1% содержанием L-аскорбиновой кислоты, составляющей 94,4% степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и составляющей 0,15% общей восстановительной способностью всей дисперсной композиции. Уровень динамического поглощения паров дисперсной композиции был ниже предела обнаружения. С помощью определения распределения частиц дисперсной композиции выявлено, что она содержала частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 83,2%, и частицы с размером частиц, составляющим 53 мкм или более, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 57,1%. После подвергания таким же, как в экспериментах 1-4 и 7, исследованиям твердения и темнения, соответственно, дисперсную композицию считали «незатвердевшей» (-) при исследовании твердения и «непотемневшей или по существу не потемневшей» (-) при исследовании темнения.

Дисперсной композицией легко манипулировать, поскольку она почти не твердеет и характеризуется меньшей окрашиваемостью по сравнению с традиционным «AA2G», название продукта в виде дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, превращенного в источник прибыли Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, с качеством, подходящим для применения в лечебно-профилактической косметике, в качестве отбеливающего кожу ингредиента и т.д. Поскольку дисперсная композиция не отличается от традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством в том смысле, что она представляет собой дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, ее можно использовать отдельно или в комбинации с другими ингредиентами в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики, лекарственных препаратов и т.д., как и вышеуказанные традиционные порошки. Поскольку дисперсная композиция характеризуется составляющим 0,1% или менее содержанием L-аскорбиновой кислоты, нет опасения вызова окрашивания в дисперсной композиции как таковой даже в случае хранения композиции в течение относительно длительного периода времени в форме продукта, одинаковой с таковыми традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством.

Пример 3

Приготовление мутантной цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы

Был клонирован ген цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы штамма Tc-91 Geobacillus stearothermophilus (известного как Bacillus stearothermophilus согласно прежней классификации), и определена аминокислотная последовательность зрелой формы цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы (SEQ ID NO:1) на основе нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO:2). Известно, что в аминокислотной последовательности зрелой формы цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы содержатся четыре консервативных района, которые, как общепризнано, обычно существуют у ферментов, отнесенных к семейству α-амилаз. Пространственная структура белка цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы уже определена с помощью рентгеновской кристаллографии и, как установлено, содержит четыре домена A, B, C и D, представленных на фиг.5 (смотрите “Kogyo-yo-Toshitsu-Koso-Handbook”, pp. 56-63, Kodansha Scientific K.K. Ed., Tokyo, Japan (1999)). Были идентифицированы три каталитические группы цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы, т.е. аспарагиновая кислота в положении 225 (D225), глютаминовая кислота в положении 253 (E253) и аспарагиновая кислота в положении 324 (D324) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 (смотрите "Kogyo-yo-Toushitsu-Koso-Handbook", pp. 56-63, Kodansha Scientific K.K. Ed., Tokyo, Japan (1999)). Фиг.6 является схематическим представлением первичной структуры цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы. В результате индукции мутации в ДНК гена цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы с помощью следующих процедур была получена мутантная цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза, характеризующаяся большей продуктивностью 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, чем таковая в случае цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы дикого типа.

Ген цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза штамма Tc-91 Geobacillus stearothermophilus (депонированного под входящим номером FERM P-2225 и в соответствии с процедурой международного депонирования с входящим номером FERM ABP-11273 в International Patent Organism Depositary в National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), поддерживаемого авторами настоящего изобретения, был мутирован в результате вовлечения или делетирования сайтов расщепления рестрикционными ферментами без изменения аминокислотной последовательности цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и воссоединен с плазмидным вектором с превращением в рекомбинантную ДНК, содержащую ген, кодирующий цикломальтодекстрин-глюканотрансферазу дикого типа. Структура рекомбинантной ДНК, «pRSET-iBTC12», представлена на фиг.7. Фрагменты гена (NdeI-EcoT22I-фрагменты), содержащие район, кодирующий активный центр цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы дикого типа, в вышеуказанной рекомбинантной ДНК были получены посредством расщепления рекомбинантной ДНК, и продукты были подвергнуты неспецифическому мутированию in vitro, используя «GeneMorph PCR Mutagenesis Kit» (название продукта в виде набора для мутирования с использованием ПЦР, превращенного в источник прибыли Stratagene Company). Мутированные фрагменты встраивали в исходную рекомбинантную ДНК для приготовления смеси генов, которые кодируют варианты цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы с различными заменами аминокислот. Рекомбинантные ДНК получали посредством воссоединения вариантов гена с экспрессионным плазмидным вектором. Используя рекомбинантные ДНК, трансформировали колиподобные бактериальные клетки с получением библиотеки генов, кодирующих варианты цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы.

