ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus stratosphericus, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТАНОЛА ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12P7/06 C12R1/07 

Описание патента на изобретение RU2560585C1

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для промышленного производства этанола, а также в различных отраслях, например в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве для производства кормов.

В отличие от крахмала, который содержит гомогенные и легко гидролизуемые полимеры, лигнинцеллюлозная биомасса не является гомогенной по природе. Помимо легко поддающейся превращению целлюлозы и гемицеллюлозы она также содержит лигнин и другие компоненты, которые не могут быть легко превращены в сбраживаемые сахара.

К настоящему времени известны различные микроорганизмы, используемые для получения этанола.

Наиболее распространенным продуцентом этанола являются дрожжи - Saccharomyces cerevisiae. Эти микроорганизмы способны выдерживать высокие концентрации спирта и сахара, растут при высокой концентрации клеток, что позволяет им достигать значительной скорости наработки этанола. Однако все представители этого вида не способны к сбраживанию пентасахаров, что делает невыгодным их использование для переработки лигноцеллюлозной биомассы.

Например, известен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae В-3855 - продуцент этилового спирта. Штамм является термотолерантным, способен эффективного сбраживать мелассную питательную среду с использованием геотермальной воды нефенольного класса с концентрацией углеводов 21.0 г/100 см3 при температурах 30-32°C (патент RU 2492229 С1, оп. 10.09.2013). Однако этот микроорганизм имеет ряд существенных недостатков: низкая скорость роста и требовательность к субстрату.

Были предприняты попытки использования других видов дрожжей, способных к сбраживанию ксилозы до этанола. Наиболее изучены в этом направлении три вида дрожжей: Pichia stipites (заявка WO 2009004273 Α1, оп. 08.01.2009); Pachysolen tannophilus (заявка WO 1982003874 A1, оп. 11.11.1982) и Candida lusitaniae (заявка WO 2010072093 A1, оп. 01.07.2010). Главным недостатком этих микроорганизмов является их чувствительность к воздействию ингибирующих агентов, образующихся в результате гидролиза лигноцеллюлозной биомассы.

Известен способ получения этанола путем сбраживания пентозы гидролизатов кукурузной кочерыжки дрожжами Pachysolen zannophilus (Besic S. Grba S. Fermentation of hydrolyzate of corn stover hemicellulose to ethanol by Pachysolen tannophlus. Kem. Ind. 1990, v. 39, N 2, p. 57-67), однако данный способ характеризуется низким выходом этанола из гидролизатов древесины, так как гексоза (преобладающая в древесине) и пентоза эффективно сбраживаются разными видами дрожжей при различных условиях проведения процесса.

Другим распространенным продуцентом этилового спирта является бактерия Zymomonas mobilis. Данные бактерии способны продуцировать этиловый спирт в высоких концентрациях (заявка WO 1986004357 A1, оп. 31.07.1986). Недостатком является их неспособность к сбраживанию пентасахаров.

Известно, что бактерии рода Clostridium при сбраживании различных углеводов синтезируют этанол. Так, штамм Clostridium acetobutylicum ВКМ B-2512D является продуцентом н-бутилового спирта, ацетона и этанола (патент RU 2393213 С1, оп. 27.06.2010).

Также известен штамм Clostridium thermocellum (заявка WO 2012109578 А2, оп. 16.08.2012), способный продуцировать этиловый спирт. Данный штамм несет мутантный генотип с делецией в гене фермента формиат пируват лиазы, что приводит к прекращению наработки формиата, соответственно к снижению выхода побочных продуктов.

Актуальной задачей на сегодняшний день является поиск новых штаммов бактерий, способных эффективно усваивать пентасахара, которые могут составлять до 40% от всех сахаров, содержащихся в растительной биомассе быстрорастущих травянистых растений. Такие растения являются наиболее перспективными источниками биомассы, которая может быть использована в качестве возобновляемого источника энергии и вещества, целлюлозосодержащего сырья.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм бактерий Clostridium acetobutylicum, являющийся продуцентом бутанола, ацетона и этанола из целлюлозосодержащего сырья (патент RU 2381270 С1, оп. 10.02.2010). Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов, ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером B-2531D. Для культивирования штамма применяют питательные среды, содержащие автолизат кормовых дрожжей, биотин и пара-аминобензойную кислоту. Ферментацию ведут при термостатировании при 36-37°C в течение 40 часов. Выход этанола составляет 0,01-1,35%.

Недостатками известного штамма являются его анаэробность, что требует дополнительного оборудования и усложняет условия культивирования, а также потребность штамма в факторах роста (необходимость добавления в питательные среды пищевого сырья, например муки или отрубей, а также минеральных добавок).

