ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСА АНТИОКСИДАНТНЫХ ВИТАМИНОВ И АМИНОКИСЛОТ В КАЧЕСТВЕ ДОПОЛНЕНИЯ К СТАНДАРТНЫМ МЕТОДАМ ТЕРАПИИ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАПИЛЛОМАВИРУС-АССОЦИИРОВАННЫХ ПРЕДРАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ШЕЙКИ МАТКИ И ПРОФИЛАКТИКИ КАНЦЕРОГЕНЕЗА ПРИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/355 A61K31/198 A61K31/122 A61K31/685 A61K31/20 A61P31/20 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкогинекологии, биохимии и иммунологии, а именно к применению комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот для лечения папилломавирус-ассоциированных предраковых заболеваний шейки матки и профилактики канцерогенеза при папилломавирусной инфекции.

В последние годы в человеческой популяции отмечен рост заболеваемости раком шейки матки среди женщин молодого и среднего возраста [1], с особенно заметным повышением заболеваемости рака шейки матки в группе женщин до 29 лет, составляющим 2,1% в год.

В настоящее время нет единого международного стандарта лечения заболеваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека [2]. Проводится активная разработка хирургических методов терапии предраковых заболеваний шейки матки, однако описаны осложнения в результате применения деструктивных методик [1, 3, 4].

Для консервативной терапии предлагается использовать несколько направлений, учитывающих участие иммунной системы в развитии заболевания, среди которых ведущее место принадлежит иммуномодулирующей и противовирусной терапии.

Известны способы терапии предраковой патологии шейки матки с применением иммуномодуляторов (ликопид, амиксин, виферон, кипферон) [2]. В патенте РФ №2283663 (авторы Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л.А. и другие) предлагается использование пентапептида (Val-Val-Tyr-Pro-Asp) в качестве иммуномодулятора при раковых и предраковых заболеваниях. В патенте РФ №2337700 Гольдберга Е.Д. с соавторами предлагается использование водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, обладающих иммуномодулирующей активностью и эффективно стимулирующих Thl-зависимый тип иммунного ответа. Известен способ иммунотерапии по патенту №2347562 Данилец М.Г. и соавторов производными D-глюкуроновой кислоты. Также описан способ активации противовирусного иммунитета с помощью лекарственного средства на основе ионного серебра с метиленовым синим (патент РФ №2390343).

Недостатками иммуностимулирующей терапии является то, что следствием активации клеток является повышение продукции радикалов кислорода и азота [10]. Высокореактивные радикалы участвуют в элиминации бактерий и вирусов при остром инфекционном процессе [10, 11]. Однако при хронических вирусных инфекциях (в том числе папилломавирусной инфекции) доказано, что избыточная генерация радикалов, в свою очередь, является канцерогенным фактором, в связи с чем актуальной задачей исследования является оценка эффективности применения препаратов антиоксидантов.

Среди веществ, регулирующих противоопухолевую активность, наибольшее количество патентов связано с антиоксидантами растительного происхождения. Предложенные в патентах способы воздействия на процессы свободно-радикального окисления касаются области применения препаратов антиоксидантов, в основном с добавлением селена и его производных (селенит натрия) (патенты РФ №2281007, №2161034), витаминов (патенты №2080871, №2306148), фитопрепаратов (№2188031, №2001118076, №2252772, №2378003, №2302252, №2404766). В патенте №2308961 Сафоновой Г.М., Дуняшевой Е.А. предлагается использование очищенных концентрированных экстрактов из листьев персика и растения очанки, обладающих антиоксидантным, противоопухолевым, противовоспалительным, антибактериальным, гипотензивным, иммуномодулирующим и адаптогенным действием.

Однако вышеуказанная группа веществ эффективна при длительном использовании, в то время как процессы трансформации тканей в раковые клетки могут превалировать по интенсивности и скорости развития над эффектом растительных препаратов. Кроме того, нежелательным следствием действия антиоксидантов является неконтролируемое снижение радикалообразования с падением уровня радикалов ниже нормы. Желательным эффектом антиоксидантных препаратов является нормализация, а не падение ниже нормы уровня антиоксидантных ферментов и общей антиокислительной активности плазмы крови и тканей.

Оптимальным в терапии вирус-ассоциированных заболеваний, таких как предраковые и раковые заболевания шейки матки, является наличие комбинированного как антиоксидантного, так и противовирусного эффекта.

Наиболее близким по действию к заявляемому изобретению является патент №2244546 на средство (3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия), обладающее антиоксидантными и противовирусными свойствами, благодаря чему может использоваться как самостоятельное лекарственное средство, так и в композициях с другими препаратами для лечения вирусных инфекций (авторы Киселев О.И., Малякшин А.В.). Однако 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия снижает радикалообразование, а не регулирует его, нормализуя баланс свободные радикалы - антиоксидантны.

В качестве прототипа принят патент RU №2328294 Беспалова В.Г. и соавторов, в котором предлагается использование комплекса антиоксидантных витаминов ретинола ацетата (90-270 мг%) и α-токоферола ацетата (1,3-4 г%), антиоксидантного микроэлемента селенита натрия (1,3-4 мкг%) и глюкарата кальция (4-12 г%). Несмотря на сбалансированный состав, у данного комплекса нет противовирусной активности.

Таким образом, перспективным направлением, по-видимому, является применение комбинированных антиоксидантов и аминокислот, сочетающих различные механизмы действия нескольких компонентов препарата, а также корригирующих радикалообразование, но не уменьшающих его интенсивность ниже нормы, что является патогенетически обоснованным при вирус-ассоциированном поражении клеток и тканей.

