СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОЗИДОВ АКРИЛАТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИСАХАРИДОВ И ГЛИКОЗИДАЗ ИЛИ ГЛИКОЗИЛТРАНСФЕРАЗ Российский патент 2015 года по МПК C12P19/04 C07H1/00 C07H15/10 C08B37/00 

Изобретение относится к способу получения этиленово-ненасыщенного гликозида реакцией этиленово-ненасыщенного соединения с полисахаридом в присутствии гликозидазы или гликозилтрансферазы.

Полимеры, содержащие остатки сахаров (сополимеры сахаридов), могут иметь типичные свойства сахаридов, такие как хорошую растворимость в воде, высокую электролитическую устойчивость, устойчивость коллоидов в горячей воде, сильное взаимодействие с поверхностями, такими как хлопок, и нетоксичность. Эти специфические свойства обеспечивают многообразие применений для таких полимеров. Следовательно, имеется большой интерес разработать рентабельные способы получения определенных сополимеров сахаридов и их соответствующих мономеров. Такие мономеры могут быть полимеризуемыми этиленово-ненасыщенными гликозидами, которые получают гликозидным сочетанием сахарида и этиленово-ненасыщенного спирта. Синтез таких гликозидов включает ряд испытаний. Имеется много возможностей для формирования позиционных изомеров, в которых различные гидроксильные группы сахарида становятся включенными в формирование связи. Кроме того, есть потенциал для формирования различных аномерных форм. Следовательно, химический синтез большинства мономеров, несущих остатки сахаров, является, в целом, невыполнимым и приводит к недостаточным выходам желательного мономера.

Применение ферментов считали альтернативным подходом для получения гликозидных мономеров. В отличие от химического синтеза, катализируемые ферментами реакции незащищенных сахаров обычно дают намного более структурно-гомогенный продукт вследствие их высокой стереоселективности.

В общем, имеются два подхода, используемых для ферментативного синтеза гликозидов: термодинамически контролируемый обратимый гидролиз и кинетически контролируемое трансгликозилирование. Подходы для применения гликозидаз, которые катализируют гидролиз гликозидов in vivo, для синтеза гликозидов путем обратного гидролиза описаны, например, I. Gill and R. Valivety (Angew. Chem. Int. Ed. 39 (21): 3804-3808, 2000). Перенос гликозильных звеньев на не сахарные соединения с первичными гидроксильными группами путем катализируемого ферментами трансгликозилирования показан, например, S. Matsumura et al. (Makromol. Chem., Rapid Commun. 14: 55-58, 1993).

Полисахариды, такие как целлюлоза или крахмал, недороги и легко доступны. Следовательно, целью настоящего изобретения было разработать способ получения этиленово-ненасыщенных гликозидов, используя полисахариды в качестве источника гликозильных звеньев.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ получения этиленово-ненасыщенного гликозида формулы I

где Y и Y' независимо представляют собой H или моносахарид, либо линейный или разветвленный олигосахарид, содержащий от 2 до 12 моносахаридных звеньев, где по меньшей мере один из Y и Y' является отличным от H;

m представляет собой целое число от 0 до 3;

A представляет собой C_2-20 алкилен или -R⁶-O-[-R⁶-O-]_x-C_2-20 алкилен;

X выбран из группы, состоящей из -O-, -NH- и -NR⁵-,

R³ выбран из группы, состоящей из -H, и C_1-10 алкила;

R⁴ выбран из группы, состоящей из -H, -COOH и -COO^-M⁺;

R⁵ представляет собой C_1-10алкил;

R⁶ представляет собой -C₂H₄- или -C₃H₆-;

M⁺ выбран из группы, состоящей из Li⁺, Na⁺, K⁺ и NH₄ ⁺; и

x представляет собой целое число от 0 до 200,

включающий реакцию этиленово-ненасыщенного соединения формулы II

с полисахаридом, содержащим 10 или больше моносахаридных звеньев в присутствии гликозидазы или гликозилтрансферазы.

В предпочтительных вариантах выполнения изобретения Y' представляет собой H, а Y представляет собой моносахарид, либо линейный или разветвленный олигосахарид, содержащий от 2 до 12 моносахаридных звеньев.

