ШТАММ БАКТЕРИИ Geobacillus stearothermophilus - ПРОДУЦЕНТ БИОЭТАНОЛА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12P7/06 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для промышленного производства этанола, используемого в качестве топлива, а также в различных отраслях, например, в медицине и пищевой промышленности.

К настоящему времени известны различные микроорганизмы, используемые для получения спирта. Наиболее распространенным продуцентом биоэтанола являются дрожжи - Saccharomyces cerevisiae. Эти микроорганизмы способны выдерживать высокие концентрации спирта и сахара, растут при высокой концентрациях клеток, что позволяет им достигать значительной скорости наработки этанола. Однако все представители этого вида не способны к сбраживанию пентасахаров, что делает невыгодным их использование для переработки лигноцеллюлозной биомассы.

Известен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae B-3855 - продуцент этилового спирта. Штамм является термотолерантным, способен эффективного сбраживать мелассную питательную среду с использованием геотермальной воды нефенольного класса с концентрацией углеводов 21.0 г/100 см³ при температурах 30-32°C (патент RU 2492229 C1, оп. 10.09.2013). Однако этот микроорганизм имеет ряд существенных недостатков: низкая скорость роста и требовательность к субстрату.

Другим распространенным продуцентом этилового спирта является бактерия Zymomonas mobilis. Данные бактерии способны продуцировать этиловый спирт в высоких концентрациях (заявка WO 1986004357 A1, оп. 31.07.1986). Недостатком является их неспособность к сбраживанию пентасахаров.

Кроме ранее перечисленных продуцентов были предприняты попытки использования других видов дрожжей, способных к сбраживанию ксилозы до этанола. Наиболее изучены в этом направлении три вида дрожжей: Pichia stipites (заявка WO 2009004273 A1, оп. 08.01.2009); Pachysolen tannophilus (заявка WO 1982003874 A1, оп. 11.11.1982) и Candida lusitaniae (заявка WO 2010072093 A1, оп. 01.07.2010). Главным недостатком этих микроорганизмов является их чувствительность к воздействию ингибирующих агентов, образующихся в результате гидролиза лигноцеллюлозной биомассы.

Актуальной задачей на сегодняшний день является поиск новых штаммов бактерий, способных эффективно усваивать пентасахара, которые могут составлять до 40% от всех сахаров, содержащихся в растительной биомассе быстрорастущих травянистых растений. Такие растения являются наиболее перспективными источниками биомассы, которая может быть использована в качестве возобновляемого источника энергии и вещества целлюлозосодержащего сырья.

Важным аспектом получения биоэтанола является необходимость его отгонки из культуральной среды, а также, по возможности, использование в качестве субстрата питательных элементов, полученных при гидролизе растительной биомассы. И тот, и другой процесс требуют использования повышенных температур, а, соответственно, наличие стадии с понижением температуры будет приводить к повышению затрат энергии, связанной с перепадом температур. Другой момент использования высоких температур при культивировании, который приводит к снижению энергетических затрат, - это возможность организации более простой системы отвода тепла и возможность его использования. Кроме этого, использование при культивировании температур, близких к 70°C или выше, дает возможность проводить отгонку этилового спирта непосредственно из емкости, в которой проводится культивирование.

Известны термофильные микроорганизмы - потенциальные продуценты этилового спирта, обладающие высоким температурным оптимумом роста.

Например, известен штамм Clostridium thermocellum (заявка WO 2012109578 A2, оп. 16.08.2012), способный продуцировать этиловый спирт. Данный штамм несет мутантный генотип с делецией в гене фермента формиат пируват лиазы, что приводит к прекращению наработки формиата, соответственно к снижению выхода побочных продуктов.

Бактерии рода Geobacillus отличаются устойчивостью к высоким температурам и способностью к переработке большого количества соединений, что делает их перспективным объектом для метаболической инженерии с целью производства биоэтанола (Taylor М.P., et al. Trends Biotechnol. 2009. 27(7). P.398-405). Большинство видов рода Geobacillus способны перерабатывать такие сахара, как D-глюкоза, D-ксилоза и L-арабиноза в диапазоне температур 55°C-70°C до смеси продуктов, содержащей лактат, формиат, ацетат и этанол. Некоторые штаммы могут также перерабатывать ксилан (Wu S., Liu В., Zhang X. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. 72(6). P.1210-1216), а также отличаются высокой толерантностью к этанолу (Fong J.С. et al. Extremophiles. 2006. 10(5). P.363-372).

