сылка на связанные заявки
Приоритет данной заявки определяется датами подачи патентной заявки США №12/846,580, поданной 29.07.2010, международной патентной заявки PCT/GB2010/001443, поданной 29.07.2010, и патентных заявок Великобритании №№1101222.6 и 11066180, поданных соответственно 25.01.2011 и 19.04.2011. Содержание данных заявок полностью включено в данное описание посредством ссылки.
Область техники
Изобретение относится к планшету для образцов, к автоматизированному устройству, к диспенсеру гранул (микросфер) реагента, к набору для осуществления энзим-связывающего иммуносорбентного анализа (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, далее - ELISA), к набору для осуществления процедуры, использующей нуклеиново-кислотный зонд, к способу изготовления планшета для образцов и к компьютерной программе, выполняемой системой управления автоматизированного устройства.
Предложен автоматизированный диспенсер гранул (микросфер) реагента, служащий для распределения этих гранул (микросфер) по планшету для образцов. Планшет для образцов может быть использован для проведения диагностического тестирования, такого как ELISA, или других процедур, связанных с иммунным анализом. Альтернативно, планшет для образцов может быть использован для проведения тестирования на наличие ДНК- или РНК- последовательностей.
Уровень техники
Иммунологические исследования являются предпочтительным методом тестирования биологических продуктов. Эти исследования используют способность антител, продуцируемых телом человека, распознавать специфические антигены (которые могут, например, ассоциироваться с чужеродными частицами, такими как бактерии или вирусы, или с другими веществами, вырабатываемыми организмом, такими как гормоны) и взаимодействовать с ними. После образования специфического комплекса антиген-антитело, он может быть обнаружен с использованием хромогенных, флуоресцентных или хемилюминесцентных материалов или (что менее желательно) радиоактивных веществ. Радиоактивные вещества не относятся к предпочтительным вследствие проблем в отношении охраны окружающей среды и безопасности, связанных с использованием, хранением и утилизацией этих веществ. Для обнаружения и распознавания любых материалов, образующих специфические связанные пары, могут использоваться сходные методы, например с применением в качестве одного из компонентов пары пектинов, ревматоидного фактора, протеина или нуклеиновых кислот.
ELISA представляет собой особо предпочтительную форму иммунологического исследования, в которой один из членов связанной пары связывается (иммобилизуется) нерастворимой поверхностью-носителем ("твердой фазой"), такой как емкость для образца. После реакции связанная пара детектируется с помощью еще одного специфичного связывающего агента, конъюгированного с энзимом ("конъюгатом"). Операции для осуществления теста ELISA хорошо известны из уровня техники; они использовались как в исследовательских, так и в коммерческих целях в течение многих лет. Теория и практика иммунного анализа описана во множестве книг и обзорных статей. Например, сформулированы рекомендации по характеристикам и выбору твердых фаз для анализов методом захвата, по методам и реагентам для обеспечения покрытия твердых фаз захваченными компонентами, по природе и выбору меток и по методам маркирования компонентов. Примером стандартного справочника является "ELISA and Other Solid Phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects", Editors D.M. Kemeny & S. J. Challacombe, John Wiley, 1988. Аналогичные рекомендации применимы и к анализам с другими комплексами.
В самом распространенном варианте анализа ELISA твердую фазу покрывают одним из компонентов комплекса. Аликвоту исследуемого образца инкубируют с твердой фазой с твердым покрытием, и любой аналит, который может присутствовать, захватывается твердой фазой. После промывки для удаления остаточного образца и любых посторонних материалов, которые он может содержать, к твердой фазе добавляют второй связывающий агент, специфичный по отношению к аналиту и конъюгированный с энзимом. Во время второй инкубации любой аналит, захваченный на твердой фазе, будет связываться с конъюгатом. После второй промывки для удаления любого несвязанного конъюгата к твердой фазе добавляют хромогенный субстрат для энзима. Любой присутствующий энзим начнет превращать субстрат в хромофорный продукт. По истечении определенного времени количество образовавшегося продукта можно измерить с помощью спектрофотометра, сразу же или после проведения останавливающей реакции.
Должно быть понятно, что выше было приведено в общем виде краткое описание процедуры для биологического анализа и что из уровня техники известны многие варианты, включающие использование флуорогенных и люминогенных субстратов для анализа ELISA, прямой метки для второго компонента комплекса, содержащей флуоресцентную или люминесцентную молекулу (в этом случае процедура не называется ELISA, но содержит весьма схожие с ней операции), а также нуклеиновых кислот или других специфичных комплексообразующих агентов в качестве связывающих агентов вместо антител. Однако все подобные анализы предусматривают, что жидкие образцы, например кровь, сыворотка и моча, отбираются из пробирки с образцом и затем диспенсируются в твердую фазу. Перед диспенсированием в твердую фазу образцы могут разбавляться; альтернативно, они подаются в микропланшеты с глубокими лунками и разбавляются in situ, после чего разбавленный аналит переносится на функциональную твердую фазу.
Самым распространенным типом твердой фазы является стандартная емкость для образцов, известная как микропланшет, которая является удобной для хранения и может использоваться с широким набором биологических образцов. Микропланшеты имеются в продаже, начиная с шестидесятых годов; они изготавливаются, например, из полистирола, поливинилхлорида, перспекса или люцита (акрилового пластика). Их размеры составляют 12,7 см в длину, 8,5 см в ширину и 1,4 см в высоту. Микропланшеты из полистирола являются особенно предпочтительными вследствие повышенной оптической прозрачности полистирола, облегчающей визуальную интерпретацию результатов любой реакции. При этом микропланшеты из полистирола являются компактными, легкими и хорошо моются. Микропланшеты, производимые заявителем изобретения, продаются под торговым наименованием "MICROTITRE"®. Известные микропланшеты содержат 96 лунок (часто именуемых также "микролунками"), которые расположены симметрично по схеме 8×12 микролунок. Максимальная емкость микролунок обычно составляет около 350 мкл. Однако обычно в микролунку подают 10-200 мкл жидкости. В некоторых вариантах микропланшетов микролунки могут быть сгруппированы в стрипы (линейки) по 8 или 12 лунок, которые могут переставляться и комбинироваться в держателе, чтобы получить заполненный планшет, имеющий обычные размеры.
Имеющиеся в продаже наборы обычно снабжаются средствами положительного и отрицательного контроля, которые используются для контроля качества и обеспечивают относительный уровень отсечения. После считывания микропланшета, в котором прошли требуемые процессы, результаты контроля сравниваются с подтвержденными значениями, подтвержденными изготовителем, чтобы удостовериться, что анализ был проведен правильным образом. После этого полученное значение используют, чтобы разделить образцы, давшие положительные и отрицательные результаты, и рассчитывают уровень отсечения. Для проведения количественных анализов обычно поставляются стандартные образцы, используемые для построения стандартной кривой, по которой можно, посредством интерполяции, определить концентрацию аналита в образце.
Следует отметить, что описанная процедура ELISA предусматривает много шагов, включая подачу образцов, инкубацию, промывку, перенос микропланшетов между различными операциями, считывание и анализ данных. В последние годы были разработаны системы с автоматическим выполнением шагов ("фаз"), входящих в процедуру ELISA, в том числе распределения образцов, разбавления, инкубации при определенных температурах, промывки, добавления энзима-конъюгата, добавления реагента, остановки реакции и анализа результатов. Пипеточный дозатор, применяемый для отбора и диспенсирования жидких образцов, использует одноразовые наконечники, которые автоматически сбрасываются после использования, чтобы исключить перекрестное загрязнение образцов, полученных от пациентов. Имеется множество автоматических проверок с целью гарантировать, что используются соответствующие объемы, временные интервалы, длины волн и температуры. Предусмотрены полная валидация и мониторинг передачи и анализа данных. В настоящее время автоматизированные устройства для выполнения процедур ELISA широко применяются в лабораториях, например, в фармацевтических компаниях, ветеринарных и ботанических лабораториях, больницах и университетах для диагностики in-vitro, например для тестирования на болезни и инфицирование, а также в процессе разработки новых вакцин и лекарств.
В продаже имеются наборы для осуществления анализа ELISA, состоящие из микропланшетов с микролунками, на которые изготовителем нанесено покрытие, содержащее определенные антитела (или антигены). Например, в случае набора для диагностики на антиген гепатита В изготовитель набора поместит в микролунки в составе микропланшета, в виде суспензии, антитела для антигепатита В. Затем проводят инкубацию микропланшета в течение заданного периода времени, в течение которого антитела фиксируются на стенках микролунок до уровня заполнения жидкостью (соответствующего обычно половине объема микролунки). Далее микролунки промывают, получая микропланшет с микролунками, стенки которых равномерно покрыты антителами для анти-гепатита В до уровня, которого в них достигала жидкость.
Лаборатория, проводящая тесты, будет получать большое количество пробирок, содержащих, например, жидкости организма от различных пациентов. С помощью пипеточного дозатора определенное количество жидкости отбирают из пробирки и подают в одну или более микролунок микропланшета, которые были предварительно подготовлены изготовителем, как это описано выше. Если представляется желательным провести тестирование пациента на различные заболевания, полученная от него жидкость должна быть подана в различные микропланшеты, каждый из которых имеет нанесенное изготовителем покрытие с различным связывающим агентом. После этого каждый микропланшет может быть обработан отдельно, чтобы детектировать соответствующую болезнь. Должно быть понятно, что для проведения анализа с использованием различных аналитов нужно иметь группу микропланшетов и вводить аликвоты одного и того же образца в различные микропланшеты. Это требует выполнения большого количества шагов и наличия инкубаторов и промывочных станций, способных практически одновременно обрабатывать несколько микропланшетов. Соответственно, приборы в составе автоматизированных систем также должны иметь по несколько инкубаторов; кроме того, чтобы избежать конфликтов между микропланшетами, отвечающими различным требованиям, необходимы сложные программы. Для работы вручную необходимы несколько лаборантов, иначе производительность оказывается слишком низкой. Имеется возможность группировать на одном носителе стрипы микролунок с различными покрытиями, вводить аликвоты одного и того же образца в ячейки различных типов и затем проводить анализ ELISA в таком, комбинированном микропланшете. Однако различные ограничения на проведение анализа делают такую комбинацию трудноосуществимой, и специалистам известно, что комбинирование стрипов описанным образом может приводить к ошибкам в отождествлении результатов, в то время как изготовление микропланшетов с несколькими различными покрытиями в различных микролунках создает трудности для контроля качества.
Традиционные методики ELISA концентрировались на проведении одного и того же теста с микропланшетом, содержащим множество образцов от различных пациентов, или на детектировании присутствия у этих пациентов одного или более аналитов без определения того, какой именно из возможных аналитов, действительно, присутствует. Например, типичным является определение с помощью единственной микролунки, имеет ли пациент антитела к ВИЧ-1 или к ВИЧ-2 или антигены ВИЧ-1 или ВИЧ-2, без определения того, какой именно аналит присутствует, и соответствует ли он антителам или антигенам для ВИЧ.
Однако разрабатывается новое поколение анализов, способное осуществлять мультиплексирование. Мультиплексирование позволяет проводить группу различных тестов по одному и тому же образцу, полученному от пациента.
Новый подход к мультиплексированию состоит в разработке микропланшета, содержащего 96 лунок, в каждую из которых помещен набор различных антител. Такой набор может состоять из пятен по 20 нл с диаметром 350 мкм. Пятна расположены с шагом 650 мкм. Каждое пятно соответствует антителам, отличным от остальных.
По сравнению с традиционными методиками ELISA, в которых каждый планшет для образцов предназначен для тестирования на один интересующий аналит, мультиплексирование позволяет получить в одном анализе большее количество точек данных и, следовательно, больше информации. Способность объединять в одном исследовании несколько тестов может дать большую экономию времени и затрат. Мультиплексирование позволяет также сократить площадь, занимаемую автоматическим устройством.
Несмотря на значительные достоинства существующих методик ELISA и разрабатываемых новых методик, продолжает оставаться желательным создание планшета для образцов и соответствующих автоматизированных устройств, имеющих улучшенный формат и обеспечивающих повышенную гибкость по сравнению с существующими устройствами для осуществления анализа ELISA.
В дополнение к процедурам ELISA известно также использование гибридных проб для тестирования на наличие ДНК- или РНК-последовательностей. Подобная проба обычно содержит фрагмент ДНК или РНК, который используется для обнаружения присутствия нуклеотидных последовательностей, комплементарных к ДНК- или РНК-последовательности в пробе. Гибридная проба гибридизируется в односпиральную (одноцепочечную) нуклеиновую кислоту (например, ДНК или РНК), базовая последовательность которой позволяет ей взаимодействовать с анализируемым образцом благодаря комплементарности гибридной пробы и образца. Гибридная проба может быть помечена молекулярным маркером, таким как радиоактивная или, более предпочтительно, флуоресцентная молекула. Пробы неактивны до того, как произойдет гибридизация; в этот момент происходит конформационное преобразование и молекулярный комплекс становится активным и способным к флуоресценции, которая может быть обнаружена путем визуализации под действием ультрафиолетового (УФ) излучения. Таким образом, посредством визуализации пробы УФ излучением детектируются ДНК-последовательности или РНК-транскрипты, имеющие схожесть последовательностей, от умеренной до значительной, с последовательностью пробы.
В патенте US 5620853 (принадлежащем фирме Chiron Corporation) описано устройство для проведения анализа с целью обнаружения аналита в жидком образце. Известное устройство содержит лунку, сформованную таким образом, что у нее имеются выступающие из дна пальцы, в которые может быть помещена гранула реагента. Гранула реагента захватывается пальцами, но все же она может смещаться вверх и вниз в пределах высоты пальцев. Известное устройство построено таким образом, чтобы гранула реагента максимально возможным образом взаимодействовала с потоком реагента, причем для получения результата используется сигнал, поступающий из-под гранулы.
С устройством, описанным в US 5620853, связано много проблем.
Во-первых, поскольку гранулы реагента могут свободно двигаться вверх и вниз в пределах высоты пальцев, существует вероятность того, что при проведении анализа или считывания данных гранула реагента застрянет на нежелательной высоте. Главное, лунка имеет довольно сложную и неудобную конструкцию, причем любое смещение или повреждение пальцев может привести к застреванию гранулы реагента на нежелательной высоте. Наличие выступающих из основания лунки пальцев делает их легко повреждаемыми, особенно на шагах подачи образца и промывки. Если гранула реагента застревает между пальцами на нежелательной высоте, это с высокой вероятностью неблагоприятно отразится на точности анализа.
Во-вторых, конструкция лунки с пальцами, приспособленными для приема единственной гранулы реагента, такова, что жидкость подается в лунку в непосредственной близости от гранулы, так что гранула покрывается жидкостью во время повышения ее уровня. Для отдельной лунки требуется около 300 мкл жидкости. В US 5620853 описан также вариант, в котором различные лунки сообщаются между собой. В таком варианте для каждой лунки также требуется около 300 мкл жидкости. Поэтому должно быть понятно, что устройство с сообщающимися лунками по сравнению с традиционными системами требует повышенного расхода жидкости.
В-третьих, наличие пальцев снижает максимальную плотность расположения лунок при заданном размере планшета для образцов, так что с таким планшетом можно провести меньшее количество анализов.
В-четвертых, вариант со связанными лунками согласно US 5620853 особенно подвержен перекрестным помехам.
В-пятых, описанное в US 5620853 устройство построено так, что когда используется единственная гранула, на однородность жидкости влияют выступающие пальцы. Вполне возможно наличие зон внутри лунки, которые будут удерживать несмешанную жидкость. Серьезная проблема, возникающая в варианте со связанными лунками, состоит в том, что любая жидкость, которая должна пройти над всеми гранулами, при переходе из одной лунки в другую должна двигаться по извилистому пути. Это будет создавать серьезные трудности в отношении перемешивания жидкости и повторяемости условий от гранулы к грануле. Схема с одиночными лунками полностью отличается от взаимосвязанной линейки лунок, описанной в US 5620853. Поэтому два различных варианта будут иметь существенно различные параметры для жидкости. Это с большой вероятностью будет приводить к зависимости поведения жидкости от того, какой формат (с одиночными или связанными лунками) был использован. Хотя в теории два различных варианта могут градуироваться независимо, это может привести к повышению стоимости и снижению производительности.
Наконец, лунка, описанная в US 5620853, относительно сложна в изготовлении и, вероятно, при ее изготовлении будут возникать проблемы надежности. Тонкие длинные пальцы трудно изготовить формованием, причем они могут быть повреждены как при производстве, так и в процессе использования. Кроме того, на вершине пальцев имеется выступ, который должен соответствовать вырезу в пресс-форме. При выбрасывании готового изделия пальцы должны изгибаться, чтобы данный выступ прошел мимо компонентов пресс-формы. Подобный процесс изготовления, как правило, представляется нежелательным, поскольку имеет низкую надежность. Далее, любое изменение параметров процесса с высокой вероятностью затруднит выведение изделия из пресс-формы и потребует изменения ее параметров с учетом заданных допусков. Взаимное положение пальцев может быть критичным для обеспечения правильного перемещения гранулы реагента вверх и вниз, а также для предотвращения выхода гранулы реагента за пределы пальцев по высоте. На практике это положение может оказаться трудновыполнимым при массовом производстве. Нужно также отметить, что конструкции вариантов с одиночными и с сообщающимися лунками сильно отличаются. В результате для них потребуются различные комплекты инструментов, что также заметно увеличит сложность изготовления. При крупномасштабном производстве сочетание конструктивных особенностей и проблем обеспечения качества сделают данный планшет для образцов чрезмерно дорогим.