В предпочтительных вариантах выполнения изобретения Y представляет собой:

где R⁷ представляет собой -H или радикал формулы IV

где в периферических моносахаридных звеньях R⁷ представляет собой H.

Определения

Используемый здесь термин "моносахарид" относится к единственному звену полигидроксиальдегида, образующему внутримолекулярный гемиацеталь, структура которого включает шестичленное кольцо из пяти атомов углерода и одного атома кислорода. Моносахариды могут присутствовать в различных диастереомерных формах, таких как α или β аномеры, и D или L изомеры. "Олигосахарид" состоит из коротких цепей ковалентно связанных моносахаридных звеньев. Олигосахариды содержат дисахариды, которые включают два моносахаридных звена, а также трисахариды, которые включают три моносахаридных звена. "Полисахарид" состоит из длинных цепей ковалентно связанных моносахаридных звеньев.

Термин "гликозидная химическая связь" или "гликозидная связь" представляет собой тип химической связи или присоединения, формируемой(-ого) между аномерной гидроксильной группой сахарида или производного сахарида (гликона) и гидроксильной группой другого сахарида или несахаридного органического соединения (агликона), такого как спирт. Восстанавливающий конец ди- или полисахарида находится в направлении последнего аномерного углерода этой структуры, а невосстанавливающий конец находится в противоположном направлении.

Используемый здесь термин "катализируемый ферментами" или "биокаталитический" способ означает, что указанный способ проводят под каталитическим действием фермента, в особенности гликозидазы или гликозилтрансферазы. Этот способ можно проводить в присутствии указанных гликозидазы или гликозилтрансферазы в выделенной (очищенной, обогащенной) или сырой форме.

Термин "гликозидаза" также включает варианты, мутанты и части гликозидаз, обладающие ферментативной активностью.

Аналогично термин "гликозилтрансфераза" также включает варианты, мутанты и части гликозилтрансфераз, обладающие ферментативной активностью.

Каталитические количества фермента выражают в "U" ("Unit" или "unit"), где 1 U равно количеству фермента, которое катализирует реакцию 1 мкмоль субстрата в минуту при специфических условиях (обычно 37°C и рН 7,5). Таким образом, например, 10 U гликозидазы равно каталитическому количеству фермента, требуемому для реакции 10 мкмоль сахаридного субстрата в минуту. Каталитические количества мальтогенной амилазы могут быть выражены в "MANU" (Maltogenic Amylase Novo Unit), где 1 MANU равно каталитическому количеству фермента, требуемому для реакции 1 мкмоль мальтотриозы в минуту при стандартных условиях (10 мг/мл мальтотриозы, 37°C, pH 5,0, время реакции 30 мин). Каталитическое количество фермента можно определить способами, хорошо известными из уровня техники.

Термин "алкил" содержит охватывает C_1-10 радикалы, которые являются линейными или разветвленным радикалами, имеющими от 1 до 10 атомов углерода. Примеры их представляют собой метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, 2-бутил, изобутил или трет-бутил, пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метилпропил, 1-этил-2-метилпропил, гептил, октил, нонил и децил, а также их структурные изомеры, такие как 2-этилгексил.

Термин "алкилен" охватывает C_2-20 алкиленовые бирадикалы, которые являются линейными или разветвленными бирадикалами, имеющими от 1 до 20 атомов углерода.

Термин "этиленово-ненасыщенный" относится к соединению, содержащему неароматическую двойную связь С=С. В частности, "этиленово-ненасыщенный гликозид", используемый здесь, относится к гликозиду, состоящему из сахарида, который является связанным гликозидной связью с этиленово-ненасыщенным спиртом.

В способе по настоящему изобретению полисахарид действует в качестве источника сахаридных звеньев, которые переносятся к этиленово-ненасыщенному соединению формулы II, чтобы сформировать этиленово-ненасыщенный гликозид формулы I. Переносимые сахаридные звенья представляют собой моносахаридные звенья, такие как звенья глюкозы, галактозы или маннозы; дисахаридные звенья, такие как звенья мальтозы, лактозы или целлобиозы; трисахаридные звенья, такие как звенья мальтотриозы; или другие олигосахаридные звенья, такие как мальтогексаоза, или их смеси. Например, переносимые сахаридные звенья представляют собой звенья D-глюкозы, мальтозы, целлобиозы, мальтотриозы или мальтогексаозы. Переносимые олигосахаридные звенья могут быть линейными или разветвленными.