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является термофильный штамм Thermoanaerobacter italicus (патент EP 2516621 A1, оп. 31.10.2012), который способен продуцировать этанол, молочную и уксусную кислоты из лигноцеллюлозы.

Недостатком известного штамма является его отношение к кислороду - строгий анаэробиоз, что затрудняет работу с ним в условиях производства.

Задачей изобретения является получение термостабильного бактериального штамма, являющегося продуцентом этанола и способного к конверсии целлюлозосодержащего сырья в биоэтанол и устойчивого к токсичным составляющим лигноцеллюлозого гидролизата.

Поставленная задача достигается получением термофильного штамма Geobacillus stearothermophilus, обладающего способностью продуцировать этанол. Предлагаемый штамм выделен из природного материала донного осадка термального источника Северного Прибайкалья в результате целенаправленного поиска.

Технический результат: упрощение условий культивирования штамма и расширение ассортимента штаммов-продуцентов для получения биоэтанола.

Полученный штамм Geobacillus stearothermophilus депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-11691.

Штамм Geobacillus stearothermophilus ВКПМ В-11691 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки: грамположительные палочки растут на средах LB-бульон, LB-arap, среда Пфеннига с глюкозой, среда Пфеннига с ксилозой. При росте на агаризованной среде LB образует округлые колонии кремового цвета. Края колоний волнистые или слегка волнистые. Профиль колоний слегка выпуклый, размеры варьируют от 3 до 5 мм. Рост в жидких средах (LB, среда Пфеннига с глюкозой или ксилозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физиолого-биохимические признаки: аэроб, термофил. Оптимальная температура роста 60-65°C. Хорошо растет в пределах рН среды от 6,5 до 7,5. Штамм характеризуется способностью использовать в качестве субстратов пептон, дрожжевой экстракт, эскулин. Продуцирует кислоту из D-глюкозы. Не утилизирует цитрат, маннитол, малонат, инозитол, адонитол, сорбитол, дульцит, пируват, сахара (целлобиозу, сахарозу, трегалозу, рамнозу, мелибиозу, раффинозу) и аминокислоты (лизин, орнитин, аргинин, триптофан, фенилаланин). Способен к гидролизу мочевины и лактозы.

Штамм не обладает инфекционным и общетоксическим действием.

Штамм является непатогенным и не включен в списки, приведенные в санитарных правилах СП 1.3.2322-08; штамм не несет опасных генетических конструкций; способность штамма выживать в окружающей среде ограничена в связи с термофильностью.

Штамм идентифицирован на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК.

Хранение штамма осуществляют на среде Luria Bertani (LB) с глицерином при температуре - 70°C.

Для культивирования штамма применяют среды следующего состава:

Среда LB (г/л): хлорид натрия - 5,0; триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0.

Среда Пфеннига (г/л): KH₂PO₄-0,5; NH₄Cl-0,5; MgSO₄×7H₂O-0,5; KCl-0,5; NaCl-0,5; CaCl₂×2H₂O-0,05; NaHCO₃-1,5, содержание глюкозы и/или ксилозы - 10,0-30,0.

Предлагаемый штамм термофильных бактерий рода Geobacillus в качестве продуцентов биоэтанола имеет ряд преимуществ, заключающихся в следующем.

1. Бактерии рода Geobacillus имеют часть ферментов целлюлозолитического комплекса и, следовательно, продуцент этанола на основе Geobacillus spp. может стать хорошей основой для последующих работ, направленных на создание штамма, способного к прямой конверсии лигноцеллюлозной биомассы в биоэтанол.

2. Снижается вероятность контаминации в ходе технологического процесса ввиду того, что микрофлора мезофильных мест обитания плохо приспособлена к жизни в условиях повышенных температур.

3. Термофильные организмы обладают большей скоростью роста и скоростью катаболических процессов по сравнению с мезофильными микроорганизмами, следовательно, скорость конверсии источника углерода в биоэтанол будет выше у термофильных организмов.

