СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫХ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ПОРАЖЕНИЙ ШЕЙКИ МАТКИ Российский патент 2015 года по МПК A61K31/00 A61K9/02 

Заявленное изобретение относится к области медицины, а именно к способу лечения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки.

Папилломавирусная инфекция (ПВИ) считается самой распространенной инфекцией, передающейся половым путем (около 80% сексуально активного населения заражены ВПЧ) (Tota J.Е., 2011). При этом подтверждено влияние ПВИ на развитие доброкачественных и злокачественных новообразований половых органов. Наиболее частым клиническим проявлением ВПЧ-инфекции являются генитальные бородавки. Однако установлена этиологическая роль ВПЧ и в развитии рака шейки матки в результате инфицирования цервикальных тканей 16 и 18-м (преимущественно) типами ВПЧ высокого онкогенного риска (Херрингтон К.С. Вирусы папилломы человека и неоплазия шейки матки. Взаимодействие ВПЧ с другими факторами, 1995, ЗППП. №5. С. 3-10).

В инфицированных клетках на начальных стадиях вирусный генетический материал персистирует в эписомальной форме, и клетка способна продуцировать вирусные частицы. На более поздних стадиях вирусный геном интегрируется в клеточный, в результате чего утрачивается способность к репродукции вируса. Интеграция вирусной ДНК в клеточную часто сопровождается потерей вирусного материала, но с обязательным сохранением генов Е6 и Е7, индуцируется нестабильность клеточного генома. При интеграции вирусного генома в клеточный сохраняется транскрипция вирусных генов, прежде всего Е6 и Е7, а также активируется транскрипция некоторых клеточных генов. Белки Е6 и Е7 могут взаимодействовать с белками-супрессорами опухолевого роста, которые играют ключевую роль в процессах регуляции клеточного деления. Так продукт гена Е6 способен взаимодействовать с белком гена p53, а Е7 с pRb и инактивируют их функцию. Кроме того, указанные гены влияют на циклины, являющиеся регуляторами клеточного цикла.

До настоящего времени нет четкой определенности в отношении факторов, обусловливающих различные темпы прогрессирования папилломавирусной инфекции, в то время как именно на фоне персистирующей ПВИ развивается интраэпителиальная неоплазия (Киселев В.И., Ашрафян Л.А. и соавт., 2004; Bekkers R., Meijer С, et al. Effects of HPV detection in population-based screening programmers for cervical cancer: a Dutch moment // Gynecol. Oncol. 2006; Mar: 100(3):451-4).

О роли клеточного звена иммунитета в патогенезе ВПЧ-инфекции свидетельствуют данные о полной ремиссии ВПЧ-ассоциированных заболеваний после специфической стимуляции Т-клеточного иммунного ответа на Е6 и Е7 (Киселев В.И., Киселев О.И. Вирусы папиломы человека в развитии рака шейки матки - СПб. - М., 2003). Предлагаемые в настоящее время различные методы лечения ПВИ, такие как использование интерферонов и иммуностимулирующих активных веществ, нередко мало эффективны и дают значительное число рецидивов инфекции. Экспериментальные исследования показали, что интерфероны не способны подавлять ВПЧ универсально (Kim K.Y., Kim, L. Blatt, M.W. Taylor. The effects of interferon on the expression of human papillomavirus oncogenes J. Gen. Virol., 81 (2000), pp. 695-700). Дело в том, что онкобелок Е7 является мощным иммуносупрессивным агентом, существенно снижая эффективность таких иммунокоррегирующих методов лечения, как интерферонотерапия, индукторов интерферона (циклоферон) и иммуномодуляторов. Использование препаратов, оказывающих цитостатическое действие на вирусинфицированные клетки, также неэффективно из-за особенностей жизненного цикла ВПЧ (отсутствие цитопатических свойств), которые позволяют уйти патогену от контроля иммунной системы (Молочков В.А., Киселев В.И, Рудых И.В., Щербо С.Н. Папиломавирусная инфекция: клиника, диагностика, лечение. Пособие для врачей. Москва, 2005 г.). С другой стороны, ВПЧ включает механизмы, разрушающие активирование иммунной системы.

