ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ВЕКТОРНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ Российский патент 2015 года по МПК C07K7/56 A61K38/12 A61P11/00 

Изобретение относится к органическим соединениям и их фармацевтическим композициям, подходящим для регуляции векторных ионных каналов, заболеваний, связанных с функцией легких, и для лечения отеков.

Уровень техники

Транспорт жидкости через слои клеток и ткани, главным образом, основывается на осмотическом градиенте посредством векторного ионного транспорта, например транспорта натрия. Он происходит, в основном, посредством строго регулируемых и жизненно важных ионных каналов, таких как, например, комплекс эпителиального натриевого канала (ENaC) (Ware L.B. и Matthay M.A. New England J Med 2001; 342/18: 1334-1359. Matthay et al., Am J Physiol 1996; 270:L487-L503; Berthiaume Y. и Matthay M.A. Respiratory Physiology & Neurobiology 159 (2007) 350-359). Вода пассивно следует по данному градиенту, в том числе, через специальные водные каналы, такие как водный канал аквапорин V. Таким образом, медицинская регуляция векторного ионного транспорта через клетки и ткань будет приводить к возможности контроля содержания жидкости в тканях, а также профилактического или терапевтического лечения заболеваний, связанных с накоплением жидкости в ткани.

Если говорят об отеке, то имеют в виду патологическое накопление жидкости в органе, таком как, например, легкие, а также мозг или кожа. Отек в легких называют отеком легких. Отек легких, главным образом, основан на дисбалансе между выходом жидкости из сосудов в ткани и всасыванием жидкости. Очень часто проницаемость ткани легкого также нарушена таким образом, что происходит повышенный приток жидкости, и жидкость накапливается в легочных альвеолах.

Отек легких в результате недостатка обратного транспорта жидкости из легочных альвеол в интерстиций имеет особое значение при синдроме острого повреждения легких, ALI, при остром респираторном дистресс-синдроме, ARDS, при тяжелом остром респираторном синдроме (SARS), при пневмонии, при гриппе и других вызываемых бактериями и вирусами заболеваниях легких. Однако отек легких также играет значительную роль в других заболеваниях легких, таких как вызванные дыханием повреждения легких, при трансплантатах легких, повреждениях легких, связанных с переливанием крови, терапевтическом введении IL-2 или астме.

В результате повышенного накопления жидкости в ткани или органе, например в легких, требуемый газообмен затруднен или полностью ограничен. Кислород из вдыхаемого воздуха не достигает крови так, что по причине кислородной недостаточности могут происходить угрожающие жизни повреждения органов.

Lucas et al. (Lucas R et al. Science 1994, 263: 814) описывают пептид, являющийся производным областей от Ser(99) до Glu(116) фактора некроза опухоли и предположительно контролирующий содержание жидкости в легочных альвеолах.

Указанный пептид, содержащий последовательности CGQRETPEGAEKPWYC, также является объектом изобретения в WO 00/09149.

Кроме того, пептид для контроля содержания жидкости в альвеолах, содержащий последовательность CGTKPIELGPDEPKAVC, включен в EP 2009023, и пептид, содержащий последовательность LSPGQRETPEGAEAKPWYE, включен в WO2009/073909.

В настоящее время не существует селективной и применимой в медицинских целях терапии или лечения для регуляции векторных ионных каналов в клетках и тканях, в частности для регуляции векторных ионных каналов ткани легкого. До сих пор не существует селективной терапии для регуляции векторного ионного транспорта в легких и, в частности, для лечения отека легких. Как правило, предпринимают попытки осуществлять искусственную вентиляцию легких пациентов, страдающих отеком легких, для обеспечения снабжения крови и, таким образом, органов кислородом.

Таким образом, настоящее изобретение основывается на предоставлении органических и биоактивных веществ, подходящих для векторной активации ионных каналов. В частности, настоящее изобретение нацелено на предоставление органических и биоактивных веществ, которые можно применять для активации эпителиальных натриевых ионных каналов в легких и для селективного лечения отека легких.

Неожиданно, в настоящее время обнаружены органические соединения, подходящие для решения поставленной задачи.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к циклическому органическому соединению, отличающемуся тем, что оно содержит 16 аминокислот или 17 аминокислот и не имеет C-концевой карбоксильной группы и/или N-концевой аминогруппы, где, необязательно, одна из аминокислот является неприродной аминокислотой и где замыкание цикла осуществляют между боковой цепью одной аминокислоты и C-концом другой аминокислоты или замыкание цикла осуществляют посредством неприродной аминокислоты.