Свыше 13000 штаммов трансформантов были выделены из библиотеки генов и подвергнуты культивированию для наращивания клеток, и на их основе были приготовлены лизаты в качестве неочищенных ферментов, содержащих варианты цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы. Обеспечивали действие неочищенных ферментов на водный раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и продукты частичного гидролиза крахмала, с образованием α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, которые затем обрабатывали глюкоамилазой для образования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. В результате сравнения выходов продукции α-гликозил-L-аскорбиновых кислот с таковым при использовании цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы дикого типа были отобраны трансформанты, способные продуцировать мутантную цикломальтодекстрин-глюканотрансферазу, характеризующуюся большей продуктивностью 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. В результате был получен требуемый трансформант, имеющий ген требуемой мутантной цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы. Нуклеотидная последовательность мутантного гена цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы трансформанта была расшифрована, и установлено, что остаток лизина в положении 228 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 был заменен остатком глютаминовой кислоты.

Трансформант, содержащий ген или ДНК, кодирующий вышеуказанную мутантную цикломальтодекстрин-глюканотрансферазу, культивировали с использованием T-среды, содержащей 100 мкл/мл натрия ампициллина (содержащей 12 г бактотриптона, 24 г бакто-дрожжевого экстракта, 5 мл глицерина, 17 мМ первичный кислый фосфат калия и 72 мМ вторичный кислый фосфат калия на л среды) при 37ºC в течение 24 часов в аэробных условиях. Клетки, собранные из культуры с помощью центрифугирования, разрушали с помощью «ULTRA SONIC HOMOGENIZER UH-600» (ультразвукового дезинтегратора производства SMT Co., Ltd.), и супернатант обрабатывали нагреванием при 60ºC в течение 30 мин для инактивации или денатурации неустойчивых к нагреванию белков, присущих клеткам-хозяевам. Подвергнутый нагреванию супернатант далее центрифугировали с приготовлением частично очищенного образца мутантной цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы.

Приготовление дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

Пять весовых частей картофельного крахмала смешивали с 15 весовыми частями воды и затем растворяли в них посредством нагревания после добавления коммерциализированного разжижающего крахмал фермента. Раствор смешивали с тремя весовыми частями L-аскорбиновой кислоты и доводили до pH 5,5 для обеспечения раствора субстрата. Раствор субстрата смешивали с частично очищенной мутантной цикломальтодекстрин-глюканотрансферазой, полученной с помощью вышеприведенного способа, в количестве, составляющем 20 единиц/г картофельного крахмала, и осуществляли реакцию при 65ºC в течение 72 часов с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и α-гликозил-L-аскорбиновых кислот. Впоследствии реакционную смесь нагревали для инактивации остающейся мутантной цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы. К раствору добавляли «GLUCOZYME #20000» (название продукта в виде глюкоамилазы с активностью 20000 единиц/г, превращенного в источник прибыли Nagase ChemteX Corp., Osaka, Япония) в количестве 100 единиц/г картофельного крахмала, с последующей ферментативной реакцией при рН 5,0 и 40ºC в течение приблизительно 18 часов для деградации α-гликозил-L-аскорбиновых кислот с превращением их в 2-глюкозид аскорбиновой кислоты и деградации сопутствующих сахаридов с превращением их в D-глюкозу. Реакционный раствор содержал 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продукции, составляющим приблизительно 40%, и он содержал 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту и 6-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту при общем содержании, составляющем приблизительно 0,3%.