Применение профилактических вакцин против ВПЧ пока находится на ранних стадиях экспериментальной проверки, и опубликованные данные исследований зачастую противоречивы (Franco Е., Harper D. Vaccination against human papillomavirus infection: a new paradigm in cervical cancer control, 2005, Vaccine. 23(17-18):2388-94).

В разное время было предложено множество консервативных и деструктивных методов лечения патологических состояний шейки матки. Из консервативных способов широкое применение нашли химические коагулянты, такие как Солковагин. Механизм действия препарата обусловлен морфофункциональным отличием многослойного плоского и эктопического цилиндрического эпителия. Цилиндрический эпителий намного больше, чем плоский многослойный эпителий, восприимчив к раствору, в состав которого входят азотная и уксусная кислоты, дигидрат щавелевой кислоты и гексагидрат нитрата цинка. С помощью этого достигается избирательное влияние на измененные ткани шейки матки, не вызывая нарушений в окружающем здоровом многослойном плоском эпителии. Глубина действия препарата на ткани обеспечивает разрушение патологически измененного участка. Эффективность лечения этим препаратом при неосложненных формах псевдоэрозии у молодых нерожавших женщин составляет 74,3% (Костава М.Н. Эффективность лечения фоновых заболеваний шейки матки у молодых нерожавших женщин «Солковагином» и низкоинтенсивным лазером. - М., 1994. - 24 с.).

Также применяется диатермокоагуляция, криотерапия, лазеротерапия, но в настоящее время хирургические методы (по причине высокого процента рецидивов после их применения) стали играть второстепенную роль. На первое место вышла этиопатогенетическая терапия, имеющая два основных направления: 1) воздействие на этиологический фактор - ВПЧ; 2) блокирование основных механизмов канцерогенеза.

Эпиген-интим спрей обеспечивает ингибирование ДНК и РНК вирусов, инактивацию вирусных частиц, блокирование внедрения активных вирусных частиц через мембрану внутрь клетки, нарушение синтеза новых структурных компонентов вирусов. Основным механизмом противовирусной активности глицирризиновой кислоты является ингибирование киназы P, влекущее за собой угнетение фосфорилирования клеточных и кодируемых вирусом белков в инфицированных клетках и находящихся в свободном состоянии. Однако, ввиду низкой эффективности (30-40%), длительности лечения, развития нежелательных побочных эффектов и осложнений многие врачи от данных методов отказались (Прилепская В.Н., Кондриков Н.И., Бебнева Т.Н. Папилломавирусная инфекция и патология шейки матки (обзор литературы) // Гинекология. - М., - 2000. - Т. 2. - N 3. - С. 80-82).

Наиболее близким аналогом является лечение неопластических заболеваний репродуктивных органов, известное из патента RU 2318510 С1, 10.03.2008, основанное на применении вагинальных суппозиториев на основе 3,3′-дииндолилметана. Однако в данном источнике не предлагается использование данного препарата для терапии интраэпителиальных поражений шейки матки, не ассоциированных с ВПЧ, и не раскрываются наиболее оптимальные и эффективные дозировки.

Исходя из этого задачей изобретения является разработка способа лечения интраэпителиальных поражений шейки матки, не ассоциированных с ВПЧ, обладающего повышенной эффективностью и снижением или исключением негативного воздействия побочных эффектов.

Задача изобретения решается способом лечения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки, независимым от наличия их ассоциированности с ВПЧ. Способ включает применение суппозиториев вагинальных «Цервикон-ДИМ», содержащих дииндолилметан. При этом препарат применяется в течение не менее 6 месяцев в дозировке 200 мг/сут дииндолилметана.

Заявленный способ обеспечивает длительный противорецидивный эффект на протяжении не менее года после окончания терапии, а также стимулирует иммунную систему, в том числе общего и местного иммунитета слизистой оболочки влагалища. Кроме того, заявленный способ способствует ускорению эпителизации после проведения деструктивной терапии по поводу цервикальной интраэпителиальной неоплазии.