Задачей изобретения является получение бактериального штамма, являющегося продуцентом этанола, способного к конверсии целлюлозосодержащего сырья в этанол и устойчивого к токсичным составляющим лигноцеллюлозого гидролизата.

Поставленная задача достигается получением штамма Bacillus stratosphericus, обладающего способностью продуцировать этанол из лигноцеллюлозной биомассы.

Технический результат: упрощение условий культивирования штамма и расширение ассортимента штаммов-продуцентов для переработки лигноцеллюлозной биомассы в этанол.

Предлагаемый штамм выделен из природного материала донного осадка озера Соленое, Новосибирская область (Купинский район) в результате целенаправленного поиска.

Полученный штамм Bacillus stratosphericus депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-11678.

Штамм Bacillus stratosphericus ВКПМ В-11678 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки: грамположительные палочки, растут на средах LB-бульон, LB-arap, среда Гетчинсона с лигноцеллюлозной биомассой. При росте на агаризованной среде LB образует колонии неправильной формы белого цвета. Профиль колоний слегка выпуклый, размеры варьируют от 3 до 5 мм. Рост в жидких средах (LB-бульон) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физиолого-биохимические признаки: аэроб, мезофил. Оптимальная температура роста 30-37°C. Хорошо растет в пределах рН среды от 6.5 до 7.5. Штамм характеризуется способностью использовать в качестве субстратов пептон, дрожжевой экстракт. Не утилизирует цитрат, маннитол, малонат, инозитол, адонитол, сорбитол, дульцит, пируват, сахара (глюкозу, целлобиозу, сахарозу, трегалозу, рамнозу, мелибиозу, раффинозу) и аминокислоты (аргинин, триптофан, фенилаланин). Слабо декарбоксилирует лизин и орнитин. Не способен к гидролизу мочевины.

Штамм не обладает инфекционным и общетоксическим действием.

Штамм является непатогенным и не включен в списки, приведенные в санитарных правилах СП 1.3.2322-08; штамм не несет опасных генетических конструкций.

Штамм идентифицирован на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК.

Хранение штамма осуществляют на среде Гетчинсона с глицерином при температуре -70°C.

Для культивирования штамма применяют среды следующего состава:

Среда LB (г/л): хлорид натрия - 5.0; триптон - 10.0; дрожжевой экстракт - 5.0.

Среда Гетчинсона (г/л): NaNO3 - 2.5, K2HPO4 - 1, (NH4)2SO4 - 0.15, MgCl2 - 0.15, NaCl - 0.1, CaCl2 - 0.1, лигноцеллюлозная биомасса - 15, FeCl3*6H2O - 50 мкг.

Предлагаемый штамм бактерий Bacillus stratosphericus, обладающий способностью перерабатывать лигноцеллюлозную биомассу в этанол, имеет ряд преимуществ, заключающихся в следующем.

1. Бактерии рода Bacillus имеют часть ферментов целлюлозолитического комплекса и, следовательно, продуцент этанола на основе штаммов Bacillus может стать хорошей основой для последующих работ, направленных на создание штамма, способного к прямой конверсии лигноцеллюлозной биомассы в этанол.

2. На основе бактерий рода Bacillus возможно создание эффективных комплексов микроорганизмов, деградирующих лигноцеллюлозную биомассу и продуцирующих этанол.

3. Бактерии рода Bacillus обладают достаточно высокой скоростью роста и скоростью катаболических процессов, следовательно, скорость переработки лигноцеллюлозной биомассы в этанол будет выше, чем у других организмов.

4. Штамм бактерий Bacillus stratosphericus обладает устойчивостью к содержанию в среде ацетата и этанола, что делает его перспективным для использования в условиях производства.

5. Штамм является аэробом и мезофилом, в связи с чем упрощаются условия его культивирования, поскольку не требуется дополнительный нагрев и поддержание высокой температуры среды культивирования.

6. Штамм проявляет более активный рост на лигноцеллюлозной биомассе, чем на богатых питательных средах (мясо-пептонный агар, Лурия-Бертани бульон), что будет способствовать удешевлению технологии переработки растительной биомассы.

7. Штамм устойчив к токсичным составляющим лигноцеллюлозого гидролизата, что позволит упростить технологию переработки растительной биомассы.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и он характеризуется уникальной способностью перерабатывать лигноцеллюлозную биомассу в этанол, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выращивание штамма Bacillus stratosphericus и определение содержания этанола в культуральной жидкости.