Циклическое органическое соединение или циклические органические соединения, предоставляемые по настоящему изобретению, в данной заявке также обозначают как "соединение (соединения) по настоящему изобретению".

Соединение по настоящему изобретению относится к соединению в любой форме, например в свободной форме и в форме сокристаллов, например в форме соли или в форме сольвата, или в форме соли и сольвата.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению в форме соли.

Предпочтительно, такие соли включают фармацевтически приемлемые соли, хотя фармацевтически неприемлемые соли включают, например, в целях получения, выделения, очистки соединения по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение относится к соли соединения по настоящему изобретению с трифторуксусной кислотой, которая может образовываться, например, при получении соединения по настоящему изобретению.

Соединение по настоящему изобретению в форме соли включает соль металла или кислотно-аддитивную соль. Соли металлов включают, например, соли щелочных или щелочноземельных металлов, кислотно-аддитивные соли включают соль соединения по настоящему изобретению с кислотой.

Соединение по настоящему изобретению в свободной форме, необязательно, в форме сольвата, можно превращать в подходящее соединение в форме соли, в несольватной форме или в форме сольвата, и наоборот.

В соединениях по настоящему изобретению конкретные аминокислотные последовательности в сочетании с замыканиями циклов, до настоящего времени неизвестные для пептидов, неожиданно приводили к циклическим органическим соединениям, образуя внутримолекулярную амидную связь, до настоящего времени неизвестную для пептидов, где такие соединения, совершенно неожиданно, способны регулировать векторные ионные каналы в клетках и тканях, например, соединения по настоящему изобретению способны регулировать комплекс эпителиального натриевого канала, частично в большей степени, чем ранее известные, но структурно отличающиеся пептиды.

Неожиданно оказалось, что соединение по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность GQRETPEGAEAKPWY.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению, содержащему аминокислотную последовательность GQRETPEGAEAKPWY.

Неприродную аминокислоту в соединении по настоящему изобретению, предпочтительно, выбирают из орнитина или омега-аминокислоты, в частности омега-амино-(C_3-8)-алкановой кислоты, в частности 3-аминопропионовой кислоты, гамма-аминомасляной кислоты, 5-аминопентановой кислоты, 6-аминогексановой кислоты и 7-аминогептановой кислоты, в частности неприродная аминокислота связана через амидные связи.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению, в котором неприродная аминокислота выбрана из орнитина или омега-аминокислоты; в частности неприродная аминокислота связана через амидные связи.

В соединении по настоящему изобретению замыкание цикла предпочтительно происходит между боковой цепью одной аминокислоты и C-концом другой аминокислоты, в частности между боковой цепью орнитина или лизина и C-концом природной аминокислоты, в частности глицина.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению, отличающемуся тем, что замыкание цикла происходит между боковой цепью одной аминокислоты и C-концом другой аминокислоты.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению, содержащему аминокислотные последовательности

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

SEQ ID NO:3

SEQ ID NO:4

SEQ ID NO:5

SEQ ID NO:6

SEQ ID NO:7

и

SEQ ID NO:8

В соединении последовательности SEQ ID NO:1 {[KGQRETPEGAEAKPWYG] (цикло-Kepsilon1-G17)} аминокислоты соединены пептидной связью от C-концевой аминокислотой глицин (G) до N-концевой аминокислоты лизин (K), в то время как N-концевая аминокислота лизин (K) соединена с C-концевой аминокислотой глицин (G) посредством амидной связи между азотом эпсилон-аминогруппы боковой цепи лизина и углерода карбоксильной группы глицина таким образом, что соединение не имеет C-концевой карбоксильной группы.

В соединении, содержащем последовательность SEQ ID NO:2 {[орнитин-GQRETPEGAEAKPWYG] (цикло-Orn-delta1-G17)}, аминокислоты соединены пептидной связью от C-концевой аминокислоты глицин (G) до N-концевой аминокислоты орнитин (Orn), в то время как N-концевая аминокислота орнитин (Orn) соединена с C-концевой аминокислотой глицин (G) посредством амидной связи между азотом дельта-аминогруппы боковой цепи орнитина и углерода карбоксильной группы глицина таким образом, что соединение не имеет C-концевой карбоксильной группы.