Использование заявленного способа лечения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки также позволяет повысить эффективность терапии и снизить или исключить негативное воздействие побочных эффектов.

Таким образом, существует необходимость поиска новых альтернативных методов терапии интраэпителиальных поражений шейки матки, а также профилактических средств с учетом генеза развития. Поводом для исследований служили опубликованные экспериментальные, клинические и эпидемиологические исследованиях, подтверждающие противоопухолевую активность I3C, предшественника DIM, в отношении огромного числа предопухолевых и опухолевых заболеваний молочной железы, яичников, шейки матки, эндометрия, простаты, кожи, желудочно-кишечного тракта, легких [Bradlow HL, Sepkovic DW, Telang NT, Osborne MP. Multifunctional aspects of the action of indole-3-carbinol as an antitumor agent. Ann. NY Acad. Sci., 1999, 889, 204-213; Telang NT, Katdare M, Bradlow HL et al. Inhibition of proliferation and modulation of estradiol metabolism: novel mechanisms for breast cancer prevention by the phytochemical indole-3-carbinol. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1997, 216, 246-252; Chinni SR, Li Y, Upadhyay S et al. Indole-3-carbinol (I3C) induced cell growth inhibition, G1 cell cycle arrest and apoptosis in prostate cancer cells. Oncogene, 2001, 20, 2927-2936; Jin L, Qi M, Chen DZ et al. Indole-3-carbinol prevents cervical cancer in human papilloma virus type 16 (HPV16) transgenic mice. Cancer Res, 1999, 59, 3991-3997; Huh SW, Bae SM, Kim YW, Lee JM et al. Anticancer effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate on ovarian carcinoma cell line. Gynecol. Oncol, 2004, 94(3), 760-768].

Были проанализированы результаты исследований специфической эффективности I3C и его метаболического производного 3,3′-дииндолилметана (DIM) при раке шейки матки, а также в отношении клеточных культур ВПЧ-индуцированных дисплазии и цервикальной карциномы. Выяснилось, что DIM избирательно ингибирует синтез Е7 в эпителиальных клетках, инфицированных ВПЧ [Schwartz S.M, Daling J.R, Shera K.S. et al. Human Papillomavirus and Prognosis of Inva-sive Cervical Cancer: A Population-Based Study. J. Clin. Oncol. 2001, 19: 1906-1915].

В настоящее время подтверждено участие метаболитов эстрогенов в развитии неопластических процессов в тканях шейки матки. Метаболит 16-OHE1 в эстрогензависимых тканях органов женской репродуктивной системы многократно усиливает экспрессию эстрогензависимых генов. В то же время 2-ОНЕ1 обладает антипролиферативными свойствами и индуцирует апоптоз. Многочисленные экспериментально-клинические исследования доказали необходимость поддержания баланса между метаболитами 2-ОНЕ1/16б-ОНЕ1 в соотношении 2:1. Установлено, что при персистенции ВПЧ-инфекции образование агрессивного метаболита эстрогена 16б-ОНЕ1 происходит в 200 раз чаще, чем 2-ОНЕ1. В исследовании (Gynecol. Oncol., 78(2), 123-129) соотношение метаболитов 2-ОНЕ1 и 16-ОНЕ1 измеряли в моче у пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией II и III степени (CIN II-III), ежедневно принимавших 200-400 мг I3C. Оказалось, что у женщин с выраженной регрессией дисплазии наблюдалось значительное изменение концентраций метаболитов эстрадиола в сторону эстрогена - 2-ОНЕ1 (приложение, фиг. 1).

На К14-ВПЧ16-трансгенной мышиной модели было показано, что I3C, добавляемый в корм экспериментальным животным, повышает в цервикальном эпителии экспрессию опухоль-супрессорной фосфатазы PTEN, препятствуя проявлениям генетической нестабильности со стороны вирусных онкогенов Е6 и Е7 и тормозя развитие РШМ (Mol. Med., 11, 59-63)

Было установлено, что DIM, а также его метаболический предшественник - I3C, индуцировали апоптоз цервикальных опухолевых клеток человека линии С33А. При этом DIM проявлял в несколько раз более выраженную проапоптотическую активность по сравнению с I3C (Nutr., 131(12), 3294-3302).