Для получения биомассы и определения содержания биоэтанола в культуральной жидкости культуру штамма-продуцента рассевали штрихом на чашках с агаризованной средой Гетчинсона с лигноцеллюлозной биомассой таким образом, чтобы были получены отдельные колонии. Засеянные чашки культивировали в суховоздушном термостате в течение 24-48 часов при температуре 37°C. Затем 20 мл среды Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы инокулировали одной колонией нарабатываемого штамма. Культивировали при 37°C в течение 12 часов на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 200 оборотов в минуту. После этого к 200 мл среды Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы в литровой конической колбе добавляли 4 мл наработанной культуры. Культивирование проводили при 37°C на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 250 оборотов в минуту до достижения оптической плотности OD 600~0.90-0.95. В полученной таким образом культуральной жидкости определяли содержание этанола.

Содержание этанола в культуральной жидкости определяли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на хроматографе Agilent Technologies 6890N с квадрупольным масс-спектрометром Agilent Technologies 5973N и кварцевой колонной DB-1. Газ-носитель - гелий с постоянным потоком 1 мл/мин. Режим программирования температуры колонки: начальная температура термостата колонки 50°C, выдержка при начальной температуре 5 мин, далее нагрев до температуры 250°C со скоростью 25°C/мин, выдержка при конечной температуре 7 мин. Ввод пробы осуществляли с помощью микрошприца, объем вводимой пробы 1 мкл, температура инжектора 250°C. Ионизация электронным ударом (70 эВ). Через 15 часов культивирования отбирали 350 мкл культуральной жидкости в пробирку (1,7 мл) и добавляли 1050 мкл 0,5 Μ ТОА (триоктиламин) в ТБФ (трибутилфосфат). Экстракцию проводили при помощи перемешивания на шейкере (15 минут). Затем отбирали 1 мл органического растворителя с экстрактом в стеклянный бокс для хроматографа. Концентрацию этилового спирта определяли сравнением площадей пиков экспериментальных образцов с калибровочными растворами. Выход этанола составил 0,4%.

Пример 2. Наработка этанола штаммом Bacillus stratosphericus.

Для определения количества этанола, нарабатываемого штаммом Bacillus stratosphericus, было проведено культивирование штамма в вихревом биореакторе "Vortex-5" с программируемым блоком управления («Центр вихревых технологий», Россия) следующим образом.

Предварительно исследуемую культуру выращивали на питательной среде Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы при температуре 37°C в 1/10 объема от предполагаемого объема культуральной жидкости в биореакторе. Через 12 часов переносили инокулят в биореактор, заполненный 3-мя литрами среды Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы. В ходе культивирования поддерживали температуру 37°C и рН 7.0. Начальный этап культивирования проводили в аэробных условиях. Перемешивание осуществляли вихревым образом при помощи воздушной мешалки (2600 об/мин). В полученной культуральной жидкости определяли содержание этанола аналогично примеру 1. Выход этанола составил 0,5%.

Использование предлагаемого штамма позволит упростить процесс культивирования последнего и расширить ассортимент штаммов, обладающих способностью переработки лигноцеллюлозной биомассы в этанол.

