Способ исследования состояния шейки матки Российский патент 2025 года по МПК G01N33/53 G01N33/574 A61B5/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и касается комплексной оценки состояния шейки матки при фоновых и предраковых заболеваниях.

Известно, что вирус папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска поражает полипотентные стволовые и пролиферирующие клетки в формирующейся зоне трансформации, а также в расположенном выше канале и эндоцервикальных криптах [1]. Вовлечение эндоцервикальных крипт в патологический процесс, наблюдаемое у 82,57 % женщин, сопряжено с более глубоким или мультифокальным поражением со скрытыми штаммами ВПЧ-инфекции, что является предиктором более высокого риска развития рецидива интраэпителиальных повреждений. Вовлечение желез в 80,77 % коррелирует с положительным краем зоны резекции, в то время как рецидив без железистого поражения наблюдался только у 18,23% пациенток с положительным краем зоны резекции [2]. У 94% больных глубина поражения крипт не превышает 5 мм латерально от стенки цервикального канала, однако их расположение на расстоянии до 4 см от эктоцервикса является причиной неполноценной эксцизии в области эндоцервикального края [3].

На сегодняшний день общепринятым стандартом диагностики персистирующей папилломавирусной инфекции является обнаружение ДНК вируса в соскобе эпителиальных клеток шейки матки методом ПЦР (Hybrid Capture Diegene test) с определением критической концентрации ДНК (вирусной нагрузки), с оценкой физического статуса, степени онкогенного риска (высокого/промежуточного) и типа инфицирования (одиночное/множественное).

Несмотря на описанные в литературе случаи ВПЧ-негативных поражений шейки матки, в том числе злокачественного характера, ряд авторов связывают обнаружение таких форм с артефактами методик исследования и получением ложноотрицательных результатов, что подтверждалось обнаружением ДНК вируса при использовании более чувствительных методов ПЦР-диагностики [4].

Известно, что вовлечении проксимальных отделов шейки матки в патологический процесс является одним из основных факторов риска рецидивов и наличия остаточных поражений после хирургического лечения. Наличие ВПЧ высокого онкогенного риска, высокая вирусная нагрузка до и после проведенного лечения являются более точным предиктором неудач в лечении, чем статус краев резекции [5, 6].

Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки риска развития канцерогенеза шейки матки [7]. Предлагаемый способ заключается в ранней оценке степени риска канцерогенеза шейки матки у женщин с выявленной методами ПЦР инфекцией, вызванной семейством вирусов папилломы. Подход предполагает оценку различных звеньев патогенеза рака, в том числе тип вируса, интенсивность радикал-зависимого повреждения тканей шейки матки в процессе хронической инфекции высокого онкогенного риска и способности организма к элиминации раковых и инфицированных вирусом клеток за счет апоптоза. В тканях биоптата шейки матки, взятых при кольпоскопическом исследовании, исследуют тип вируса папилломы человека (ВПЧ), оценивают особенности экспрессии генов, регулирующих процессы апоптоза. В гомогенате тканей шейки матки оценивают показатели апоптоза (sFAS, TRAIL), а также процессы радикалообразования (активность миелопероксидазы, уровень нитрат-нитритов, общую антиоксидантную емкость ткани). Рассчитывают суммирующий коэффициент риска развития канцерогенеза шейки матки по предложенной формуле.

К недостаткам аналога следует отнести выбор кольпоскопии в качестве метода первичной диагностики ВПЧ-индуцированной патологии шейки матки с последующим отбором женщин, подлежащих углубленной диагностике на основании кольпоскопической картины.

Известно, что стандартная кольпоскопия является субъективным методом исследования, чувствительность которого зависит от опыта врача и способности специалиста выбрать правильные участки для взятия биопсийного материала, кроме того данный метод имеет описательный характер с недостаточной PPV (предполагаемой положительной вероятностью диагноза) [8, 9].