Результаты поиска в данном направлении позволили нам применить и оценить клиническую эффективность длительного применения суппозиториев вагинальных, содержащих в качестве активного вещества дииндолилметан (препарат «Цервикон-ДИМ») (патент РФ №325310). Препарат представляет собой суппозитории вагинальные, содержащие в качестве активной субстанции 3,3′-дииндолилметан (DIM), липофильную основу, содержащую твердый кондитерский жир, поливинилпирролидон и бутилгидроксианизол или бутилгидрокситолуол при следующем содержании, мас. % (см. таблица 1):

Таблица 1. Состав вагинальных суппозиториев «Цервикон-ДИМ». Дииндолилметан 2,0-6,0 Поливинилпирролидон 0,5-1,2 Бутилгидроксианизол или бутилгидрокситолуол 0,3-0,5 Липофильная основа остальное Дииндолилметан содержится в количестве 0,045-0,110 г на дозу.

Проведено определение эффективности применения препарата Цервикон-ДИМ в экспериментах in vivo.

Пример 1. Моделирование эрозии (дисплазии) шейки матки.

Эксперименты in vivo проводились на белых беспородных крысах-самках (4-6 лет), полученных из питомника Рапполово, Санкт-Петербург.

Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты. Животные содержались при 12-часовом режиме освещения, температуре 20-25°C, относительной влажности 50-70% и свободном доступе к корму и воде.

Крыс перед нанесением ожога наркотизировали кетамином в дозе 30 мг/кг внутримышечно. Во влагалище вводили стеклянную воронку, во внутреннюю часть которой вносили разогретый до 100°C медный стержень и через отверстие в цилиндрической части воронки вызывали ожог шейки матки (2-3 сек, во избежание потери температуры стержня). После ожога в это же отверстие вводили 2 капли 5% водного раствора едкого натра для изменения кислотной среды влагалища. Лечение начинали через сутки; при этом препараты вносились во влагалище: Солковагин - в объеме 3 капель, а Цервикон-ДИМ (0,1 г) - в виде полоски в дозе 100 мг/кг курсом 7 дней.

Отмечали динамику регенерации и гистологическую картину. Кроме этого, в периферической крови общепринятыми способами определяли показатели выраженности воспалительных процессов (количество лейкоцитов, содержание лимфоцитов и нейтрофилов, СОЭ, СРБ и фибриноген) (см. таблицу 2).

Таблица 2 Показатели выраженности воспалительных процессов в контрольных и опытных группах. Показатели Контрольная I (интактные животные) n=10 Контрольная II (эрозия шейки матки) n=10 Опытная I (лечение Цервикон-ДИМом) n=10 Опытная II (лечение Солковагином) n=10 Лейкоциты, 10⁹/л 12.50.5 16.30.2* 11.80.6 11.90.8 Лимфоциты, % 728 8611 705 696 Нейтрофилы, % 122 141 102 102 СОЭ, мм/час 41 101* 51 61 СРБ, мм преципитации 0 41* 11 11 Фибриноген, г/л 2.50.5 9.20.3* 3.10.1 3.00.2

Для гистологического исследования крыс умерщвляли декапитацией в динамике и после окончания эксперимента. Контрольных крыс умерщвляли тем же способом. Шейку матки фиксировали в 10% формалине и после спиртовой проводки заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Срезы изучали под биологическим микроскопом МБИ-6.

При гистологическом исследовании шейки матки у крыс после аппликации Цервикон-ДИМ наблюдалась полная эпителизация поверхности эрозии. Эпителий, покрывающий слизистую шейки, был многослойным плоским неороговевающим. Воспалительная инфильтрация в подслизистом слое отсутствовала. В подслизистом слое были видны коллагеновые соединительнотканные волокна и единичные полиморфноядерные лейкоциты и капилляры. В то время как наблюдение за течением эрозивно-воспалительного процесса у животных без лечения показало, что имеет место некробиоз эпителия, отек и инфильтрация полиморфно ядерными лейкоцитами подслизистого слоя. Клеточные границы эпителия влагалищной части матки были неразличимыми, ядра пикнотичными и деформированными. Местами эпителий отсутствовал, наблюдалась его дисплазия (приложение, фиг. 2).