В US 2009/0069200 описано устройство для приготовления биомолекулярных систем. Согласно методике, описанной в US 2009/0069200, сферические гранулы помещают в лунки, которые имеют квадратное поперечное сечение. Сферические гранулы не обеспечивают герметичное уплотнение по периметру стенки лунки. Как результат, жидкость, поднимаясь со дна выполненных в лунке гнезд, проходит рядом с гранулами и над их верхней частью, так что гранулы оказываются полностью погруженными в жидкость. С такой системой связан ряд проблем, которые будут подробно рассмотрены далее.
Раскрытие изобретения
В связи с изложенным представляется желательным создать улучшенный планшет для образцов, обеспечивающий фиксацию гранул реагента.
Согласно одному аспекту изобретения создан планшет для образцов, содержащий одну или более лунок для образцов, причем единственная или каждая из лунок имеет основание и одно или более открытых сквозных отверстий, выполненных в основании.
Планшет характеризуется тем, что при его использовании гранула (микросфера) реагента удерживается или фиксируется в указанном сквозном отверстии с формированием, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное сквозное отверстие.
Единственное или каждое сквозное отверстие проходит от дна лунки для образцов к нижней (задней) поверхности планшета для образцов. Как следствие, если гранула реагента не зафиксирована в открытом сквозном отверстии, то любая жидкость, попавшая в лунку для образцов, может вытечь из нее через сквозное отверстие.
Согласно другому аспекту изобретения создан планшет для образцов, содержащий одну или более лунок для образцов, причем единственная или каждая лунка планшета имеет основание и одно или более углублений, выполненных в основании.
Планшет характеризуется тем, что при его использовании гранула (микросфера) реагента удерживается или фиксируется в указанном углублении с формированием, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное углубление.
Должно быть понятно, что круглая гранула, помещенная в отверстие, гнездо или углубление с квадратным поперечным сечением, не может формировать непроницаемое для текучей среды периферийное уплотнение относительно стенки, образующей это отверстие, гнездо или углубление. Под формированием непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения в контексте описания понимается образование барьера для текучей среды по всему периметру сечения гранулы и стенки, образующей отверстие, гнездо или углубление.
Согласно изобретению гранулы (микросферы) реагента удерживаются (фиксируются) в сквозном отверстии или углублении, образованном в основании планшета для образцов, причем каждая гранула (микросфера) реагента образует уплотнение, непроницаемое для текучей среды (в частности для воды и/или воздуха), вдоль всего наружного диаметра (периферии) гранулы (микросферы) реагента.
Должно быть понятно, что сферические гранулы реагента в системе согласно US 2009/0069200 не формируют непроницаемое для текучей среды периферийное уплотнение относительно квадратной стенки, образующей гнездо, ячейку или выемку (далее - гнездо).
Введение гранулы (микросферы) реагента в сквозное отверстие или углубление, по существу, делает невозможным прохождение жидкости с одной стороны сквозного отверстия или углубления на другую его сторону мимо гранулы (микросферы), которая формирует герметичное уплотнение по всей периферии гранулы (микросферы).
Разработаны различные варианты изобретения.
Если планшет для образцов содержит одно или более углублений, то единственное или каждое углубление предпочтительно представляет собой глухое углубление, закрытое на одном своем конце. Отличие глухого углубления от сквозного отверстия состоит в том, что в отсутствие зафиксированной в глухом углублении гранулы реагента жидкий образец, поданный в лунку для образца, не будет вытекать из этой лунки.
Открытые сквозные отверстия или углубления, выполненные в основании лунки, могут быть, по существу, цилиндрическими и иметь диаметр, меньший, чем диаметр введенной в него гранулы (микросферы) реагента. В результате гранула (микросфера) реагента удерживается (фиксируется) в сквозном отверстии или в углублении посредством посадки с натягом или фрикционной посадки.
Согласно другому варианту открытое сквозное отверстие или углубление может быть коническим и иметь первый диаметр, который больше чем диаметр гранулы (микросферы) реагента, введенной в это отверстие (углубление), и второй диаметр, который меньше чем диаметр гранулы (микросферы) реагента, введенной в это отверстие (углубление). Наличие соответствующего сужения обеспечивает удерживание гранул (микросфер) реагента в сквозном отверстии.
По отношению к той части основания, на которую при использовании планшета подается жидкий образец, первый диаметр предпочтительно является дистальным, а второй диаметр - проксимальным.
Альтернативно, первый диаметр может быть проксимальным по отношению к той части основания, на которую при использовании планшета подается жидкий образец, а второй диаметр - дистальным.
Сужающаяся часть сквозного отверстия или углубления может иметь угол конусности, выбранный из группы, состоящей из следующих угловых интервалов: (i) <0,5°; (ii) 0,5°; (iii) 0,5°-1°; (iv) 1°-2°; (v) 2°-4°; (vi) 4°-6°; (vii) 6°-8°; (viii) 8°-10°; (ix) >10°.
На входе отверстие или углубление предпочтительно является круглым.
Сквозное отверстие или углубление предпочтительно имеет поперечное сечение круглой формы. Согласно одному варианту сквозные отверстия или углубления могут иметь поперечное сечение круглой формы на отрезке, составляющем по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% полной длины (глубины) сквозного отверстия или углубления.
Диаметр сквозного отверстия или углубления предпочтительно выбран из группы, включающей следующие интервалы: (i) <0,5 мм; (ii) 0,5-1,0 мм; (iii) 1,0-1,5 мм; (iv) 1,5-2,0 мм; (v) 2,0-2,5 мм; (vi) 2,5-3,0 мм; (vii) 3,0-3,5 мм; (viii) 3,5-4,0 мм; (ix) 4,0-4,5 мм; (х) 4,5-5,0 мм; (xi) <5,0 мм; (xii) >5,0 мм.
Глубина сквозного отверстия или углубления предпочтительно выбрана из группы, включающей следующие интервалы: (i) <0,5 мм; (ii) 0,5-1,0 мм; (iii) 1,0-1,5 мм; (iv) 1,5-2,0 мм; (v) 2,0-2,5 мм; (vi) 2,5-3,0 мм; (vii) 3,0-3,5 мм; (viii) 3,5-4,0 мм; (ix) 4,0-4,5 мм; (х) 4,5-5,0 мм; (xi) <5,0 мм; и (xii) >5,0 мм.
Согласно одному варианту основание по меньшей мере одной лунки для образцов (или каждой лунки) предпочтительно снабжено группой открытых сквозных отверстий и/или углублений, причем по меньшей мере некоторые (или все) эти открытые сквозные отверстия и/или по меньшей мере некоторые (или все) эти углубления расположены таким образом, что отсутствует линия прямого видения между гранулами реагента, удерживаемыми или зафиксированными в смежных открытых сквозных отверстиях и/или в смежных углублениях.
Кроме того, по меньшей мере одна лунка для образцов (или каждая из выполненных в основании лунок) предпочтительно может быть снабжена группой открытых сквозных отверстий и/или углублений, а основание может быть разделено на сегменты, взаимно смещенные по высоте.
При этом основание по меньшей мере одной или каждой лунки для образцов может быть снабжено группой открытых сквозных отверстий и/или углублений, а лунка может быть дополнительно снабжена одной (одним) или более заслонок (разделителей), предпочтительно разделяющих указанное основание по меньшей мере на первую и вторую области.
Одна (один) или более указанных заслонок (разделителей) предпочтительно выполнены с возможностью: (i) ослаблять или устранять попадание света, отраженного от одной или более гранул реагента, находящихся в указанной первой области, на одну или более гранул реагента, находящихся в указанной второй области, и/или (ii) ослаблять или устранять попадание света, отраженного от одной или более гранул реагента, находящихся в указанной второй области, на одну или более гранул реагента, находящихся в указанной первой области.
Чтобы облегчить введение гранул (микросфер) реагента в одно или более открытых сквозных отверстий или углублений, в этом отверстии или углублении (в этих отверстиях или углублениях) можно выполнить внутреннюю фаску или расширенную часть.
Одна или более лунок предпочтительно содержат по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 сквозное отверстие или углубление, каждое из которых выполнено с возможностью приема, в процессе использования указанного планшета, гранул (микросфер) реагента.
Сквозные отверстия или углубления, выполненные в основании лунки, предпочтительно размещены:
(i) по окружности вокруг центральной части лунки для образцов или
(ii) по окружности вокруг центрального сквозного отверстия или углубления, или,
(iii) по существу, с тесным расположением, или,
(iv) по существу, симметричным или асимметричным образом, или,
(v) no существу, вдоль прямой или кривой линии, или,
(vi) по существу, регулярным или иррегулярным образом, или
(vii) в виде прямоугольного массива, или
(viii) вдоль одной или более концентричных окружностей при отсутствии гнезда или углубления в центре основания.
Планшет для образцов предпочтительно содержит лунки для образцов, размещенные в формате А×В, причем значения А и В выбраны из группы, состоящей из: (i) 1; (ii) 2; (iii) 3; (iv) 4; (v) 5; (vi) 6; (vii) 7; (viii) 8; (ix) 9; (х) 10; (xi) более 10.
Согласно варианту одна или более лунок могут быть связаны с одной или более другими лунками одним или более ломкими участками или одним или более ломкими соединениями, так что каждый планшет для образцов может быть разделен пользователем на планшеты для образцов, имеющие меньшие размеры, стрипы или индивидуальные лунки для образцов.
Планшет для образцов может представлять собой планшет для образцов, предназначенный для иммунного анализа. Альтернативно, такой планшет может содержать гибридную пробу для обнаружения наличия образцов комплементарной ДНК или РНК.
Планшет для образцов предпочтительно содержит основание, снабженное охватываемым, охватывающим или иным участком для фиксации указанного планшета на соответствующем охватываемом, охватывающем или ином фиксаторе, выполненном на держателе планшетов.
Согласно другому аспекту изобретения разработана комбинация планшета для образцов, описанного выше, и одной или более гранул (микросфер) реагента, введенных в одно или более указанных гнезд одной или более лунок для образцов.
По меньшей мере, некоторые или, по существу, все гранулы (микросферы) реагента предпочтительно содержат указанный реагент или покрыты им, при этом указанный реагент выбран и расположен с возможностью проведения с его использованием анализа на наличие интересующего аналита в образце жидкости.
Согласно альтернативному варианту по меньшей мере некоторые или, по существу, все гранулы (микросферы) реагента содержат нуклеиново-кислотный зонд или покрыты им, при этом указанный зонд выбран и расположен с возможностью гибридизации ДНК или РНК посредством одноцепочечной нуклеиновой кислоты.
Согласно другому аспекту изобретения разработана комбинация держателя планшетов и планшета для образцов, описанного выше.
Держатель планшетов предпочтительно содержит охватываемый, охватывающий или иной фиксатор для надежной фиксации планшета для образцов на держателе планшетов.
Согласно одному из аспектов изобретения разработано автоматизированное устройство, содержащее:
один или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента;
планшет для образцов, описанный выше, и
систему управления, выполненную с возможностью управления диспенсированием гранул (микросфер) реагента из указанных одного или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента в одну или более лунок планшета для образцов.
Единственный или каждый из диспенсеров гранул (микросфер) реагента предпочтительно содержит:
корпус шприцевого дозатора, имеющий кольцевую камеру, окружающую продольный канал и выполненную с возможностью направлять, в процессе использования указанного устройства, находящиеся в ней гранулы (микросферы) реагента, к камере, выполненной в указанном канале;
плунжер, установленный в продольном канале, и
втулку или сужающийся участок.
При этом плунжер выполнен с возможностью диспенсирования, в процессе использования указанного устройства, гранулы (микросферы) реагента из указанной камеры во втулку или сужающийся участок.
Согласно аспекту изобретения разработано устройство для анализа жидкости на наличие одного или более интересующих аналитов, содержащее:
один или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента и
планшет для образцов, описанный выше.
Согласно аспекту изобретения разработан способ, включающий:
обеспечение наличия планшета для образцов, содержащего одну или более лунок для образцов, причем одна или каждая лунка для образцов имеет основание и одно или более открытых сквозных отверстий, выполненных в основании, и
удерживание или фиксацию гранулы или микросфера реагента в сквозном отверстии с формированием, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное сквозное отверстие.
Согласно другому аспекту изобретения разработан способ, включающий:
обеспечение наличия планшета для образцов, содержащего одну или более лунок для образцов, причем одна или каждая лунка для образцов имеет основание и одно или более углублений, выполненных в основании, и
удерживание или фиксацию гранулы или микросферы реагента в углублении с формированием, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное углубление.
Согласно еще одному аспекту изобретения разработан способ, включающий:
обеспечение наличия одного или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента;
обеспечение наличия описанного выше планшета для образцов и
управление диспенсированием гранул (микросфер) реагента из указанных одного или более диспенсеров в одну или более лунок для образцов.
Согласно аспекту изобретения разработан способ использования планшета для образцов при анализе образца на наличие различных аналитов, включающий:
обеспечение наличия описанного выше планшета для образцов;
введение гранул (микросфер) реагента в одно или более сквозных отверстий или углублений лунки для образцов и
добавление образца в лунку для образцов.
Гранулы (микросферы) реагента могут вводиться в одно или более гнезд лунок для образцов либо изготовителем планшета для образцов, либо конечным пользователем.
Согласно аспекту изобретения разработан способ применения энзим-связывающего иммуносорбентного анализа (ELISA) для определения в образце антигена или антитела, включающий:
обеспечение наличия описанного выше планшета для образцов;
введение одной или более гранул (микросфер) реагента в одно или более сквозных отверстий или углублений лунки для образцов и
добавление образца в лунку для образцов.
Гранулы (микросферы) реагента могут вводиться в одно или более гнезд лунок для образцов либо изготовителем планшета для образцов, либо конечным пользователем.
Согласно другому аспекту изобретения разработан способ применения нуклеиново-кислотного зонда для обнаружения в образце ДНК- или РНК-последовательностей, включающий:
обеспечение наличия описанного выше планшета для образцов;
введение одной или более гранул (микросфер) реагента в одно или более сквозных отверстий или углублений лунки для образцов и
добавление образца в лунку для образцов.
Гранулы (микросферы) реагента могут вводиться в одно или более гнезд лунок для образцов либо изготовителем планшета для образцов, либо конечным пользователем.
Кроме того, представлен способ анализа на наличие в образце различных аналитов, включающий:
введение одной или более гранул (микросфер) реагента в одно или более сквозных отверстий или углублений одной или более лунок планшета для образцов при обеспечении удерживания или фиксации гранулы или микросферы реагента в сквозном отверстии с формированием, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное сквозное отверстие или углубление.
Гранулы (микросферы) реагента могут вводиться в одно или более гнезд лунок для образцов либо изготовителем планшета для образцов, либо конечным пользователем.
Согласно аспекту изобретения разработан способ детектирования аналита, включающий:
обеспечение наличия описанного выше планшета для образцов, в котором в одном или более открытых сквозных отверстий или углублений, выполненных в основании планшета для образцов, удерживаются или фиксируются одна или более гранул (микросфер) реагента;
добавление образца в планшет для образцов и
детектирование связывания содержащегося в образце аналита с гранулой (микросферой) реагента.
Способ предпочтительно включает дополнительно одну или более из следующих операций:
(i) инкубацию планшета для образцов и/или
(ii) промывку планшета для образцов, и/или
(iii) отсос жидкости из планшета для образцов, и/или
(iv) добавление конъюгата с энзимом в планшет для образцов, и/или
(v) добавление визуализирующего агента в планшет для образцов, и/или
(vi) осуществление визуального анализа планшета для образцов.
Согласно следующему аспекту изобретения разработан набор для осуществления ELISA, содержащий:
один или более планшетов для образцов, подобных описанным выше, и множество гранул (микросфер) реагента с покрытием из реагента, содержащего антитело, антиген или иную биомолекулу.
Согласно другому аспекту изобретения разработан набор для осуществления процедуры, использующей нуклеиново-кислотный зонд, при этом набор содержит:
один или более планшетов для образцов, подобных описанным выше, и множество гранул (микросфер) реагента с покрытием из ДНК- или РНК-последовательности.
Одна или более гранул (микросфер) реагента предпочтительно удерживаются или фиксируются в одном или более сквозных отверстиях или углублениях, выполненных в основании планшета для образцов.
Согласно аспекту изобретения разработан набор для детектирования аналита, содержащий:
один или более описанных выше планшетов для образцов и множество гранул (микросфер) реагента, удерживаемых или зафиксированных в одном или более сквозных отверстиях или углублениях, выполненных в основании планшета для образцов, с формированием множеством гранул (микросфер) реагента, по существу, непроницаемых для жидкости периферийных уплотнений со стенкой основания, образующей указанные сквозные отверстия или углубления.