Показатели процессов радикалообразования и экспрессии маркеров апоптоза не являются патогномоничными для патологии шейки матки, ограничено применимы в клинической практике, не оказывают влияния на тактику ведения таких пациенток.

Вышеописанный способ не оценивает состояние эндоцервикального компонента шейки матки с позиций выявления риска развития железистой дисплазии и эндоцервикальной аденокарциномы, а также этиологически связанных с воздействием персистирующей ВПЧ-инфекции, особенно в области цервикальных крипт [10].

Предложенное изобретение решает задачу повышения эффективности диагностики патологий шейки матки путем оценки степени вовлечения шейки матки и особенно цервикальных крипт в патологический процесс.

Технический результат достигается за счет использования цитологических, молекулярно-биологических, гистологических и иммуногистохимичских методов исследования, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики патологий шейки матки.

Включение определения уровня маркеров клеточной пролиферации, таких как Ki-67 и p16ink4a в диагностический алгоритм обусловлено тем, что повышение степени диспластических изменений эпителия шейки матки связано с ростом экспрессии данных белков [11]. Установлено, что диагностическое значение имеет не столько изолированное определение p16ink4α или Ki-67, сколько их одновременное обнаружение (коэкспрессия) в результате иммуноцитохимического исследования в виде двойного окрашивания. Оценка уровня пролиферативного потенциала эпителия шейки матки на основании одновременного изучения экспрессии двух маркеров р16/Ki-67 позволяет прогнозировать течение папилломавирусной инфекции [12].

Несмотря на то, что все вышеперечисленные методы давно используются в клинической практике, использование гомогенатов тканей шейки матки в качестве материала для ПЦР диагностики вируса папилломы человека является новым подходом, повышающим выявление латентной ВПЧ-инфекции, что совместно с оценкой экспрессии маркеров клеточной пролиферации, гистологической картиной будет способствовать персонализации лечебно-диагностической тактики в зависимости от степени вовлеченности различных отделов шейки матки в патологический процесс.

Сущность изобретения состоит в том, что предложенный способ позволяет провести комплексную оценку состояния шейки матки при фоновых и предраковых заболеваниях.

Диагностический алгоритм для выявления патологий шейки матки согласно клиническим протоколам на раннем этапе хронологически включает:

- микробиологическую диагностику (мазок на степень чистоты влагалищного секрета, бактериоскопию и бактериологическое исследование биологического материала эндоцервикса);

- Цитологическое исследование с верификацией диагноза по системе Bethesda;

- ПЦР (Hybrid Capture real time Digene test) ВПЧ высокого онкогенного риска с количественным определением ДНК вируса (вирусная нагрузка);

- Кольпоскопию;

- Биопсию шейки матки (прицельная моно/мультифокальная или первично-операционная в зависимости от результат цитологии и клинических данных);

- Иммунногистохимическое исследование (ИГХ);

- определение онкомаркера SCC и онкобелков Е6 и Е7.

В рамках предложенного подхода производится определение способа получения гистологического материала с обязательным включением эндоцервикального компонента:

- прицельная моно-/мультифокальная биопсия при первичном выявлении H-SIL по данным цитологии;

- первично-операционная биопсия при L-SIL по данным цитологии, доброкачественных гиперпластических и фоновых процессах, рецидивах ASC-US по данным цитологии, AGC по данным цитологии, инфицировании ВПЧ высокого онкогенного риска;

- диатэрмоэлектроэксцизия в качестве лечебного мероприятия при H-SIL по данным цитологии или прицельной биопсии, при отсутствии показаний для более радикального лечения.

При наличии диспластических изменений (то есть наличии изолированных признаков ядерной и цитоплазматической атипии и признаков тканевой атипии с вовлечением в патологический процесс пласта многослойного плоского сквамозного эпителия) по результатам цитологического исследования и/или инфицировании ВПЧ высокого и промежуточного онкогенного риска - полученный материал подвергается гистологическому и иммуногистохимическому исследованию c использованием антител к белкам p16INK4a и KI-67 для оценки степени выраженности пролиферативной активности, а также клеточной атипии (определение доказательных критериев потенциала злокачественности).