После инактивации остающейся глюкоамилазы посредством нагревания реакционный раствор обесцвечивали и фильтровали с использованием активированного угля, и фильтрат концентрировали и подавали на анионообменную смолу (OH^--форму) для адсорбции на ней L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, с последующей промывкой смолы водой для удаления D-глюкозы и допуском осуществления элюирования с помощью 0,5 н раствора соляной кислоты. Как и в примере 1, результирующий элюат подавали на колонку с сильнокислотным катионитом для хроматографии с псевдодвижущимся слоем с получением фракции, обогащенной 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, но обедненной в отношении L-аскорбиновой кислоты. Полученная фракция содержала 90,4%, на основе сухого остатка, 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

После обессоливания с использованием катионообменной смолы (H⁺-формы) фракцию концентрировали под вакуумом с превращением в приблизительно 75% концентрат, который затем помещали в кристаллизатор и смешивали с дисперсной композицией, содержащей 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, приготовленной в примере 1, в качестве затравочного кристалла, в количестве, составляющем два процента от содержания сухого остатка. Впоследствии концентрат доводили до 45ºC и постепенно охлаждали до 10ºC в течение двух дней в условиях осторожного перемешивания для кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с образованием безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Кристаллы собирали, промывали посредством разбрызгивания небольшого количества холодной деионизированной воды, выдерживали и высушивали при 38ºC в течение трех часов, непринудительно охлаждали в течение ночи и измельчали с получением дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая характеризовалась составляющей приблизительно 98,8% степью чистоты, содержала менее 0,1% L-аскорбиновой кислота и D-глюкозы в общей сложности, содержала менее 0,1% L-аскорбиновой кислоты, характеризовалась составляющей 93,5% степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и характеризовалась составляющей 0,31% общей восстановительной способностью всей дисперсной композиции. Уровень динамического поглощения паров дисперсной композиции был ниже предела обнаружения. С помощью определения распределения частиц дисперсной композиции выявлено, что она содержала частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 93,1%, и частицы с размером частиц, составляющим 53 мкм или более, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 48,2%. После подвергания таким же, как в экспериментах 1-4 и 7, исследованиям твердения и темнения, соответственно, дисперсную композицию считали «незатвердевшей» (-) при исследовании твердения и «непотемневшей или по существу не потемневшей» (-) при исследовании темнения.

Дисперсной композицией легко манипулировать, поскольку она почти не твердеет и характеризуется меньшей окрашиваемостью по сравнению с традиционным «AA2G», название продукта в виде дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, превращенного в источник прибыли Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, с качеством, подходящим для применения в лечебно-профилактической косметике, в качестве отбеливающего кожу ингредиента и т.д. Поскольку дисперсная композиция не отличается от традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством в том смысле, что она представляет собой дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, ее можно использовать отдельно или в комбинации с другими ингредиентами в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики, лекарственных препаратов и т.д., как и вышеуказанные традиционные порошки. Поскольку дисперсная композиция характеризуется составляющим 0,1% или менее содержанием L-аскорбиновой кислоты, нет опасения вызова окрашивания в дисперсной композиции как таковой даже в случае хранения в течение относительно длительного периода времени в форме продукта, одинаковой с таковыми традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством.

Пример 4

Приготовление дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

Ферментативную реакцию проводили способом, схожим с таковым, описанным в примере 3, за исключением обеспечения действия 500 единиц/г сухого остатка крахмала изоамилазы (производства Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Япония) на крахмал при 55ºC вместе с цикломальтодекстрин-глюканотрансферазой. После обработки глюкоамилазой реакционный раствор содержал 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продукции, составляющим приблизительно 45%. Реакционный раствор содержал 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту и 6-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту при общем содержании, составляющем приблизительно 0,2%. Реакционный раствор подвергали очистке, схожей с таковой в примере 3, для получения фракции с составляющим 91,8% содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, на основе сухого остатка.

После осуществления кристаллизации способом, схожим с таковым, описанным в примере 3, результирующие кристаллы собирали, промывали посредством разбрызгивания небольшого количества холодной деионизированной воды, выдерживали и высушивали при 38ºC в течение трех часов, непринудительно охлаждали в течение ночи и измельчали с получением дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая характеризовалась составляющей 99,2% степенью чистоты, содержала менее 0,1% L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы в общей сложности, содержала менее 0,1% L-аскорбиновой кислота, характеризовалась составляющей 95,6% степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и характеризовалась составляющей 0,25% общей восстановительной способностью. Уровень динамического поглощения паров дисперсной композиции был ниже предела обнаружения. С помощью определения распределения частиц дисперсной композиции выявлено, что она содержала частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 92,7%, и частицы с размером частиц, составляющим 53 мкм или более, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 44,2%. После подвергания таким же, как в экспериментах 1-4 и 7, исследованиям твердения и темнения, соответственно, дисперсную композицию считали «незатвердевшей» (-) при исследовании твердения и «непотемневшей или по существу не потемневшей» (-) при исследовании темнения.