Согласно другому аспекту изобретения разработан способ изготовления планшета для образцов, включающий:
обеспечение наличия планшета для образцов, содержащего одну или более лунок, каждая из которых имеет основание, и
формирование в одном или более оснований одного или более сквозных отверстий или углублений, выполненных с возможностью удерживать или фиксировать гранулу (микросферу) реагента в сквозном отверстии или углублении с формированием, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное сквозное отверстие или углубление.
Данный способ предпочтительно предусматривает введение одной или более гранул (микросфер) реагента в сквозные отверстия или углубления таким образом, чтобы единственная или каждая гранула (микросфера) реагента формировала, по существу, непроницаемое для текучей среды периферийное уплотнение относительно стенки указанного основания, образующей сквозное отверстие или углубление.
Согласно аспекту изобретения разработан планшет для образцов, содержащий лунку для образцов, имеющую основание, в котором выполнено углубление с диаметром, меньшим, чем диаметр гранулы, вводимой в лунку для образцов.
Диаметр углубления предпочтительно меньше диаметра гранулы по меньшей мере на 5%.
Углубление предпочтительно снабжено внутренней фаской.
Планшет для образцов предпочтительно содержит множество лунок для образцов.
Лунка для образцов предпочтительно содержит группу углублений.
Одно или более углублений предпочтительно являются круглыми, т.е. имеют в поперечном сечении круглую форму.
Согласно варианту изобретения гранула в процессе использования планшета, по существу, удерживается или фиксируется в одном из углублений или гнезд посредством посадки с натягом или фрикционной посадки относительно боковой поверхности этого углубления или гнезда.
Согласно варианту прикладываемое к грануле заданное усилие сжимает ее и/или деформирует углубление, чтобы обеспечить или усилить посадку с натягом или фрикционную посадку гранулы в углубление или гнездо.
Согласно предпочтительному варианту гранула формирует с углублением уплотнение, по существу, непроницаемое для текучей среды.
Одно или более углублений предпочтительно не содержат сужающейся части.
Лунка для образцов предпочтительно имеет от 2 до 20 углублений.
Согласно варианту лунка для образцов содержит по меньшей мере 10 углублений.
Углубления могут быть размещены по окружности вокруг центральной части лунки для образцов.
Согласно менее предпочтительному варианту центральная часть может содержать центральное углубление.
Согласно предпочтительному варианту центральная часть не содержит углубления.
Углубления предпочтительно размещены, по существу, симметричным или регулярным образом.
Согласно менее предпочтительному варианту углубления размещены, по существу, асимметричным или иррегулярным образом.
Согласно одному варианту углубления размещены, по существу, вдоль прямой линии.
Согласно другому варианту они размещены, по существу, вдоль кривой линии.
Множество лунок для образцов предпочтительно размещено в формате А×В, где А и В - это ортогональные оси, причем количество лунок вдоль оси А может быть большим, меньшим или равным их количеству вдоль оси В.
Согласно одному варианту количество лунок вдоль оси А или В равно по меньшей мере 2.
Предпочтительное количество лунок вдоль оси А или В составляет от 2 до 15.
Согласно варианту по меньшей мере одна из лунок в составе группы лунок для образцов связана с другой лункой для образцов посредством ломкого участка.
Планшет для образцов предпочтительно содержит основание, снабженное участком для фиксации указанного планшета на соответствующем фиксаторе, выполненном на держателе планшетов.
Согласно варианту планшет для образцов дополнительно содержит гранулу, которая предпочтительно связана с зондом.
Зонд предпочтительно является нуклеиновой кислотой, антителом, фрагментом антитела, белком, пептидом, аптамером или иным химическим соединением. Согласно одному из вариантов зонд является олигонуклеидом.
Планшет для образцов предпочтительно содержит группу зондов, причем одна подгруппа этой группы отличается от другой ее подгруппы.
Группа зондов предпочтительно содержит по меньшей мере 3 различных зонда.
Согласно другому аспекту изобретения разработана система подачи гранул, содержащая:
диспенсер гранул;
планшет для образцов, содержащий лунку для образцов, имеющую основание, в котором выполнено углубление, имеющее диаметр, меньший, чем диаметр гранулы, подаваемой в лунку, и
систему управления, сконфигурированную для управления диспенсированием гранул из диспенсера гранул в планшет для образцов.
Диспенсер гранул предпочтительно содержит:
корпус шприцевого дозатора, имеющий кольцевую камеру, окружающую продольный канал и выполненную с возможностью направлять гранулу реагента из этой камеры к камере, выполненной в указанном канале;
плунжер, установленный в продольном канале, и
втулку или сужающийся участок.
При этом плунжер выполнен с возможностью диспенсирования гранулы из указанной камеры во втулку или сужающийся участок.
Диспенсер гранул предпочтительно сконфигурирован с возможностью автоматически диспенсировать множество гранул.
Согласно другому аспекту изобретения разработан способ подачи гранул, включающий:
обеспечение наличия диспенсера гранул, содержащего гранулу;
обеспечение наличия планшета для образцов, содержащего лунку для образцов, имеющую основание, в котором выполнено углубление с диаметром, меньшим, чем диаметр гранулы, и
управление диспенсированием гранулы из диспенсера гранул в планшет для образцов.
Диспенсирование предпочтительно производится автоматически.
Согласно еще одному аспекту разработан набор для детектирования аналита, содержащий:
множество гранул и
планшет для образцов, содержащий лунку для образцов, имеющую основание, в котором выполнено углубление с диаметром, меньшим, чем диаметр гранулы из указанного множества гранул.
Множество гранул предпочтительно содержит один или более зондов.
Зонд предпочтительно содержит нуклеиновую кислоту, антитело, фрагмент антитела, белок, пептид, аптамер или иное химическое соединение.
Согласно одному из вариантов зонд является олигонуклеотидом.
Согласно другому аспекту изобретения разработан способ детектирования аналита, включающий:
добавление образца в планшет для образцов, содержащий лунку для образцов, имеющую основание, в котором выполнено углубление, содержащее зонд и имеющее диаметр, меньший, чем диаметр гранулы, содержащей зонд, и
детектирование связывания аналита в образце с зондом.
Планшет для образцов предпочтительно содержит множество зондов, что позволяет детектировать множество аналитов.
В планшет для образцов предпочтительно вводят множество образцов.
Описан также планшет для образцов, содержащий одну или более лунок, причем единственная или каждая лунка имеет основание с одним или более гнездами или углублениями, а единственное или каждое гнездо или углубление представляет собой гнездо с сужающейся частью. При использовании планшета гранула (микросфера) реагента, по существу, удерживается (фиксируется) в гнезде посредством сужающейся части.
Гнездо, имеющее сужающуюся часть, не должно рассматриваться, например, как мелкая или маленькая выемка, в которую гранула (микросфера) реагента может быть помещена, но в которой эта гранула (микросфера) не может удерживаться (фиксироваться).
Планшет для образцов согласно изобретению обладает преимуществами по сравнению с планшетом для образцов, описанным в US 5620853.
Согласно предпочтительному варианту при использовании планшета гранула (микросфера) реагента, по существу, удерживается (фиксируется) в гнезде посредством посадки с натягом или фрикционной посадки в сужающуюся часть гнезда.
Согласно предпочтительному варианту изобретения гранулы реагента предпочтительно вводятся в планшет для образцов, имеющий множество сужающихся отверстий или частей, которые обеспечивают надежное фиксирование или удерживание введенных гранул реагента в определенном положении. Для введения гранул реагента предпочтительно используется определенное усилие, которое предпочтительно выбирается достаточным для того, чтобы сжать гранулу реагента и/или деформировать сужающуюся часть гнезда и тем самым создать или улучшить качество посадки с натягом или фрикционной посадки в сужающейся части гнезда.
Планшет для образцов согласно изобретению характеризуется повышенной прочностью в процессе изготовления и на стадиях его использования, включая стадии введения гранул реагента в сужающиеся отверстия и последующего использования планшета для образцов. После того как гранулы реагента были введены в планшет для образцов, они предпочтительно не могут смещаться ни в каком направлении и, по существу, становятся фиксированной частью планшета. Угол конусности сужающейся части предпочтительно выбирают таким, чтобы гранулы реагента были заблокированы или иным образом надежно зафиксированы в отверстиях, что делает устройство по изобретению весьма надежным.
Согласно предпочтительному варианту при использовании планшета гранула реагента, по существу, рассматривается как удерживающаяся (зафиксированная) в гнезде, если плоскость планшета для образцов может быть наклонена относительно горизонтальной плоскости более чем на 10°, 20°, 30°, 40°, 50°, 60°, 70°, 80° или 90° или если планшет может быть перевернут.
Согласно предпочтительному варианту открытая сторона гнезда и/или поперечное сечение гнезда (например, на участке между его открытой стороной и основанием) имеют круглую форму. Однако в менее предпочтительных вариантах открытая сторона гнезда и/или его поперечное сечение могут быть, по существу, круглыми, эллиптическими, продолговатыми, треугольными, квадратными, прямоугольными, пятиугольными, шестиугольными, семиугольными, восьмиугольными, девятиугольными, десятиугольными и т.д.
Согласно предпочтительному варианту диаметр открытой стороны гнезда предпочтительно выбран из группы, включающей следующие интервалы: (i) <0,5 мм; (ii) 0,5-1,0 мм; (iii) 1,0-1,5 мм; (iv) 1,5-2,0 мм; (v) 2,0-2,5 мм; (vi) 2,5-3,0 мм; (vii) 3,0-3,5 мм; (viii) 3,5-4,0 мм; (ix) 4,0-4,5 мм; (х) 4,5-5,0 мм; (xi) <5,0 мм и (xii) >5,0 мм.
Согласно предпочтительному варианту диаметр открытой стороны гнезда предпочтительно превышает диаметр гранулы (микросферы) реагента. Если форма открытой стороны углубления отличается от круглой, минимальный размер поперечного сечения этой стороны предпочтительно превышает диаметр гранулы (микросферы) реагента.
Согласно предпочтительному варианту диаметр гнезда, предпочтительно на участке между открытой стороной гнезда и его основанием, предпочтительно по меньшей мере на 5% меньше диаметра гранулы (микросферы) реагента, и/или предпочтительно по меньшей мере на 5% меньше диаметра открытой стороны гнезда. Если поперечное сечение гнезда имеет некруглую форму, то наименьший размер этого поперечного сечения, предпочтительно на участке между открытой стороной гнезда и его основанием, выбирается предпочтительно по меньшей мере на 5% меньшим, чем диаметр гранулы (микросферы) реагента, и/или предпочтительно по меньшей мере на 5% меньшим, чем диаметр открытой стороны гнезда.
Согласно предпочтительному варианту диаметр гнезда, предпочтительно на участке между открытой стороной гнезда и его основанием, предпочтительно выбран из группы, включающей следующие интервалы: (i) <0,5 мм; (ii) 0,5-1,0 мм; (iii) 1,0-1,5 мм; (iv) 1,5-2,0 мм; (v) 2,0-2,5 мм; (vi) 2,5-3,0 мм; (vii) 3,0-3,5 мм; (viii) 3,5-4,0 мм; (ix) 4,0-4,5 мм; (х) 4,5-5,0 мм; (xi) <5,0 мм и (xii) >5,0 мм.
Согласно предпочтительному варианту сужение сужающейся части предпочтительно выполнено, по существу, по линейному закону. Например, диаметр или периметр гнезда предпочтительно изменяется (например, уменьшается) по глубине углубления, по существу, линейно. Если поперечное сечение гнезда имеет некруглую форму, то определенный размер (например, наименьший) поперечного сечения гнезда или периметр этого сечения также предпочтительно изменяется (например, уменьшается) по глубине гнезда, по существу, линейно.
Согласно предпочтительному варианту гранулы реагента предпочтительно непрозрачны, а сигнал предпочтительно считывается только с верхней стороны гранулы. Нижняя часть гранулы, лежащая ниже линии плотного контакта с лункой, предпочтительно не вступает в контакт с жидкостью. В предпочтительном варианте при использовании планшета гранула реагента предпочтительно образует, в сочетании с сужающейся частью углубления, по существу, непроницаемое для текучей среды уплотнение, по существу, предотвращающее вытекание жидкости из углубления (лунки для образца) с обтеканием гранулы реагента. Благодаря этому планшет для образцов с введенными гранулами реагента согласно предпочтительному варианту весьма похож на планшет с пустыми традиционными лунками.
Согласно предпочтительному варианту гранулы реагента выступают над дном лунки для образцов, что позволяет избежать образования застойных зон вокруг верхней части гранулы, в которых может задерживаться жидкость.
Однако согласно другим менее предпочтительным вариантам гранулы реагента могут быть расположены так, чтобы не выступать над дном лунки для образцов. В таких вариантах они предпочтительно защищены, т.е. не подвержены повреждениям в процессе работы с планшетом, включая подачу жидкости или промывку. Согласно менее предпочтительному варианту глубина, на которой диаметр гнезда становится меньше диаметра гранулы реагента, равна радиусу гранулы реагента или превышает его, так что гранулы реагента не выступают над дном лунки планшета. Если поперечное сечение гнезда имеет некруглую форму, то предпочтительно равна или превышает радиус гранулы реагента та его глубина, на которой наименьший размер гнезда становится меньше диаметра гранулы реагента.
Гранулы вдавливаются или вводятся в гнезда, образованные в основании лунок для образцов. После ввода гранул реагента их верхние края согласно предпочтительному варианту выступают над дном лунок для образцов; альтернативно, согласно менее предпочтительным вариантам, они могут находиться на уровне дна лунок.
Согласно предпочтительному варианту гранула диаметром 2 мм может выступать на 0,5 мм над дном основания лунки для образцов. Согласно другим вариантам одна или более гранул реагента могут выступать над дном основания лунки для образцов на расстояние, соответствующее 0-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40% или >40% диаметра гранулы.
Согласно предпочтительному варианту глубина гнезда предпочтительно выбрана из группы, включающей следующие интервалы: (i) <0,5 мм; (ii) 0,5-1,0 мм; (iii) 1,0-1,5 мм; (iv) 1,5-2,0 мм; (v) 2,0-2,5 мм; (vi) 2,5-3,0 мм; (vii) 3,0-3,5 мм; (viii) 3,5-4,0 мм; (ix) 4,0-4,5 мм; (х) 4,5-5,0 мм; (xi) <5,0 мм и (xii) >5,0 мм.
Согласно предпочтительному варианту при использовании планшета гранула реагента предпочтительно не контактирует с основанием (дном) гнезда. Однако допустимы и менее предпочтительные варианты, в которых имеется контакт между гранулой реагента и основанием гнезда.
Желательный аспект предпочтительного варианта состоит в том, что, поскольку гранулы реагента предпочтительно вводятся так, что их верхняя часть лежит на уровне дна лунки, планшет для образцов согласно изобретению может быть использован с известными автоматизированными устройствами, использующими микропланшеты, без какого-либо модифицирования остальной аппаратуры. Кроме того, лунка согласно предпочтительному варианту является, по существу, цилиндрической, т.е. имеет свойства, аналогичные свойствам лунки традиционного микропланшета. Соответственно, характеристики лунки, в том числе связанные с работой с жидкостью, хорошо известны. Операции обработки согласно предпочтительному варианту, такие как подача жидкости, смешивание, промывка и инкубация, предпочтительно характеризуются теми же свойствами в отношении жидкости, что и при использовании традиционных микропланшетов.
Планшет для образцов согласно предпочтительному варианту позволяет использовать дозы жидкости до 800 мкл, однако, при использовании планшета в реальной ситуации, чтобы покрыть все гранулы реагента, находящиеся в основании планшета для образцов, достаточно лишь небольшой доли указанной полной дозы.
Другое желательное свойство планшета для образцов согласно предпочтительному варианту состоит в том, что жидкость может диспенсироваться прямо в центр лунки, причем планшет для образцов может быть выполнен так, что гнезда, служащие для фиксации гранул реагента, не находятся в центральной зоне лунки. Такое расположение особенно эффективно потому, что реагент, который предпочтительно покрывает гранулы, не будет случайно смываться с данных гранул под воздействием струи жидкости от промывочной головки или кончика пипетки.
Это достигается введением различных гранул реагента в различные гнезда одной лунки, благодаря чему достигается мультиплексирование тестов. Согласно предпочтительному варианту гранулы реагента по желанию могут с усилием вдавливаться в сужающиеся или несужающиеся отверстия, выполненные в основании лунки, что приводит к большой гибкости и к возможности использовать всю лунку с высокой эффективностью.
Планшет для образцов согласно варианту изобретения может содержать одну или более лунок диаметром 12 мм. Площадь поперечного сечения каждой лунки может составлять 58 мм2, причем в пределах традиционного микропланшета можно разместить 54 лунки такого размера. В каждую лунку для образцов можно вводить различные количества гранул. Отверстия в лунке могут иметь различные диаметры, чтобы, по желанию, в них можно было разместить гранулы различных размеров.