В соединении, содержащем последовательность SEQ ID NO:3 {[5-аминопентановая кислота-GQRETPEGAEAKPWYG] (цикло-1-17)}, аминокислоты соединены пептидной связью от C-концевой аминокислоты глицин (G) до N-концевой аминокислоты глицин (G), в то время как N-концевая аминокислота глицин (G) соединена с C-концевой аминокислотой глицин (G) посредством амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углеродом C1 карбоксильной группы 5-аминопентановой кислоты с одной стороны и амидной связью между азотом 5-аминогруппы 5-аминопентановой кислоты и углеродом карбоксильной группы C-концевого глицина с другой стороны таким образом, что соединение не имеет C-концевой карбоксильной группы.

В соединении, содержащем последовательность SEQ ID NO:4 {[гамма-аминомасляная кислота-GQRETPEGAEAKPWYG] (цикло-1-17)}, аминокислоты соединены пептидной связью от C-концевой аминокислоты глицин (G) до N-концевой аминокислоты глицин (G), в то время как C-концевая аминокислота глицин (G) соединена с N-концевой аминокислотой глицин (G) посредством амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углеродом C1 карбоксильной группы гамма-аминомасляной кислоты с одной стороны и посредством амидной связи между азотом аминогруппы гамма-аминомасляной кислоты и углеродом карбоксильной группы C-концевого глицина с другой стороны таким образом, что соединение не имеет C-концевой карбоксильной группы.

В соединении, содержащем последовательность SEQ ID NO:5 {[гамма-аминомасляная кислота-GQRETPEGAEAKPWYD-OH] (цикло-1-Dγ17)}, аминокислоты соединены пептидной связью от C-концевой аспарагиновой кислоты (D) до N-концевой аминокислоты глицин, в то время как C-концевая аспарагиновая кислота (D) соединена с N-концевой аминокислотой глицин посредством амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углеродом C1 карбоксильной группы гамма-аминомасляной кислоты с одной стороны и посредством амидной связи между азотом аминогруппы гамма-аминомасляной кислоты и углеродом карбоксильной группы боковой цепи C-концевой аспарагиновой кислоты с другой стороны таким образом, что соединение не имеет N-концевой аминогруппы.

В соединении, содержащем последовательность SEQ ID NO:6 {[3-аминопропионовая кислота-GQRETPEGAEAKPWYE-OH] (цикло-1-Εδ17)}, аминокислоты соединены пептидной связью от C-концевой глутаминовой кислоты (E) до N-концевой аминокислоты глицин, в то время как C-концевая глутаминовая кислота (E) соединена с N-концевой аминокислотой глицин посредством амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углеродом C1 карбоксильной группы 3-аминопропионовой кислоты с одной стороны и посредством амидной связи между азотом аминогруппы 3-аминопропионовой кислоты и углеродом карбоксильной группы боковой цепи C-концевой глутаминовой кислоты с другой стороны таким образом, что соединение не имеет N-концевой аминогруппы.

В соединении, содержащем последовательность SEQ ID NO:7 {[7-аминогептановая кислота-GQRETPEGAEAKPWY] (цикло-1-16)}, аминокислоты соединены пептидной связью от C-концевой аминокислоты тирозин до N-концевой аминокислоты глицин, в то время как C-концевая аминокислота тирозин соединена с N-концевой аминокислотой глицин посредством амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углеродом C1 карбоксильной группы 7-аминогептановой кислоты с одной стороны и посредством амидной связи между азотом аминогруппы 7-аминогептановой кислоты и углеродом карбоксильной группы C-концевого тирозина с другой стороны таким образом, что соединение не имеет ни N-концевой аминогруппы, ни C-концевой карбоксильной группы.

В соединении, содержащем последовательность SEQ ID NO:8 {[6-аминогексановая кислота-GQRETPEGAEAKPWYG] (цикло-1-17)}, аминокислоты соединены пептидной связью от C-концевой аминокислоты глицин до N-концевой аминокислоты глицин, в то время как C-концевая аминокислота глицин соединена с N-концевой аминокислотой глицин посредством амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углеродом C1 карбоксильной группы 6-аминогексановой кислоты с одной стороны и посредством амидной связи между азотом аминогруппы 6-аминогексановой кислоты и углеродом карбоксильной группы C-концевого глицина с другой стороны таким образом, что соединение не имеет ни N-концевой аминогруппы, ни C-концевой карбоксильной группы.