Для получения гомогенатов от полученного биопсийного/операционного материала отделяется фрагмент диаметром не менее 5 мм, с обязательным включением зоны эндоцервикса, и помещается в стерильную пробирку с добавлением 5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl). В течение первых 2-4 часов от получения материала в этой же пробирке производится его гомогенизация роторным гомогенизатором до однородной массы, суспендированной в физиологическом растворе, с последующим центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. Надосадочная жидкость в объеме 1 мл с помощью автоматического лабораторного дозатора помещается в пробирку типа Эппендорф с транспортной средой для сбора и транспортировки соскобов/мазков эпителиальных клеток (назальных, фарингеальных, урогенитальных) с целью последующего проведения анализа методом ПЦР. Для предотвращения контаминации образцов рабочая поверхность гомогенизатора промывается мыльным раствором и обрабатывается антисептическими средствами перед каждой процедурой гомогенизации. Наконечники автоматического дозатора утилизируются после однократного использования.

Молекулярно-биологическое исследование гомогенатов тканей шейки матки с преобладанием железистого компонента проводится методом ПЦР (Hybrid Capture real time Digene test) с определением ВПЧ высокого онкогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 типов, с определением вирусной нагрузки на валидированном лабораторном оборудовании. Выявление ВПЧ высокого онкогенного риска в гомогенате тканей шейки матки свидетельствует о вовлечении проксимальных отделов шейки матки в ВПЧ-индуцированный патологический процесс и высоком риске развития дисплазии железистого эпителия.

После комплексного обследования выставляется заключительный диагноз в соответствии с классификацией Bethesda System на основании морфологического исследования. При наличии в гомогенате проксимальных отделов шейки матки ВПЧ высокого онкогенного риска, клинически значимой вирусной нагрузке, положительном крае резекции, а также при коэкспрессии p16ink4a/ki-67 прогнозируется высокий риск рецидива. Данное обстоятельство диктует необходимость повторного хирургического лечения в виде высокой широкой электроконизации шейки матки.

При отсутствии в гомогенате проксимальных отделов шейки матки ВПЧ высокого онкогенного риска, отрицательном крае резекции, отсутствии коэкспрессии p16ink4a/ki-67 рекомендуется наблюдение в соответствии с окончательным гистологическим диагнозом на основании действующего клинического протокола.

Предложенный способ позволяет провести комплексную оценку состояния шейки матки, определить группу пациенток повышенного риска развития рецидивов и наличия остаточных поражений после лечения.

Клинический пример №1. Пациентка 27 лет, обратилась к гинекологу с заключением: плоскоклеточная интраэпительная неоплазия низкого потенциала злокачественности - L-SIL (МКБ10 N87.0) и подозрением на атипическую метаплазию по результатам цитологического исследования соскоба эпителиальных клеток шейки матки.

ПЦР на ВПЧ - выявлен 16-й серотип в количестве 4,4 Lg ДНК/10⁵, 33-й серотип в количестве 5,3 Lg ДНК/10⁵, а также 51-й серотип в количестве 5,5 Lg ДНК/10⁵.

В качестве лечебно-диагностического мероприятия пациентке была выполнена двухкомпонентная диатермоэлектроконизация шейки матки с иссечением фрагментов экзоцервикса, а также эндоцервикаса. Полученный операционный материал был направлен на гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Фрагмент эндоцервикса был подвергнут гомогенизации по методике, описанной выше и направлен на ПЦР-диагностику.

Согласно морфологическому исследованию, в пределах исследуемого материала эпителий эктоцервикса выстлан несколько утолщенным многослойным плоским эпителием, с участками H-SIL (CIN2). В субэпителиальной строме шейки матки - железы эндоцервикального типа и очаговая лимфоцитарная инфильтрация.