Задача изобретения - разработка способа лечения больных с вирус-ассоциированными предраковыми заболеваниями шейки матки, а также способа профилактики канцерогенеза шейки матки при папилломавирусной инфекции, сочетающего коррекцию радикалообразования и противовирусный эффект.

Предложено в качестве дополнения к стандартным методам терапии применять комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот, состоящий из альфа-токоферола, 1-метионина, убихинона, селена, фосфолипидов и омега 3,6 жирных кислот (Immugen, IDI FARMACEUTICI, Италия). Комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот обладает противовирусным и антиоксидантным эффектами. Комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот назначают пациенткам ежедневно в капсулах во время еды по 1-2 капсулы в зависимости от состояния пациентки в течение 2-3 месяцев.

Существенным отличием предлагаемого способа лечения и профилактики развития предраковых заболеваний шейки матки на фоне ВПЧ является сочетание нескольких патогенетически важных эффектов: нормализация интенсивности радикалообразования, повышение антиоксидантной защиты, а также противирусный эффект комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот. Преимуществом от всех известных аналогов является также возможность применения данного метода до формирования патологических процессов в тканях, что дает возможность врачам назначить профилактический курс и предотвратить развитие рака шейки матки при выявленной предрасположенности или при наличии факторов риска.

Сущность изобретения состоит в одновременном воздействии на разные звенья патогенеза канцерогенеза шейки матки, что приводит к оптимизации терапии предраковых заболеваний шейки матки и повышению ее эффективности. Препарат, состоящий из альфа-токоферола, 1-метионина, убихинона, селена, фосфолипидов и омега 3,6 жирных кислот, как было показано ранее, являлся эффективным при бактериальных и вирусных заболеваниях (Immugen, IDI FARMACEUTICI, Италия) [5, 6, 7, 8, 9]. Однако его состав и сочетание противирусной активности (показана активность при папилломавирусной инфекции кожи [5], антиоксидантной активности позволило нам предположить возможность его успешного применения при ВПЧ-ассоциированных предраковых заболеваниях шейки матки.

Предлагаемый способ лечения и профилактики развития предраковых заболеваний шейки матки у женщин, инфицированных вирусами папилломы человека, осуществляют следующим способом:

комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот, состоящий из альфа-токоферола, 1-метионина, убихинона, селена, фосфолипидов и омега 3,6 жирных кислот назначают пациенткам с предраковыми заболеваниями шейки матки ежедневно в капсулах во время еды (по 1-2 капсулы зависимости от состояния пациентки в течение 2-3 месяцев). Способ позволяет повысить эффективность лечения и составляет основу профилактики канцерогенеза шейки матки у женщин с выявленными вирусами папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска.

Пример 1.

Для исследования эффективности комбинированной терапии с подключением комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот («Immugen») было проведено клинико-лабораторное исследование с оценкой основных звеньев противоопухолевой защиты: оценкой интенсивности апоптоза и уровня радикалобразования в биоптатах шейки матки на фоне терапии. Критериями терапевтической и противоопухолевой эффективности комплексной терапии шейки матки явились результаты повышения активности апоптоза и понижения концентрации токсичных метаболитов радикалов (нитрат-нитритов) в биоптатах шейки матки.

В исследование были включены 250 пациенток, стратифицированных по патологии:

1 группа - 152 клинически здоровые женщины с выявленным ВПЧ высокого онкогенного риска в возрасте 25-45 лет;

2 группа - 98 пациенток с предраковыми заболеваниями шейки матки в возрасте 25-52 лет.

Все пациентки предоставили подробную информацию об имевшихся ранее случаях заболеваний, передающихся половым путем. У всех пациенток был проведен тщательный осмотр промежности, вульвы, влагалища, уретры и канала шейки матки.

Разделение участников исследования. Каждая из женщин-участниц рандомизированного исследования эффективности подключения препаратов антиоксидантов в профилактике развития канцерогенеза подписала подтверждение согласия на участие. После стратификации пациентов по патологии (см. схему 1) они были распределены случайным образом (двойное слепое рандомизированное исследование) в опытную группу или в плацебо-группу:

1 группа «Immugen 1» - 82 клинически здоровые женщины с выявленным ВПЧ высокого онкогенного риска в опытной группе; 70 клинически здоровых женщин с выявленным ВПЧ высокого онкогенного риска в группе плацебо (группа «Плацебо 1»).

2 группа «Immugen 2» - 50 пациенток с предраковыми заболеваниями шейки матки в опытной группе; 48 женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки в группе плацебо (группа «Плацебо 2»).

На схеме 1 показано разделение пациенток с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ-инфекция) и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки в испытании эффективности подключения препаратов-антиоксидантов.

В качестве препарата-антиоксиданта апробирован «Immugen» IDIFARMACEUTICIS.p.A. (Италия), который является одной из последних разработок в области комбинаций антиоксидантов и аминокислот и представляет собой уникальный комплекс оптимально сочетающихся компонентов [5, 6, 7, 8, 9, 11]. Препарат состоит из убихинона, витамина E (альфа-токоферол-ацетат), фосфолипидов сои (лецитин), альфа-метионина и селена. Метионин и селен обладают антиоксидантными свойствами, снижая разрушающее действие свободных радикалов. КоэнзимQ усиливает метаболические процессы и ускоряет ранозаживление, снижает интоксикацию, улучшает общую сопротивляемость организма, является одним из основных веществ, активно противостоящих процессам старения. Фосфолипиды сои и витамин E дополняют комплекс за счет выраженных антисклеротических и противораковых свойств. Показано эффективное действие препарата при некоторых вирусных инфекциях, папилломатозе кожи, атопическом дерматите, гнойно-воспалительных процессах мягких тканей [5, 6, 7, 8, 9, 11].