Дисперсной композицией легко манипулировать, поскольку она почти не твердеет и меньше окрашивается по сравнению с традиционным «AA2G», название продукта в виде дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, превращенного в источник прибыли Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, с качеством, подходящим для применения в лечебно-профилактической косметике, в качестве отбеливающего кожу ингредиента и т.д. Поскольку дисперсная композиция не отличается от традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством в том смысле, что она представляет собой дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, ее можно использовать отдельно или в комбинации с другими ингредиентами в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики, лекарственных препаратов и т.д., как и вышеуказанные традиционные порошки. Поскольку дисперсная композиция характеризуется составляющим 0,1% или менее содержанием L-аскорбиновой кислоты, нет опасения вызова окрашивания в дисперсной композиции как таковой даже в случае хранения композиции в течение относительно длительного периода времени в форме продукта, одинаковой с таковыми традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством.

Пример 5

Приготовление дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

Пять весовых частей картофельного крахмала добавляли к 15 весовым частям воды и затем растворяли в них посредством нагревания после добавления коммерциализированного разжижающего крахмал фермента. Раствор смешивали с тремя весовыми частями L-аскорбиновой кислоты и доводили до pH 5,5 для обеспечения раствора субстрата. Раствор субстрата смешивали с цикломальтодекстрин-глюканотрансферазой (производства Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, происходящей из штамма Tc-91 Geobacillus stearothermophilus (депонированного под входящим номером FERM P-2225 и в соответствии с процедурой международного депонирования с входящим номером FERM ABP-11273 в International Patent Organism Depositary в National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) и изоамилазой (производства Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Япония) в количествах, составляющих 100 единиц и 1000 единиц на грамм картофельного крахмала, соответственно, и подвергали реакции при 55ºC в течение 50 часов с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и других α-гликозил-L-аскорбиновых кислот. После инактивации ферментов посредством нагревания реакционный раствор доводили до pH 4,5, смешивали с «GLUCOZYME #20000», название продукта - глюкоамилазы с активностью 20000 единиц/г, превращенного в источник прибыли Nagase ChemteX Corp., Osaka, Япония, в количестве 50 единиц на грамм картофельного крахмала, подвергали реакции при 55ºC в течение 24 часов для деградации α-гликозил-L-аскорбиновых кислот с превращением их в 2-глюкозид аскорбиновой кислоты и деградации сопутствующих сахаридов с превращением их в D-глюкозу. Выход продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты составлял приблизительно 38%, на основе сухого остатка. Реакционный раствор содержал 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту и 6-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту при общем содержании, составляющем приблизительно 0,4%, на основе сухого остатка.

После инактивации фермента посредством нагревания реакционный раствор обесцвечивали и фильтровали с использованием активированного угля. Фильтрат обессоливали с использованием катионообменной смолы (H⁺-формы) и подвергали хроматографии с использованием анионообменной смолы (OH^--формы) для адсорбции на ней L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, с последующей промывкой смолы водой для удаления D-глюкозы и элюированием адсорбировавшихся ингредиентов с помощью 0,5 н соляной кислоты. Элюент подавали на хроматографическую колонку с «TOYOPEARL HW-40», название продукта пористой - смолы Tosoh Corp., Tokyo, Япония, с получением фракции, обогащенной 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, но обедненной в отношении L-аскорбиновой кислоты. Полученная фракция содержала 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве 87,6%, на основе сухого остатка.