Иммунопозитивные ядра клеток с антителами к Ki-67 определялись в 2/3 толщины эпителиального пласта. Индекс пролиферации - 87%, положительная экспрессия p16ink4a в цитоплазме и ядрах клеток 2/3 толщины эпителиального пласта.

Заключительный диагноз: плоскоклеточная интраэпительная неоплазия высокого потенциала злокачественности - L-SIL (МКБ10 N87.2)

Методом ПЦР в гомогенате тканей иссеченного эндоцервикса был выявлен ВПЧ 16-го типа в количестве 3,7 Lg ДНК/10⁵, а также 33-го типа в количестве 3,3 Lg ДНК/10⁵. Данные результаты свидетельствуют о вовлечении в патологический процесс как проксимальных, так и дистальных отделов шейки матки, повышенном риске рецидива после проведенного лечения, а также развития эндоцервикальной дисплазии с необходимостью повторного хирургического вмешательства.

Клинический пример №2. У пациентки 35 лет, при обращении по поводу объемного образования правых придатков, выявленного при профилактическом осмотре по результатам УЗИ ОМТ обнаружена патология шейки матки (Эрозия шейки матки МКБ10 N86). Последний визит к гинекологу - более 6 лет назад. При обследовании: H-SIL по результатам цитологии, ПЦР на ВПЧ - выявлен 16-й серотип в количестве 6,1 Lg ДНК/10⁵.

В качестве лечебно-диагностического мероприятия была запланирована гистероскопия с последующим раздельным диагностическим выскабливанием цервикального канала и полости матки, ДЭК шейки матки.

При осмотре эндоцервикса с помощью гистероскопа: эпителий цервикального канала высокий, гиперпластичный. После раздельного диагностического выскабливания была выполнена двухкомпонентная диатермоэлектроконизация шейки матки с иссечением фрагментов экзоцервикса, а также эндоцервикаса. Полученный операционный материал был направлен на гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Фрагмент эндоцервикса был подвергнут гомогенизации по методике, описанной выше и направлен на ПЦР-диагностику.

Согласно морфологическому исследованию, в фрагментах слизистой шейки матки определялись гиперплазированные железы цервикального типа, покрытые многослойным плоским эпителием, с очаговой гиперплазией базальных отделов, выраженным паракератозом, слабо выраженной лимфоцитарной инфильтрацией подслизистого слоя, расстройствами кровообращения (L-SIL). Иммунопозитивные клетки с антителами к Ki-67 определялись в базальном слое многослойного плоского эпителия, что соответствует картине хронического воспаления. Индекс пролиферации - 16,9%, гиперэкспрессия антител к белку p16ink4a не была обнаружена.

Заключительный диагноз: плоскоклеточная интраэпительная неоплазия низкого потенциала злокачественности - L-SIL (МКБ10 N87.0)

Методом ПЦР в гомогенате тканей эндоцервикса был выявлен ВПЧ 18-го типа в количестве 5,5 Lg ДНК/10⁵, а также ВПЧ 33 типа в количестве 6,8 Lg ДНК/10⁵, в то время как 16 серотип обнаружен не был. Данное обстоятельство может свидетельствовать о вовлеченности более глубоких отделов шейки матки в инфекционный процесс, вызванный ассоциацией высоко-онкогенных штаммов ВПЧ, не выявленных ранее при стандартном обследовании, что является предиктором повышенного риска рецидива после проведенного лечения, а также развития эндоцервикальной дисплазии с необходимостью повторного хирургического вмешательства.

Клинический пример №3. Пациентка 48 лет по результатам цитологического исследования обратилась к гинекологу с заключением: плоскоклеточная интраэпительная неоплазия высокого потенциала злокачественности - Н-SIL (МКБ10 N87.2). Кроме того, ранее было проведено молекулярно-биологическое исследование методом ПЦР, показавшее отсутствие ВПЧ в соскобе эпителиальных клеток шейки матки.