Полисахарид, используемый в способе по настоящему изобретению, содержит 10 или больше моносахаридных звеньев. Как правило, число моносахаридных звеньев полисахарида составляет от около 300 до около 200000, например от около 2000 до около 200000; от около 300 до около 3000; или от около 300 до около 10000. Размер полисахаридов, то есть количество мономерных звеньев может быть снижено путем предварительной обработки, например, путем использования кислоты и/или нагревания, либо ферментов, таких как α-амилазы. Полисахариды могут быть линейными цепями моносахаридных звеньев, связанных через (1→4)-гликозидные связи; либо могут быть разветвленными путем формирования (1→6)-гликозидных связей, например каждые 24-30 мономерных звена. Концевые моносахаридные звенья сахаридной цепи (и боковых цепей) здесь также именуются периферическими моносахаридными звеньями.

В частности, этот полисахарид может быть соединением формулы V

где R⁷ представляет собой -Н или радикал формулы VI

где в периферических моносахаридных звеньях R⁷ представляет собой H, а n является таким, что количество моносахаридных звеньев, охватываемых повторяющимися звеньями в скобках, составляет 10 или больше, например от около 300 до около 200000.

Типичные полисахариды включают крахмал, амилозу, амилопектин, целлюлозу и их смеси.

В одном варианте выполнения изобретения m равно 0, то есть этиленово-ненасыщенное соединение формулы II представляет собой этиленово-ненасыщенный спирт, выбранный из гидроксиалкил(мет)акрилатов, N-гидроксиалкил(мет)акриламидов, моно(гидроксиалкиловых) эфиров малеиновой кислоты, и их солей; либо их этоксилированных, пропоксилированных или этоксилированнных и пропоксилированных производных.

В других вариантах выполнения изобретения m равно 1, 2 или 3, то есть этиленово-ненасыщенное соединение формулы II представляет собой этиленово-ненасыщенный моно-, ди- или тригликозид, состоящий из моно-, ди- или трисахаридного компонента, а спиртовой компонент выбран из указанных выше этиленово-ненасыщенных спиртов.

Предпочтительные этиленово-ненасыщенные спирты формулы II выбраны из 2-гидроксиэтилакриалата, 2-гидроксиэтилметакриалата, 3-гидроксипропилакрилата, 3-гидроксипропилметакрилата, N-(2-гидроксиэтил)акриламида, N-(2-гидроксиэтил)метакриламида, N-(3-гидроксипропил)акриламида, N-(3-гидроксипропил)метакриламида, (2-гидроксиэтил)гидромалеата, и их гликозидов.

В некоторых вариантах выполнения изобретения А представляет собой C_2-6 алкилен, X представляет собой -O-, a R³ представляет собой -H или -CH₃.

В других вариантах выполнения изобретения m равно 1, Y' представляет собой H, а Y представляет собой моносахарид, либо линейный или разветвленный олигосахарид, содержащий от 2 до 12 моносахаридных звеньев, и предпочтительно представляет собой моносахарид, дисахарид или трисахарид.

В способе по настоящему изобретению реакция полисахарида и этиленово-ненасыщенного спирта или гликозида катализируется ферментом, выбранным из гликозидазы и гликозилтрансферазы. Как правило, ферменты показывают высокую специфичность в отношении реакций, которые они катализируют, субстратов, которые включаются в эти реакции.

Гликозидазы, тип ферментов, также известных как гликозидгидролазы, представляют собой ферменты, способные катализировать гидролиз О- и S-гликозидных соединений. Далее, гликозидазы могут быть использованы для катализа формирования гликозидных связей через обратимый гидролиз, где положение равновесия реакции меняется, либо трансгликозилирование, где гликозидный фрагмент переносится от одного гликозида, то есть донорного гликозида, к другому гликозиду, то есть акцепторному гликозиду, чтобы сформировать новый гликозид. Гликозидазам присвоен номер КФ 3.2.1.х по классификации ферментов.