Комплексная терапия пациенток из группы «Плацебо 1» включала «Виферон» №2 2 раза в день внутривлагалищно в течение 7 дней в сочетании с индукторами интерферона (амиксин, ридостин, циклоферон) [2]. Комплексная терапия пациенток из группы «Плацебо 2» включала при большой площади поражения метод эксцизии или деструкции, в сочетании с противовирусной и иммуномодулирующей терапией (изопринозин 1000 мг, 3 раза в стуки, 10 дней, свечи «Виферон» №2 2 раза в день внутривлагалищно в течение 10 дней в сочетании с индукторами интерферона (амиксин, ридостин, циклоферон) [2, 3].

В группах «Immugen 1» и «Immugen 2» дополнительно к стандартной терапии соответствующей группы добавлялся препарат Immugen по 2 капсулы 3 раза в день во время еды в течение 3 месяцев. При оценке переносимости препарата Immugen проводился мониторинг и регистрация любых эпизодов (как общих, так и местных), которые могут быть связаны или не связаны с применением препарата. На каждую женщину, участвующую в исследовании, была заведена и тщательно заполнялась «Индивидуальная регистрационная карта» для учета общих и местных реакций. В исследование не включались больные, подвергнутые ранее любому виду противовирусной и противоопухолевой терапии, и пациентки, имеющие серьезные сопутствующие заболевания других систем организма. Во всех группах пациенток были изучены показатели апоптоза в различном биологическом материале согласно нижеприведенным методам.

Все пациентки после лечения оставались под наблюдением, сроки которого варьировали от одного года до 8 лет.

В группу контроля вошли 30 здоровых доноров, не имеющих антител к ВПЧ, ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ в сыворотке крови и не содержащих ДНК ВПЧ, ВПГ, ЦМВ и других инфекций, передающихся половым путем в половом тракте.

Показатели апоптоза измерялись в следующих биологических материалах: сыворотка крови, цервикальное отделяемое, в лейкоцитах периферической крови пациенток, в клеточных элементах цервикального канала.

Метод определения sFAS

Для определения использовались 96-луночные тест-системы BenderMedSystems (USA). Определение растворимогоsFAS проводили следующим образом:

- Промывали ячейки планшета дважды промывочным буфером.

- Добавляли по 100 мкл разбавителя образцов в ячейки, предназначенные для стандартов.

- Вносили по 100 мкл разбавителя образцов в ячейки «Бланк».

- Вносили по 90 мкл разбавителя образцов в ячейки, предназначенные для образцов.

- Вносили по 10 мкл каждого образца в дублях в соответствующие ячейки.

- Приготовили стандартные разведения добавлением 100 мкл разбавленного стандарта sAPO-1/Fas в ячейки A1 и A2, создавая разведения стандарта sAPO-1/Fas в диапазоне от 1000 до 16 пг/мл переносом по 100 мкл из ячейки в ячейку. Удалили и выбросили 100 мкл жидкости из последних ячеек (G1, G2).

- Приготовили биотиновый конъюгат. Добавили по 50 мкл разбавленного биотинового конъюгата, готового для использования, во все ячейки, включая Бланк.

- Закрыли планшет пленкой и инкубировали 1 час при температуре 37°C.

- Приготовили стрептавидиновый конъюгат.

- Полностью удалили содержимое ячеек и промыли ячейки 4 раза промывочным буфером.

- Вносили по 100 мкл стрептавидинового конъюгата во все ячейки. Закрыли планшет пленкой и инкубировали 1 час при температуре 37°C.

- Приготовили субстратный раствор за несколько минут до использования. Полностью удалили содержимое ячеек и промыли ячейки 4 раза промывочным буфером. Внесли по 100 мкл субстратного раствора во все ячейки, включая Бланк. Инкубировали при комнатной температуре 15 минут (18-25°C). Добавили по 100 мкл стоп-раствора во все ячейки, включая Бланк. Определили оптическую плотность ячеек при 450 нм против «Бланка» при длине волны сравнения 610-650 нм.

Ход определения содержания TRAIL-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда

A. Приготовление и разбавление стандартов было произведено согласно следующей методике:

- Восстанавливающий стандарт (3000 пг/мл) соединяли со стандартным разбавляющим буфером. Перемешивали и оставляли на 10 минут. Использовали не позже 1 часа после приготовления.

- Добавляли 300 мкл стандартного разбавляющего буфера в каждую из 6 ячеек, обозначенную 1500; 750; 375; 187,5; 93,7; 46,8 пг/м TRAIL.

- Сделали серийные разведения, как описано выше.

B. Разбавление и хранение стрептавидин-hrp

100-кратный стрептавидин-hpr разбавлялся в 50% растворе глицерола. Раствор доводился до комнатной температуры и перемешивался.

Растворяли 10 мкл 100-кратного стрептавидина-hpr в 1 мл растворителя стрептавидин-hpr для каждого стрипа. Отмечали рабочее разведение.

C. Разбавление промывающего буфера

Доводили 25-кратный раствор до комнатной температуры и хорошо перемешивали. Добавляли к 1 объему 24 объема дистиллированной воды. Рабочий раствор хранили в холодильнике 14 дней.

Проведение процедуры и подсчет

- Сыворотку или плазму разбавляли 1-2-стандартным разбавляющим буфером.