В качестве хирургического лечения пациентке была выполнена двухкомпонентная диатермоэлектроконизация шейки матки с иссечением фрагментов экзоцервикса, а также эндоцервикаса. Полученный операционный материал был направлен на гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Фрагмент эндоцервикса был подвергнут гомогенизации по методике, описанной выше и направлен на ПЦР-диагностику.

Согласно морфологическому исследованию, в эктоцервиксе определялись фокусы HSIL (CIN III), несмотря на это, по результатам иммуногистохимического исследования, гиперэкспрессия антител к белку p16ink4a не была обнаружена. Иммунопозитивные клетки с антителами к Ki-67 определялись в базальном слое многослойного плоского эпителия. Индекс пролиферации составил 15%.

Заключительный диагноз: Плоскоклеточная интраэпительная неоплазия высокого потенциала злокачественности - Н-SIL (МКБ10 N87.2).

Методом ПЦР в гомогенате тканей эндоцервикса был выявлен ВПЧ 16-го типа в количестве 3 Lg ДНК/10⁵, в то время как в соскобе эпителиальных клеток шейки матки вирус не был идентифицирован ранее. Что является предиктором повышенного риска рецидива после проведенного лечения, а также развития эндоцервикальной дисплазии с необходимостью повторного хирургического вмешательства.

Список использованных источников:

1. Ж.Н. Медведева, Цервикальные интраэпителиальные неоплазии / Ж.Н. Медведева, А.С. Подгорная, А.Ю. Захарко, О.В. Мурашко - Гомель: ГУ «РНПЦ РМиЭЧ», 2021. - 40 с.

2. Chen J. et al. The risk factors of residual lesions and recurrence of the high-grade cervical intraepithelial lesions (HSIL) patients with positive-margin after conization // Medicine (Baltimore). 2018. Vol. 97, № 41. P. e12792.

3. Короленкова, Л.И. Влияние морфологических особенностей цервикального канцерогенеза на эффективность диагностики и лечения CIN III и микроинвазивного рака шейки матки / Л.И. Короленкова // Opinion Leader. - 2018. - № S1. - С. 80-85.

4. Rodríguez-Carunchio L, Soveral I, Steenbergen RD, Torné A., Martinez S., Fusté P., et al. HPV-negative carcinoma of the uterine cervix: a distinct type of cervical cancer with poor prognosis. BJOG. 2015;122(1):119-127. doi:10.1111/1471-0528.13071.

5. Arbyn M. et al. Incomplete excision of cervical precancer as a predictor of treatment failure: a systematic review and meta-analysis // Lancet Oncol. 2017. Vol. 18, №12. P. 1665-1679.

6. Alder S. et al. Incomplete excision of cervical intraepithelial neoplasia as a predictor of the risk of recurrent disease-a 16-year follow-up study // Am. J. Obstet. Gynecol. 2020. Vol. 222, №2. P. 172.e1-172.e12.

7. Патент №2522908 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ оценки риска развития канцерогенеза шейки матки у женщин, инфицированных вирусами папилломы: №2012156061/15: заявл. 24.12.2012: опубл. 20.07.2014 / З.Ф. Хараева, Е.В. Михальчик, А.А. Шевченко [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова.

8. Landers E.E. et al. Trends in Colposcopy Volume: Where Do We Go From Here? // J. Low. Genit. Tract Dis. 2016. Vol. 20, №4. P. 292-295.

9. Peron M. et al. Adjunctive colposcopy technologies for assessing suspected cervical abnormalities: systematic reviews and economic evaluation // Health Technol. Assess. 2018. Vol. 22, №54. P. 1-260.