Соединение по настоящему изобретению можно получать подходящим способом, например аналогично известному способу, или как описано в настоящем документе, например, химическим синтезом или с применением микробиологических способов, где, в частности, введение амидной связи между свободной аминогруппой и свободной карбоксильной группой можно осуществлять подходящим способом, например аналогично известному способу, или как описано в настоящей заявке.

Оказалось, что соединение по настоящему изобретению демонстрирует представляющую интерес фармакологическую активность, и, таким образом, его можно применять в качестве лекарственного средства.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Биологические исследования на клетках человека показывают, что соединения по настоящему изобретению не проявляют воспалительных или токсических свойств. С этой целью эпителиальные клетки человека культивируют в общей лабораторной культуре клеток и добавляют соединение по настоящему изобретению. Несмотря на добавление соединения по настоящему изобретению, в клетках человека не наблюдали токсических или воспалительных реакций.

Определение векторной регуляции ионных каналов посредством соединения можно проводить в соответствии с общим для лабораторий способом, например, по Clunes M.T. et al., J Physiolo. (2004) 557, 3: 809-819), посредством экспериментов с локальной фиксацией потенциала. Для исследований ионных каналов с локальной фиксацией потенциала стеклянную канюлю растягивают так, чтобы она была тонкой, и наполняют нейтральным буферным раствором. Стеклянную канюлю (пипетка для локальной фиксации потенциала) осторожно вдавливают в интактную эпителиальную клетку. Участок мембраны локализуют под пипеткой. Тем самым производится электрическое сопротивление между внутренней частью пипетки и внешним раствором. Электрод, прикрепленный к чувствительному усилителю, погружают в раствор в пипетке.

Регуляцию векторных эпителиальных ионных каналов определяют через изменение силы тока с постоянным напряжением.

Таким образом, неожиданно оказалось, что соединения по настоящему изобретению демонстрируют регуляцию векторных эпителиальных ионных каналов.

Особенно неожиданным являлось то, что соединения по настоящему изобретению, например соединения, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:8, приводят к значимо более высокой активации векторного ионного тока, чем пептиды CGQRETPEGAEKPWYC (Lucas et al. Science 1994, также WO00/09149), CGTKPIELGPDEPKAVC (SEQ ID NO:2 из EP 2009023) и LSPGQRETPEGAEAKPWYE (SEQ ID NO:2 из PCT AT2008448), уже известные из литературы.

Соединение по настоящему изобретению, таким образом, можно применять для получения лекарственного средства, например для регуляции векторных ионных каналов, в частности ионных каналов в легких, и для лечения отеков, в частности для лечения отека легких; и в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для регуляции векторных ионных каналов, в частности ионных каналов в легких, для лечения заболеваний, связанных с функцией легких, и для лечения отеков, в частности для лечения отека легких.

Лечение заболеваний, связанных с функцией легких, включает, например, активацию эпителиальных ионных каналов, улучшение функции легких и/или лечение отеков, таких как отек легких, кроме того, лечение

- синдрома острого повреждения легких, ALI,

- острого респираторного дистресс-синдрома, ARDS,

- тяжелого острого респираторного синдрома (SARS),

- пневмонии,

- вирусных пневмоний, таких как грипп и инфекции RSV,

- в случае полиорганной недостаточности,

- в случае вызванных дыханием повреждений легких, трансплантатов легких, повреждений легких, связанных с переливанием крови, терапевтического введения IL-2 или астмы.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу регуляции векторных ионных каналов, в частности ионных каналов в легких, лечения заболеваний, связанных с функцией легких, и лечения отеков, в частности лечения отека легких, отличающемуся тем, что нуждающемуся в таком лечении пациенту вводят эффективное количество соединения по настоящему изобретению.

Как применяют в настоящем документе, пациент включает млекопитающих, например, людей.