- Добавляли 100 мкл стандартного разбавляющего буфера в нулевую ячейку.

- Добавляли 100 мкл стандартов или проб в соответствующие ячейки.

- Накрывали и оставляли в инкубаторе на 2 часа при комнатной температуре.

- Отмывали 4 раза.

- Добавляли 100 мкл биотинилированного антиTRAIL.

- Инкубировали 1 час при комнатной температуре.

- Промывали 4 раза.

- Добавляли 100 мкл стрептавидина-hpr.

- 30 минут инкубировали при комнатной температуре.

- Промывали 4 раза.

- Добавляли 100 мкл стабилизирующего хромогена.

- 30 минут инкубировали при комнатной температуре в темном месте.

- Добавляли 100 мкл стоп-раствора в каждую ячейку.

- Подсчитывали оптическую плотность при длине волны 450 нм.

Определение фактора некроза опухоли α(ФНОα). Для изучения содержания ФНОα использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа (производитель тест-системы «Протеиновый контур», Россия).

Исследуемый образец (сыворотка, отделяемое цервикального канала) в количестве 50 мкл вносили в 50 мкл инкубационного буфера и выдерживали при комнатной температуре 2 часа. Затем удаляли содержимое ячеек и промывали 4 раза. Добавляли биотинилированный конъюгат в объеме 100 мкл и инкубировали 2 часа при комнатной температуре. После четырехкратного промывания добавляли 100 мкл стрептавидинового конъюгата и спустя 30 минут 100 мкл хромогенного раствора. После 30-минутной инкубации добавляли 100 мкл стоп-раствора и считывали оптическую плотность при 450 нм.

Определение интерлейкина-2 (ИЛ-2). Для изучения содержания ИЛ-2 использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа (производитель тест-системы «Протеиновый контур», Россия).

Исследуемый образец (сыворотка, отделяемое цервикального канала) в количестве 50 мкл вносили в 50 мкл инкубационного буфера и выдерживали при комнатной температуре 2 часа. Затем удаляли содержимое ячеек и промывали 3 раза. Добавляли биотинилированный конъюгат в объеме 100 мкл и инкубировали 2 часа при комнатной температуре. После четырехкратного промывания добавляли 100 мкл стрептавидинового конъюгата и спустя 30 минут 100 мкл хромогенного раствора. После 30-минутной инкубации добавляли 100 мкл стоп-раствора и считывали оптическую плотность при 450 нм.

Для сопоставления показателей пациентов с данными сывороточных маркеров апоптоза у здоровых людей провели исследование 15 доноров (таблица 1).

Таблица 1 Показатели сывороточных маркеров апоптоза в группе здоровых доноров, (пг/мл) Сывороточные показатели апоптоза Показатели контрольной группы ФНОα 18,0±2,0 sFas 1250,5±135,5 TRAIL 199,0±5,3 ИЛ-2 1,0±0,2

Для оценки экспрессии рецепторов апоптоза CD95, TRAIL были исследованы лейкоциты периферической крови и клеточные элементы цервикального канала.

Выделение лейкоцитов из периферической крови. Для выделения лейкоцитов использовали центрифугирование в градиенте плотности фиколл-верографина. Из локтевой вены пациентов брали 10 мл крови, смешивали с 1 мл 3,8% раствора трехзамещенного цитрата натрия. Плазму отстаивали при 37°C, наслаивали на фиколлсодержащий раствор («ICN», США) и центрифугировали при 230 g в течение 30 минут при комнатной температуре. Интерфазный слой в виде кольца, содержащий лейкоциты, отбирали в чистые пробирки, добавляли фосфатно-солевой буфер (ФСБ) до 15 мл, проводили двукратную отмывку лейкоцитов ФСБ с центрифугированием при 230 g в течение 10 минут при комнатной температуре. Клетки ресуспендировали в 2 мл ФСБ, отбирали 10 мкл для подсчета количества клеток в камере Горяева (без окрашивания), доводя пробы до концентрации 1×10⁶ кл/мл.

Выделение клеточных элементов цервикального канала женщин. Содержимое цервикального канала получали при гинекологическом осмотре. Взятие материала из цервикального канала шейки матки производилось только после того, как шейку матки открывали при помощи зеркал. После того, как шейка матки была открыта в зеркалах, влагалищная часть ее протиралась сухим ватным тампоном. Материал брался зондом. Зонд вводился в цервикальный канал на 1-1,5 см, осторожно поворачивался, вынимался, не прикасаясь к стенкам влагалища. После взятия биологического материала зонд помещали в транспортную среду. К пробам добавляли 10 мл ФСБ и отмывали центрифугированием при 230 g в течение 10 минут при комнатной температуре. Осадок ресуспендировали, подсчитывали и определяли клеточный состав.

Иммунофенотипический анализ. Для определения рецепторного фенотипа клеток 5 мл крови помещали в пробирку VACUTAINER, содержащую динатриевую соль ЭДТА (BD).

Для выделения лейкоцитов использовали стандартный метод градиентного центрифугирования с последующей отмывкой клеток фосфатно-солевым буферным раствором (pH 7.2). Концентрация клеток во всех проведенных исследованиях составляла 1×10⁶ клеток/мл, жизнеспособность более 95%.