10. Abbas M., De Jonge J., Bettendorf O. Distribution and incidence of atypical glandular lesions in cervical cytology focusing on the association with high-risk human papillomavirus subtypes // Oncol. Lett. Spandidos Publications, 2023. Vol. 25, №1. P. 1-10.

11. Stefanidis K. et al. OCT-4 and DAZL expression in precancerous lesions of the human uterine cervix // J. Obstet. Gynaecol. Res. 2015. Vol. 41, №5. P. 763-767.

12. Klinyshkova T.V., Samosudova I.B., Buyan M.S. Comparative evaluation of the results of an immunocytochemical study of P16/Ki-67 coexpression in patients with cervical intraepithelial neoplasia associated with human papillomavirus // Gynecology. 2021. Vol. 23, №4. P. 341-345.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и касается исследования состояния шейки матки. Осуществляют осмотр шейки матки в зеркалах при кольпоскопии, цитологическое исследование с верификацией диагноза, ПЦР исследование соскоба цервикального эпителия на ВПЧ. Затем выполняют прицельную мономультифокальную биопсию при первичном выявлении H-SIL; или первично-операционную биопсию при L-SIL, доброкачественных гиперпластических процессах, рецидивах ASC-US. После этого полученный материал подвергают гистологическому и иммуногистохимическому исследованию c использованием антител к белкам p16INK4a и KI-67 для оценки степени выраженности пролиферативной активности, а также клеточной атипии. Осуществляют получение гомогенатов от полученного биопсийного или операционного материала путем отделения фрагмента диаметром не менее 5 мм с включением зоны эндоцервикса, который помещают в стерильную пробирку с добавлением 5 мл физиологического раствора. Затем в течение первых 2-4 часов от получения материала в этой же пробирке производят его гомогенизацию роторным гомогенизатором до однородной массы, суспендированной в физиологическом растворе, с последующим центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин, затем надосадочную жидкость в объеме 1 мл с помощью дозатора помещают в пробирку типа Эппендорф с транспортной средой для сбора и транспортировки соскобов или мазков эпителиальных клеток, после чего осуществляют исследование гомогенатов тканей шейки матки с преобладанием железистого компонента методом ПЦР с определением 14 онкосеротипов ВПЧ с определением вирусной нагрузки. Изобретение обеспечивает повышение эффективности диагностики патологий шейки матки путем оценки степени вовлечения шейки матки и особенно цервикальных крипт в патологический процесс. 3 пр.

Способ исследования состояния шейки матки, включающий осмотр шейки матки в зеркалах при кольпоскопии, цитологическое исследование с верификацией диагноза по системе Bethesda, ПЦР исследование соскоба цервикального эпителия на ВПЧ - Hybrid Capture Diegene test, затем выполняют прицельную мономультифокальную биопсию при первичном выявлении H-SIL или первично-операционную биопсию при L-SIL, доброкачественных гиперпластических процессах, рецидивах ASC-US; после чего полученный материал подвергают гистологическому и иммуногистохимическому исследованию c использованием антител к белкам p16INK4a и KI-67 для оценки степени выраженности пролиферативной активности, а также клеточной атипии, осуществляют получение гомогенатов от полученного биопсийного или операционного материала путем отделения фрагмента диаметром не менее 5 мм с включением зоны эндоцервикса, который помещают в стерильную пробирку с добавлением 5 мл физиологического раствора, затем в течение первых 2-4 часов от получения материала в этой же пробирке производят его гомогенизацию роторным гомогенизатором до однородной массы, суспендированной в физиологическом растворе, с последующим центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин, затем надосадочную жидкость в объеме 1 мл с помощью дозатора помещают в пробирку типа Эппендорф с транспортной средой для сбора и транспортировки соскобов или мазков эпителиальных клеток, после чего осуществляют исследование гомогенатов тканей шейки матки с преобладанием железистого компонента методом ПЦР с определением 14 онкосеротипов ВПЧ - Hybrid Capture Diegene test с определением вирусной нагрузки.