Соединение по настоящему изобретению можно вводить в форме фармацевтической композиции.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, отличающейся тем, что она содержит соединение по настоящему изобретению, например, в сочетании с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым адъювантом, таким как носители или разбавители, например в сочетании с одним или несколькими наполнителями, связывающими средствами, разрыхлителями, модификаторами текучести, смазочными средствами, вкусовыми добавками, сахаром или подсластителями, ароматизаторами, консервантами, стабилизаторами, увлажнителями, эмульгаторами, солюбилизаторами, солями для регуляции осмотического давления и/или буфером (смесями).

Подходящее для лечения заболеваний количество соединения по настоящему изобретению, конечно, сильно будет зависеть от различных параметров, например, химической природы и фармакокинетики применяемого соединения, конкретного пациента, заболевания, подвергаемого лечению, типа нанесения; однако для большинства млекопитающих эффективная суточная доза включает количество, например, в диапазоне от 0,0001 г до 1,5 г, например от 0,001 мг/кг массы тела до приблизительно 20 мг/кг массы тела.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить в свободной форме или в форме соли, необязательно, в форме сольвата. Соединение по настоящему изобретению в форме соли, необязательно, в форме сольвата, проявляет, по существу, ту же активность, что и соединение по настоящему изобретению в свободной, необязательно, несольватной форме.

Введение соединения по настоящему изобретению или его фармацевтической композиции, предпочтительно, можно осуществлять внутрилегочно или парентерально и осуществлять, в частности, предпочтительно, внутрилегочно.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать подходящим способом, например аналогично известному способу, например способами смешивания, грануляции, покрывания, растворения, лиофилизации.

Описание чертежей

На фиг.1 представлена ВЭЖХ-хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

На фиг.2 представлена ВЭЖХ-хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

На фиг.3 представлена ВЭЖХ-хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

На фиг.4 представлена ВЭЖХ-хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

На фиг.5 представлена ВЭЖХ-хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.

На фиг.6 представлена ВЭЖХ-хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

На фиг.7 представлена ВЭЖХ-хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.

На фиг.8 представлена ВЭЖХ-хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

На хроматограммах на фиг.1-8 поглощение [mAU = миллиединица поглощения] отложено на оси y и время [минуты] отложено на оси x.

На фиг.9 представлена хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, при измерении с локальной фиксацией потенциала.

На фиг.10 представлена хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, при измерении с локальной фиксацией потенциала.

На фиг.11 представлена хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, при измерении с локальной фиксацией потенциала.

На фиг.12 представлена хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, при измерении с локальной фиксацией потенциала.

На фиг.13 представлена хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, при измерении с локальной фиксацией потенциала.

На фиг.14 представлена хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, при измерении с локальной фиксацией потенциала.

На фиг.15 представлена хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, при измерении с локальной фиксацией потенциала.

На фиг.16 представлена хроматограмма соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, при измерении с локальной фиксацией потенциала.

На хроматограммах на фиг.9-16 сила тока [pA = пикоампер] отложена по оси y и время [sec = секунды] отложено по оси x.

Пример 1

Синтез соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1

Соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, синтезировали полностью автоматически посредством твердофазного синтеза Fmoc со стадиями, описанными в таблице 1:

Таблица 1 Стадия Способ Продукт 1 последовательное присоединение аминокислот наращивание пептидной цепи, связанной с твердой фазой 2 селективное отщепление от твердой фазы частично защищенный пептид в растворе 3 очистка и лиофилизация очищенный, частично защищенный пептид 4 селективная циклизация частично защищенный, циклизованный пептид 5 отщепление защитных групп циклизованный пептид в растворе 6 очистка и лиофилизация очищенный, циклизованный пептид в форме соли трифторуксусной кислоты 7 аналитическое исследование очищенный пептид

Замыкание цикла осуществляли посредством образования амидной связи между азотом эпсилон-аминогруппы боковой цепи N-концевого лизина и углерода карбоксильной группы C-концевого глицина.

Затем пептид исследовали с помощью обратной ВЭЖХ. Чистота составляла более 95%. Молекулярная масса составляла 1886,1.

Пример 2

Синтез соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2

Соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, синтезировали полностью автоматически посредством твердофазного синтеза Fmoc с этапами, описанными в таблице 1 примера 1.

Замыкание цикла осуществляли посредством образования амидной связи между азотом дельта-аминогруппы боковой цепи N-концевого орнитина и углерода карбоксильной группы C-концевого глицина.