Согласно другим вариантам одна или более лунок могут содержать 6 гнезд диаметром 3,0 мм, 10 аналогичных гнезд диаметром 2,0 мм или 21 гнездо диаметром 1,75 мм. Центральная зона лунки предпочтительно свободна от подобных гнезд. Гнезда могут быть расположены вокруг центральной зоны лунки по одной или нескольким концентрическим окружностям или согласно другим паттернам.
Согласно одному варианту планшет для образцов содержит прямоугольный массив из 9×6 лунок. Если на одну лунку приходится по 6 гнезд, такой планшет может принять 324 гранулы реагента. Если же на одну лунку приходится по 10 гнезд, такой планшет может вместить 540 гранул реагента. При наличии 21 гнезда на лунку планшет может принять 1134 гранулы реагента.
Еще один желательный аспект изобретения заключается в том, что планшет для образцов согласно изобретению относительно прост в изготовлении по сравнению с другими известными решениями. Планшет для образцов может быть изготовлен посредством формования (в частности, прессования) с использованием открывающейся/закрывающейся пресс-формы, что позволяет обеспечить высокую производительность и надежность. Конструкция литьевой пресс-формы для изготовления планшетов для образцов проста и не требует формования вырезов или тонких деталей. Благодаря этому легко может быть организовано производство планшетов, имеющих различные форматы. Инструмент, обеспечивающий формирование лунки для образцов с 6 гнездами, может быть легко адаптирован для производства лунок с другим количеством гнезд (например равным 21).
Еще одно преимущество предпочтительного варианта состоит в том, что можно легко добиться аттестации различных конструкций и форматов лунок, поскольку протоколы проведения исследований могут оставаться, по существу, такими же. Подача жидкости и инкубация не изменятся, а процедура промывки, в крайнем случае, потребует небольших модификаций режима отсасывания жидкости.
Таким образом, очевидно, что планшет для образцов согласно изобретению весьма эффективен по сравнению с другими аналогичными планшетами, включая планшет для образцов, описанный в US 5620853.
Сужающаяся часть гнезда предпочтительно имеет угол конусности, выбранный из группы, состоящей из следующих угловых интервалов: (i) 2°-4°; (ii) 4°-6°; (iii) 6°-8°; (iv) 8°-10°; (v) по меньшей мере 1° и (vi) 1°-15°. Альтернативно, выполняемые в основании сквозные отверстия или гнезда могут быть цилиндрическими, т.е. несужающимися.
Согласно менее предпочтительному выполнению гнезда в основании лунки могут содержать камеру, имеющую удерживающий элемент, мембрану, выступ или кольцевую часть. Гранула (микросфера) реагента может, в процессе использования диспенсера, проталкиваться за мембрану или иную функционально аналогичную деталь или через нее в камеру, а также, по существу, удерживаться или фиксироваться в камере посредством мембраны или иной функционально аналогичной детали.
Одно или более гнезд предпочтительно содержат внутреннюю фаску или расширенную часть для облегчения ввода гранул (микросфер) реагента в одно или более из указанных гнезд Одна или более лунок для образцов предпочтительно содержат по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 гнездо или углубление, каждое из которых имеет сужающуюся или несужающуюся часть и выполнено с возможностью приема, в процессе использования планшета, гранул (микросфер) реагента.
Гнезда, выполненные в основании лунки, предпочтительно размещены: (i) по окружности вокруг центральной части лунки и/или (ii) по окружности вокруг центрального гнезда, и/или (hi), по существу, с тесным расположением, и/или (iv), по существу, симметричным или асимметричным образом, и/или (v), по существу, вдоль прямой или кривой линии, и/или (vi), по существу, регулярным или иррегулярным образом, и/или (vii) в виде прямоугольного массива, и/или (viii) вдоль одной или более концентричных окружностей при отсутствии гнезда или углубления в центре основания.
Планшет для образцов предпочтительно изготовлен из полистирола.
Планшет для образцов может иметь формат стрипа или прямоугольного массива. Так, согласно одному предпочтительному варианту планшет для образцов может содержать стрип формата 6×1, а согласно другому предпочтительному варианту - девять стрипов лунок для образцов формата 6×1.
Согласно варианту одна или более лунок для образцов могут быть связаны с одной или более другими лунками одним или более ломкими участками или одним или более ломкими соединениями, так что каждый планшет для образцов может быть разделен пользователем на планшеты для образцов, имеющие меньшие размеры. Например, стрип 6×1 планшета для образцов может быть разделен на индивидуальные планшеты для образцов формата 1×1 (т.е. содержащие единственную лунку) или на два планшета для образцов, каждый из которых содержит стрип в формате 3×1.
Согласно предпочтительному варианту индивидуальные лунки, стрипы и планшеты для образцов изготовлены из полипропилена. Предпочтительное использование для лунок, стрипов и планшетов такого химически стойкого материала, как полипропилен, гарантирует, что неспецифическое связывание в лунке удерживается на минимальном уровне.
Держатель планшетов, способный нести множество лунок, стрипов или один или более планшетов для образцов, предпочтительно изготавливается из пластика, например из такого как акрилонитрилбутадиенстирол или, предпочтительно, из аналогичного материала, обладающего высокой жесткостью и обеспечивающего постоянство положения лунок, стрипов или планшета (планшетов) для образцов, сохранение плоской формы держателя после закрепления в нем лунок, стрипов или планшета (планшетов) для образцов. Держатель планшета является достаточно прочным, чтобы выдерживать его интенсивное использование.
Одна или более лунок могут быть связаны с одной или более другими лунками одним или более ломкими участками или одним или более ломкими соединениями, так что каждый планшет для образцов может быть разделен пользователем на планшеты для образцов, имеющие меньшие размеры, стрипы или индивидуальные лунки для образцов.
Согласно аспекту изобретения разработана также компьютерная программа, выполняемая системой управления автоматизированного устройства, содержащего один или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента. Данная программа обеспечивает выполнение системой управления ряда операций, включая управление подачей гранул (микросфер) реагента из одного или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента в одну или более лунок планшета для образцов (как это описано выше).
Согласно другому аспекту изобретения разработана машиночитаемая среда (машиночитаемый носитель), содержащая (содержащий) записанные на нем (на ней) машинные команды, сформулированные с возможностью обеспечения их выполнения системой управления автоматизированного устройства, содержащего один или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента. Эти компьютерные команды обеспечивают, посредством системы управления, управление подачей гранул (микросфер) реагента из одного или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента в одну или более лунок планшета для образцов (как это описано выше).
Машиночитаемый носитель предпочтительно выбран из группы, состоящей из: (i) постоянной памяти; (ii) электрически перепрограммируемой постоянной памяти; (iii) стираемой программируемой постоянной памяти; (iv) электрически стираемой программируемой постоянной памяти; (v) флэш-памяти; (vi) оптического диска; (vii) оперативной памяти и (viii) жесткого диска.
По меньшей мере, некоторые или, по существу, все гранулы (микросферы) реагента, которые при использовании планшета выдаются в одно или более гнезд, могут нести или содержать реагент, предназначенный: (i) для анализа образцов и/или (ii) для анализа образцов с помощью реакций амплификации нуклеиновой кислоты, и/или (iii) для анализа образцов с помощью цепных реакций полимеризации (ЦРП), и/или (iv) для анализа образцов посредством процесса иммунного анализа, и/или (v) для анализа образцов с использованием технологии гибридной пробы.
По меньшей мере, некоторые или, по существу, все гранулы (микросферы) реагента, которые при использовании планшета выдаются в одно или более гнезд, могут содержать полистирол или иной пластик (полимер).
Описанный планшет для образцов может содержать одну или более гранул. Гранула может представлять собой частицу, небольшую частицу, микросферу или их эквиваленты. Состав гранулы зависит от типа проводимого исследования. Гранула может включать керамику, стекло, различные пластики, полистирол, метилстирол, полиакрилаты, парамагнитные материалы, оксид тория, угольный графит, диоксид титана, латекс или поперечно сшитые декстраны, например сефарозу (Sepharose), целлюлозу, нейлон, мицеллы с поперечными сшивками, тефлон или любую комбинацию перечисленных веществ. В одном варианте гранула содержит полистирол или иной пластик (полимер), или их комбинацию. В другом варианте гранула содержит железистое или магнитное покрытие или обладает железистыми или магнитными свойствами. Еще в одном варианте гранула содержит антистатическое покрытие или обладает антистатическими свойствами. Гранулы, используемые в планшете для образцов в качестве гранул реагента, могут быть просвечивающими, слегка просвечивающими или непрозрачными. Могут использоваться гранулы, имеющиеся в коммерческой продаже.
Гранулы не обязательно должны быть сферическими, они могут иметь иррегулярную форму. Кроме того, гранулы могут быть пористыми. Размеры гранул могут составлять от нанометров до миллиметров. Так, гранула может иметь диаметр не менее 0,1 мм, например в интервале 0,1-10 мм. В одном варианте гранула может иметь диаметр около или более 0,5 мм или диаметр в одном из следующих интервалов: 0,5-1,0 мм; 1,0-1,5 мм; 1,5-2,0 мм; 2,0-2,5 мм; 2,5-3,0 мм; 3,0-3,5 мм; 3,5-4,0 мм; 4,0-4,5 мм; 4,5-5,0 мм или диаметр около или более 5,0 мм. Гранула может иметь диаметр, больший, равный или меньший, чем диаметр углубления или гнезда лунки для образцов. Например, диаметр гранулы может быть меньше диаметра углубления или гнезда лунки, имеющего сужающуюся часть. В другом варианте диаметр гранулы может быть больше диаметра углубления или гнезда лунки. Например, углубление может не иметь сужающейся части, а диаметр гранулы, которая должна быть помещена в планшет для образцов или находиться в нем, может превышать диаметр углубления в планшете для образцов по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более процентов. В одном варианте гранула, находящаяся в планшете для образцов, не касается дна планшета, т.е. основания лунки для образцов.
Гранула в планшете для образцов может содержать реагент или зонд или быть покрыта реагентом или зондом. Реагент или зонд могут использоваться для проведения анализа образца, например, путем детектирования аналита. Зонд или реагент может быть связан с гранулой. Эта связь может являться ковалентным или нековалентным взаимодействием. Зонд может являться нуклеиновой кислотой, антителом, фрагментом антитела, белком, пептидом, аптамером или иным химическим соединением. Так, зонд может являться олигонуклеидом. В одном варианте зонд может использоваться для детектирования аналита в биологическом образце, а в другом варианте - для лекарственного скрининга. Например, может производиться скрининг библиотеки веществ для определения их способности связываться с белком или нуклеиново-кислотным зондом.
Зонд может быть использован в целях детектирования биомаркера для определения диагноза или прогноза заболевания или патологического состояния, чувствительности к лекарству или потенциальной чувствительности к лекарству или для мониторинга прогрессирования заболевания или состояния. Например, зонд может быть антителом или его фрагментом, служащим для детектирования антигена, являющегося биомаркером для рака. В другом варианте зондом может быть антиген, пептид или белок, используемый для детектирования в образце антитела, которое может служить индикатором заболевания или состояния.
Описанный планшет для образцов может содержать множество зондов, причем одно их подмножество будет отличаться от другого подмножества этого множества. Множество зондов может быть связано с гранулами. Различные зонды можно использовать для детектирования различных аналитов, что позволит применить данный планшет для мультиплексирования. Планшет для образцов может содержать по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 различных зондов. Зонды могут быть одного типа (например, различными антителами) или различного типа (например, комбинацией нуклеиново-кислотных зондов и антигенов).
Согласно варианту один или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента предпочтительно содержат трубчатый корпус, в котором при использовании диспенсера находится множество гранул (микросфер) реагента.
Устройство, кроме того, предпочтительно содержит один или более датчиков, чтобы определять, были ли выданы или нет одна или более гранул (микросфер) реагента из одного или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента.
Далее, устройство предпочтительно содержит подвижную платформу для перемещения планшета для образцов относительно одного или более диспенсеров гранул (микросфер) реагента.
Система управления предпочтительно выполнена с возможностью управлять подвижной платформой таким образом, что благодаря перемещению планшета для образцов относительно диспенсера гранул (микросфер) реагента из данного диспенсера последовательно выдается по одной или более гранул (микросфер) реагента в различные приемные камеры.
Согласно варианту устройство дополнительно содержит подающее устройство для подачи (диспенсирования) жидкости в лунки планшета для образцов.
Данное подающее устройство предпочтительно выполнено и установлено с возможностью подавать порцию жидкости объемом х мл в одну или более зон приема жидкости одной или более лунок для образцов, где значение х предпочтительно выбирают из группы, состоящей из: (i) <10; (ii) 10-20; (iii) 20-30; (iv) 30-40; (v) 40-50; (vi) 50-60; (vii) 60-70; (viii) 70-80; (ix) 80-90; (х) 90-100; (xi) 100-110; (xii) 110-120; (xiii) 120-130; (xiv) 130-140; (xv) 140-150; (xvi) 150-160; (xvii) 160-170; (xviii) 170-180; (xix) 180-190; (xx) 190-200; (xxi) более 200 лунок.
Согласно варианту устройство дополнительно содержит устройство анализа изображения или камеру, чтобы определять, была ли произведена выдача гранулы (микросферы) реагента и находится ли она в гнезде планшета для образцов.
Планшет для образцов предпочтительно имеет первый цвет (или является прозрачным), а гранула (микросфера) реагента - второй, отличный от первого цвета, выбранный контрастным по отношению к первому цвету или к прозрачному планшету, чтобы облегчить визуальное определение присутствия или отсутствия гранулы (микросферы) реагента в углублении или гнезде планшета для образцов.
Согласно варианту планшет для образцов может содержать также люминесцентный или флуоресцентный маркер.
Соответственно, устройство может содержать также приспособление для обнаружения люминесценции или флуоресценции, чтобы определять, была ли произведена выдача гранулы (микросферы) реагента и присутствует ли такая гранула (микросфера) в углублении или гнезде планшета для образцов, в зависимости от того, препятствует ли гранула (микросфера) реагента, полностью или частично, наблюдению люминесцентного или флуоресцентного маркера.
Устройство предпочтительно содержит дополнительно магнитный, электрический, емкостной или механический датчик, чтобы определять, была ли произведена выдача гранулы (микросферы) реагента и присутствует ли такая гранула (микросфера) в углублении или гнезде планшета для образцов.
Система управления предпочтительно определяет количество присутствующих и/или отсутствующих в лунке гранул (микросфер) реагента и/или количество гранул (микросфер) реагента, которые были выданы или которые требуется выдать в лунку для образцов.
Согласно варианту система управления измеряет и/или регулирует объем жидкости, который был выдан или который нужно выдать в лунку, в зависимости от найденного количества присутствующих и/или отсутствующих в лунке гранул (микросфер) реагента и/или от количества гранул (микросфер) реагента, которые были выданы или которые требуется выдать в лунку для образцов.
Система управления может быть выполнена с возможностью гарантировать, что после выдачи жидкости в лунку по меньшей мере некоторые или, по существу, все гранулы (микросферы) реагента в лунке по меньшей мере частично или полностью будут покрыты данной жидкостью.
Система управления предпочтительно выполнена с возможностью гарантировать, что уровень жидкости, выданной в лунку, остается, по существу, постоянным независимо от количества гранул (микросфер) реагента, которые присутствуют или отсутствуют в лунке или выданы или должны быть выданы в лунку.
Согласно аспекту изобретения разработан планшет для образцов, содержащий одну или более лунок для образцов, причем единственная или каждая лунка для образцов имеет основание и одно или более углублений, выполненных в основании.
При этом размеры единственного или каждого углубления выбраны из условия удерживания (фиксирования) в нем гранулы, помещенной в лунку, с формированием гранулой, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное углубление.
Согласно другому аспекту изобретения разработана система подачи гранул, содержащая:
диспенсер гранул;
планшет для образцов, содержащий лунки для образцов, имеющие основание, в котором выполнены одно или более углублений, причем размеры единственного или каждого углубления выбраны из условия удерживания (фиксирования) в нем гранулы, помещенной в лунку, с формированием гранулой, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное углубление, и
систему управления, сконфигурированную для управления диспенсированием гранулы из диспенсера гранул в планшет для образцов.
Согласно аспекту изобретения разработан способ подачи гранул, включающий:
обеспечение наличия диспенсера гранул, содержащего гранулу;
обеспечение наличия планшета для образцов, содержащего лунку для образцов, имеющую основание, в котором выполнены одно или более углублений, причем размеры единственного или каждого углубления выбраны из условия удерживания (фиксирования) в нем гранулы, помещенной в лунку, с формированием гранулой, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное углубление, и
управление диспенсированием гранулы из диспенсера гранул в планшет для образцов.
Согласно еще одному аспекту разработан набор для детектирования аналита, содержащий:
множество гранул и
планшет для образцов, содержащий лунку для образцов, имеющую основание, в котором выполнены одно или более углублений, причем размеры единственного или каждого углубления выбраны из условия удерживания (фиксирования) в нем гранулы, помещенной в лунку, с формированием гранулой, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное углубление.