4. Культивирование при высоких температурах делает возможным разработку технологии отгонки спирта в процессе культивирования, что позволит сократить объем отработанных жидкостей.

5. Упрощение условий культивирования, поскольку штамм является аэробом.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и он характеризуется уникальным свойством продуцировать этанол, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выращивание штамма Geobacillus stearothermophilus и определение содержания этанола в культуральной жидкости.

Для получения биомассы и определения содержания биоэтанола в культуральной жидкости культуру штамма-продуцентов рассевали штрихом на чашках с агаризованной средой LB таким образом, чтобы были получены отдельные колонии. Засеянные чашки культивировали в суховоздушном термостате в течение 16 часов при температуре 65°C. Затем 20 мл среды LB инокулировали одной колонией нарабатываемого штамма. Культивировали при 65°C в течение 12 часов на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 200 оборотов в минуту. После этого к 200 мл среды LB в литровой конической колбе добавляли 4 мл ночной культуры нарабатываемого штамма. Культивирование проводили при 60°C на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 250 оборотов в минуту до достижения оптической плотности OD600~0.90 -0.95. В полученной таким образом культуральной жидкости определяли содержание этанола.

Содержание этанола в культуральной жидкости определяли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на хроматографе Agilent Technologies 6890N с квадрупольным масс-спектрометром Agilent Technologies 5973N и кварцевой колонной DB-1. Газ-носитель - гелий с постоянным потоком 1 мл/мин. Режим программирования температуры колонки: начальная температура термостата колонки 50°C, выдержка при начальной температуре 5 мин, далее нагрев до температуры 250°C со скоростью 25°C/мин, выдержка при конечной температуре 7 мин. Ввод пробы осуществляли с помощью микрошприца, объем вводимой пробы 1 мкл, температура инжектора 250°C. Ионизация электронным ударом (70 эВ). Через 15 часов культивирования отбирали 350 мкл культуральной жидкости в пробирку (1,7 мл) и добавляли 1050 мкл 0,5 М ТОА (триоктиламин) в ТБФ (трибутилфосфат). Экстракцию проводили при помощи перемешивания на шейкере (15 минут). Затем отбирали 1 мл органического растворителя с экстрактом в стеклянный бокс для хроматографа. Концентрацию этилового спирта определяли сравнением площадей пиков экспериментальных образцов с калибровочными растворами. Выход этанола - не менее 20 г/л.

Пример 2. Наработка биоэтанола штаммом Geobacillus stearothermophilus.

Для определения количества биоэтанола, нарабатываемого штаммом Geobacillus stearothermophilus, было проведено культивирование штамма в вихревом биореакторе ′′Vortex-5′′ с программируемым блоком управления («Центр вихревых технологий», Россия) следующим образом.

Предварительно исследуемую культуру выращивали на питательной среде LB (дрожжевой экстракт - 5 г/л, триптон - 10 г/л, NaCl - 10 г/л, рН 7,0) при температуре 60°C в 1/10 объема от предполагаемого объема культуральной жидкости в биореакторе. Через 12 часов переносили инокулят в биореактор, заполненный 3-мя литрами среды Пфеннига, содержащей 2% глюкозы. В ходе культивирования поддерживали температуру 60°C и рН 7.0. Начальный этап культивирования проводили в аэробных условиях. Перемешивание осуществляли вихревым образом при помощи воздушной мешалки (2600 об/мин). Через 5 часов в среду добавляли 3% глюкозы и продолжали культивирование в течение 7 часов.

В полученной культуральной жидкости определяли содержание этанола аналогично примеру 1.

Использование предлагаемого штамма позволит упростить процесс культивирования последнего и расширить ассортимент штаммов-продуцентов для получения биоэтанола.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Geobacillus stearothermophilus ВКПМ В-11691 - продуцент биоэтанола. Выход биоэтанола составляет более 20 г/л. Изобретение позволяет расширить ассортимент штаммов-продуцентов биоэтанола. 2 пр.

Штамм бактерии Geobacillus stearothermophilus, депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-11691, продуцент биоэтанола.