Похожие патенты RU2560585C1

название год авторы номер документа
ШТАММ БАКТЕРИИ Bacillus stratosphericus, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОДУЦИРОВАТЬ ЭТАНОЛ ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ 2014
  • Брянская Алла Викторовна
  • Старостин Константин Викторович
  • Шеховцов Сергей Викторович
  • Розанов Алексей Сергеевич
  • Горячковская Татьяна Николаевна
  • Пельтек Сергей Евгеньевич
RU2560584C1
ШТАММ БАКТЕРИИ Geobacillus stearothermophilus - ПРОДУЦЕНТ БИОЭТАНОЛА 2013
  • Розанов Алексей Сергеевич
  • Малуп Татьяна Константиновна
  • Брянская Алла Викторовна
  • Пельтек Сергей Евгеньевич
RU2534880C1
СПОСОБ ОЧИСТКИ ГИДРОЛИЗАТОВ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО СЫРЬЯ ОТ ИНГИБИТОРОВ АЦЕТОНОБУТИЛОВОГО БРОЖЕНИЯ 2013
  • Семенов Сергей Юрьевич
  • Морозова Татьяна Сергеевна
  • Сибатаев Ануарбек Каримович
  • Храброва Наталья Валерьевна
RU2555537C2
ШТАММ BACILLUS SPECIES, СПОСОБНЫЙ К РОСТУ В СРЕДЕ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ БУТАНОЛА 2009
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2404241C1
Штамм дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290, применяемый для получения этанола на каталитических гидролизатах целлюлозы 2016
  • Сорокина Ксения Николаевна
  • Пармон Валентин Николаевич
RU2626544C1
ШТАММ Penicillium sp., ОБЛАДАЮЩИЙ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ И ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОСТАТКОВ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 2012
  • Жемякин Сергей Викторович
  • Попов Александр Анатольевич
  • Свиридова Ольга Владимировна
  • Воробьев Николай Иванович
RU2487933C1
Трансформант дрожжей Komagataella kurtzmanii, продуцирующий бета-глюканазу 2019
  • Козлов Дмитрий Георгиевич
  • Чеперегин Сергей Эдуардович
  • Малышева Анастасия Васильевна
  • Санникова Евгения Павловна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Калинина Анна Николаевна
  • Агранович Аннета Михайловна
  • Федоров Александр Сергеевич
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2722563C1
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ ФОСФОЛИПАЗЫ С 2012
  • Синеокий Сергей Павлович
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Соболевская Татьяна Ивановна
  • Калинина Анна Николаевна
  • Патрушева Елена Викторовна
RU2500811C1
ШТАММ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ Clostridium tyrobutyricum - ПРОДУЦЕНТ МАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА МАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА 2015
  • Сахибгараева Лилия Флюзовна
  • Березина Оксана Валентиновна
  • Рыков Сергей Викторович
  • Яроцкий Сергей Викторович
RU2605545C1
БАКТЕРИЯ Bacillus subtilis, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ 5`-АМИНОИМИДАЗОЛ-4-КАРБОКСАМИДРИБОЗИД (АИКАР), И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА АИКАР ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТАКОЙ БАКТЕРИИ 2013
  • Миронов Александр Сергеевич
  • Шакулов Рустэм Саидович
  • Эрраис Лопес Любовь
  • Королькова Наталья Валентиновна
  • Белова Валентина Алексеевна
  • Лобанов Константин Владимирович
  • Сергеева Галина Ильинична
  • Нудлер Евгений Александрович
  • Тяглов Борис Владимирович
  • Глазунов Александр Викторович
  • Воронина Лиля Николаевна
  • Булеева Елена Тимофеевна
  • Барсуков Евгений Дмитриевич
  • Демина Наталья Георгиевна
  • Румянцева Надежда Фридриховна
  • Яроцкий Сергей Викторович
  • Бебуров Михаил Юрьевич
RU2542387C1

Реферат патента 2015 года ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus stratosphericus, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТАНОЛА ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Bacillus stratosphericus Сол. НК 2, обладающий способностью продуцировать этанол, депонирован в ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ В-11678. Штамм может быть использован для промышленного производства этанола, а также в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве для производства кормов. Изобретение позволяет расширить ассортимент штаммов, обладающих способностью переработки лигноцеллюлозной биомассы в этанол. 2 пр.

Формула изобретения RU 2 560 585 C1

Штамм бактерий Bacillus stratosphericus, депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-11678, предназначенный для получения этанола из лигноцеллюлозной биомассы.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2560585C1

ШТАММ БАКТЕРИЙ Clostridium acetobutylicum - ПРОДУЦЕНТ БУТАНОЛА, АЦЕТОНА И ЭТАНОЛА 2008
  • Давидов Евгений Рубенович
  • Каныгин Петр Сергеевич
  • Филиппов Кирилл Борисович
  • Фракин Олег Анатольевич
  • Черемнов Игорь Владимирович
  • Чекасина Елизавета Васильевна
RU2381270C1
ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ВКПМ Y-3415 - ПРОДУЦЕНТ ЭТИЛОВОГО СПИРТА 2010
  • Цугкиев Борис Георгиевич
  • Рамонова Залина Гавриловна
  • Таучелов Сослан Казгериевич
RU2445356C2
ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПИРТА 2012
  • Котенко Светлана Цалистиновна
  • Халилова Эсланда Абдурахмановна
  • Исламмагомедова Эльвира Ахмедовна
  • Аливердиева Динара Алиевна
RU2492229C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM - ПРОДУЦЕНТ Н-БУТИЛОВОГО СПИРТА, АЦЕТОНА И ЭТАНОЛА 2008
  • Поляков Виктор Антонович
  • Римарева Любовь Вячеславовна
  • Галкина Галина Васильевна
  • Илларионова Валентина Ивановна
  • Куксова Елена Владимировна
  • Горбатова Елена Владимировна
  • Волкова Галина Сергеевна
RU2393213C1
ДМИТРУК К.В
и др., Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола, Цитология и генетика, 2013, Т.47, N 6, стр
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
РОЗАНОВ А.С
и др., Современное состояние исследований в области

RU 2 560 585 C1

Авторы

Брянская Алла Викторовна

Старостин Константин Викторович

Розанов Алексей Сергеевич

Шеховцов Сергей Викторович

Горячковская Татьяна Николаевна

Пельтек Сергей Евгеньевич

Даты

2015-08-20Публикация

2014-10-29Подача