Согласно другому аспекту изобретения разработан способ детектирования аналита, включающий:
добавление образца в планшет для образцов, содержащий лунку для образцов, имеющую основание, в котором выполнены одно или более углублений, причем размеры единственного или каждого углубления выбраны из условия удерживания (фиксирования) в нем гранулы, помещенной в лунку, с формированием гранулой, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное углубление, и
детектирование связывания аналита в образце с зондом.
Согласно следующему аспекту изобретения разработан способ изготовления планшета для образцов, включающий:
обеспечение наличия планшета для образцов, содержащего одну или более лунок, каждая из которых имеет основание, и
формирование в одном или более оснований одного или более углублений, причем размеры единственного или каждого углубления выбраны из условия удерживания (фиксирования) в нем гранулы, помещенной в лунку, с формированием гранулой, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное углубление.
Краткое описание чертежей
Далее, только в качестве примеров, со ссылкой на прилагаемые чертежи, будут описаны различные варианты изобретения.
На фиг.1 показана лунка планшета для образцов согласно варианту изобретения.
На фиг.2А тот же вариант лунки планшета для образцов показан на виде в плане; на фиг.2В более подробно показано дно лунки согласно данному варианту, а на фиг.2С показана гранула (микросфера) реагента, поданная в гнездо лунки согласно данному варианту.
На фиг.3А представлен диспенсер гранул (микросфер) реагента; на фиг.3В этот диспенсер показан в продольном разрезе.
На фиг.4 диспенсер гранул (микросфер) реагента показан с пространственным разделением его компонентов.
На фиг.5 показан микроформирователь, содержащий приводной механизм шприцевого дозатора, установленного на платформу, подвижную по трем координатам, и взаимодействующего с диспенсером гранул (микросфер) реагента, установленным над планшетом для образцов.
На фиг.6 приводной механизм шприцевого дозатора, прикрепленный к диспенсеру гранул (микросфер) реагента, показан в продольном разрезе.
На фиг.7А диспенсер гранул (микросфер) реагента показан в процессе его переноса приводным механизмом; на фиг.7В иллюстрируется процесс выдачи гранул (микросфер) реагента из диспенсера гранул (микросфер) реагента посредством плунжерного механизма, активируемого приводным механизмом шприцевого дозатора.
На фиг.8А иллюстрируется процесс сбрасывания шприцевого дозатора с приводного механизма; на фиг.8В данный дозатор показан отделенным от приводного механизма.
На фиг.9А показаны девять планшетов для образцов, установленные в держатель планшетов, причем каждый из этих планшетов содержит стрип из 6 лунок; на фиг.9В показан держатель планшетов, в который можно установить планшет для образцов или один или более стрипов для образцов.
На фиг.10А более подробно показан стрип из шести лунок; на фиг.10В данный стрип показан установленным в держатель планшетов.
На фиг.11А показана отдельная лунка, установленная в держатель планшетов; на фиг.11В более подробно показаны две лунки, связанные отделяемым звеном; на фиг.11С показана лунка, связанная с концевым отделяемым звеном; на фиг.11D - лунка, снабженная пластинкой идентификации/ориентации.
На фиг.12А стрип лунок представлен на виде снизу, на фиг.12В показана охватывающая часть, которая облегчает позиционирование стрипа лунок на держателе планшетов; на фиг.12С показана ответная охватываемая часть, выполненная в основании держателя планшетов.
На фиг.13 стрип лунок представлен в продольном разрезе; показано, что согласно предпочтительному варианту лунки содержат сужающиеся книзу гнезда с углом конусности, составляющим 6,0°.
На фиг.14А представлен еще один вариант изобретения, в котором в основании планшета для образцов выполнены конические сквозные отверстия, а гранулы реагента загружаются с нижней стороны планшета; на фиг.14В представлен планшет для образцов согласно предпочтительному варианту, в котором планшет имеет цилиндрические (несужающиеся) сквозные отверстия, так что гранулы реагента могут быть загружены (введены) сверху, через лунку для образцов, и удерживаться в сквозном отверстии посредством посадки с натягом.
На фиг.15 представлен стрип для образцов, содержащий шесть лунок для образцов, в которые гранулы реагента вводятся с нижней стороны планшета для образцов.
На фиг.16 иллюстрируется, в перспективном изображении, в разрезе, вариант, в котором гранулы реагента введены в вогнутую концевую часть сквозного отверстия.
На фиг.17 представлен вариант, в котором основание лунки для образцов разделено на 5 сегментов, причем каждый сегмент основания смещен по высоте относительно других сегментов, так что отсутствуют линии прямого видения между гранулами реагента, введенными в открытые сквозные отверстия или углубления, выполненные в каждом сегменте основания.
На фиг.18А представлен, на виде в плане, вариант, в котором лунка для образцов разделена перегородкой (разделителем) небольшой высоты на две области, так что отсутствуют линии прямого видения между гранулами реагента, введенными в открытые сквозные отверстия или углубления, выполненные в одной области, и гранулами реагента, введенными в открытые сквозные отверстия или углубления, выполненные в другой области; на фиг.18В представлено перспективное изображение данного варианта, в котором перегородка небольшой высоты разделяет основание на две области с отсутствием линий прямого видения между гранулами реагента, находящимися в одной области, и гранулами реагента, находящимися в другой области.
На фиг.19А представлен, на виде в плане, другой вариант, в котором лунка для образцов также разделена перегородкой небольшой высоты на две области с отсутствием линий прямого видения между гранулами реагента, введенными в открытые сквозные отверстия или углубления, выполненные в одной области, и гранулами реагента, введенными в открытые сквозные отверстия или углубления, выполненные в другой области; на фиг.19В представлено перспективное изображение данного варианта, в котором перегородка небольшой высоты разделяет основание на две области с отсутствием линий прямого видения между гранулами реагента, находящимися в одной области, и гранулами реагента, находящимися в другой области.
Осуществление изобретения
Далее, со ссылкой на фиг.1, будет описан вариант изобретения. В нем используется планшет для образцов, который предпочтительно содержит множество лунок 19 для образцов (хотя согласно менее предпочтительному варианту можно использовать планшет для образцов только с одной лункой 19). Согласно предпочтительному варианту планшет для образцов может содержать массив 9×6 лунок 19. Единственная лунка 19 показана на фиг.1 для большей наглядности. Возможны и варианты, в которых планшет для образцов может содержать стрип лунок 19, содержащий, например, 1×9 или 1×6 лунок 19.
Каждая лунка 19 предпочтительно содержит гнезда, выемки или ячейки (далее - гнезда) 21, которые предпочтительно выполнены в основании лунки 19. В конкретном варианте, представленном на фиг.1, лунка 19 содержит 10 гнезд 21, образованных в ее основании. В других вариантах количество гнезд 21 в основании лунки 19 для образца может быть иным. Так, согласно альтернативным вариантам, по меньшей мере некоторые или все лунки 19, имеющиеся в планшете для образцов, могут иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более 21 гнезд 21.
Гнезда 21 предпочтительно размещены по краю (периметру) основания лунки 19 для образца, тогда как центральная зона основания лунки 19 предпочтительно является, по существу, плоской и свободной от гнезд 21.
Согласно варианту изобретения в диспенсер гранул (микросфер) реагента может быть загружено множество гранул (микросфер) реагента, каждая из которых имеет диаметр 1,75 или 2 мм. Согласно другому варианту могут использоваться диспенсеры гранул (микросфер) реагента, рассчитанные на гранулы (микросферы) реагента с диаметром, отличным от 1,75 мм или 2 мм. В менее предпочтительных вариантах гранулы (микросферы) реагента, помещенные в первый диспенсер, могут иметь первый диаметр, а гранулы (микросферы) реагента, помещенные во второй диспенсер, отличный от первого, - другой, второй диаметр. Рассматриваются также менее предпочтительные варианты, в которых гранулы (микросферы) реагента, загруженные в конкретный диспенсер, могут иметь различные диаметры.
Гранулы (микросферы) реагента могут быть заранее загружены (поданы) в гнезда 21 изготовителем планшета для образцов. Альтернативно, загрузку (подачу) гранул (микросфер) реагента в гнезда 21 может произвести конечный пользователь.
Гранулы (микросферы) реагента предпочтительно содержат ядро из полистирола или иного пластика (полимера). Эти гранулы (микросферы) могут иметь также покрытие из реагента (например, содержащего антитела или антигены), который предпочтительно используется при анализе образцов. Согласно одному из вариантов реагент может применяться для анализа образцов с использованием цепных реакций полимеризации (ЦРП) или в рамках иммунологического исследования. Альтернативно согласно столь же предпочтительному варианту реагент может содержать ДНК- или РНК-последовательность, используемую в качестве гибридной пробы для обнаружения наличия в образце комплементарных ДНК- или РНК-последовательностей. Гранулы (микросферы) реагента могут иметь также антистатическое покрытие или обладать антистатическими свойствами.
Исследуемая жидкость предпочтительно диспенсируется в лунку 19 планшета для образцов. Жидкость может, например, содержать взятый у пациента образец крови, сыворотки, слюны или мочи.
Согласно данному варианту в каждую лунку 19 в планшете для образцов может быть подано 10-200 мл жидкого образца.
Согласно предпочтительному варианту по сравнению с обычным планшетом для образцов в каждую лунку 19 может быть подано меньшее количество жидкости.
В одном варианте для определения положения и/или типа гранул (микросфер) реагента, поданных в гнезда 21 лунок 19 для образцов, может быть использована система управления. Альтернативно, гранулы (микросферы) реагента могут быть загружены в гнезда 21 лунок 19 заранее. Система управления может также определять, в какие гнезда 21 следует подать дополнительные гранулы (микросферы) реагента (если такая подача необходима). После того как жидкий образец будет диспенсирован в лунку 19, система управления может проверить, было ли диспенсировано требуемое количество жидкого образца и все ли гранулы (микросферы) реагента по меньшей мере частично или полностью погружены в жидкий образец.
Количество жидкого образца, подлежащее диспенсированию в лунку 19, может зависеть от количества гнезд 21, сформированных в лунке 19, диаметра гранул (микросфер) реагента, которые были поданы или заранее загружены в эти гнезда, и от степени, в которой гранулы (микросферы) реагента выступают в основание лунки 19. Система управления может использоваться также, чтобы варьировать количество жидкого образца, диспенсируемого в лунки 19, таким образом, чтобы гранулы (микросферы) реагента были погружены в жидкий образец, по существу, на постоянную глубину, независимо от количества гнезд, имеющихся в лунке 19 для образцов, диаметра гранул (микросфер) реагента или степени, в которой гранулы (микросферы) реагента выступают в основание лунки 19.
Применимы различные форматы планшетов для образцов. Например, планшет может содержать двумерный массив лунок 19. Так, планшет для образцов может содержать массив 4×4, 4×6, 4×8, 4×10, 4×12, 6×6, 6×8, 6×10, 6×12, 8×8, 8×10, 8×12, 10×10, 10×12 или 12×12 лунок 19. Согласно другим вариантам планшет для образцов может содержать одномерный стрип лунок 19 для образцов, например стрип, содержащий 4×1, 6×1, 8×1, 10×1 или 12×1 лунок 19. Возможны и иные варианты, в которых лунки 19 могут быть расположены в формате, отличном от двумерного массива или стрипа.
По меньшей мере некоторые или все гнезда 21 в основании лунки 19 предпочтительно выполнены сужающимися, по существу, по всей своей глубине или по меньшей мере на ее части. Гнезда 21 могут иметь угол конусности, равный 6°. Согласно одному из вариантов верхняя часть сужающегося гнезда, принимающая гранулу (микросферу) реагента, может иметь диаметр 1,82 мм. Часть основания лунки 19, окружающая гнездо, может быть снабжена внутренней фаской (раззенковкой), чтобы облегчить введение гранул (микросфер) 20А; 20 В реагента в гнездо 21. В одном варианте наружный диаметр такой фаски может равняться 2,25 мм.
На фиг.2А показаны, на виде в плане, лунка 19 и части двух смежных лунок 19, выполненных в планшете для образцов. Лунки, показанные на фиг.2А, образуют часть массива лунок 19, выполненных в планшете для образцов. Каждая лунка 19 содержит 10 гнезд 21, выполненных в основании (дне) лунки 19. При использовании планшета гранула (микросфера) реагента предпочтительно вводится в каждое гнездо 21 лунки 19 для образцов, причем в варианте, показанном на фиг.2А-2С, гранулы (микросферы) реагента предпочтительно неподвижно фиксируются в гнездах 21 благодаря сужающемуся профилю гнезд.
На фиг.2В более наглядно показано дно лунки 19; видны образованные в основании (дне) лунки гнезда 21, каждое из которых выполнено с возможностью приема гранулы (микросферы) реагента. Каждое гнездо 21 в основании лунки 19 предпочтительно снабжено фаской на входе в сужающуюся часть. Согласно предпочтительному варианту в каждое гнездо 21 подается и удерживается в нем единственная гранула (микросфера) реагента.
На фиг.2С в увеличенном масштабе показана гранула (микросфера) реагента 20А, помещенная и зафиксированная в гнезде 21, выполненном в основании лунки 19. Согласно варианту, представленному на фиг.2С, верхняя поверхность гранулы 20А (микросферы) реагента, когда она удерживается или фиксируется внутри гнезда 21, расположена примерно на 0,3 мм ниже поверхности основания лунки. Таким образом, согласно этому варианту, гранула (микросфера) 20А реагента, удерживаемая в гнезде 21, выполненном в основании (дне) лунки 19, не выступает над входом (т.е. над верхней поверхностью) гнезда 21 и, соответственно, над поверхностью основания (дна) лунки 19. Однако в других вариантах одна или более гранул (микросфер) реагента, помещенная (помещенных) в одно или более гнезд 21 в основании лунки 19, может (могут) находиться в мелком гнезде (в мелких гнездах) 21 или в гнезде (гнездах) 21, сужающемся (сужающихся) настолько, что при удерживании в таком гнезде гранулы (микросферы) 20А реагента она слегка выступает над верхним краем гнезда 21, т.е. над поверхностью основания лунки 19. Согласно предпочтительному варианту гранулы 20А (микросферы) реагента могут быть расположены таким образом, что они выступали из нижней поверхности лунки для образцов вверх на 20-40% своего диаметра.
Гранулы (микросферы) реагента могут подаваться в гнезда 21, выполненные в дне лунки 19 планшета для образцов, посредством диспенсера 22 гранул (микросфер) реагента, как это будет описано далее со ссылками на фиг.3А, 3В и 4. Загрузка (подача) гранул (микросфер) реагента может быть произведена либо изготовителем планшета для образцов, либо конечным пользователем. На фиг.3А показан предпочтительный вариант диспенсера 22 гранул (микросфер) реагента. Диспенсер содержит верхнюю крышку 23, корпус 24 шприцевого дозатора и втулку 25, которая выступает из нижнего конца корпуса 24 шприцевого дозатора.
На фиг.3В диспенсер 22 гранул (микросфер) реагента показан в продольном разрезе. Видно, что согласно предпочтительному варианту он содержит также направляющую 26 плунжера, которая предпочтительно находится внутри корпуса 24 шприцевого дозатора. На наружной поверхности верхней части направляющей 26 предпочтительно сформирована резьба. Внутренняя поверхность верхней части корпуса 24 шприцевого дозатора предпочтительно снабжена соответствующей резьбой, сопрягающейся с указанной резьбой на наружной поверхности направляющей 26 плунжера, так что при ее использовании эта направляющая фиксируется посредством ввинчивания в корпус 24 шприцевого дозатора. Внутренняя поверхность крышки 23 также предпочтительно снабжена резьбой, так что она предпочтительно навинчивается на верхнюю часть направляющей 26 плунжера.
Плунжер 27 предпочтительно помещен внутрь направляющей 26 плунжера; при этом его можно опускать посредством приводного компонента 28, который находится над плунжером 27, в канале, образованном направляющей 26 плунжера. Между этим компонентом и плунжером находится приводная пружина (не изображена), так что при отжимании приводного компонента 28 вниз усилие от него через приводную пружину передается на плунжер 27, и это заставляет плунжер опуститься вниз. Возвратная пружина (не изображена) предпочтительно установлена между нижней частью направляющей 26 плунжера и плунжером 27, так что когда приводной компонент 28 больше не отжимается вниз, плунжер 27 и приводной компонент 28 предпочтительно возвращаются в верхнее положение.