После концентрирования фракции под вакуумом до достижения составляющей приблизительно 76% концентрации концентрат помещали в кристаллизатор, смешивали с дисперсной композицией, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, приготовленной в примере 1, в качестве затравочного кристалла, в количестве, составляющем два процента от содержания сухого остатка, доводили до 40ºC, постепенно охлаждали до 15ºC в течение двух дней в условиях осторожного перемешивания для кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с образованием безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Кристаллы собирали с использованием центрифуги с подвешивающимися стаканами, промывали посредством разбрызгивания небольшого количества дистиллированной воды, выдерживали и высушивали при 35ºC в течение восьми часов, охлаждали с помощью дутья воздуха с температурой 20ºC в течение 10 мин и измельчали с получением дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты. Дисперсная композиция характеризовалась составляющей 98,5% степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, содержала менее 0,1% L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы в общей сложности, содержала менее 0,1% L-аскорбиновой кислоты, характеризовалась составляющей 94,8% степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и составляющей 0,15% общей восстановительной способностью всей дисперсной композиции. Уровень динамического поглощения паров для дисперсной композиции был ниже предела обнаружения. С помощью определения распределения частиц дисперсной композиции выявлено, что она содержала частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 83,0%, и частицы с размером частиц, составляющим 53 мкм или более, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 57,7%. После подвергания таким же, как в экспериментах 1-4 и 7, исследованиям твердения и темнения, соответственно, дисперсную композицию считали «незатвердевшей» (-) при исследовании твердения и «непотемневшей или по существу не потемневшей» (-) при исследовании темнения.

Дисперсной композицией легко манипулировать, поскольку она почти не твердеет и меньше окрашивался по сравнению с традиционным «AA2G», название продукта в виде дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, превращенного в источник прибыли Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, с качеством, подходящим для применения в лечебно-профилактической косметике, в качестве отбеливающего кожу ингредиента и т.д. Поскольку дисперсная композиция не отличается от традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством в том смысле, что она представляет собой дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, ее можно использовать отдельно или в комбинации с другими ингредиентами в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики, лекарственных препаратов и т.д., как и вышеуказанные традиционные порошки. Поскольку дисперсная композиция характеризуется составляющим 0,1% или менее содержанием L-аскорбиновой кислоты, нет опасения вызова окрашивания в дисперсной композиции как таковой даже в случае хранения композиции в течение относительно длительного периода времени в форме продукта, одинаковой с таковыми традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством.

Сравнительный пример 1

Приготовление дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты

За исключением не использования изоамилазы, дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, готовили способом, одинаковым с таковым, используемым в примере 5, используя цикломальтодекстрин-глюканотрансферазу из штамма Tc-91 Geobacillus stearothermophilus (депонированного под входящим номером FERM P-2225 и в соответствии с процедурой международного депонирования с входящим номером ABP-11273 в International Patent Organism Depositary в National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) производства Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония. Выход продукции 2-глюкозида аскорбиновой кислоты после обработки глюкоамилазой составлял приблизительно 28%. Реакционный раствор содержал 5-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту и 6-O-α-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту при общем содержании, составляющем приблизительно 1,0%, на основе сухого остатка. Так же как и в примере 5, реакционный раствор обесцвечивали, обессоливали и подвергали очистке с получением фракции, обогащенной 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты. Полученная фракция содержала 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве, составляющем 87,7%, на основе сухого остатка.

Так же как и в примере 5, фракцию, обогащенную 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, концентрировали для кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и результирующие кристаллы собирали, выдерживали, высушивали и охлаждали с получением дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая характеризовалась составляющей 98,5% степенью чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, содержала 0,4% L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы в общей сложности, содержала 0,2% L-аскорбиновой кислоты, характеризовалась составляющей 89,1% степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и составляющей 1,17% общей восстановительной способностью всей дисперсной композиции. Уровень динамического поглощения паров для дисперсной композиции составлял 0,04%. С помощью определения распределения частиц дисперсной композиции выявлено, что она содержала частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 78,1%, и частицы с размером частиц, составляющим 53 мкм или более, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 50,2%.

После подвергания таким же, как в экспериментах 1-4 и 7, исследованиям твердения и темнения, соответственно, дисперсную композицию считали «затвердевшей» (+) при исследовании твердения и «потемневшей» (+) при исследовании темнения. Поскольку дисперсная композиция характеризуется составляющей менее 90% степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,04%, который выше 0,01%, она может приводить к твердению во время периода времени ее дистрибуции и хранения, и это могло бы неизбежно вызвать серьезные проблемы при ее использовании в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики, лекарственных препаратов и т.д.

Поскольку дисперсная композиция характеризуется содержанием L-аскорбиновой кислоты вплоть до 0,2%, существует опасение вызова окрашивания в дисперсной композиции как таковой во время периода времени коммерческой дистрибуции и хранения.

