ШТАММ PSEUDOMONAS MIGULAE ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ, ВОДЫ И ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ ВОДОЕМОВ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/38 

Описание изобретения

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки почвы, воды и донных отложений водоемов от нефтяных загрязнений при температуре среды от +1 до +20°C.

Известен способ очистки водных поверхностей от нефтяных загрязнений в путем внесения в воду консорциума клеток микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 с последующей аэрацией водных объектов (1).

Недостатком способа является ограничение по температуре эффективной очистки среды - не ниже +14°C.

Известен штамм Pseudomonas putida 36 (2), обладающий высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов.

Недостатком штамма является его высокая чувствительность к температуре среды.

Известен штамм Mycobacterium flavescens (3), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур (10-28°C).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°C и снижения уровня растворенного кислорода, что не позволяет ожидать эффективной очистки донных отложений от нефти.

Задача изобретения - получение штамма бактерии, обеспечивающей нефтяных соединений в почве и воде при низкой (до +1°C) температуре окружающей среды.

Штамм Pseudomonas migulae KP-24CO выделен в 2007 году из накопительной культуры из проб загрязненного нефтью донного грунта пресноводного озера Усинского района республики Коми с глубины 7 м в зоне хронического нефтяного загрязнения. Штамм Pseudomonas migulae KP-24CO депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер VKM B-2761D.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Штамм растет на агаризованной среде, содержащей жидкие алканы в качестве единственного источника углерода и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками: грамотрицательные прямые подвижные палочки. Колонии на питательном агаре округлой формы с ровными краями, выпуклые, прозрачные, с желтоватым оттенком. Консистенция слизистая. Выделяет в среду дифундирующий зеленоватый флюоресцирующий пигмент. Аэроб. Оксидазоположительный, каталазоположительный, хемоорганотроф.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - NaNO₃ - 3,0; KH₂PO₄ - 1,0; KCl - 0,5; MgSO₄·5H₂O - 0,5; FeSO₄ - 0,01; агар микробиологический - 20,0; пептон ферментативный - 20,0; дрожжевой экстракт (дрожжевой автолизат) - 1,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°C.

Среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды: NaNO₃ - 3,0; KH₂PO₄ - 1,0; KCl - 0,5; MgSO₄·5H₂O - 0,5; FeSO₄ - 0,01; NaCl - 1,5; пептон ферментативный - 20,0; дрожжевой экстракт (дрожжевой автолизат) - 1,0; алканы (или сырая нефть) - 10,0; культивирование при 15-25°C на качалке при 220 об/мин, 3 суток.

Способность штамма к биодеструкции нефтяных углеводородов изучали в лабораторных опытах, результаты приведены в примерах ниже. Для опытов готовили суспензию биопрепарата, приготовленную из испытуемой культуры путем глубинного культивирования. Титр клеток в трехсуточной рабочей культуре составлял 10¹⁰ на 1 мл.

Пример 1. Очистка от нефти водных сред в присутствие штамма Pseudomonas migulae KP-24CO

Для изучения нефтеокисляющих свойств штамма в водной среде готовили раствор минеральных солей в воде: на 1000 мл воды брали NaNO₃ - 3,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄·5H₂O - 0,5 г; FeSO₄ - 0,01 г; NaCl - 1,5 г; среду разливали в колбы по 100 мл и стерилизовали. После охлаждения до комнатной температуру в колбы добавляли по 5 мл нефти и 1 мл рабочей культуры. Исходный титр клеток испытуемого штамма в начале опыта составлял 108 на 1 мл. Контрольную колбу не заражали. Колбы устанавливали на качалку при 150 об/мин на 5 суток при температуре +15-+20°C и по окончании экспозиции проводили анализ нефти. Определяли концентрацию растворенных углеводородов и общую концентрацию нефти. Как видно из представленных в таблице результатов опыта за 5 суток концентрация нефти в водной среде снижается почти в 40 раз, что говорит о высокой эффективности штамма для разрушения нефти в водных средах в условиях интенсивной аэрации. Обращает на себя внимание то, что уровень растворенных в воде нефтепродуктов также значительно снижается (до 99%), что имеет важное значение для условий промышленного применения, когда речь идет об очистке водных экосистем от растворенных нефтепродуктов.

Таблица 1 Снижение массовой доли нефтепродуктов в водной среде Анализируемые показатели Контроль КМ-102СА.2 Растворенные углеводороды в начале опыта, мг/дм³ 11,98 15,99 Растворенные углеводороды в конце опыта, мг/дм³ 13,65 0,16 Общее количество нефтепродуктов в начале опыта, мг/дм³ 4680 4702 Общее количество нефтепродуктов в конце опыта, мг/дм³ 4650 120

Пример 2. Очистка от нефти почвы в присутствие штамма Pseudomonas migulae KP-24CO

Если говорить о ликвидации разливов нефти на водных объектах, то одной из самых насущных проблем является загрязнение береговой зоны водоемов, приводящее к хроническому загрязнению вод вследствие постоянного смыва загрязнения с берега в воду. Негативное воздействие береговое загрязнение оказывает и на животный мир и орнитофауну прибрежной зоны. В этой связи при разработке технологий очистки водных объектов следует особое внимание уделять поиску методов ускоренной деструкции и обезвреживания загрязнений в почве береговых зон водных объектов. Для опыта отобрали пробу загрязненной почвы с берега р. Северная Двина. Загрязнение береговой зоны происходило в результате подтекания нефти из зоны расположенного в непосредственной близости от реки нефтешламонакопителя. Исходный уровень загрязнения почвы нефтью составлял 450000 мг/кг. Опыт по изучению эффективности штамма для очистки почвы проводили при температуре среды +1°C и +15-+20°C. Увлажнение почвы - избыточное. Пробы почвы, помещенные в кюветы, заливали пресной водой и поверхностно наносили раствор суспензии препарата с титром клеток 10¹⁰ на мл из расчета 10 мл препарата на 1 кг пробы загрязненной почвы. Контрольную пробу биопрепаратом не заражали. Кювету для оценки скорости разрушения углеводородов при низкой температуре среды помещали в холодильник с установленной температурой +1°C для оценки скорости разрушения при температуре +15-+20°C в термостат. Длительность опыта - 40 дней.