На фиг.4 диспенсер 22 гранул (микросфер) реагента, описанный со ссылками на фиг.3А и 3В, показан с пространственным разделением его компонентов. Из фиг.4 видно, что в верхней части втулки 25 предпочтительно находится элемент 30 из силикона. При использовании диспенсера гранулы (микросферы) реагента, находящиеся внутри корпуса 24 шприцевого дозатора, предпочтительно размещены вдоль спиральной дорожки, сформированной в нижней части корпуса 24 шприцевого дозатора. В результате у дна корпуса 24 шприцевого дозатора гранулы (микросферы) реагента оказываются расположенными последовательно, т.е. одна за другой. Последовательное расположение гранул (микросфер) реагента продолжается в камере, предпочтительно расположенной непосредственно над втулкой 25 и ниже направляющей 26 плунжера. Данная камера имеет форму и размеры, рассчитанные на прием единственной гранулы (микросферы) реагента, находящейся в канале ниже плунжера 27 и выше втулки 25. Когда плунжер 27 смещается вниз, он толкает единственную находящуюся в камере гранулу (микросферу) 20А реагента вниз. Эта гранула (микросфера) 20А предпочтительно проталкивается плунжером 27 через указанный элемент 30. Согласно предпочтительному варианту плунжер 27 продолжает проталкивать гранулу (микросферу) 20А реагента через втулку 25 и в гнездо 21 лунки 19, которая предпочтительно находится непосредственно под втулкой 25 диспенсера 22 гранул (микросфер) реагента. Элемент 30 из силикона предпочтительно предотвращает случайную выдачу гранул (микросфер) реагента из камеры диспенсера 22 гранул (микросфер) реагента во втулку 25 корпуса 24 шприцевого дозатора.
Нижняя часть корпуса 24 шприцевого дозатора предпочтительно имеет спиральную форму и действует как направляющая для гранул (микросфер) реагента, подводящая их к камере, находящейся в нижней части корпуса 24 шприцевого дозатора. Камера предпочтительно сконструирована такой, что в любой момент времени только одна гранула (микросфера) реагента находится над элементом 30 из силикона. Камера сформирована в канале, по которому перемещается плунжер 27, так что опускание плунжера 27 предпочтительно приводит к проталкиванию находящейся в камере гранулы (микросферы) реагента через указанный элемент 30 во втулку 25.
Может быть дополнительно предусмотрен вибрационный механизм, выполненный с возможностью воздействовать на наружную поверхность корпуса 24 шприцевого дозатора, чтобы гарантировать опускание гранулы (микросферы) реагента вниз, через корпус 24 шприцевого дозатора к его нижней части и размещение гранул (микросфер) одна за другой, готовыми войти в указанную камеру.
Гранулы (микросферы) реагента могут быть предварительно загружены в корпус 24 шприцевого дозатора, например, поставщиком набора для проведения анализа или каким-либо другим поставщиком. Альтернативно, конечный пользователь может самостоятельно заполнить корпус 24 шприцевого дозатора гранулами или микросферами реагента.
Далее, со ссылками на фиг.5, будет рассмотрено автоматизированное устройство (именуемое также микроформирователем). Как показано на фиг.5, группа корпусов диспенсеров 37 может быть установлена на поддон (лоток) 36, который затем устанавливается, предпочтительно автоматически, в микроформирователь. Поддон 36, несущий корпуса диспенсеров 37 (т.е. шприцевых дозаторов), может поступательно подводиться посредством трехкоординатного механизма переноса или роботизированного рычага к рабочей зоне микроформирователя, в которой производится распределение гранул (микросфер) реагента.
Автоматизированное устройство (микроформирователь) предпочтительно снабжен трехкоординатным механизмом переноса, который предпочтительно содержит первый узел, содержащий направляющий рельс 31, вдоль которого может поступательно перемещаться первый блок 32 в первом горизонтальном направлении (х). Предпочтительно имеется также второй узел, содержащий второй несущий блок 33, который предпочтительно охватывает или окружает первый блок 32. Несущий блок 33 может поступательно перемещаться во втором горизонтальном направлении (y), предпочтительно ортогональном первому горизонтальному направлению (х), т.е. двигаться вперед и назад вдоль первого блока 32. Предпочтительно имеется также третий узел, содержащий приводной механизм 34 шприцевого дозатора, в котором предпочтительно находится линейный приводной компонент (не изображен). Данный механизм 34 предпочтительно установлен на блоке 33 с возможностью скользящего перемещения в вертикальном направлении (z) относительно этого блока, т.е. он может подниматься и опускаться.
Описанный трехкоординатный механизм предпочтительно содержит также убираемый рычаг 35, выступающий из несущего блока 33. Данный механизм предпочтительно запрограммирован так, что он может выбирать и поднимать диспенсер 22, 37 гранул (микросфер) реагента с поддона 36, на котором находятся диспенсеры. Приводной механизм 34 шприцевого дозатора (т.е. диспенсера 37 гранул (микросфер) реагента) содержит конический наконечник, упруго установленный внутри трубчатого корпуса. Этот наконечник выполнен с возможностью взаимодействия с коническим участком, имеющимся на крышке 23 шприцевого дозатора в составе диспенсера 22, 37 гранул (микросфер) реагента. Когда этот диспенсер установлен на поддоне 36, данный наконечник может быть опущен на крышку 23 диспенсера 22, 37 гранул (микросфер) реагента, разъемно соединив тем самым данный диспенсер 22, 37 с приводным механизмом 34. Приводной механизм 34 и связанный с ним диспенсер 22, 37 гранул (микросфер) реагента могут быть затем подняты на высоту, достаточную для того, чтобы убираемый рычаг 35 (который первоначально убран в тело несущего блока 33) мог быть выведен из него. После этого диспенсер 22, 37 гранул (микросфер) реагента опускается посредством приводного механизма 34 так, что верхняя часть корпуса 24 шприцевого дозатора может быть зафиксирована рычагом 35. Убираемый рычаг 35 предпочтительно снабжен отверстием, диаметр которого предпочтительно меньше, чем наружный диаметр кромки верхней части корпуса 24 шприцевого дозатора.
Согласно предпочтительному варианту каждый диспенсер 22, 37 гранул (микросфер) реагента предпочтительно содержит множество идентичных гранул (микросфер) реагента. В этом варианте на один поддон 36 можно установить до 15 диспенсеров 22, 37 гранул (микросфер) реагента, причем каждый из этих диспенсеров может вместить примерно 2000 гранул (микросфер) реагента.
Согласно предпочтительному варианту приводной механизм 34 способен поднимать диспенсер 22, 37 гранул (микросфер) реагента с поддона 36 и опускать его так, чтобы втулка 25 данного диспенсера находилась непосредственно над требуемым гнездом 21 для гранулы (микросферы) реагента, имеющимся в лунке 19 планшета для образцов. После этого активируют приводной механизм 34, в результате чего приводной компонент 28 диспенсера 22, 37 гранул (микросфер) реагента отжимается вниз, что, в свою очередь, приводит к проталкиванию плунжером 27 гранулы (микросферы) 20А реагента через элемент 30 из силикона и через втулку 25 в требуемое гнездо 21 для гранулы (микросферы) реагента в лунке 19. Приводной механизм 34 предпочтительно выполнен с возможностью отжимать вниз приводной компонент 28 и плунжер 27 с приложением заданного усилия (в отличие от перевода приводного компонента 28 и плунжера 27 в заданное положение по вертикали). Благодаря этому гранулы (микросферы) 20А реагента под действием постоянного усилия плотно и стабильно вводятся в указанные гнезда 21 лунки 19.
На фиг.6 показано устройство для захвата диспенсера гранул (микросфер) реагента (т.е. часть приводного механизма 34) в процессе захвата диспенсера 22 гранул (микросфер) реагента. Данный приводной механизм 34 содержит наконечник 39, имеющий сужающийся на конус нижний конец, выполненный с возможностью взаимодействия с коническим участком, имеющимся на крышке 23 диспенсера 22 гранул (микросфер) реагента. В наконечнике 39 имеется центральное отверстие, через которое проведен толкатель 40 плунжера. Толкатель 40 может перемещаться вверх и вниз под действием линейного приводного элемента 41, который приводит в линейное движение ходовой винт 42, поднимающий или опускающий толкатель 40 плунжера.
Как показано на фиг.6, чтобы захватить и поднять диспенсер 22 гранул (микросфер) реагента, приводной механизм 34 опускается на этот диспенсер, так что наконечник 39 приводного механизма 34 вступает во взаимодействие с крышкой 23 диспенсера. При опускании приводного механизма 34 на диспенсер 22 гранул (микросфер) реагента наконечник 39 испытывает сжатие и сначала смещается вверх, насколько это возможно. Затем наконечник 39, находящийся в сжатом состоянии, дополнительно смещается вниз. В результате взаимодействующие конические участки наконечника 39 и крышки 23 предпочтительно оказываются связанными, обеспечивая тем самым присоединение диспенсера 22 гранул (микросфер) реагента к приводному механизму 34.
Диспенсер 22 гранул (микросфер) реагента, представленный на фиг.6, по существу, аналогичен изображенному на фиг.3А, 3В и 4, за исключением того, что прокладка 29, показанная на фиг.3В и 4, заменена в варианте по фиг.6 удерживающим колпачком 43. На фиг.6 показано также положение приводной пружины 44, установленной между приводным компонентом 28 и плунжером 27 и передающей усилие от приводного компонента 28 плунжеру 27. Показана также возвратная пружина 45, установленная между плунжером 27 и направляющей 26 плунжера и заставляющая плунжер 27 (и, следовательно, приводной компонент 28) возвращаться в верхнее положение, когда приводной компонент 28 больше не активирован, т.е. не отжат вниз.
На фиг.7А показан приводной механизм 34, который захватил и поднял диспенсер 22 гранул (микросфер) реагента и который находится в процессе переноса данного диспенсера в желательное положение. После того как приводной механизм 34 вступил во взаимодействие с диспенсером 22 гранул (микросфер) реагента, этот механизм 34 поднимается так, что наконечник 39 не находится больше в сжатом состоянии. Данный наконечник возвращается в свое нижнее положение, причем корпус 24 шприцевого дозатора в составе диспенсера 22 гранул (микросфер) реагента оказывается зафиксированным относительно наконечника 39 посредством конических участков на наконечнике и на крышке 23 шприцевого дозатора.
На фиг.7В показан диспенсер 22 гранул (микросфер) реагента в процессе диспенсирования (подачи) гранул (микросфер) 20А реагента из данного диспенсера в гнездо лунки (не изображено) планшета для образцов (не изображен). Линейный приводной элемент 41 приводного механизма 34 предпочтительно активирован и обеспечивает опускание ходового винта 42, который соответственно перемещает толкатель 40 вниз. Это перемещение толкателя 40 отжимает вниз приводной компонент 28. Данный компонент передает усилие плунжеру 27 через приводную пружину 44, причем сам толкатель предпочтительно не контактирует непосредственно с плунжером 27. Плунжер 27 предпочтительно выводит гранулу (микросферу) 20А реагента из камеры в центральном канале, имеющемся в корпусе 24 шприцевого дозатора. Гранула (микросфера) 20А реагента предпочтительно проталкивается плунжером 27 через мембранный элемент 30, через втулку 25 и далее в углубление или гнездо планшета для образцов (не изображено).
На фиг.8А приводной механизм 34 показан в процессе сбрасывания со своего конца диспенсера 22 гранул (микросфер) реагента. В этом режиме работы диспенсер 22 гранул (микросфер) реагента находится над поддоном 36. Линейный приводной элемент 41 предпочтительно перемещает ходовой винт 42 вниз до тех пор, пока плунжер 27 не опустится в свое крайнее положение. Наконечник 39 также опускается в крайнее положение. После этого указанный элемент 41 предпочтительно продолжает прикладывать через приводной компонент 28 усилие к плунжеру 27, что, как показано на фиг.13В, приведет к тому, что диспенсер 22 гранул (микросфер) реагента будет с усилием отделен от наконечника 39. После этого данный диспенсер предпочтительно падает обратно на поддон 36 для диспенсеров гранул (микросфер) реагента.
Чтобы проиллюстрировать свойства варианта изобретения, было проведено испытание с использованием планшета для образцов, содержащего девять лунок 19. Каждая лунка 19 содержала десять гнезд 21, расположенных по окружности вокруг центральной части лунки 19. В каждое из гнезд 21 помещалась гранула реагента, покрытая реагентом с различными концентрациями. 10 гранул в первой лунке были покрыты реагентом с концентрацией 10 мкг/мл; 10 гранул во второй лунке - реагентом с концентрацией 8 мкг/мл; 10 гранул в третьей лунке - реагентом с концентрацией 4 мкг/мл; 10 гранул в четвертой лунке - реагентом с концентрацией 2 мкг/мл; 10 гранул в пятой лунке - реагентом с концентрацией 1 мкг/мл; 10 гранул в шестой лунке - реагентом с концентрацией 0,5 мкг/мл. 10 гранул в седьмой лунке не были покрыты реагентом, т.е. его концентрация составила 0 мкг/мл. 10 гранул в восьмой лунке были покрыты реагентом, имеющим различные концентрации, а именно составляющие 10 мкг/мл, 8 мкг/мл, 4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0 мкг/мл, 0 мкг/мл, 0 мкг/мл и 0 мкг/мл. 10 гранул в девятой лунке имели те же концентрации, что и гранулы реагента в восьмой лунке, и были расположены в той же последовательности.
Реагенты на указанных гранулах были покрыты твердой фазой, содержащей иммобилизированные антитела, в частности IgG овцы, и транспортировались в бикарбонатном буфере, содержащем 0,02% консерванта Kathon®.
Лунки 19 планшета для образцов очистили от консерванта, в котором транспортировались гранулы, после чего в каждую лунку добавили 400 мкл ослиного пероксидазного конъюгата против IgG овцы. Конъюгат был разбавлен в отношении 1/1000 в буфере-разбавителе Tris Buffered Saline ("TBS"). Затем планшет для образцов инкубировали при комнатной температуре и подвергли его вибрациям средней интенсивности в течение 45 мин. После этого любой несвязанный конъюгат был выведен из лунок 19 посредством одноканальной промывочной головки для микроформирователей DS2®, предлагаемой фирмой Dynex Technologies. После удаления из лунок 19 любого несвязанного конъюгата в каждую лунку немедленно добавили в качестве промывочной жидкости 500 мкл вышеупомянутого буфера-разбавителя TBS, разбавленного в отношении 1:20. Затем эта жидкость была удалена из лунок 19, и процесс подачи и удаления промывочной жидкости был повторен еще два раза. После завершения последнего повторения этого процесса в каждую лунку 19 немедленно добавили 300 мкл хемилюминесцентного маркера люминола. Затем планшет для образцов инкубировали в темноте при комнатной температуре, одновременно подвергая его вибрациям средней интенсивности в течение 15 мин. Сразу же после этого планшет для образцов перенесли к считывающей камере.
Камера работала с экспозицией 6 мин 30 с и с усилением 20. Съемка производилась через 22 мин и 29 мин после добавления люминола. После этого изменили экспозицию на 8 мин 37 с. Следующие снимки были сделаны через 38 мин, 47 мин, 56 мин и 65 мин после добавления люминола. Анализ изображений показал, что наибольший уровень сигнала имел место через 15-22 мин после добавления люминола, что согласуется с кривой затухания для этого маркера.
Согласно предпочтительному варианту после подачи гранул (микросфер) реагента в гнезда лунок планшета для образцов могут выполняться следующие операции. Сначала в одну или более лунок планшета для образцов может быть добавлен жидкий образец. Этот образец может содержать один или более аналитов, таких как специфичные антигены, которые могут реагировать с реагентом, нанесенным на одну или более гранул (микросфер). Гранулы (микросферы) реагента предпочтительно покрыты специфичным иммобилизированным антителом.
После того как жидкий образец добавлен в лунки, планшет для образцов предпочтительно подвергают инкубации. Когда в результате инкубации планшета для образцов образуются комплексы антиген-антитело, планшет для образцов предпочтительно подвергают одной или более операциям промывки и отсоса жидкости, чтобы полностью удалить несвязанный жидкий образец и любую жидкость, использованную при промывке. Затем добавляют конъюгат с энзимом, который будет связываться с антигеном в составе сформированных комплексов антиген-антитело, но который не будет связываться с антителами, в том числе в составе комплекса антиген-антитело. Затем планшет для образцов инкубируют и подвергают одной или более операций промывки и отсоса жидкости. По завершении этих операций добавляют люминол (или другой визуализирующий агент). Затем предпочтительно производят отсос жидкости из планшета для образцов, чтобы удалить любое избыточное количество люминола (или другого визуализирующего агента). При контакте люминола (или другого визуализирующего агента) с энзимами, связанными с антигенной частью комплекса антиген-антитело, люминол будет распадаться, вызывая появление характерной окраски. На завершающей стадии осуществляется анализ планшета для образцов, причем предпочтительно производится определение по конечной точке.
Далее будет подробно описан наиболее предпочтительный вариант изобретения, представленный на фиг.9А и 9В. На фиг.9А показаны 9 планшетов для образцов, установленных в держатель планшетов. Каждый планшет для образцов, показанный на фиг.9А, представляет собой стрип из 6×1 лунок. Планшеты для образцов могут устанавливаться в держатель с возможностью их извлечения. Таким образом, каждый из 9 планшетов для образцов (стрипов) содержит по 6 лунок, а в каждой лунке предпочтительно имеется по 10 (например, конических) гнезд, рассчитанных на прием гранул реагента. Гранулы реагента предпочтительно загружаются в конические гнезда таким образом, что они выступают над основанием лунки. На фиг.9В более подробно показан держатель планшетов, на который могут устанавливаться планшеты для образцов.