Оценку рецепторной структуры клеток лейкоцитарной фракции осуществляли стандартным методом прямого двухпараметрического иммунофлюоресцентного окрашивания с использованием коммерческих лизирующих/фиксирующих (CellLyse, BD) и промывающих растворов (CellWash, BD) и панели моноклональных антител (IOTest, BeckmanCoulter), - антиCD95-FITC/антиDR5+-PE (CaltagLabs). В планшет раскапывали клеточную взвесь (400 тыс. клеток на лунку), добавляли моноклональные антитела (по схеме) по 5 мкл и инкубировали в течение 30 минут при 4°C. Отмывали дважды холодным ФСБ с азидом натрия путем центрифугирования по 5 мин при 1000 об/мин. Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (BD), при этом регистрировали суммарно не менее 10000 событий. Данные анализировали в рамках программного обеспечения CellQuest (BD).

Для определения метаболитов нитратов и нитритов в ткани биоптата (мкМ) спектрофотометрически с использованием реактива Гриса (Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit) (Cayman, USA). Для этого в каждую пробу добавляли разбавленную в два раза буфером (Assaybuffer) гомогенизированную ткань, 10 мкл энзимного кофактора и 10 мкл нитрат-редуктазы. Инкубировали 1 час при комнатной температуре и вносили 50 мкл реактива Гриса R1 и 50 мкл реактива Гриса R2. Инкубировали 10 минут при комнатной температуре, измеряли оптическую плотность при 540 нм.

Статистическая обработка полученных результатов

Статистическую обработку проводили с использованием пакета программы Statistica for Windows. Результаты представляли как M±m, где M - среднее арифметическое, m - стандартное отклонение. Достоверность различий между группами оценивали с помощью критерия Уилкоксона для связанных величин и U-теста или t-критерия Стьюдента для несвязанных величин. Достоверным считали отличие при p<0,05. Проверка на нормальность выборки осуществлялась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова в системе STATISTIKA 5.5. Для определения корреляционных связей использовали коэффициент линейной корреляции Пирсона (k). На чертеже и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса указаны среднеквадратичные отклонения.

Были исследованы группы женщин, разделенных по нозологической форме (клинически здоровые женщины, но инфицированные ВПЧ высокого онкогенного риска и пациентки с предраковыми заболеваниями шейки матки) и применяемой комплексной терапии (стандартная терапия и терапия с подключением препарата Immugen). Показатели изменения апоптоза были исследованы через 3 месяца после курса терапии для ниверилования эффекта антиоксидантов, поступающих с препаратом (то есть спустя 6 месяцев, из которых первые 3 месяца пациентки проходили курс комплексной терапии). Обнаружено, что на фоне терапии антиоксидантами через 6 месяцев нормализуются концентрации ФНОα и ИЛ-2 (p<0,05 по сравнению с предыдущим сроком наблюдения). Уровень TRAIL на фоне терапии с подключением антиоксидантов достоверно повышался в группе «Immugen 1» по сравнению с группой «Плацебо 1» (p<0,05), но не достигал нормальных величин. Концентрация sFAS, независимо состава комплексной терапии и сроков наблюдения не изменялась (см. таблицу 2). Схожие изменения концентраций лигандов апоптоза были обнаружены в группах больных с предраковыми заболеваниями шейки матки (таблица 3).

При оценке изменений уровня лигандов апоптоза sFAS, ФНОα, ИЛ-2, TRAIL в отделяемом цервикального канала клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) и в группе пациенток с предраковыми заболеваниями ШМ на фоне комплексной терапии с подключением комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот выявлено повышение уровня TRAIL (на 3 месяц терапии, p<0,05), (таблица 4). Ранее было обнаружено, что концентрация TRAIL уменьшается при тяжелом течении инфекционного процесса: сывороточный и цервикальный уровни TRAIL у женщин с ВПЧ 16, 18 типов, у пациенток с предраковыми и раковыми заболеваниями шейки матки ниже по сравнению с соответствующими показателями пациенток с ВПЧ 10, 13 типов и здоровых женщин, (p<0,05). Повышение уровня TRAIL должно привести к увеличению активности процессов апоптоза через DR5 + рецепторы и, следовательно, к повышению эффективности элиминации зараженных и трансформированных клеток.

Таблица 2 - Концентрация лигандов апоптоза sFAS, ФНОα, ИЛ-2, TRAIL в крови клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) в зависимости от вида терапии, пг/мл Показатель В момент первичного обращения к специалистам Через 6 месяцев Показатели доноров Группа Группа Группа Группа «Immegen 1» «Плацебо 1» «Immegen 1» «Плацебо 1» sFAS 900,5±105,5¹ 920,5±101,0¹ 913,0±75,0¹ 909,5±101,0¹ 1250,5±135,5 ФНОα 42,0±5,0¹ 39,0±8,5¹ 17,0±1,0² 31,0±5,5¹ 18,0±2,0 ИЛ-2 3,5±0,8¹ 3,3±0,5¹ 1,2±0,4 2,9±0,5¹ 1,0±0,2 TRAIL 97,0±17,0¹ 90,0±16,0¹ 143,0±8,0^1,2 90,0±16,0¹ 199,0±5,3 Примечание: ¹ - достоверность различий по отношению к показателям доноров, p<0,05; ² - достоверность p<0,05 по сравнению с предыдущим периодом исследований.