Исследование устойчивости при хранении

Устойчивости при хранении дисперсных композиций, содержащий безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученных в примерах 1-5 и сравнительном примере 1, исследовали с помощью способа, одинакового с таковым, использованным в эксперименте 5-3. Результаты этого эксперимента и результаты исследований твердения, подтвержденные в примерах и сравнительном примере, представлены в таблице 8 параллельно.

Таблица 8 № исследуемого образца Устойчивость при хранении Твердение Пример 1 - - Пример 2 - - Пример 3 - - Пример 4 - - Пример 5 - - Сравнительный пример 1 + +

Как показано в таблице 8, при исследовании устойчивости при хранении, при котором каждый исследуемый образец хранили в упакованном в 10-кг мешок состоянии в течение 45 дней в соответствии с формой фактически коммерциализируемого продукта, все дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, примеров 1-5 были в соответствии с оценкой «незатвердевшими» (-), а дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, сравнительного примера 1 была в соответствии с оценкой «затвердевшей» (+). Эти результаты полностью совпадают с результатами при исследовании твердения.

Как описано выше, дисперсные композиции, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения, как продемонстрировано в экспериментах 1-7 и примерах 1-5, имеют составляющую 90% или более степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты или характеризуются уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% или менее, и поэтому они являются настолько манипулируемыми дисперсными композициями, что их считают «нетвердеющими» (-) при исследовании твердения, даже несмотря на то, что хотя они содержат L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу в качестве примесей, характерных для способов их производства, на обнаруживаемом с помощью обычной жидкостной хроматографии уровне, степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в дисперсных композициях составляют более 98,0%, но менее 99,9%, в частности, 98,5% или более (смотрите пример 5), всего лишь 99,8% или менее (смотрите эксперимент 2), что является уровнем, который меньше составляющего 99,9% уровня содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в порошке качества реагента, и делает отличимыми дисперсные композиции настоящего изобретения от порошка качества реагента по показателю степени чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.

Пример 6

Порошковый препарат витамина C (пример применения в качестве материала для пищевых продуктов)

Двадцать весовых частей дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученной с помощью любого из способов в примерах 1-5, для применения в качестве порошкового материала для пищевых продуктов смешивали с 70 весовыми частями сахарозы, 10 весовыми частями декстрина и соответствующим количеством корригента, с последующим смешиванием результирующей смеси с помощью миксера с превращением в порошковый препарат витамина C. Продукт можно приготовить посредством смешивания без труда до однородности дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с другим порошком, используя миксер, без вызова какой-либо трудности во время стадии его приготовления. Продукт можно без труда смешать с другими материалами для пищевых продуктов, и он представляет собой порошковый препарат витамина C, по существу не приводящий к окрашиванию или твердению даже после хранения в течение относительно длительного периода времени. Поскольку продукт и содержащие его композиции имеют физиологические функции витамина C, их можно принимать перорально для сохранения здоровья или отбеливания кожи или слизистой оболочки.

Пример 7

Порошок для отбеливания кожи (пример применения в качестве материала для косметических средств)

Препарат

Ингредиенты % α,α-трегалоза 59,5 Полиэтиленгликоль 6000 20 Диоксид кремния 5 Дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученная с помощью любого из способов примеров 1-5 15 Корригент Соответствующее количество Краситель Соответствующее количество Антисептик Соответствующее количество Объединение до 100%.  

Способ приготовления

Вышеуказанные α,α-трегалозу, полиэтиленгликоль 6000, диоксид кремния, корригент, краситель и антисептик помещали в миксер и смешивали с его помощью до однородности с превращением в порошкообразную смесь. К смеси добавляли дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученную в любом из способов примеров 1-5, с последующим перемешиванием и смешиванием смеси до однородности с получением порошка для отбеливания кожи. Продукт способствовал смешиванию дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с другими ингредиентами с превращением в однородную смесь, используя миксер, без вызова какой-либо трудности во время стадии ее приготовления. Продукт можно без труда смешать с другими материалами для косметических средств, и он представляет собой порошок для отбеливания кожи, по существу не приводящий к окрашиванию или твердению даже после хранения в течение относительно длительного периода времени. Продукт и содержащие его композиции могут использоваться в качестве средства для нанесения за кожу лица для ее отбеливания.