Гликозилтрансферазы представляют собой ферменты, способные катализировать трансгликозилирование, реакцию, где гликозидный фрагмент переносится от одного гликозида, то есть донорного гликозида, к другому гликозиду, то есть акцепторному гликозиду, чтобы сформировать новый гликозид. Гликозилтрансферазы охватывают гексозилтрансферазы, которые катализируют трансгликозилирование, в котором переносимая гликозидная группа представляет собой гексозу. Гексозилтрансферазам присвоен номер КФ 2.4.1-х по классификации ферментов.

Фермент может быть использован в очищенной форме, в виде обогащенного концентрата или в виде сырого ферментного препарата.

Соответственно гликозидазу, присутствующую в способе по изобретению, выбирают из группы, состоящей из амилаз, целлюлаз, глюкозидаз и галактозидаз.

α-Амилаза представляет собой фермент, которому присвоен номер КФ 3.2.1.1 по классификации ферментов, также известный как гликогеназа, эндоамилаза, Така-амилаза А, или 1,4-α-D-глюкан-глюканогидролаза. α-Амилазы способны катализировать эндогидролиз (1→4)-α-D-глюкозидных связей в полисахаридах, содержащих три или больше (1→4)-α-связанных D-глюкозных звеньев, таких как крахмал или гликоген, тем самым освобождая восстанавливающие группы в α-конфигурации.

Р-Амилаза представляет собой фермент, которому присвоен номер КФ 3.2.1.2 по классификации ферментов, также известный как сахарогенамилаза, гликогеназа или 1,4-α-D-глюкан-мальтогидролаза. β-Амилазы способны катализировать гидролиз (1→4)-α-D-глюкозидных связей в полисахаридах, таких как крахмал и гликоген, тем самым освобождая последовательные звенья β-мальтозы из невосстанавливающих концов полисахаридных цепей.

Целлюлаза представляет собой фермент, которому присвоен номер КФ 3.2.1.4 по классификации ферментов, также известный как эндо-1,4-β-D-глюканаза, β-1,4-глюканаза, β-1,4-эндоглюкан-гидролаза, целлюлаза A, целлюлозин AP, эндоглюканаза D, щелочная целлюлаза, целлюлаза А 3, целлюдекстриназа, 9.5 целлюлаза, авицелаза, панцеллаза SS, или 1,4-(1,3;1,4)-β-D-глюкан 4-глюканогидролаза. Целлюлазы способны катализировать эндогидролиз (1→4)-β-D-глюкозидных связей в целлюлозе, лихенине и зерновых β-D-глюканах, а также 1,4-связей в β-D-глюканах, также содержащих 1,3-связи.

α-Глюкозидаза представляет собой фермент, которому присвоен номер КФ 3.2.1.20 по классификации ферментов, также известный как мальтаза, глюкоинвертаза, глюкозидосахараза, мальтаза-глюкоамилаза α-глюкопиранозидаза, глюкозидоинвертаза, α-D-глюкозидаза, α-глюкозидгидролаза или α-1,4-глюкозидаза. α-Глюкозидазы способны катализировать гидролиз концевых, не восстанавливающих (1→4)-связанных α-D-глюкозных остатков, тем самым освобождая α-D-глюкозу.

β-Глюкозидаза представляет собой фермент, которому присвоен номер КФ 3.2.1.21 по классификации ферментов, также известный как генциобиаза, целлобиаза, эмульсин, элатераза, арил-β-глюкозидаза, β-D-глюкозидаза, β-глюкозид-глюкогидролаза, арбутиназа, амигдалиназа, п-нитрофенил-β-глюкозидаза, примеверозидаза, амигдалаза, лимараза, салицилиназа, или β-1,6-глюкозидаза. β-Глюкозидазы способны катализировать гидролиз концевых, не восстанавливающих β-D-глюкозильных остатков, тем самым освобождая β-D-глюкозу.

α-Галактозидаза представляет собой фермент, которому присвоен номер КФ 3.2.1.22 по классификации ферментов, также известный как мелибиаза, α-D-галактозидаза, α-галактозидаза A, или α-галактозид-галактогидролаза. α-Галактозидазы способны катализировать гидролиз концевых не восстанавливающих остатков α-D-галактозы в α-D-галактозидах, включая олигосахариды галактозы и галактоманнаны.