Таблица 3 Концентрация лигандов апоптоза sFAS, ФНОα, ИЛ-2, TRAIL в крови женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) в зависимости от вида терапии, пг/мл показатель в момент первичного обращения к специалистам через 6 месяцев показатели доноров Группа Группа Группа Группа «Immugen 1» «Плацебо 1» «Immugen 1» «Плацебо 1» sFAS 780,5±85,5¹ 760,5±76,0¹ 723,0±21,0¹ 745,0±29,0¹ 1250,5±135,5 ФНОα 36,0±3,0¹ 34,0±3,0¹ 19,0±1,0² 32,0±1,0¹ 18,0±2,0 ИЛ-2 4,5±0,8¹ 4,8±0,4¹ 2,0±0,8² 4,9±0,5¹ 1,0±0,2 TRAIL 52,0±1,5¹ 53,0±2,0¹ 134,0±7,0^1,2 63,0±7,0¹ 199,0±5,3 Примечание: ¹ - достоверность различий по отношению к показателям доноров, p<0,05; ² - достоверность p<0,05 по сравнению с предыдущим периодом исследований.

Таблица 4 Концентрация лигандов апоптоза sFAS, ФНОα, ИЛ-2, TRAIL в отделяемом цервикального канала клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки, пг/мл ФНОα 13,0±2,0 «Immugen 1» 15,0±2,0 14,0±1,5 «Плацебо 1» 14,0±2,0 13,0±1,5 «Immugen 2» 13,0±2,0 13,5±2,0 «Плацебо 2» 13,0±1,5 13,5±2,0 sFAS 1000,5±150,5 «Immugen 1» 750,5±80,0¹ 810,5±71,0¹ «Плацебо 1» 760,5±99,0¹ 750,5±90,0¹ «Immugen 2» 720,5±100,0¹ 742,5±85,0¹ «Плацебо 2» 750,5±110,0¹ 720,5±121,0¹ TRAIL 145,0±25,0 «Immugen 1» 55,0±5,5¹ 105,0±9,5^1,2 «Плацебо 1» 58,0±5,0¹ 53,0±6,0¹ «Immugen 2» 44,0±5,5¹ 96,5±8,5^1,2 «Плацебо 2» 49,0±8,5¹ 48,0±7,5¹ ИЛ-2 4,0±0,5 «Immugen 1» 5,0±1,5 5,0±1,0 «Плацебо 1» 5,0±5,5 4,5±1,5 «Immugen 2» 4,0±5,5 4,5±2,5 «Плацебо 2» 5,0±5,5 5,0±1,5 Примечание: ¹ - достоверность различий по отношению к показателям доноров, p<0,05; ² - достоверность p<0,05 по сравнению с предыдущим периодом исследований.

Оценка экспрессии рецепторов апоптоза CD 95, TRAIL на клетках крови и клеточных элементах цервикального канала) при подключении препаратов антиоксидантов в профилактике развития канцерогенеза у клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки (через 6 месяцев).

В случае исследования клеток лейкоцитарной фракции при ВПЧ инфекции ранее было обнаружено значительное (38,4%) снижение уровня CD95 + клеток при вирусной инфекции высокого онкогенного риска, при отсутствии значимых изменений экспрессии рецептора смерти при ВПЧ низкого онкогенного риска.

В группах пациенток с предраковыми и раковыми заболеваниями отличий практически нет (p>0,05), низкий уровень CD95+клеток является одной из основных причин нарушения апоптических процессов в зараженных интегративными вирусами клеток (таблица 5).

Так как нарушение рецепторного фенотипа является существенным звеном патогенеза в канцерогенезе шейки матки, представляло интерес изучение влияния комплексной терапии с подключением препаратов антиоксидантов на уровень экспрессии основных лигандовапоптоза - sFAS (CD95) и TRAIL(DR5).

Не исключено, что при ВПЧ-инфицировании снижение экспрессии CD95 и готовности клеток к спонтанному апоптозу является неблагоприятным признаком, так как оно ассоциировано с переключением на менее эффективный при вирусной инфекции гуморальный путь иммунной защиты с присущими такому переключению проявлениями иммуносупрессии.

При исследовании относительного числа CD95+клеток в лейкоцитарной фракции периферической крови и цервикальной жидкости клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки обнаружено, что достоверно сниженный уровень CD95+клеток независимо от вида терапии не изменяется (таблица 5 и таблица 6). TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) - белок, синтезируемый клетками иммунной системы; способен вызывать апоптоз злокачественных клеток, не влияя при этом на нормальные клетки организма. При папилломавирусной инфекции общий уровень DRS+клеток в цервикальной жидкости женщин независимо от типа ВПЧ-инфекции не изменен.

Таблица 5 - Относительное число CD95 + клеток в лейкоцитарной фракции периферической крови клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки, % Группа в момент первичного обращения к специалистам через 6 месяцев «Immugen 1» 3,5±0,5¹ 3,3±0,5¹ «Плацебо 1» 3,1±0,3¹ 3,9±0,8¹ «Immugen 2» 2,9±0,8¹ 3,4±0,5¹ «Плацебо 2» 3,6±0,7¹ 3,1±0,4¹ Доноры 5,5±0,5 - Примечание: ¹ - достоверность различий по отношению к показателям доноров, p<0,05; ² - достоверность p<0,05 по сравнению с предыдущим периодом исследований.

В группах «Immugen 1» и «Immugen 2» количество DR5+клеток достоверно повышается (через 6 месяцев), следствием чего, вероятно, будет являться активация TRAIL-зависимого пути апоптоза.

Таблица 6 - Относительное число CD95 + клеток цервикального канала клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки, % Группа в момент первичного обращения к специалистам через 6 месяцев «Immugen 1» 2,5±0,5¹ 2,1±0,5¹ «Плацебо 1» 2,1±0,3¹ 2,9±0,8¹ «Immugen 2» 2,0±0,8¹ 2,4±0,5¹ «Плацебо 2» 2,6±0,7¹ 2,1±0,4¹ Доноры 5,5±0,5 - Примечание: ¹ - достоверность различий по отношению к показателям доноров, p<0,05; ² - достоверность p<0,05 по сравнению с предыдущим периодом исследований.

