ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C02F3/34 C02F101/32 C12R1/38 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано при очистке почвы и поверхностных вод при попадании в окружающую среду нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо).

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (SU 1493666), Flavobacterium tirrennicum (SU 1409594), которые осуществляют деструкцию нефтепродуктов в воде, но не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы Acinetronacter sp. HB-1 (RU 2077579); Acinetronacter sp. JN-2 (RU 2064017), Pseudomonas alcaligenes E7 (RU 2134723), Pseudomonas putida 36 (SU 1076446), пригодные для очистки почвы от нефти, но процесс утилизации резко замедляется при понижении температуры ниже 20°С, что затрудняет их использование в условиях Севера.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (RU 2019527), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Pseudomonas panipatensis С71, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур (от +8 до +30°С).

Штамм Pseudomonas panipatensis C71 выделен из воды открытого водоема (озеро Халы-Балы, село Чапчылган, Амгинский район, Республика Саха (Якутия)), загрязненного арктическим дизельным топливом, с пробы, отобранной с глубины 10 см, в удалении 1 м от берега.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (ВКПМ) (Москва, 1-й Дорожный пр., д.1) под регистрационным номером ВКПМ В-10593.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Это микроскопическая характеристика (внешний вид под микроскопом). Грамотрицательные подвижные палочки размером 2,0-3,0×0,6-0,8 мкм. Спор и капсул не образуют. В мазках располагаются беспорядочно, одиночно или короткими цепочками (по 2-3).

На питательном агаре (масс.%: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 7,1-7,5) и на мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2) через 24 часа штамм формирует дискообразные, влажные, пастообразной консистенции S - колонии сероватого или грязно-голубоватого цвета диаметром 1,5-5 мм, легко снимающиеся с агара. При температуре выше +20°С штамм образует диффундирующий пигмент зеленого цвета, который при температуре +4°С может теряться и восстанавливаться при температуре от +20°С.

На среде Эндо (масс.%: панкреатический гидролизат рыбной муки - 1,2; экстракт пекарских дрожжей - 0,1; натрий хлористый - 0,34; сульфит натрия - 0,08; натрий фосфорнокислый двух замещенный - 0,05; фуксин основной - 0,02; лактоза - 1,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное) при рН 7,4±2 образует круглые с голубым оттенком колонии 0,5-3,0 мм в диаметре, выпуклые, гладкие, с более плотным центром и плоским краем, блестящие, полупрозрачные, со временем приобретающие матовую поверхность.

На среде Сабуро (масс.%: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 6,0±3) образует круглые с сероватым оттенком колонии 1,0-5,0 мм в диаметре, выпуклые, гладкие, блестящие, непрозрачные, через 24-72 ч приобретающие матовую поверхность и зеленый пигмент.

Штамм растет на минеральной среде Мюнца с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо) следующего состава: (масс.%) KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или дизельное топливо - 1,0; вода дистиллированная - остальное, рН - 7,2, в виде влажных непрозрачных голубоватых колоний диаметром 1-2 мм.

В мясопептонном бульоне (масс.%: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; рН 7,0-7,2) растет в виде диффузного помутнения.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм является аэробом. Быстро (в течение 24-72 часов) растет на средах с добавлением гидролизата рыбной муки, при температуре от +8°С до +41°С. Оптимум роста +30°С. Растет при рН 6,0-8,0. Растет в солевой среде с добавлением 0,1-2,0% NaCl. Обладает оксидазной и каталазной активностью. В качестве источника углерода потребляет ацетат и цитрат. Восстанавливает нитраты. Денитрификационная активность отсутствует. Не гидролизует желатин. Обладает уреазной активностью. Не гидролизует крахмал. Лецитиназу не образует. Индолоотрицателен. Окисляет мальтозу и D-глюкозу. Не ферментирует глицерин, инозит, маннит, рамнозу, сорбит, раффинозу, арабинозу. Не окисляет сахарозу, маннит, ксилозу, арабинозу, фруктозу, галактозу. Не нуждается в дополнительных факторах роста.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при 4°С.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение штамма Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593

Штамм Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593 выделен из воды озера Халы-Балы (с.Чапчылган, Амгинский район. Центральная Якутия) следующим образом:

1,0 см³ исследуемой воды растирали шпателем на поверхности агаризированной питательной среды Мюнца следующего состава (масс.%): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7Н₂О - 008; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду в количестве 0,16 масс.%. Инкубирование проводили в термостате при температуре +8, +20 и +30°С в течение 1-10 суток. Образование голубоватых влажных колоний штамма Pseudomonas panipatensis C71 на среде Мюнца с нефтью происходит через 1-3 суток при температуре +30°С, через 4-6 суток при температуре +20°С, через 7-10 суток при температуре +8°С.

Пример 2. Приготовление бактериального изолята и препарата на основе клеток штамма Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593

Изолированные колонии штамма Pseudomonas panipatensis C71, полученные в примере 1, пересевают на скошенный мясопептонный агар и инкубируют 24 часа при температуре +30°С. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им.A.M.Тарасевича.

15,0 см³ суспензии полученного бактериального изолята вносят в 150 см³ среды состава (масс.%): K₂HPO₄ - 0,17; KH₂PO₄ - 0,14; NaCl - 0,2; глицерин - 2,0; пептон - 0,4; MnSO₄·7H₂O - 0,002 и культивируют в колбах на качалке в течение 48 часов при температуре 29±1°С (рН 7,2).