β-Галактозидаза представляет собой фермент, которому присвоен номер КФ 3.2.1.23 по классификации ферментов, также известный как лактаза, β-лактозидаза, максилакт, гидролакт, β-D-галактозидаза, S 2107, лактозим, трилактаза, β-D-галактаназа, оризатим или сумиклат. β-Галактозидазы способны катализировать гидролиз концевых не восстанавливающих остатков β-D-галактозы в β-D-галактозидах.

Гликозилтрансфераза, присутствующая в способе по изобретению, может быть гликозилтрансферазой, такой как гексозилтрансфераза, например цикломальтодекстрин-глюканотрансферазой или декстрансахаразой.

Цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза представляет собой фермент, которому присвоен номер КФ 2.4.1.19 по классификации ферментов, также известный как амилаза бактерии Bacillus macerans, циклодекстрин-глюканотрансфераза, циклодекстрин-гликозилтрансфераза, цикломальтодекстрин-глюкотрансфераза, цикломальтодекстрин-гликозилтрансфераза, кончизаиму, циклизующая α-1,4-глюкан 4-гликозилтрансфераза, ВМА (Bacillus macerans amilase), ЦГТаза, нейтральная циклодекстрин-гликозилтрансфераза, или 1,4-α-D-глюкан 4-α-D-(1,4-α-D-глюкано)-трансфераза. Цикломальтодекстрин-глюканотрансферазы способны катализировать гидролиз и формирование (1→4)-α-D-глюкозидных связей, и в особенности формирование циклических мальтодекстринов из полисахаридов, а также диспропорционирование линейных олигосахаридов.

Декстрансахараза представляет собой фермент, которому присвоен номер КФ 2.4.1.5 по классификации ферментов, также известный как сахароза-6-глюкозилтрансфераза, SGE, СЕР, сахароза-1,6-α-глюкан-глюкозилтрансфераза или сахароза: 1,6-α-D-глюкан-6-α-D-глюкозилтрансфераза. Декстрансахаразы способны катализировать реакцию: сахароза+[(1→6)-α-D-гликозил]_n=D-фруктоза+[(1→6)-α-D-гликозил]_n+1.

Фермент может быть растворен в реакционной смеси или иммобилизован на твердом носителе, который находится в контакте с реакционной смесью. Если фермент иммобилизован, он присоединен к инертному носителю. Подходящие материалы носителей известны из уровня техники. Примеры подходящих материалов носителей представляют собой глины, глинистые минералы, такие как каолинит, диатомовая земля, перлит, оксид кремния, оксид алюминия, карбонат натрия, карбонат кальция, порошок целлюлозы, анионообменные материалы, синтетические полимеры, такие как полистирол, акриловые смолы, фенолформальдегидные смолы, полиуретаны и полиолефины, такие как полиэтилен и полипропилен. Для получения связанных с носителем ферментов материалы носителей обычно используют в форме тонких порошков, где пористые формы являются предпочтительными. Размер частиц материала носителя обычно не превышает 5 мм, в частности 2 мм. Далее, подходящие материалы носителей представляют собой альгинат кальция и каррагинан. Ферменты могут быть напрямую связаны глутаровым альдегидом. Широкий диапазон способов иммобилизации известен в технологии (например, J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley VCH, Weinheim).

Катализируемая ферментом реакция может быть проведена в периодическом режиме, полупериодическом режиме или непрерывно. Реагенты могут быть поданы в начало реакции или могут быть поданы впоследствии, либо полунепрерывно, либо непрерывно. Каталитическое количество гликозидазы или гликозилтрансферазы, требуемое для способа по изобретению, зависит от условий реакции, таких как температура, растворители и количество субстрата.

Эта реакция может быть проведена в водной среде, такой как буфер. Буфер регулирует pH реакционной смеси до значения, пригодного для эффективного ферментативного катализа. Как правило, pH находится в интервале от около 4 до около 9, например от около 5 до около 7. Подходящие буферы включают, но не ограничены ими, ацетат натрия, трис(гидроксиметил)аминометан («Трис») и фосфатные буферы.