Затем пептид исследовали с помощью обратной ВЭЖХ. Чистота составляла более 95%. Молекулярная масса составляла 1872,4.

Пример 3

Синтез соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3

Соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, синтезировали полностью автоматически посредством твердофазного синтеза Fmoc с этапами, описанными в таблице 1 примера 1.

Замыкание цикла осуществляли посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углерода C1-карбоксильной группы аминопентановой кислоты с одной стороны и посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы аминопентановой кислоты и углеродом карбоксильной группы C-концевого глицина с другой стороны.

Затем пептид исследовали с помощью обратной ВЭЖХ. Чистота составляла более 95%. Молекулярная масса составляла 1857,0.

Пример 4

Синтез соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4

Соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, синтезировали полностью автоматически посредством твердофазного синтеза Fmoc с этапами, описанными в таблице 1 примера 1.

Замыкание цикла осуществляли посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углерода C1 карбоксильной группы гамма-аминомасляной кислоты с одной стороны и посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы гамма-аминомасляной кислоты и углеродом карбоксильной группы C-концевого глицина с другой стороны.

Затем пептид исследовали с помощью обратной ВЭЖХ. Чистота составляла более 95%. Молекулярная масса составляла 1843,0.

Пример 5

Синтез соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5

Соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, синтезировали полностью автоматически посредством твердофазного синтеза Fmoc с этапами, описанными в таблице 1 примера 1.

Замыкание цикла осуществляли посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углерода C1 карбоксильной группы гамма-аминомасляной кислоты с одной стороны и посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы гамма-аминомасляной кислоты и углеродом карбоксильной группы боковой цепи C-концевой аспарагиновой кислоты с другой стороны.

Затем пептид исследовали с помощью обратной ВЭЖХ. Чистота составляла более 95%. Молекулярная масса составляла 1901,0.

Пример 6

Синтез соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6

Соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, синтезировали полностью автоматически посредством твердофазного синтеза Fmoc с этапами, описанными в таблице 1 примера 1.

Замыкание цикла осуществляли посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углеродом C1 карбоксильной группы 3-аминопропионовой кислоты с одной стороны и посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы 3-аминопропионовой кислоты и углеродом карбоксильной группы боковой цепи C-концевой глутаминовой кислоты с другой стороны.

Затем пептид исследовали с помощью обратной ВЭЖХ. Чистота составляла более 95%. Молекулярная масса составляла 1901,0.

Пример 7

Синтез соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7

Соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, синтезировали полностью автоматически посредством твердофазного синтеза Fmoc с этапами, описанными в таблице 1 примера 1.

Замыкание цикла осуществляли посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углеродом C1 карбоксильной группы 7-аминогептановой кислоты с одной стороны и посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы 7-аминогептановой кислоты и углеродом карбоксильной группы C-концевого тирозина с другой стороны.

Затем пептид исследовали с помощью обратной ВЭЖХ. Чистота составляла более 95%. Молекулярная масса составляла 1828,0.

Пример 8

Синтез соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8

Соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, синтезировали полностью автоматически посредством твердофазного синтеза Fmoc с этапами, описанными в таблице 1 примера 1.

Замыкание цикла осуществляли посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы N-концевого глицина и углерода C1 карбоксильной группы 6-аминогексановой кислоты с одной стороны и посредством образования амидной связи между азотом аминогруппы 6-аминогексановой кислоты и углеродом карбоксильной группы C-концевого глицина с другой стороны.

Затем пептид исследовали с помощью обратной ВЭЖХ. Чистота составляла более 95%. Молекулярная масса составляла 1873,0.

Пример 9

Эксперименты с локальной фиксацией потенциала

9a. Культура клеток

Электрофизиологические эксперименты осуществляли на клетках A549 человека (ATTC № CCL-185). Клетки A549 являются эпителиальными клетками легкого человека, вовлеченными в диффузию воды и электролитов в легких. Клетки суспендировали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, продукт № R6504) с 1% пенициллином/стрептомицином и 10% эмбриональной телячьей сывороткой, переносили в пластиковые сосуды для культивирования клеток и культивировали в инкубаторе с 95% воздуха и 5% CO₂ при 37ºC. Среду меняли от 2 до 3 раз в неделю. Клетки удваивались в течение приблизительно 22 часов, и концентрация клеток не превышала 7×10⁴ клеток на см².