На фиг.10А более подробно показан стрип с шестью лунками. Согласно предпочтительному варианту лунки в стрипе разделены пространственно или каким-то иным образом. При этом в данном варианте планшета для образцов (стрипа) он может разделяться на отдельные лунки. На фиг.10В иллюстрируется установка стрипа из шести лунок в держатель планшетов.
На фиг.11А иллюстрируется установка единственной лунки (которая отделена от стрипа) в держатель планшетов. Лунки предпочтительно имеют охватывающую часть, способную сопрягаться с охватываемой частью, выполненной на основании указанного держателя. Планшет для образцов (стрип) предпочтительно выполнен с возможностью прочно фиксироваться на указанном держателе в процессе своей установки в этот держатель.
На фиг.11В представлено детальное изображение двух лунок, связанных отделяемым звеном 47. Отделяемое звено 47 предпочтительно позволяет пользователю разделять смежные лунки. Согласно данному варианту лунки могут отделяться одна от другой, но при этом могут устанавливаться одна рядом с другой в держателе планшетов, не создавая взаимных помех. Отделяемое звено 47 предпочтительно содержит одну, две или более двух точек 46 разделения. Согласно одному варианту отделяемое звено 47 между двумя лунками может быть отделено от лунки в первой точке 46 разделения. Отделяемое звено 47 может быть отломано или иным способом отделено во второй точке 46 разделения от единственной лунки, с которой оно оставалось связанным.
На фиг.11С показана лунка, связанная с концевым отделяемым звеном 48. Это звено позволяет использовать крайние лунки в держателе планшетов без создания помех для других лунок. Концевое отделяемое звено 48 создает захват, с помощью которого пользователь может извлечь стрип лунок или единственную лунку из держателя планшетов.
На фиг.11D показана лунка, снабженная пластинкой 49 идентификации/ориентации. На такую пластинку, печатью или иным способом, можно нанести идентификатор. Идентификатор может содержать двумерный или трехмерный штрих-код и/или текст, считываемый человеком. Данная пластинка предпочтительно помогает пользователю сориентировать лунку (в случае использования единственной лунки), согласуя положение пластинки с соответствующими деталями на держателе планшетов и/или на других лунках.
На фиг.12А стрип лунок представлен на виде снизу. Можно видеть, что согласно предпочтительному варианту каждая лунка содержит 10 гнезд, в которые при использовании стрипа помещают гранулы реагента. Основание (нижняя сторона) каждой лунки предпочтительно имеет также охватывающую часть, способную сопрягаться при использовании стрипа с охватываемой частью, выполненной в основании держателя планшетов.
На фиг.12В более детально показана охватывающая часть 50, которая облегчает позиционирование стрипа лунок на держателе планшетов. На фиг.12С показана соответствующая (ответная) охватываемая часть 51, выполненная в основании держателя планшетов. В одном варианте охватываемая часть 51 может содержать группу гибких выступов, которые предпочтительно могут деформироваться внутрь при установке лунки на охватываемую часть. Данные выступы предпочтительно смещаются (деформируются) все вместе, чтобы обеспечить фиксацию лунки без необходимости приложения чрезмерного усилия при установке лунки на пластину для планшетов и/или при снятии с нее лунки.
На фиг.13 стрип лунок представлен в продольном разрезе. Видно, что согласно предпочтительному варианту лунки содержат сужающиеся книзу гнезда 52. Эти гнезда 52 предпочтительно служат для размещения гранул реагента в процессе использования стрипа. Угол конусности гнезд в варианте по фиг.13 составляет предпочтительно 6,0°.
Хотя описанные варианты были основаны на применении гранул реагента, имеющих покрытие из биомолекул для использования в иммунологическом исследовании, в частности в ELISA, изобретение в равной степени охватывает гранулы реагента, содержащие (например, в виде покрытия) последовательности нуклеиновых кислот, которые применяются в качестве гибридных проб для обнаружения ДНК- или РНК-последовательностей, комплементарных содержащимся в гранулах реагента последовательностям. Как будет понятно специалистам в данной области, гибридная проба будет неактивной до момента гибридизации, после чего происходит изменение конформации, так что молекулярный комплекс становится активным, причем он будет флуоресцировать под действием УФ-облучения. Таким образом, все вышеописанные варианты во всех своих аспектах в равной степени применимы к использованию гранул реагента, содержащих (например, в виде покрытий) ДНК- или РНК-последовательности (или другие нуклеотидные последовательности) для применения в качестве гибридных проб при обнаружении комплементарных ДНК- или РНК-последовательностей.
Известны также многие варианты, включающие использование флуорогенных и люминогенных субстратов для анализа ELISA, прямой метки для второго компонента комплекса, содержащей флуоресцентную или люминесцентную молекулу (в этом случае процедура не называется ELISA, но содержит весьма схожие с ней операции), а также нуклеиновых кислот или других специфичных комплексообразующих агентов в качестве связывающих агентов вместо антител. Те же самые принципы могут быть использованы для обнаружения и распознавания любых материалов, образующих специфические связанные пары, например с применением в качестве одного из компонентов пары пектинов, ревматоидного фактора, протеина или нуклеиновых кислот.
Планшет для образцов может быть использован для детектирования аналита, такого как биомаркер, который может служить индикатором болезни или патологического состояния. Такой болезнью или состоянием может быть бластома, неоплазма или рак, например рак молочной железы, рак яичника, рак легких, рак толстой кишки, гиперпластический полип, аденома, колоректальный рак, тяжелая дисплазия, легкая дисплазия, гиперплазия простаты, рак простаты, меланома, рак поджелудочной железы, рак мозга (такой как глиобластома), заболевание системы крови, гепатоцеллюлярная карцинома, цервикальный рак, эндометриальный рак, рак головы и шеи, рак пищевода, гастроинтестинальная стромальная опухоль, гипернефроидный рак или рак желудка. Болезнями или патологическими состояниями могут также являться воспалительные заболевания, иммунные или аутоиммунные заболевания, например воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, воспаление тазовых органов, васкулит, псориаз, диабет, аутоиммунный гепатит, множественный склероз, тяжелая миастения, диабет 1 типа, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, тиреоидит Хашимото, базедова болезнь, анкилозный спондилит, болезнь Шегрена, CREST-синдром, склеродермия, ревматические заболевания, отторжение органа, первичный склерозирующий холангит или сепсис.Болезнью или патологическим состоянием может также являться кардиоваскулярное заболевание, такое как атеросклероз, сердечная недостаточность, нестабильные атеросклеротические бляшки, инсульт, ишемия, высокое кровяное давление, стеноз, окклюзия сосуда или тромбоз. Кроме того, болезнью или патологическим состоянием может являться неврологическое заболевание, такое как множественный склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, шизофрения, биполярное расстройство, депрессия, аутизм, прионная болезнь, болезнь Пика, деменция, болезнь Хантингтона, синдром Дауна, цереброваскулярная болезнь, энцефалит Расмуссена, вирусный менингит, нейропсихологическая системная красная волчанка, боковой амиотрофический склероз, болезнь Крейтцфельда-Жакоба, болезнь Герстманна-Штройсслера-Шейнкера, трансмиссивная губчатая энцефалопатия, ишемически-реперфузионное повреждение (например, инсульт), черепно-мозговая травма, микробная инфекция или синдром хронической усталости. Фенотипом может являться такое патологическое состояние, как фибромиалгия, хроническая нейропатическая боль или периферийная нейропатическая боль. Болезнью или патологическим состоянием может также быть инфекционное заболевание, вызванное бактериальной, вирусной или дрожжевой инфекцией, например болезнь Уипла, прионная болезнь, цирроз, метициллин-резистентный стафилококк золотистый, ВИЧ, гепатит, сифилис, менингит, малярия, туберкулез или грипп. Чтобы характеризовать вирусное заболевание, вирусные белки, такие как присутствующие в ВИЧ или им подобные, могут определяться в экзосомах.
Таким образом, планшет для образцов может быть использован в целях детектирования биомаркера, который может служить индикатором заболевания или патологического состояния. Так, планшет для образцов может содержать зонд для маркера рака и использоваться для определения маркера рака в образце, полученном от исследуемого человека. Присутствие, отсутствие или содержание такого маркера в образце может служить индикатором рака у этого человека. В другом варианте планшет для образцов может использоваться для мониторинга болезни или патологического состояния. Например, повышенный уровень маркера рака по сравнению с контрольным образцом или по сравнению с предыдущим анализом на маркер рака для того же человека может служить индикатором прогрессирующего рака. Еще в одном варианте планшет для образцов может использоваться для выбора терапии или плана действий применительно к патологическому состоянию. Например, пациент может иметь генетические характеристики, делающие его неспособным усваивать определенные лекарства. Планшет для образцов может использоваться для определения генетических особенностей. В другом варианте планшет для образцов может применяться для детектирования соединения, которое может свидетельствовать о неусвояемости лекарства. Планшет можно использовать и для детектирования приема определенных лекарств и веществ, например лекарств и побочных продуктов их приема, которые могут быть использованы при тестировании лекарств.
Планшет для образцов может быть использован также для лекарственного скрининга. Например, он может содержать зонд, который является целевым при разработке лекарства. В этом случае планшет для образцов можно использовать для скрининга библиотеки веществ. Альтернативно, планшет для образцов может содержать множество зондов, образующих библиотеку веществ, являющихся потенциальными лекарствами. Образец может содержать вещество, являющееся целевым лекарством, вводимым в планшет для образцов.
Разработан также набор, содержащий описанный планшет для образцов. Набор может содержать один или более компонентов для детектирования аналита или для проведения исследования. В одном варианте набор для детектирования аналита содержит один или более планшетов для образцов и множество гранул. Множество гранул может содержать один или более зондов, например нуклеиново-кислотный зонд, антитело, фрагмент антитела, протеин, пептид, аптамер или иное химическое соединение. В другом варианте предлагается набор для осуществления ELISA, содержащий: ELISA. Такой набор может содержать один или более планшетов для образцов, подобных описанным выше, и множество гранул с покрытием из реагента, содержащего антитело, антиген или иную биомолекулу. Еще в одном варианте набор может содержать компоненты для проведения тестирования на нуклеиновые кислоты, т.е. один или более планшетов для образцов, подобных описанным выше, и множество гранул с покрытием из ДНК- или РНК-последовательности.
Далее, со ссылками на фиг.14А и 14В, будут описаны другие варианты изобретения. Согласно варианту по фиг.14А гранулы 53 реагента загружают в планшет для образцов с нижней (задней) стороны планшета, содержащего гнезда в виде сквозных отверстий 54, которые в варианте, представленном на фиг.14А, выполнены сужающимися. Однако, как это будет показано далее, гнезда (сквозные отверстия) необязательно должны быть сужающимися; вместо этого они могут представлять собой, по существу, цилиндрические сквозные отверстия (гнезда), имеющие, по существу, постоянные диаметр и/или профиль, и/или площадь поперечного сечения. Так, на фиг.14В представлен планшет для образцов согласно варианту изобретения, в котором гранулы (микросферы) реагента зафиксированы в цилиндрических гнездах (сквозных отверстиях) 54. В эти гнезда гранулы (микросферы) могут быть введены либо сверху, либо снизу. Гранулы (микросферы) реагента предпочтительно фиксируются в гнездах (сквозных отверстиях) 54 с использованием посадок с натягом, так что гранулы (микросферы) образуют, по существу, герметичное (газонепроницаемое) уплотнение по всему периметру зоны контакта гранул (микросфер) реагента с гнездами.
Как показано применительно к данному варианту на фиг.15 и на фиг.14А, выполненные в лунках для образцов гнезда (сквозные отверстия) 54 могут сужаться от первого диаметра, соответствующего самой нижней части основания (дна) 55 лунки 56 для образцов, до второго меньшего диаметра, соответствующего самой верхней части основания 55. Самая верхняя часть основания 55 - это та его часть, которая при использовании планшета предпочтительно входит в контакт с жидким образцом.
В самой верхней своей части, которая непосредственно примыкает к основанию 55 и которая вступает в контакт с жидким образцом, гнездо (сквозное отверстие) 54 может иметь такой профиль, который обеспечивает для гранулы 53 реагента посадку с натягом. Профиль этой части гнезда (сквозного отверстия) может включать в себя часть сферического профиля или иную криволинейную область (например, с выпуклой или вогнутой частью) для того, чтобы гранула 53 реагента, введенная в гнездо (сквозное отверстие) 54 с нижней стороны планшета для образцов, плотно фиксировалась в части сферического профиля или в иной выпуклой или вогнутой области гнезда (сквозного отверстия) 54, как это показано на фиг.14А.
Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере часть гранулы 53 реагента выступает вверх над основанием (дном) лунки 56 для образцов, фактически образуя часть основания этой лунки. В результате верхняя часть гранулы 53 реагента (находящаяся выше области, в которой гранула и стенка сквозного отверстия образуют непроницаемое для текучей среды уплотнение по периметру гранулы) при использовании планшета может вступать в контакт с жидким образцом. Указанное уплотнение гранула 53 реагента образует вдоль всего своего периметра совместно с частью сферического или иного криволинейного профиля (выпуклой или вогнутой) гнезда (сквозного отверстия) 54.
Таким образом, согласно предпочтительному варианту макроскопические гранулы 53 вводят в лунки 56 планшета для образцов таким образом, что в контакт с жидкостью могут вступать только верхние части этих гранул. Следует отметить, что процесс приема излучения люминесценции является двумерным и воспринимающим сигнал только от видимой части гранулы 53 реагента, обращенной к камере.
Согласно предпочтительному варианту лунка с несколькими гнездами и с гранулами реагента, загруженными в сквозные отверстия, отлично воспроизводит хорошо отработанный процесс типа ELISA с применением микропланшет, причем данная лунка с несколькими гнездами согласно предпочтительному варианту, по существу, аналогична по формату лунке микропланшета.
Одним из главных факторов при проведении исследования ELISA в микропланшете является эффективность или безупречность каждого шага. Любая остаточная жидкость после проведения тех или иных шагов может оказать влияние на конечный результат. Например, если конъюгат не был полностью удален при промывке, остаточный конъюгат даст ложный сигнал от гранулы. Это может понизить чувствительность теста вследствие повышения фонового сигнала.
Ключевым фактором успешного проведения тестов является отсутствие в лунке любых ловушек для жидкости. Любые углы, ниши или выступы могут удерживать жидкость и тем самым снижать эффективность планшета для образцов. Согласно предпочтительному варианту планшет обеспечивает эффективную промывку, смешивание и отсасывание подобно тому, как это имеет место в обычных лунках микропланшета и предпочтительно не испытывает проблем, связанных с захватом жидкости.
Преимущество предпочтительного варианта состоит в том, что гранулы 53 предпочтительно фиксируются в лунке 56 для образцов на постоянной высоте, что эффективно гарантирует идентичное воздействие на каждую гранулу 53. При этом каждая гранула 53 герметично перекрывает гнездо в виде сквозного отверстия, чтобы гарантировать отсутствие жидкости, удерживаемой ниже гранулы 53.
Сквозное отверстие 54 может представлять собой сужающееся кверху отверстие, в котором фиксируется гранула, как это показано на фиг.14А. Альтернативно, сквозное отверстие 54 может представлять собой цилиндрическое отверстие меньшего диаметра, в которое гранулу механически вдавливают до положения, показанного на фиг.14В. В обоих вариантах решается задача предотвращения прохода жидкости мимо гранулы 53 и последующего удерживания жидкости ниже гранулы 53.
Если планшет для образцов содержит одно или более сужающихся сквозных отверстий 54, подобных показанным на фиг.14А, эти отверстия желательно изготовить с высокой точностью и с постоянством размеров, чтобы гарантировать фиксацию гранул в планшете для образцов на постоянной высоте (поскольку гранулы 53 реагента предпочтительно вдавливаются в сквозные отверстия 54 с постоянным усилием, а не на заданную глубину). Альтернативный вариант с использованием цилиндрических сквозных отверстий уменьшенного диаметра, представленный на фиг.14 В, не требует такой высокой точности изготовления, поскольку в нем гранулы 53 реагента предпочтительно вдавливаются в сквозные отверстия на заданную глубину, а не с заданным усилием.
В некоторых описанных вариантах гранулы реагента могут вводиться в выполненные в лунках для образцов глухие гнезда (глухие углубления). Однако более предпочтителен планшет для образцов, описанный выше со ссылками на фиг.14А и 14В, т.е. имеющий сквозные отверстия в основании.
Желательно проводить, на стадии его формирования, проверку качества планшета для образцов с загруженными в него гранулами реагента, чтобы удостовериться, что все гранулы в планшете герметично перекрывают соответствующие гнезда. Введение гранул в описанные выше глухие гнезда обеспечивает отсутствие утечек жидкости из лунки. Однако жидкость может подтекать под гранулы, причем такие утечки будет трудно обнаружить.