Получают жидкую культуру зеленоватого оттенка с титром не менее 1 млрд клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593 в лабораторных условиях

В колбочки объемом 200,0 см³, содержащие по 100,0 см³ минеральной среды Мюнца, вносят суспензию бактериального изолята, полученного по примеру 2, доводят концентрацию до 1×10⁹ микробных клеток на 1 см³ по оптическому стандарту ГИСК им.A.M.Тарасевича, и добавляют 1% нефти или дизельного топлива.

В качестве контроля используют такую же колбу со средой, нефтепродуктом, но без бактерий (для определения общих (естественных) потерь). Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин, при температурах +8°С; +20°С и +30°С в течение 5 дней.

Содержание нефтепродуктов в среде определяют с помощью концентратометра «ИКН-025» (ФР.1.31.2007.03234). Степень деградации нефтепродуктов рассчитывают как отношение разницы исходного и остаточного содержания нефтепродуктов в воде к их исходному содержанию, выраженное в процентах,

Результаты, приведенные в табл.1, показывают, что в минеральной среде предлагаемый штамм уже на пятый день при температуре +8°С утилизирует 79,6% нефти и 40,0% дизельного топлива; при +20°С - 94,5% нефти и 48,5% дизельного топлива; при +30°С - 96,4% нефти и 67,7% дизельного топлива.

Таблица 1 Степень утилизации нефтепродуктов через 5 суток культивирования штамма Pseudomonas panipatensis C71 В-10593 t°C (+) Нефть Дизельное топливо До опыта, мг Через 5 суток, мг Деструкция, % До опыта, мг Через 5 суток, мг Деструкция, % 30 1000,0 35,62 96,43 1000,0 322,96 67,70 20 1000,0 54,15 94,59 1000,0 514,18 48,58 8 1000,0 203,96 79,60 1000,0 599,54 40,05 Контроль 1000,0 1000,0 0,0 1000,0 1000,0 0,0

Пример 4. Очистка ледовой воды от сырой нефти с помощью клеток штамма бактерий Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ ледовой воды и 30,0 см³ микробной суспензии бактериального изолята Pseudomonas panipatensis C71 В-10593 (по примеру 1), содержащей 1,0·10⁹ клеток/см³ суспензии. Для создания нефтяной пленки в емкости добавляют 30 г сырой неочищенной нефти. В качестве контроля используют ледовую воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30 г нефти и без внесения микроорганизмов.

Эксперимент проводят в течение 2-х месяцев, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°С.

Таблица 2 Динамика деструкции нефти в воде после внесения препарата на основе штамма Pseudomonas panipatensis C71 В-10593 Вариант опыта Количество нефти до внесения клеток штамма, г Количество нефти через 60 дней после внесения клеток штамма, г Степень утилизации нефти, % Вода + нефть + клетки штамма Pseudomonas panipatensis C71 В-10593 30 0,4996 98,33 Вода + нефть 30 30 0,0

Полученные результаты (табл.2) показали, что деструкция нефти штаммом Pseudomonas panipatensis C71 В-10593 за 2 месяца составила 98,33%. Деструкция в контрольной емкости отсутствует.

Пример 5. Очистка почвы от нефтепродуктов с помощью клеток штамма бактерий Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593

Эксперимент по очистке мерзлотной почвы, загрязненной арктическим дизельным топливом, проведен в естественных условиях на территории Момского филиала ГУП «ЖКХ в PC (Я)» (п.Хонуу, Северо-восточная Якутия). Температура почвы в течение всего периода постановки эксперимента составляла в среднем на глубине 20 см +8°С; на глубине 10 см +13°С. Глубина проникновения нефтепродуктов составила в среднем 20 см.

Препарат на основе клеток штамма Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593 по примеру 2 вносят в почву, загрязненную нефтепродуктами, из расчета 1 литр препарата на 1 м² загрязненной почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют в естественных условиях в течение 2 месяцев. Содержание нефтопродуктов в почве определяют в соответствии с РД 52.18.647-2003. Методические указания определения массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика измерений гравиметрическим методом.

Результаты исследований, приведенные в табл.3, показывают, что при температуре почвы в интервале от +8 до +13°С заявленный штамм в течение 2 месяцев осуществил деградацию арктического дизельного топлива на 91,71%

Таблица 3 Динамика деструкции нефтепродуктов в почве, загрязненной арктическим дизельным топливом Вариант опыта Содержание нефтепродуктов до внесения штамма, мг/кг Содержание нефтепродуктов, через 2 месяца после внесения штамма, мг/кг Деструкция разлитого дизтоплива за 2 месяца, % Почва + дизельное топливо + клетки штамма Pseudomonas panipatensis C71 В-10593 18351 1521 91,71 Почва+дизельное топливо 3260 1907 58,50

Таким образом, заявляемый штамм достаточно быстро утилизирует нефть и дизельное топливо в воде и почве в широком диапазоне температур (от +8 до +30°С).

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты, в частности дизельное топливо. Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от+8 до +30°С. 3 табл., 5 пр.

Штамм бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 - деструктор нефти и нефтепродуктов.