9b. Добавление соединений

За клетками наблюдали посредством микроскопии. При этом также обнаруживали, что добавление соответствующего соединения, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8, не приводило к каким-либо изменениям морфологии или роста клеток, и добавление соответствующего соединения не приводило к гибели клеток.

9c. Эксперименты с локальной фиксацией потенциала

Для экспериментов с локальной фиксацией потенциала клетки переносили на небольшие стеклянные пластины.

9d. Измерения с локальной фиксацией потенциала

От клеток A549 отводили макроскопические токи в конфигурации "whole cell" способа "локальной фиксации потенциала" (Hamill et al., Pflugers Arch. 1981, 391(2): 85-100., 1981). Для рассеяний тока в конфигурации "whole cell" применяли следующие омывающие и электродные растворы:

Омывающий раствор: 135 мМ метансульфонат натрия, 10 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂, 5,5 мМ глюкоза и 10 мМ HEPES, pH 7,4.

Электродный раствор: 120 мМ метансульфонат калия, 15 мМ KC1, 6 мМ NaCl, 1 мМ Mg₂ATP, 2 мМ Na₃ATP, 10 мМ HEPES и 0,5 мМ EGTA (pH 7,2).

Покровные стекла с культивируемыми на них клетками переносили в тестовую кювету емкостью 1 мл, фиксированную на столике микроскопа (Axiovert 100, 400-кратное увеличение), и клетки поливали описываемым выше омывающим раствором. Затем от подходящей клетки (прикрепившейся к покровному стеклу) отводили ток. С этой целью микроэлектрод, наполненный раствором электролитов (стеклянный капилляр с определенным обработанным при высокой температуре концевым отверстием приблизительно 1-3 мкм, соответствующий сопротивлению рабочего конца электрода 3-5 Ом), помещали на клетку и мембрану всасывали таким образом, что между мембраной и электродом образовывался "гигаомный контакт" для минимизации утечки тока. При конфигурации "whole cell" через мембрану проникали под рабочим концом электрода таким образом, что могли измерять ток, проходящий через все ионные каналы клетки. После получения гигаомного контакта определяемый остаточный мембранный потенциал подавали через предварительный усилитель (CV-4 Headstage, Axon Instruments) и усилитель (Axopatch ID, Axon Instr.), и таким образом измеряли проходящий через ионные каналы ток.

Способ подачи импульсов состоял из гиперполяризации мембраны клетки до -100 мВ в течение 5 секунд и последующей постепенной деполяризации до +100 мВ этапами по 20 мВ.

Данный способ осуществляли до (контроль) и после добавления циклических органических молекул. Получаемые таким образом рассеяния тока сохраняли и анализировали посредством программного обеспечения PCLAMP 6.0. С данной целью рассеяния тока, получаемые в присутствие амилорида, вычитали из записанных ранее токов таким образом, что можно определять амилорид-чувствительный натриевый ток через эпителиальные натриевые каналы.

9d. Результаты

Регуляция натриевых ионных каналов посредством соединений по настоящему изобретению

С применением измерения с локальной фиксацией потенциала соединения по настоящему изобретению тестировали на их способность регулировать векторные ионные каналы. При этом стало очевидным, что соединения по настоящему изобретению обладают способностью регулировать векторные ионные каналы.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению сравнивали с пептидами, известными из литературы, и определяли их активность по сравнению с таковой известных пептидов.

Результаты представлены в таблице 2:

Таблица 2 Определение Структура Активность по сравнению с пептидом CGQRETPEGAEKPWYC ("ΤΙΡ-Peptid", Lucas et al. Science 1994, также WO00/09149)       SEQ ID NO:2 из EP 2009023 CGTKPIELGPDEPKAVC 80% SEQ ID NO:2 из PCT AT2008448 LSPGQRETPEGAEAKPWYE 60% SEQ ID NO:1 по настоящему изобретению [KGQRETPEGAEAKPWYG] (цикло-Kepsilon1-G17) 150% SEQ ID NO:2 по настоящему изобретению [орнитин-GQRETPEGAEAKPWYG] (цикло-Orn-delta1-G17) 115% SEQ ID NO:5 по настоящему изобретению [гамма-аминомасляная кислота-GQRETPEGAEAKPWYD-OH] (цикло-1-Dyl7) 160% SEQ ID NO:6 по настоящему изобретению [3-аминопропионовая кислота-GQRETPEGAEAKPWYE-OH] 150% SEQ ID NO:8 по настоящему изобретению [6-аминогексановая кислота-GQRETPEGAEAKPWYG] (цикло-1-17) 150%

Как можно видеть из таблицы 2, активность соединений по настоящему изобретению неожиданно являлась более высокой, чем активность структурно отличающихся известных пептидных соединений.