В начале опыта и после него проводили анализ массовой доли нефтепродуктов в почве. Результаты опыта, представленные в таблице 2, говорят о высокой степени очистки загрязненного грунта от нефти в присутствие штамма Pseudomonas migulae KP-24CO, причем скорость очищения почвы при температуре +1°C не существенно отличается от опыта с температурой среды +15-+20°C, что дает основание полагать, что использование штамма для очистки почв береговой зоны водных объектов перспективно в районах с холодным климатом и при значительном суточном колебании температуры среды.

Таблица 2 Оценка степени нефтеокисляющей активности штамма Pseudomonas migulae KP-24CO для очистки загрязненной почвы в условиях избыточного увлажнения и при отличающейся температуре среды Наименование варианта Концентрация нефтепродуктов в начале опыта, мг/кг Концентрация нефтепродуктов в конце опыта, мг/кг Степень очистки почвы, % Контроль 450000 446000 0,18 Pseudomonas migulae KP-24CO t+1°C 450000 89900 80 Pseudomonas migulae KP-24CO t+15-+20°C 450000 35700 92

Пример 3. Очистка от нефти донных отложений в условиях дефицита кислорода присутствие штамма Pseudomonas migulae KP-24CO

Пробы донных отложений, отобранные из загрязненного нефтью озера, с концентрацией остаточного нефтяного загрязнения 25000 мг/кг, взяли по 500 г и поместили на дно опытных сосудов. Контрольный вариант залили 10 литрами стерильной воды, опытный обработали биопрепаратом на основе испытуемого штамма взяв 10 мл суспензии с титром клеток 10¹⁰ на 10 литров стерильной воды и добавили 15 г минерального удобрения нитроаммофоски с содержанием действующий веществ по азоту, фосфору и калию по 17%. Титр клеток испытуемой культуры в начале опыта составил 10⁷ на 1 мл. Опытные сосуды поместили на 40 дней в холодильник при температуре +7-+10°C для имитации условий постоянно низкой температуры среды, свойственной для водоемов закрытого типа в условиях холодного климата, аэрирование воды не проводили. В процессе опыта проводили отбор проб воды для анализа концентрации растворенных нефтепродуктов, в начале и конце опыта определяли массовую концентрацию нефтепродуктов в пробах донного грунта. Результаты измерений представлены в таблице 3.

Как можно увидеть из приведенных в таблице результатов, за 40 дней опыта концентрация нефти в пробах донных отложений в контрольном варианте снизилась на 14%, при этом динамика концентрации растворенных в воде нефтепродуктов на контроле характеризовалась постоянным увеличением. Это связано, прежде всего, с работой микробиоты, присутствовавшей в пробах самих донных отложений. В опытном варианте в присутствии штамма Pseudomonas migulae KP-24CO массовая доля нефтепродуктов в пробах донного грунта снизилась на 95,2%, что в 7 раз больше, чем на контроле, а концентрация растворенных в воде нефтепродуктов за 10 дней выросла в 2,5 раза от исходного значения, затем за еще 30 дней снизилась почти в 50 раз. Это говорит об интенсивном окислении нефтепродуктов как в пробах донных отложений, так и в воде испытуемым штаммом.

Полученные результаты позволяют предполагать положительный эффект очищения воды и донных отложений в присутствие штамма Pseudomonas migulae KP-24CO в условиях холодного климата для водоемов закрытого типа (не проточных).

Таблица 3 Динамика концентрации нефтепродуктов в опыте с нефтезагрязненными донными отложениями в присутствии штамма Pseudomonas migulae KP-24CO Вариант/контролируемые параметры Контроль Pseudomonas migulae KP-24CO Концентрация нефти в пробах донных отложений в начале опыта, мг/кг 25000 25000 Концентрация нефти в пробах донных отложений в конце опыта, мг/кг 21500 1200 Уровень растворенных нефтепродуктов в начале опыта, мг/дм³ 6,25 9,76 Уровень растворенных нефтепродуктов на 10-й день опыта, мг/дм³ 12,54 24,15 Уровень растворенных нефтепродуктов на 20 день опыта, мг/дм³ 15,23 4,57 Уровень растворенных нефтепродуктов в конце опыта, мг/дм³ 25,12 0,54

Таким образом, получен технический результат высокоэффективной очистки воды, донных отложений и почвы береговой зоны водных объектов от нефти в присутствии штамма Pseudomonas migulae KP-24CO при низкой температуре окружающей среды, что дает основание для его использования в широком географическом диапазоне, в том числе и в районах с холодным климатом для проведения работ по ликвидации нефтяных разливов на водных объектах.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Pseudomonas migulae, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов под номером VKM B-2761D. Штамм выделен из проб загрязненного нефтью донного грунта пресноводного озера Усинского района республики Коми в зоне хронического нефтяного загрязнения. Штамм обладает высокой нефтеокисляющей активностью в отношении нафтеновых углеводородов, способен снижать концентрацию растворенных в воде углеводородов и ускоряет разрушение нефти в почвах и донных отложениях водоемов при температуре от +1 до +20^оС. 3 табл., 3 пр.

Штамм Pseudomonas migulae, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер VKM B-2761D, используемый для очистки почвы, воды и донных отложений водоемов от нефтяных загрязнений при температуре среды от +1 до +20°C.