Возможно, эта реакция протекает в присутствии смеси растворителей из воды и смешиваемого с водой органического растворителя при весовом отношении воды к органическому растворителю от 0,1:1 до 9:1, например от 1:1 до 3:1. Органический растворитель не является первичным или вторичным спиртом и соответственно является не реакционноспособным по отношению к полисахариду. Подходящие органические растворители охватывают алканоны, алкилнитрилы, третичные спирты и простые циклические эфиры, и их смеси, например ацетон, ацетонитрил, трет-пентанол, трет-бутанол, 1,4-диоксан и тетрагидрофуран, и их смеси. Обычно применение органических растворителей не является предпочтительным.

Под «смешиваемым с водой органическим растворителем» подразумевается органический растворитель, который формирует гомогенную смесь с водой при используемом весовом отношении воды к органическому растворителю.

Концентрация и отношение реагентов, то есть полисахарида и этиленово-ненасыщенного соединения формулы II, могут быть приспособлены к оптимальным условиям реакции. Например, первоначальная концентрация полисахарида может быть в интервале от 10 до 400 г/л относительно полного объема реакционной смеси, например 50 г/л.

Температура реакции может быть приспособлена к оптимальным условиям реакции, которые могут зависеть от конкретного применяемого фермента. Эту реакцию можно выгодно провести при температурах между точкой замерзания реакционной смеси и температурой денатурации фермента. При достижении температуры денатурации каталитическая активность фермента теряется. Например, реакция может быть проведена при температуре в интервале от 0°C до 80°C, например от 30°C до 65°C. Этот процесс может протекать до достижения равновесия между реагентами и продуктами, но может быть остановлен и раньше. Обычные длительности процесса лежат в интервале от 1 ч до 96 ч.

Методология настоящего изобретения может дополнительно содержать стадию извлечения полученного этиленово-ненасыщенного гликозида формулы I. Термин «извлечение» включает экстракцию, сбор, выделение и очистку этого соединения из реакционной смеси. Извлечение соединения может быть проведено по любой традиционной методике выделения или очистки, известной из уровня техники, включая, но не ограничиваясь ими, обработку любой обычной смолой (например, анионо- или катионообменной смолой, неионогенной поглощающей смолой и т.д.), обработку обычным абсорбентом (например, активированным древесным углем, кремниевой кислотой, силикагелем, целлюлозой, оксидом алюминия и т.д.), изменением pH, экстракцией растворителем (например, обычным растворителем, таким как спирт, этилацетат, гексан и т.п.), перегонкой, диализом, фильтрацией, концентрированием, кристаллизацией, перекристаллизацией, регулированием pH, лиофилизацией и т.п.

Подлинность и чистота выделенного продукта может быть определена известными методиками, как, например, тонкослойная хроматография (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газовая хроматография (ГХ), спектроскопия (например ИК, УФ, ЯМР спектроскопия), методы окрашивания, спектроскопия в ближней ИК-области (БИКС) или ферментативный анализ.

Примеры, описанные ниже, имеют целью проиллюстрировать настоящее изобретение без ограничения его каким-либо образом.

Пример 1: Катализируемый целлюлазой синтез 2-(β-глюкозилокси)этилакрилата из целлюлозы

0,5 г целлюлозы суспендировали в 10 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера при pH 5,0, содержащего 1 мл 2-гидроксиэтилакрилата. Реакцию начинали путем добавления 0,010 г (60 U) целлюлазы из Trichoderma reesei. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 дней при 37°C. Продукт детектировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (смесь хлороформ/метанол 4/1 по объему, Rf 0,55). Непрореагировавшую целлюлозу удаляли путем фильтрования и продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, элюент: хлороформ/метанол 7/1 по объему). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и растворитель удаляли путем роторного испарения. Выход: 9,4 мг (2% от всей целлюлозы).

¹H-ЯМР δ в м.д.: 3,2-4,2 GlucOCH₂CH₂R (8р); 4,38 GlucOCH₂CH₂R (2p Tri J 4,38 4,38 Гц); 4,50 GlucH₁ (1p Dou J 7,92 Гц); 5,99 H_transCH=CHR (1p Dou J 10,42 Гц); 6,22 CH₂=CHR (1p DDou J 17,30 10,47 Гц); 6,46 H_cisCH=CHR (1p Dou J 17,31 Гц).