Как описано выше, поскольку дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения значительно менее способна твердеть по сравнению с обычно коммерциализируемыми порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством в качестве материалов для косметических средств, лечебно-профилактической косметики и пищевых продуктов, дисперсная композиция обладает преимуществом, состоящим в том, что ее легко манипулировать, и она по существу не теряет своего удовлетворительного свойства сыпучести как дисперсная композиция во время ее хранения, сохранения или транспортировки. Несмотря на тот факт, что дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения значительно менее способна твердеть по сравнению с традиционными порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, нет необходимости увеличить в ней степень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до уровня в порошках качества реагентов, и, следовательно, нет необходимости в дополнительных стадиях в процессе производства, таких как рекристаллизация и/или многократные промывки кристаллов. Вследствие этого дисперсная композиция настоящего изобретения обладает преимуществом, состоящим в том, что выход продукции не снижается на очень много, и ее можно продуцировать при меньших затратах.

В соответствии со способом настоящего изобретения дисперсную композицию настоящего изобретения можно приготовить из L-аскорбиновой кислоты и крахмального вещества в качестве материалов с помощью способа производства, который не отличается от способа производства традиционных порошков с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством включенными в него стадиями. Следовательно, способ производства настоящего изобретения обладает преимущественным качеством, состоящим в том, что с его помощью получается значительно менее способная твердеть дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, по сравнению с традиционными порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, с использованием по существу таких же периода времени, труда, производственного оборудования и затрат, как те, которые требуются для производства таких традиционных порошков.

На основании порошкообразных материалов для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лекарственных препаратов настоящего изобретения, поскольку они состоят из дисперсной композиции, значительно менее способной твердеть, можно получить следующее преимущество: нет опасения вызова беспокойства во время транспортировки материала, его просеивания и смешивания даже при использовании на промышленных предприятиях, которые спроектированы так, на исходных условиях, чтобы использовались материалы с удовлетворительным свойством сыпучести.

Кроме того, поскольку дисперсную композицию, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения можно легко превратить в композицию, содержащую как частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 70% в весовом отношении или более от всей дисперсной композиции, так и частицы с размером частиц, составляющим по меньшей мере 53 мкм, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем 40-60% в весовом отношении, ее можно обычно использовать без изменения обычных стадий производства и стандартов на материалы даже при использовании в качестве материалов для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лекарственных препаратов. Когда дисперсной композицией, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения является композиция, которая содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу и характеризуется восстановительной способностью всей дисперсной композиции, составляющей менее одного процента, она достигает преимущества, состоящего в том, что, хотя она является дисперсной композицией, полученной из L-аскорбиновой кислоты и крахмального вещества в качестве материалов, нет опасения вызова ухудшения ее качества, такого как темнение, даже после смешивания с другими ингредиентами, имеющими внутримолекулярно аминогруппу, такими как аминокислоты и белки. В частности, когда содержание L-аскорбиновой кислоты в дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения составляет 0,1% в весовом отношении или менее, на основе сухого остатка, нет опасения изменения цвета дисперсной композиции как таковой на бледно-бурую окраску даже после хранения отдельно в течение относительно длительного периода времени, и она может использоваться в качестве по существу бесцветного, белого порошкообразного материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лекарственных препаратов.

Кроме того, поскольку дисперсная композиция, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения значительно менее способна твердеть по сравнению с традиционными порошками с подходящим для лечебно-профилактической косметики качеством, ее можно легче манипулировать, чем традиционными композициями, и ее можно использовать в качестве материала для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики или лекарственных препаратов в областях производства пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики, лекарственных препаратов, кормов, приманок, химических продуктов и промышленных продуктов. Способ производства дисперсной композиции, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, настоящего изобретения можно использовать в качестве способа ее производства из крахмальных веществ и L-аскорбиновой кислоты, в качестве природных материалов, в требуемом количестве и при меньших затратах в областях производства продуктов превращения крахмала в сахар или производных витамина.