Таблица 7 - Относительное число DRS + клеток в лейкоцитарной фракции периферической крови клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки, % Группа в момент первичного обращения к специалистам через 6 месяцев «Immugen 1» 4,5±0,5 6,9±0,5^1,2 «Плацебо 1» 4,1±0,3¹ 3,9±0,8¹ «Immugen 2» 4,5±0,5 6,4±0,5^1,2 «Плацебо 2» 4,6±0,7¹ 4,1±0,4¹ Доноры 4,5±0,5   Примечание: ¹ - достоверность различий по отношению к показателям доноров, p<0,05; ² - достоверность p<0,05 по сравнению с предыдущим периодом исследований.

Таблица 8 - Относительное число DRS+клеток цервикального каналаклинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки, % Группа в момент первичного обращения к специалистам через 6 месяцев «Immugen 1» 4,1±0,5 6,9±0,5^1,2 «Плацебо 1» 3,9±0,3 3,9±0,8¹ «Immugen 2» 4,5±1,5 6,8±0,5^1,2 «Плацебо 2» 4,6±0,7¹ 4,1±0,4¹ Доноры 4,0±0,5 - Примечание: ¹ - достоверность различий по отношению к показателям доноров, p<0,05; ² - достоверность p<0,05 по сравнению с предыдущим период исследований.

Таким образом, при подключении в стандартную терапию пациенток с выявленной ВПЧ инфекцией и предраковыми заболеваниями комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот «Immugen» происходит уменьшение концентрации и нормализация уровня провоспалительных медиаторов, таких как ФНОα и ИЛ-2.

Провоспалительные цитокины поддерживают состояние хронического воспаления в тканях, что является одним из факторов канцерогенеза, так как активирует макрофагальную систему и приводит к радикал-зависимой трансформации клеток и тканей [10].

Через 6 месяцев на фоне комплексной терапии с подключением антиоксидантов выявлено повышение сывороточной и цервикальной концентрации TRAIL, а также повышение количества DR5 + клеток.

Таблица 9 Концентрация нитрат-нитритов в тканях биоптата, взятых при кольпоскопии у женщин с диагностированной папилломавирусной инфекцией высокого онкогенного риска, с предраковыми заболеваниями шейки матки (дисплазия, лейкоплакия с явлениями атипии, эритроплакия, аденоматоз), с раком шейки матки (через 6 месяцев на фоне терапии антиоксидантами). Группа пациентов
Срок наблюдения Момент первичного
обращения 6 месяцев Immugen 1 23,0±1,3¹ 13,0±1,5² Плацебо 1 23,0±2,5¹ 21,4±2,5¹ Immugen 2 21,0±2,0¹ 14,0±2,5² Плацебо 2 21,0±1,5¹ 20,5±2,0¹ Доноры 13,5±2,5 - Примечание: ¹ - достоверность различий по отношению к показателям доноров, p<0,05; ² - достоверность p<0,05 по сравнению с предыдущим периодом исследований.

Выявленные повышенные уровни нитрат-нитритов у женщин с ВПЧ высокого онкогенного риска и у больных с предраковыми заболеваниями ШМ являлись основанием для назначения и апробации эффективности антиоксидантов в комплексной терапии женщин с данной патологией.

На фоне терапии препаратом Immugen через 6 месяцев достоверно снизились концентрации нитрат-нитритов во всех группах «Immugen-1,2», (p<0,05). Однако нормализация уровня нитрат-нитритов произошла только в группе «Immugen 1» (см. таблицу 9). Стандартная терапия пациенток с данной патологией ШМ не влияла на концентрацию нитрозорадикалов (см. таблицу 9).

Обнаружено, что эффектом терапии комплексом антиоксидантами через 6 месяцев:

- Нормализуются концентрации ФНОα и ИЛ-2 в сыворотке крови и цервикальной жидкости (p<0,05 по сравнению с предыдущим сроком наблюдения).

- Уровень TRAIL после курса терапии с подключением антиоксидантов достоверно повышался в группе пациенток «Immugen 1» по сравнению с группой «Плацебо 1», (p<0,05), но не достигал нормальных величин.

- Концентрация sFAS, независимо состава комплексной терапии и сроков наблюдения и исследуемой группы не изменялась.

- При исследовании относительного числа CD95+клеток в лейкоцитарной фракции периферической крови и цервикальной жидкости клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки обнаружено, что достоверно сниженный уровень CD95+клеток независимо от вида терапии не изменялся.

- После курса терапии с подключением антиоксидантов количество DR5+клеток как в крови, так и в цервикальной жидкости пациенток с риском развития рака ШМ (выявленная ВПЧ инфекция высокого онкогенного риска) и женщин с предраковыми заболеваниями ШМ достоверно повышалось.

- После курса терапии препаратом Immugen через 6 месяцев достоверно снизились концентрации нитрат-нитритов во всех группах «Immugen-1,2» (p<0,05).

Пример 2.

Пациентка 47 лет, выявлена ВПЧ 16, 18 типов.

Кольпоскопический диагноз Эктопия: Зона трансформации. Взята биопсия шейки матки 12 часов 1 зона. Оригинальный сквамозный эпителий: по краю цилиндрического эпителия. Цилиндрический эпителий: 1 зона вокруг цервикального канала. Нормальная зона трансформации (ЗТ): представлена закрытыми и открытыми железами. Стык между плоским и цилиндрическим эпителием: экзоцервикс. Плоскоклеточная метаплазия: по краю цилиндрического эпителия.