Также было проанализировано длительное применение Цервикон-ДИМ у пациентов с генитальными кондиломами. Исследование подтвердило способность препарата элиминировать неонкогенные типы вируса.

Пример 2. Исследование воздействия на генитальные кондиломы.

Были проведены также исследования на пациентах с диагнозом «генитальная остроконечная кондилома». Диагностика проводилась на основании цитологического, гистологического исследования биоптатов, определения антител к ВПЧ и обнаружения ДНК ВПЧ и онкобелка Е7. Из 25 пациентов группы генитальные кондиломы примерно в 90% случаев ассоциировались с другими урогенитальными инфекциями. Примерно 10% ранее лечились методом электрокоагуляции. 15 пациентам вводили 2 раза в день свечи по примеру 2 и 10 пациентам свечи по примеру 1 в течение 10 недель - 12 недель до того, как генитальные бородавки разрешились. При контрольном осмотре через полтора года рецидива остроконечных кондилом в основной группе не было, у 3 пациенток отмечен рецидив. Назначено дополнительное лечение с увеличением дозы.

Пример 3. Проведение плацебо-контролируемого многоцентрового клинического исследования эффективности и безопасности препарата Цервикон-ДИМ (суппозитории вагинальные) в лечении цервикальной интраэпителиальной неоплазии.

Исследовалась частота рецидивов при длительной терапии препаратом Цервикон-ДИМ, а именно определялась доля пациенток с отсутствием рецидивов в течение 3, 6 и 18 месяцев (таблица 3), а также доля пациенток, у которых произошла элиминация клеток, содержащих вирусную ДНК (ПЦР-теста) в конце периода терапии (6 мес). Пациенткам контрольной группы была проведена терапия плацебо (табл.4).

Таблица 3. Оценка показателей выявления рецидивов внутри групп по визитам. День исследования Показатель рецидивирования Группа Цервикон-ДИМ Плацебо Частоты % в группе Частоты % в группе 0 CIN есть 31 100,0 31 100,0 0 CIN нет 0 0 0 0 90±5 CIN есть 2 6,5 10 32,3 CIN нет 29 93,5 21 67,7 180±5 CIN есть / рецидив 0 0 8 25,8 CIN нет 31 100,0 23 74,2 540±15 рецидив 0 0 14 45,2 CIN нет 31 100,0 17 54,8

Таблица 4. Оценка показателей выявления ВПЧ методом ПЦР внутри групп по визитам (ВПЧ 16 и 18 типов). День исследования Показатель ВПЧ 16/18 Группа Цервикон-ДИМ Плацебо Частоты % в группе Частоты % в группе 0 ВПЧ- 5 17,85714 2 6,45161 ВПЧ+ 23 82,14286 29 93,54839 элиминация         90±5 реинфекция 0 0 4 12,90323 нет эффекта 19 70,37037 27 87,09677 элиминация 8 29,62963 0 0 180±5 реинфекция 0 0 1 3,44828 нет эффекта 20 71,42857 27 93,10345 элиминация 8 28,57143 1 3,44828

По данным ПЦР-диагностики ВПЧ-инфекции общая эффективность проведенной противовирусной терапии в группе, пациентки которой принимали Цервикон-ДИМ, составила около 30%. Также имеется более высокая эффективность терапии Цервикон-ДИМом для предотвращения рецидива цервикальной интраэпителиальной неоплазии по сравнению с группой плацебо: 93,5% к концу 3-го месяца и 100% к концу 6 месяца. Отдаленное наблюдение показало, что достигнутый лечебный эффект сохраняется на протяжении года: не было зарегистрировано рецидивов в группе, получавшей Цервикон-ДИМ, при том, что их число в группе плацебо достигло 45,2%.