Хотя было описано то, что в настоящее время считается предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, будет понятно, в них могут быть внесены различные модификации, и предполагается включение в прилагаемую формулу изобретения всех модификаций, которые находятся в рамках подлинной сущности и объема настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к композиции в виде твердых частиц, включающей безводную кристаллическую 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, которая включает 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту в количестве, которое больше 98,0% в весовом отношении, но меньше 99,7% в весовом отношении, на основе сухого остатка, которая имеет составляющую 90% или более степень кристалличности безводной кристаллической 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты, при расчете на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для порошка в виде указанной композиции, которая содержит частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 70% в весовом отношении или более относительно всей дисперсной композиции, и частицы с размером частиц, составляющим по меньшей мере 53 мкм, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем от 40 до 60% в весовом отношении относительно всей дисперсной композиции, и которая имеет восстановительную способность всей композиции, составляющую менее 1% в весовом отношении. Данная композиция используется в составе порошковых материалов для пищевых продуктов, косметических средств, лечебно-профилактической косметики и лечебных препаратов. Также настоящее изобретение относится к способу получения предлагаемой композиции и к ее применениям. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 7 ил., 8 табл., 7 пр.

1. Композиция в виде твердых частиц, включающая безводную кристаллическую 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, которая включает 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту в количестве, которое больше 98,0% в весовом отношении, но меньше 99,7% в весовом отношении, на основе сухого остатка, которая имеет составляющую 90% или более степень кристалличности безводной кристаллической 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты, при расчете на основе дифракционной картины рентгеновских лучей для порошка в виде указанной композиции, которая содержит частицы с размером частиц, составляющим менее 150 мкм, в количестве, составляющем 70% в весовом отношении или более относительно всей дисперсной композиции, и частицы с размером частиц, составляющим по меньшей мере 53 мкм, но менее 150 мкм, в количестве, составляющем от 40 до 60% в весовом отношении относительно всей дисперсной композиции, и которая имеет восстановительную способность всей композиции, составляющую менее 1% в весовом отношении.

2. Композиция по п.1, где композиция характеризуется уровнем динамического поглощения паров, составляющим 0,01% в весовом отношении или менее, после хранения при 25°C при относительной влажности, составляющей 35% в весовом отношении, в течение 12 часов после удаления воды в указанной дисперсной композиции в потоке газообразного азота.

3. Композиция по любому из пп.1 или 2, где композиция содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу и содержание L-аскорбиновой кислоты составляет 0,1% в весовом отношении или менее, на основе сухого остатка.

4. Способ получения композиции по любому из пп.1 или 2, где указанный способ включает стадии:
обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и глюкоамилазы в этом порядке на раствор, включающий крахмальное вещество и L-аскорбиновую кислоту, для получения раствора, включающего 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, с выходом продукции, составляющим 35% в весовом отношении или более 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты;
очистки результирующего раствора для увеличения содержания 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты до уровня, превышающего 86% в весовом отношении, на основе сухого остатка;
кристаллизации безводной кристаллической 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты из результирующего очищенного раствора;
сбора результирующей осаждаемой безводной кристаллической 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты без какой-либо стадии рекристаллизации; и
выдерживания и высушивания собранной безводной кристаллической 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты и необязательно измельчения полученных в результате кристаллов.

5. Способ по п.4, в котором на стадии обеспечения действия цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы и глюкоамилазы в этом порядке на раствор, включающий крахмальное вещество и L-аскорбиновую кислоту, обеспечивают действие указанной цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы на раствор в комбинации с разветвляющим крахмал ферментом.

6. Способ по п.4 или 5, в котором на стадии очистки результирующего раствора, включающего 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, он содержит стадию удаления сахаридов с помощью хроматографии на колонке с анионообменной смолой и хроматографии с псевдодвижущимся слоем на колонке с катионообменной смолой в качестве наполнителя.

7. Способ по п.4 или 5, в котором на стадии очистки результирующего раствора, включающего 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, он содержит стадию удаления сахаридов с помощью хроматографии на колонке с анионообменной смолой и хроматографии на колонке с сильнокислотным катионитом или пористой смолой.

8. Порошковый материал для пищевых продуктов, который содержит композицию по любому из пп.1 или 2.

9. Порошковый материал для косметических средств, который содержит композицию по любому из пп.1 или 2.

10. Порошковый материал для лечебно-профилактической косметики, который содержит композицию по любому из пп.1 или 2.

11. Порошковый материал для лекарственных препаратов, который содержит композицию по любому из пп.1 или 2.