Согласно предпочтительному варианту планшет для образцов, содержащий сквозные отверстия типа показанных на фиг.14А и 14В, позволяет проводить проверку с приложением давления как часть процесса загрузки гранул в планшет и контроля качества этой загрузки. Такая проверка гарантирует, что качество уплотнения, создаваемое гранулами в планшете, является высоким. Дефектные гранулы или поврежденные отверстия будут обнаруживаться на стадии изготовления, а не при проведении исследования пользователем.
Планшет для образцов согласно варианту по фиг.14А или, возможно, по фиг.14В, в котором гранулы реагента вводят в гнездо снизу, по ряду причин является особенно эффективным. Во-первых, контакт между гранулой 53 реагента и инструментом, осуществляющим ее введение, происходит на нижней части гранулы 53, так что любой след от данного контакта будет находиться на нижней части гранулы 53 реагента, т.е. не на той ее части, которая будет затем контактировать с жидким образцом. Во-вторых, верхней части сквозного отверстия 54 в основании 55 лунки для образца в примере по фиг.14А можно придать профиль, соответствующий форме гранулы 53 реагента, так что никакая часть гнезда не будет окружать часть гранулы 53, выступающую вниз, в основание планшета. Следовательно, такая конструкция предотвращает любую возможность удерживания жидкости ниже гранулы 53 реагента. В-третьих, если кончик вдавливающего инструмента создает перекрестное загрязнение между гранулами, это не будет иметь значения, поскольку данный инструмент вступает в контакт только с нижней частью гранулы 53 реагента и не контактирует с ее верхней частью (т.е. с той частью гранулы 53, которая будет вступать в контакт с жидким образцом). В-четвертых, в варианте по фиг.14А гранулы 53 реагента могут быть введены в основание на большую глубину без формирования областей, охватывающих гранулы, и при снижении риска перекрестного загрязнения.
В US 2009/0069200 описана система для приготовления биомолекулярных систем. На фиг.2 и 3 в US 2009/0069200 показаны сферические гранулы реагента 9, находящиеся в квадратных гнездах 8. Представляется очевидным, что круглые гранулы, помещенные в квадратные гнезда, не создают герметичных уплотнений в сочетании со стенками гнезд. Решение, описанное в US 2009/0069200, отличается от предпочтительного варианта изобретения также тем, что жидкость может проходить по гнездам вверх, поднимаясь над гранулами. По контрасту, согласно предпочтительному варианту изобретения жидкость может контактировать только с верхней поверхностью гранулы 53 реагента, т.е. в этом варианте предотвращается прохождение жидкости по сквозному отверстию 54 за гранулу 53 реагента, зафиксированную в сквозном отверстии (гнезде) 54.
Преимуществом планшета для образцов согласно предпочтительному варианту является возможность его удобной очистки в процессе исследования без удерживания жидкости под гранулами 53 реагента. Эти гранулы предпочтительно поставляются максимально приближенными по размерам к размерам цилиндрического гнезда и позволяющими обеспечить удобный доступ к ним сверху.
В решении, описанном в US 2009/0069200, используется общая заполнительная камера в виде резервуара, расположенного под загруженными в лунки гранулами, наличие которых в лунках позволяет жидкости подниматься по индивидуальным лункам. Круглые гранулы помещают в квадратные сужающиеся гнезда, т.е. гранулы в сочетании с гнездами не создают непроницаемых для жидкости уплотнений. Более того, именно помещение сферических гранул в квадратные гнезда позволяет жидкости подниматься, проходя вдоль гранул и выше их.
Такой планшет для образцов, как описанный в US 2009/0069200, должен изготавливаться в виде двух отдельных частей, поскольку технически невозможно изготовить в виде отдельной детали планшет для образцов, снабженный резервуаром. При этом нижнюю часть описанного планшета, образующую дно 11 планшета, в процессе изготовления планшета будет необходимо герметично соединить с его верхней секцией, содержащей множество лунок 7. Для устранения утечек каждая лунка 7 должна быть герметично прикреплена к дну 11 планшета. Следовательно, необходимо будет обеспечить надежное герметичное сопряжение между дном 11 планшета и всеми расположенными выше лунками 7 для образцов. Как следствие, процесс изготовления является относительно сложным, с высокой вероятностью различных производственных проблем.
Планшет для образцов, описанный в US 2009/0069200, обладает высокой сложностью в отношении гидродинамических характеристик. Первоначальная подача жидкости в планшет для образцов должна производиться через одно из гнезд. Как следствие, необходимо обеспечить точную подачу жидкости в небольшую зону со стороной менее 1,7 мм, которая, по существу, меньше диаметра лунки для образцов согласно предпочтительному варианту. Кроме того, жидкость, поданная в одно из гнезд, должна распределиться по камере (резервуару) 12 на дне планшета для образцов перед тем, как она будет равномерно подниматься в каждом гнезде, чтобы гарантировать достаточную степень иммерсии всех гранул. Поэтому должно быть понятно, что гидродинамика, ассоциированная с устройством согласно US 2009/0069200, является сложной, а наличие извилистых каналов для жидкости затрудняет получение воспроизводимых результатов.
После того как образец или жидкий конъюгат будет подан в планшет устройства согласно US 2009/0069200 и пройдет мимо гранул и за них, в серийных устройствах такого типа жидкость может быть удалена. Однако, поскольку доступ к планшету для образцов имеется только сверху, эта задача является очень сложной. Даже если герметично присоединить к верхнему концу лунки прямоугольную вакуумную трубку, нельзя гарантировать, что будет удалена вся жидкость, находящаяся в камере (резервуаре), выполненной (выполненном) в дне планшета для образцов. Как следствие, существует вероятность, что в резервуаре будет присутствовать остаточная жидкость, что может привести к появлению ложных сигналов.
Таким образом, должно быть понятно, что устройству, описанному в US 2009/0069200, присущи серьезные проблемы.
В отличие от него, планшет для образцов согласно предпочтительному варианту изобретения свободен от рассмотренных проблем, т.е представляет собой существенное усовершенствование по сравнению с известными устройствами типа описанных в US 2009/0069200.
На фиг.15 показан стрип из 6 лунок для образцов с 5 гранулами реагента диаметром 3 мм, загруженными в сквозные отверстия в каждой лунке. Гранулы реагента введены в сквозные отверстия снизу, т.е. с нижней стороны планшета для образцов. Гранулы реагента удерживаются в сквозных отверстиях благодаря наличию верхних вогнутых участков, сформированных в сквозных отверстиях.
На фиг.16 часть планшета, описанная выше и представленная на фиг.14А и 15, показана в перспективном изображении, в разрезе.
На фиг.17 представлен еще один вариант изобретения, в котором основание лунки для образцов разделено на сегменты 57А-57Е. Согласно данному варианту в основании каждого из сегментов 57А-57Е выполнены одно или более открытых сверху сквозных отверстий, в которые можно, сверху или снизу, вводить гранулы реагента. Согласно другому варианту в основании каждого из сегментов 57А-57Е можно выполнить одно или более глухих углублений, в которые гранулы реагента можно вводить сверху. Согласно еще одному варианту в основаниях некоторых сегментов 57А-57Е могут быть выполнены одно или более сквозных отверстий, а в основаниях других сегментов 57А-57Е - одно или более глухих углублений. Согласно предпочтительному варианту некоторые или все сквозные отверстия и/или углубления выполнены несужающимися и образующими цилиндрические гнезда. Однако, согласно менее предпочтительному варианту, некоторые или все сквозные отверстия и/или некоторые или все углубления могут быть сужающимися.
Согласно предпочтительному варианту при использовании планшета гранулы (микросферы) реагента удерживаются (фиксируются) в имеющихся в основаниях сегментов сквозных отверстиях и/или в углублениях с образованием по периферии гранул, совместно со стенками оснований, задающих эти отверстия и/или углубления, уплотнений, по существу, непроницаемых для текучей среды.
Сегменты 57А-57Е основания могут быть размещены с взаимным смещением, например по спирали, подобно тому, как это показано на фиг.17. Желательно, чтобы эти сегменты были взаимно смещены по высоте. В результате гранулы реагента, которые введены в открытые сквозные отверстия или углубления, выполненные в основаниях сегментов 57А-57Е, не будут находиться на линиях прямого видения, проведенных между смежными гранулами (в менее предпочтительных вариантах части гранул реагента, находящиеся на линиях прямого видения между смежными гранулами, будут существенно уменьшены). В варианте, показанном на фиг.17, основание сегмента 57А расположено выше, чем основание сегмента 57В; основание сегмента 57В расположено выше, чем основание сегмента 57С; основание сегмента 57С расположено выше, чем основание сегмента 57D, а основание сегмента 57D расположено выше, чем основание сегмента 57Е. Варианты, в которых отсутствуют (или, менее предпочтительно, их количество уменьшено) линии прямого видения между гранулами реагента, введенными в сквозные отверстия и/или углубления в основаниях сегментов, находящихся в одной и той же лунке для образцов, включая вариант по фиг.17 (и, в меньшей степени, варианты с ограниченными областями прямого видения), имеют преимущества. Эти преимущества состоят в том, что при последующем оптическом анализе гранул с целью определения интенсивности реакции перекрестное влияние между гранулами реагента оказывается, по существу, уменьшенным или устраненным. Согласно предпочтительному варианту гранулы реагента содержат индикатор, который в процессе анализа освещают источником света и определяют интенсивность этого индикатора на гранулах посредством детектора (такого как камера), чтобы получить количественную оценку интенсивности реакции.
На фиг.18А и 18В представлен другой вариант, в котором в лунке для образцов имеется перегородка (разделитель) 58 небольшой высоты, чтобы разделить основание лунки на первую область 59 с двумя открытыми сквозными отверстиями или углублениями и вторую область 60 с тремя открытыми сквозными отверстиями или углублениями. Должно быть понятно, что возможны и другие варианты, в которых первая область 59 и/или вторая область 60 основания могут содержать большее или меньшее количество сквозных отверстий или углублений.
На фиг.19А и 19В представлен еще один вариант, в котором в лунке для образцов также предусмотрена перегородка 61 небольшой высоты. Согласно варианту по фиг.19А и 19В перегородка 61 разделяет основание лунки на первую область 62А с 4 открытыми сквозными отверстиями или углублениями и вторую область 62В, также имеющую 4 открытых сквозных отверстия или углубления.
Хотя изобретение было описано со ссылками на предпочтительные варианты, специалистам будет понятно, что, не выходя за пределы изобретения, определяемые прилагаемой формулой, в форму и детали его осуществления могут быть внесены различные изменения и модификации.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПЛАНШЕТ ДЛЯ ОБРАЗЦОВ | 2010 |
|
RU2537234C2 |
| ПЛАНШЕТ ДЛЯ ОБРАЗЦОВ | 2010 |
|
RU2476889C2 |
| ТЕПЛООБМЕННОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЛУНОЧНЫХ ПЛАНШЕТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ОБРАЗЦЫ | 2002 |
|
RU2272978C2 |
| ФИКСАТОР ПЛАНШЕТА ДЛЯ ПРЕЦИЗИОННОГО МАНИПУЛЯТОРА, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ РАБОТЫ С ЖИДКОСТЯМИ | 2001 |
|
RU2270720C2 |
| СПОСОБ И СИСТЕМА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ В ЖИДКОМ ОБРАЗЦЕ С ПОМОЩЬЮ МАГНИТНЫХ ЧАСТИЦ | 2016 |
|
RU2721121C1 |
| ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ИНСТРУМЕНТ И СПОСОБ ПОДГОТОВКИ, АНАЛИЗА ОБРАЗЦА | 2011 |
|
RU2579971C2 |
| МИКРОПЛАНШЕТ | 2015 |
|
RU2663042C2 |
| УСТРОЙСТВО ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ, ОСНАЩЕННОЕ ЭЛЕМЕНТОМ ДЛЯ ПРИЛОЖЕНИЯ МАГНИТНОГО ПОЛЯ, СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЦЕЛЕВОГО ВЕЩЕСТВА ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА И СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ И ОЧИСТКИ БЕЛКА | 2011 |
|
RU2545404C2 |
| ПРИБОР ДЛЯ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ И РЕАГЕНТОВ | 2015 |
|
RU2697877C2 |
| Септы (варианты) | 2022 |
|
RU2789055C1 |
Группа изобретений относится к области биологии, в частности к иммунологическим исследованиям, являющимися предпочтительным методом тестирования биологических продуктов и при которых используется планшет для образцов, в частности, при осуществлении энзим-связывающего иммуносорбентного анализа - ELISA, или других процедур, связанных с иммунным анализом, использующих нуклеиново-кислотный зонд, а также при использовании для проведения тестирования на наличие ДНК- или РНК-последовательностей. Планшет содержит одну или более лунок для образцов, причем каждая лунка для образцов имеет основание и одно или более открытых сквозных отверстий, выполненных в основании. Каждое из открытых сквозных отверстий имеет в поперечном сечении круглую форму и выполнено цилиндрическим, причем диаметром, меньшим, чем диаметр введенной в него гранулы или микросферы реагента. Гранула или микросфера реагента удерживается или фиксируется в указанном сквозном отверстии посредством посадки с натягом или фрикционной посадки с формированием периферийного уплотнения, непроницаемого для текучей среды относительно стенки основания, образующей указанное сквозное отверстие. Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности и качества исследований при одновременном сокращении временных затрат. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 34 ил.
1. Планшет для образцов, содержащий одну или более лунок для образцов, причем единственная или каждая лунка для образцов имеет основание и одно или более открытых сквозных отверстий, выполненных в основании, отличающийся тем, что:
единственное или каждое из открытых сквозных отверстий имеет в поперечном сечении круглую форму,
гранула или микросфера реагента удерживается или фиксируется в указанном сквозном отверстии посредством посадки с натягом или фрикционной посадки с формированием, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки основания, образующей указанное сквозное отверстие,
при этом открытое сквозное отверстие является цилиндрическим и имеет диаметр, меньший, чем диаметр введенной в него гранулы или микросферы реагента, с обеспечением тем самым возможности удерживания или фиксации гранулы или микросферы реагента в сквозном отверстии посредством указанной посадки с натягом или фрикционной посадки.
2. Планшет по п. 1, в котором по меньшей мере некоторые из открытых отверстий, выполненных в основании по меньшей мере одной лунки, расположены так, что отсутствует линия прямого видения между гранулами реагента, удерживаемыми или зафиксированными в смежных открытых сквозных отверстиях.
3. Планшет по п. 1, в котором в основании по меньшей мере одной лунки выполнено более одного отверстия, а указанное основание разделено на сегменты, взаимно смещенные по высоте.
4. Планшет по любому из пп. 1-3, в котором в основании по меньшей мере одной лунки выполнено более одного отверстия, а указанная лунка снабжена одной (одним) или более заслонок (разделителей), разделяющих указанное основание по меньшей мере на первую и вторую области.
5. Планшет по п. 4, в котором одна (один) или более указанных заслонок (разделителей) выполнены с возможностью:
(i) ослаблять или устранять попадание света, отраженного от одной или более гранул реагента, находящихся в указанной первой области, на одну или более гранул реагента, находящихся в указанной второй области, и/или
(ii) ослаблять или устранять попадание света, отраженного от одной или более гранул реагента, находящихся в указанной второй области, на одну или более гранул реагента, находящихся в указанной первой области.
6. Способ фиксации гранулы или микросферы реагента в планшете для образцов, включающий:
обеспечение наличия планшета для образцов, содержащего одну или более лунок для образцов, причем одна или каждая лунка для образцов имеет основание и одно или более открытых сквозных отверстий, выполненных в основании, и характеризующегося тем, что одно или более открытых сквозных отверстий имеют в поперечном сечении круглую форму, и
удерживание или фиксацию гранулы или микросферы реагента в сквозном отверстии посредством посадки с натягом или фрикционной посадки с формированием, по существу, непроницаемого для текучей среды периферийного уплотнения относительно стенки указанного основания, образующей указанное сквозное отверстие,
при этом открытое сквозное отверстие является цилиндрическим, с диаметром, меньшим, чем диаметр помещенной в него гранулы или микросферы реагента, с обеспечением тем самым возможности удерживания или фиксации гранулы или микросферы реагента в сквозном отверстии посредством указанной посадки с натягом или фрикционной посадки.
7. Способ использования планшета для образцов при анализе образца на наличие различных аналитов, включающий:
обеспечение наличия планшета для образцов, выполненного в соответствии с любым из пп. 1-5, и
добавление образца в лунку указанного планшета.
8. Применение планшета для образцов по одному из пп. 1-5 для подготовки образцов к энзим-связывающему иммуносорбентному анализу (ELISA) для определения антигена или антитела в образце.
9. Применение планшета для образцов по одному из пп. 1-5 для подготовки образцов к анализу для обнаружения в образце посредством нуклеиново-кислотного зонда ДНК- или РНК-последовательности.
| Регулятор давления | 1973 |
|
SU481742A1 |
| Устройство для качения тел | 1947 |
|
SU74479A1 |
| Способ приготовления мыла | 1923 |
|
SU2004A1 |
| Способ и приспособление для нагревания хлебопекарных камер | 1923 |
|
SU2003A1 |
| Колосоуборка | 1923 |
|
SU2009A1 |