Таким образом, было подтверждено, что длительная терапия препаратом Цервикон-ДИМ способствует элиминации папилломавирусной инфекции у пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией, предотвращение рецидива заболевания и его возможной прогрессии в рак шейки матки.

Пример 4. Хронические вирусные инфекции обычно связаны с нарушением работы иммунной системы. Результаты исследования влияния препарата Цервикон-ДИМ на выраженность иммунодефицитного состояния, индуцированного эмоциональным стрессом, изучали на модели стрессирования мышей путем помещения в условия скученности (Таблица 5).

Таблица 5. Влияние на иммунную систему стрессированных мышей Показатели иммунореактивности, единицы измерения Интактные животные Стрессированные животные Контроль P₁< Опыт (Цервикон-ДИМ) P₂< Число АОК на 10⁶ кл на селезенку (Mm) 4.9 (5.0-4.2) 2.3 (2.6-1.8) 0.01 5.9 (6.3-5.7) 0.01 Титр ГА на 14 день (Mm) 5.4±0.11 4.4±0.24 0.001 4.2±0.32 0.01 Индекс завершенности фагоцитоза, % (Mm) 36.2±7.3 16.6±3.3 0.05 33.4±5.0 0.01 Клиренс туши, индекс (Mm) 4.41±0.13 3.08±0.21 0.01 3.60±0.1 0.01 P1 - достоверность различий с показателями интактных животных P2 - достоверность различий с показателями стрессированных животных

Как видно из таблицы 5, скученность животных в течение 10 дней приводит к подавлению гуморального иммунного ответа (числа АОК и титра ГА), подавлению завершенности фагоцитоза и скорости очищения крови от инертных частиц туши. Все перечисленные нарушения индуцированы стрессом. 14-дневное интравагинальное введение препарата в дозе 1000 мг/кг/сут предотвращает эти нарушения.

Пример 5. У пациенток из примера 3 был изучен уровень секреторного иммуноглобулина класса A (sIgA) во влагалищном отделяемом. Уровень sIgA определялся методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест».

Расчет содержания sIgA производился на 1 г общего белка, определяемого по биуретовой реакции. Исходный уровень sIgA составил в группе плацебо - 210±43 мкг/г, а в группе пациенток, получающих Цервикон-ДИМ в дозе 200 мг/сут - 223±37 мкг/г (М±m). После 6 месяцев терапии уровень sIgA составил в группе плацебо - 239±68 мкг/г, а в группе пациенток, получающих Цервикон-ДИМ в дозе 200 мг/сут - 326±55 мкг/г (отличия значимы, p<0,001 по тесту Стьюдента).

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и касается нового способа лечения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки, независимых от наличия их ассоциированности с ВПЧ. Для этого применяют вагинальные суппозитории «Цервикон-ДИМ», содержащие дииндолилметан. Препарат применяется в течение не менее 6 месяцев в дозировке 200 мг/сут дииндолилметана. Заявленный способ обеспечивает длительный противорецидивный эффект на протяжении не менее года после окончания терапии, а также стимулирует иммунную систему, в том числе общий и местный иммунитет слизистой оболочки влагалища. Изобретение способствует ускорению эпителизации после проведения деструктивной терапии по поводу цервикальной интраэпителиальной неоплазии, а также позволяет снизить или исключить негативное воздействие побочных эффектов. 3 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр., 2 ил.

1. Способ лечения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки, независимый от наличия их ассоциированности с ВПЧ, включающий применение суппозиториев вагинальных «Цервикон-ДИМ», содержащих дииндолилметан, отличающийся тем, что препарат применяется в течение не менее 6 месяцев в дозировке 200 мг/сут дииндолилметана.

2. Способ по п. 1, обеспечивающий длительный противорецидивный эффект на протяжении не менее года после окончания терапии.

3. Способ по п. 1, обеспечивающий стимуляцию иммунной системы, в том числе общего и местного иммунитета слизистой оболочки влагалища.

4. Способ по п. 1, обеспечивающий ускоренную эпителизацию после проведения деструктивной терапии по поводу СIN.