Изобретение относится к циклическому соединению, содержащему аминокислотную последовательность GQRETPEGAEAKPWY в дополнение к одной или двум дополнительным аминокислотам, и не имеющему C-концевую карбоксильную группу и/или N-концевую аминогруппу, где одна из аминокислот является неприродной аминокислотой и где замыкание цикла происходит между боковой цепью одной аминокислоты и C-концом другой аминокислоты или замыкание цикла происходит посредством неприродной аминокислоты; способу его получения и его применению для регуляции векторных ионных каналов, для лечения заболеваний, связанных с функцией легких, и для лечения отеков. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 табл., 9 пр.

1. Циклическое органическое соединение, необязательно в форме фармацевтически приемлемой соли, содержащее аминокислотную последовательность GQRETPEGAEAKPWY в дополнение к одной или двум дополнительным аминокислотам, отличающееся тем, что оно не содержит С-концевую карбоксильную группу и/или N-концевую аминогруппу,
где одна из аминокислот является неприродной аминокислотой, выбранной из орнитина или омега-аминокислоты,
и где замыкание цикла происходит между боковой цепью одной аминокислоты и C-концом другой аминокислоты, или замыкание цикла происходит посредством неприродной аминокислоты, или
циклическое органическое соединение является соединением формулы

2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что омега-аминокислота представляет собой омега-амино-(C_3-12)-алкановую кислоту.

3. Соединение по любому из пп.1 или 2, отличающееся тем, что омега-аминокислота выбрана из 3-аминопропионовой кислоты, гамма-аминомасляной кислоты, 5-аминопентановой кислоты, 6-аминогексановой кислоты и 7-аминогептановой кислоты.

4. Соединение по любому из пп.1 или 2, отличающееся тем, что неприродная аминокислота связана посредством амидных связей.

5. Соединение по п.1, отличающееся тем, что замыкание цикла происходит между боковой цепью орнитина и С-концом природной аминокислоты, в частности глицина.

6. Соединение по п.1, где соединение является соединением формулы

7. Соединение по любому из пп.1 или 2 в форме фармацевтически приемлемой соли.

8. Соединение по любому из пп.1 или 2 для применения в качестве лекарственного средства.

9. Соединение по любому из пп.1 или 2 для получения лекарственного средства для регуляции векторных ионных каналов.

10. Соединение по любому из пп.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с функцией легких.

11. Соединение по п.10, где заболевания, связанные с функцией легких, выбраны из синдрома острого повреждения легких (ALI), острого респираторного дистресс-синдрома (ARDS), тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), пневмонии, вирусных пневмоний, таких как грипп и инфекции RSV, в случае полиорганной недостаточности, в случае вызванных дыханием повреждений легких, трансплантатов легких, повреждений легких, связанных с переливанием крови, терапевтического введения IL-2 или астмы и отеков.

12. Соединение по любому из пп.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения отеков.

13. Фармацевтическая композиция для регуляции векторных ионных каналов, отличающаяся тем, что она содержит эффективное количество соединения по любому из пп.1-7.

14. Фармацевтическая композиция по п.10, отличающаяся тем, что она содержит соединение по любому из пп.1-7 в сочетании по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым адъювантом.

15. Фармацевтическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый адъювант содержит носители или разбавители.

16. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13 или 14, отличающаяся тем, что она содержит соединение по любому из пп.1-7 в сочетании с одним или несколькими наполнителями, связывающими средствами, разрыхлителями, модификаторами текучести, смазочными средствами, вкусовыми добавками, сахаром или подсластителями, ароматизаторами, консервантами, стабилизаторами, увлажнителями, эмульгаторами, солюбилизаторами, солями для регуляции осмотического давления и/или буфером.