¹³C-ЯМР 5 в м.д.: 60,9 GlucC₆ 64,4 OCH₂CH₂; 68,1 OCH₂CH₂; 69,8 GlucC₅; 73,3 GlucC₂; 75,9 GlucC₃; 76,1 GlucC₄; 102,7 GlucC_1β; 127,6 H₂C=CHR; 132,9 H₂C=CHR; 168,6 O(O)CR.

Масс-спектрометрия и ионизация электрораспылением с детектированием положительных ионов: рассчитанное: 301,09 (C₁₁H₁₈O₈Na); наблюдаемое: 301,25.

Пример 2: Катализируемый амилазой синтез 2-(α-мальтозилокси)-этилакрилата из крахмала

5,0 г растворимого крахмала суспендировали в 50 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера при pH 5,0, содержащего 50 мл 2-гидроксиэтилакрилата. Реакцию начинали добавлением 10 мл (32000 MANU) мальтогенной амилазы из Bacillus stearothermophilus. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 дней при 55°C. Продукт детектировали методом ТСХ (смесь хлороформ/метанол 2/1 по объему, Rf 0,45). Остающийся 2-гидроксиэтилакрилат удаляли экстракцией диэтиловым эфиром. Водный слой концентрировали с помощью роторного испарения при 30°C. Непрореагировавший крахмал осаждали в изопропанол и удаляли фильтрацией. Фильтрат концентрировали с помощью роторного испарения при 30°C, и продукт далее очищали колоночной хроматографией (силикагель, элюент: хлороформ/метанол 3/1 по объему). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и растворитель удаляли роторным испарением. Выход: 0,408 г (8%). Чистота: >85%.

¹H-ЯМР δ в м.д.: 3,2-4,2 Gluc_1-2OCH₂CH₂R (14p); 4,38-4,50 GlucOCH₂CH₂R (2p); 4,96 GlucH₁ (1p Dou J 3,75 Гц); 5,35 Gluc₂H₁ (1p Dou J 3,76 Гц); 5,99 H_transCH=CHR (1p Dou J 10,43 Гц); 6,21 CH₂=CHR (1p DDou J 17,29 10,45 Гц); 6,44 H_cisCH=CHR (1p Dou J 17,30 Гц).

¹³C-ЯМР δ в м.д.: 60,6 Gluc₂C₆; 63,5 Gluc₁C₆; 64,1 OCH₂CH₂; 67,7 OCH₂CH₂; 69,5 Gluc₁C₅; 71,2 Gluc₂C₅; 72,0 Gluc₁C₂; 72,9 Gluc₁Ca₃; 73,1 Gluc₂C₃; 73,6 Gluc₂C₂; 76,3 Gluc₁C₄; 77,5 Gluc₂C₄; 98,2 Gluc₁C_1α; 100,1 Gluc₂C_1□; 127,7 H₂C=CHR; 132,8 H₂C=CHR; 168,6 O(O)CR.

Масс-спектрометрия и ионизация электрораспылением с детектированием положительных ионов: рассчитанное 463,1422 (C₁₇H₂₈О₁₃Na); наблюдаемое: 463,3333.

Пример 3: Катализируемый циклодекстрин-гликозилтрансферазой синтез 2-(β-мальтриозилокси)-этилакрилата из крахмала

0,634 г 2-(β-глюкозилокси)-этилакрилата и 1,0 г растворимого крахмала растворяли в 10 мл буфера Трис-HCl при pH 7,0, содержащего 0,01 моль хлорида кальция и 0,004 г параметоксифенола. Реакцию начинали добавлением 0,1 мл (60 U) циклодекстрин-гликозилтрансферазы из Bacillus macerans. Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 ч при 60°C. Продукт определяли методом ТСХ (ацетонитрил/вода/аммиак 6/3/1 по объему), Rf 0,27, и очищали колоночной хроматографией (силикагель, элюент: этила цетат/метанол 4/1 по объему). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и растворитель удаляли роторным испарением. Продукт: α-D-глюкопиранозил-(1-4)-α-D-глюкопиранозил-(1-4)-(3-глюкопиранозил-оксиэтилакрилат. Выход: 0,241 г (38 мас.%) Чистота: 95%.