Пациентке проведена криодеструкция патологического участка и назначены иммуномодулирующая терапия (Виферон №2, 2 раза в день). Дополнительно к стандартной терапии назначен комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот по 2 капсулы 2 раза в день во время еды в течение 3 месяцев. Рекомендованы контрольные осмотры врачом-гинекологом (1 раз в 1-2 месяца)

Контрольные кольпоскопические исследования проводились в сроки 2, 6, 9, 12, 24, 36 месяцев. Показатели апоптоза и радикалобразования нормализованы в срок 6 месяцев после начала терапии. Патологических изменений в более отдаленные сроки (7 лет) не обнаружено.

Пример 3. Пациентка 32 лет. Выявлен ВПЧ 16 типа. Патологий шейки матки не обнаружено. Дополнительно к иммуномодулирующей терапии назначен комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот по 2 капсулы 2 раза в день во время еды в течение 3 месяцев. Рекомендованы контрольные осмотры врачом-гинекологом (1 раз в полгода).

Контрольные гинекологические осмотры на протяжении 5 лет не выявили патологий шейки матки, при ПЦР обследовании через 1,5 года ВПЧ 16 типа не обнаружен.

Список литературы

1. Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Алешикова О.И., Добровольская Н.Ю. Хирургический этап как один из основных компонентов в комплексном лечении рака шейки матки IIb-IIIb стадии.// Российский онкологический журнал. - 2007. - №3 - С.21-25.

2. Васильев М.М., Богатырева И.И., Котова Л.К., Белавин А.С. Современные аспекты папилломавирусной инфекции урогенитального тракта (клиника, диагностика, лечение) // ИППП. 1999. №5. С.20-25.

3. Дмитриев Г.А., Биткина О.А. Папилломавирусная инфекция. - М.: Медицинская книга, 2006, - 76 с.

4. Козаченко В.П. Современное состояние проблемы рака шейки матки /Заболевания шейки матки, влагалища и вульвы/ Под ред. В.Н. Прилепской. М.: МЕДпресс, 2000. С.133-139.

5. De Luca С., A. Luci, I. Deeva, I. Trakhtman, and L. Korkina. Double-blind, randomized, placebo-controlled clinical study of a pro-/antioxidant formulation in recurrent viral warts. J. European Society for Clinical Investigation, 2004.

6. De Luca С., E. Mikhal′chik, Z. Kharaeva, A. Luci, L. Korkina. Efficacia di una formulazione a base di pro-/antiossidanti come coadiuvante nel trattamento delle infezioni batteriche cutanee. Esperienze Dermatologiche, 2005.

7. De Luca С., E. Mikhal′chik, Z. Kharaeva, A. Luci, L. Korkina. Efficacia di una formulazione a base di pro-/antiossidanti come coadiuvante nel trattamento delle infezioni batteriche cutanee. Esperienze Dermatologiche, 2005.

8. Korkina L., Z. Kharaeva, A. Luci, C. De Luca. Pro-/antioxidant formulations enhance antiviral defences in herpes simplex (type 2) and zoster (type 3) recurrent diseases: a controlled clinical-laboratory study. European Journal of Clinical Investigations, 2004.

9. Mikhal′chik E., Deeva I., Suprun M., De Luca C., Guarnieri D., Luci A., Korkina L. The antioxidant and immunomodulating properties of IMMUGEN in the in vitro systems and animal model of peritonitis. The Journal of Epidemiology, Microbiology and Immunopathology, 2003.

10. Mikhal′chik E.V., Kharaeva Z.F., Kovalchuk L.V., Nagoev B.S., Korkina L.G.. Effect of cytokines on the level of free radicals in the blood of patients with systemic and local staphylococcus infection. Russ J Immunol. 2002 Oct; 7(3):251-8.

11. Pagano G., Korkina L.G., Brunk U.T., Chessa L., Degan P., Del Principe D., Kelly F.J., Malorni W., PallardÓ F., Pasquier C., Scovassi I., Zatterale A., Franceschi C.: Congenital disorders sharing oxidative stress and cancer proneness as phenotypic hallmarks: Prospects for joint research in pharmacology. Med Hyp: 51:253-266, 1998.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой применение в качестве дополнения к стандартным методам терапии комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот, состоящего из альфа-токоферола, L-метионина, убихинона, селена, фосфолипидов и омега 3,6 жирных кислот для лечения папилломавирус-ассоциированных предраковых заболеваний шейки матки и профилактики канцерогенеза при папилломавирусной инфекции. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для лечения папилломавирус-ассоциированных предраковых заболеваний шейки матки и профилактики канцерогенеза при папилломавирусной инфекции. 2 н.п. ф-лы, 3 пр., 9 табл., 1 ил.

1. Применение в качестве дополнения к стандартным методам терапии комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот, состоящего из альфа-токоферола, 1-метионина, убихинона, селена, фосфолипидов и омега 3,6 жирных кислот (Immugen, IDI FARMACEUTICI, Италия) для лечения папилломавирус-ассоциированных предраковых заболеваний шейки матки и профилактики канцерогенеза при папилломавирусной инфекции.

2. Способ лечения папилломавирус-ассоциированных предраковых заболеваний шейки матки и профилактики канцерогенеза при папилломавирусной инфекции, заключающийся в том, что в дополнение к стандартным методам терапии пациенткам назначают ежедневно в капсулах во время еды по 1-2 капсулы Immugen, IDI FARMACEUTICI в зависимости от состояния пациентки в течение 2-3 месяцев.