¹H-ЯМР δ в м.д.: 3,2-4,2 Gluc_1-3OCH₂CH₂R (20p); 4,39 GlucOCH₂CH₂R (2p Tri J 4,38 4,38 Гц); 4,50 Gluc₁H₁ (1p Dou J 7,91 Гц); 5,39 Gluc_2-3H₁ (2р Sin) 5,99 H_transCH=CHR (1p Dou J 10,46 Гц); 6,22 CH₂=CHR (1p DDou J 17,29 10,46 Гц); 6,46 H_cisCH=CHR (1p Dou J 17,30 Гц).

¹³С-ЯМР δ в м.д.: 60,7 Gluc_2-3C₆; 60,8 Gluc₁C₆; 64,4 OCH₂CH₂; 68,1 OCH₂CH₂; 69,5 Gluc₁C₅; 71,4 Gluc₂C₅; 71,7 Gluc₃C₅; 72,0 Gluc₁C₂; 72,9 Gluc₁C₃; 73,1 Gluc_2-3С₃; 73,5 Gluc₂C₂; 74,8 Gluc₃C₂; 76,3 Gluc₁C₄; 77,0 Gluc₂C₄; 77,1 Gluc₃C₄; 99,7 Gluc₃C_1α; 100,0 Gluc₂C_1α; 102,5 Gluc₁C_1β; 127,6 H₂C=CHR; 132,9 H₂C=CHR; 168,7 O(O)CR.

Масс-спектрометрия и ионизация электрораспылением с детектированием положительных ионов: рассчитанное: 625,1950 (C₂₃H₃₈О₁₈Na); наблюдаемое: 625,1957.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения этиленово-ненасыщенного гликозида формулы (I). Проводят реакцию этиленово-ненасыщенного соединения формулы (II) с полисахаридом, содержащим от 10 до около 200000 моносахаридных звеньев, таким как крахмал, амилоза, амилопектин, целлюлоза, в присутствии гликозидазы, такой как амилаза, целлюлаза, глюкозидаза и галактозидаза, или гликозилтрансферазы, такой как цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза. Преимуществом способа является высокая чистота продукта. 6 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ получения этиленово-ненасыщенного гликозида формулы I

где Y и Y′ независимо представляют собой Н или моносахарид, либо линейный или разветвленный олигосахарид, содержащий от 2 до 12 моносахаридных звеньев, где по меньшей мере один из Y и Y′ является отличным от Н;
m представляет собой целое число от 0 до 3;
А представляет собой С_2-20 алкилен или -R⁶-O-[-R⁶-O-]_x-C_2-20 алкилен;
X выбран из группы, состоящей из -О-, -NH- и -NR⁵-,
R³ выбран из группы, состоящей из -Н, и С_1-10 алкила;
R⁴ выбран из группы, состоящей из -Н, -СООН и -СОО^-М⁺;
R⁵ представляет собой С_1-10 алкил;
R⁶ представляет собой -С₂Н₄- или -С₃Н₆-;
М⁺ выбран из группы, состоящей из Li⁺, Na⁺, К⁺ и NH₄ ⁺; и
x представляет собой целое число от 0 до 200,
включающий реакцию этиленово-ненасыщенного соединения формулы II

с полисахаридом формулы V

где R⁷ представляет собой Н или радикал формулы VI

где в периферических моносахаридных звеньях R⁷ представляет собой Н, а n является таким, что количество моносахаридных звеньев, охватываемых повторяющимися звеньями в скобках, составляет от 10 до около 200000, в присутствии гликозидазы или гликозилтрансферазы.

2. Способ по п. 1, в котором Y′ представляет собой Н.

3. Способ по п. 1, в котором А представляет собой С_2-6 алкилен, X представляет собой -О- и R³ представляет собой -Н или -СН₃.

4. Способ по п. 1, в котором m равно 1 и Y выбран из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов и трисахаридов.

5. Способ по п. 1, в котором гликозидаза выбрана из группы, состоящей из амилаз, целлюлаз, глюкозидаз и галактозидаз.

6. Способ по п. 1, в котором гликозилтрансфераза выбрана из группы, состоящей из цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором полисахарид выбран из группы, состоящей из крахмала, амилозы, амилопектина, целлюлозы и их смесей.