ИНГИБИТОРЫ ГИПЕРСЕКРЕЦИИ МУЦИНА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК C07K14/47 C07K5/10 C07K7/04 A61K38/17 A61K38/07 A61K38/08 A61K38/10 A61P11/06 A61P37/08 

Область техники

Изобретение главным образом относится к композициям, включающим пептиды, и способам их применения.

Уровень техники

Слизь является биологической жидкостью, способной к образованию гелей. Она представляет собой смесь компонентов, включающих воду и продукты секреции из различных клеток. Муцины, также называемые гликопротеинами слизи или эпителиальными гликопротеинами, являются основным компонентом слизи и представляют собой гликоконъюгаты, которые характеризуются многочисленными боковыми олигосахаридными цепями, связанными с остовом пептида посредством N- и O-связей. Гиперсекреция муцина (гликопротеиновый компонент слизи) наблюдается при некоторых респираторных заболеваниях, включающих астму, хронический бронхит и кистозный фиброз (CF), и является фактором риска смерти пациентов с этими заболеваниями.

В дыхательных путях муцины высвобождаются на поверхность дыхательных путей из клеток Гоблета на поверхности эпителия и из клеток слизи подслизистой железы. Общее количество поверхностной жидкости (слизи) в дыхательных путях является результатом скорости секреции слизи в сочетании со скоростью ее удаления (путем эпителиальной реабсорбции, испарения, цилиарного транспорта и кашлевого транспорта), то есть результатом различия между скоростью секреции слизи и скоростью ее удаления. При «нормальных» условиях скорость секреции и удаления слизи сбалансированы настолько, что трахеобронхиальное дерево покрыто только тонким поверхностным слоем жидкости. Гиперсекреция слизи (если она не сопровождается одновременным увеличением процесса удаления слизи) приводит к общему увеличению количества слизи по отношению к нормальным условиям, что ведет к накоплению слизи дыхательных путей, которое может в свою очередь привести к обструкции дыхательных путей и увеличению задержки вдыхаемых частиц и микробных компонентов.

Гиперсекреция слизи вносит вклад в патогенез большого числа воспалительных заболеваний дыхательных путей как у людей, так и у животных, отличных от людей. Увеличенная секреция слизи проявляется в состояниях хронических заболеваний, таких как астма, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD) и хронический бронхит; в генетических заболеваниях, таких как кистозный фиброз; при аллергических состояниях (атопии, аллергическом воспалении); при бронхоэктазии; а также в ряде острых инфекционных респираторных заболеваний, таких как пневмония, ринит, грипп и простуда.

Во многих из этих респираторных заболеваний гиперсекреция слизи сопровождается увеличенным присутствием в дыхательных путях воспалительных клеток. Эти клетки вносят большой вклад в патологию этих заболеваний посредством повреждения и разрушения тканей, произведенного воспалительными медиаторами, высвобождаемыми из этих клеток. Один пример такого разрушения посредством хронического воспаления наблюдается у пациентов с кистозным фиброзом, где высвобождаемые из нейтрофилов медиаторы (т.е. миелопероксидаза) индуцируют десквамацию эпителиальных тканей дыхательных путей.

Дыхательные пути млекопитающих покрыты линиями из тонкого слоя слизи, продуцируемой и секретируемой эпителиальными клетками дыхательных путей (клетками Гоблета) и подслизистыми железами. При таких заболеваниях, как астма, COPD, хронический бронхит и кистозный фиброз, гиперсекреция слизи является общим поражением. Избыток слизи может вносить вклад в обструкцию, восприимчивость к инфекции и даже в разрушение стенок дыхательных путей и прилегающих тканей. Основными компонентами слизи являются муциновые гликопротеины, которые синтезируются секреторными клетками (т.е. клетками Гоблета и клетками слизи) и аккумулируются внутри гранул, связанных с цитоплазматической мембранной. Муцины представляют собой семейство гликопротеинов, которые секретируются эпителиальными клетками, включая клетки респираторного, желудочно-кишечного и женского репродуктивного трактов. Муцины ответственны за вязкоупругие свойства слизи, причем известно по меньшей мере восемь генов муцина. См. Патентную заявку США 10/180,753 (Публикация № U.S. 2003/0013652). Мукоцилиарные повреждения, вызванные гиперсекрецией муцина, и/или гиперплазия клеток слизи ведет к закупорке дыхательных путей слизью, что содействует хронической инфекции, обструкции дыхательных путей и иногда смерти. Многие заболевания дыхательных путей, такие как хронический бронхит, хроническое обструктивное легочное заболевание, бронхоэктазия, астма, кистозный фиброз и бактериальные инфекции, характеризуются сверхпродукцией муцина. См. патентную заявку США № 10/180,753 (Публикация No. U.S. 2003/0013652). При подходящей стимуляции муциновые гранулы высвобождаются посредством процесса экзоцитоза, в котором гранулы транслоцируются к периферии клетки, где мембраны гранулы сливаются с плазматической мембраной, приводя к секреции содержимого в просвет.

Несмотря на очевидную патофизиологическую важность этого процесса, внутриклеточные сигнальные механизмы, связывающие стимуляцию на поверхности клетки с высвобождением муциновых гранул, были освещены только недавно. См. Li et al., Journal of Biological Chemistry, 276: 40982-40990 (2001). Полагают, что миристоилированный, богатый аланином белок субстрата С-киназы (MARCKS) требуется для секреции слизи бронхиальными эпителиальными клетками человека. Предположили, что MARCKS связывается по различным сайтам с мембранами секреторных гранул и с актиновым цитоскелетом, чтобы служить в качестве физической связи между сокращением цитоскелета и муциновыми гранулами, и может играть роль в направлении секреторных гранул к связывающим сайтам на клеточной мембране. См. Singer et al., “A MARCKS-related peptide blocks mucus hypersecretion in a mouse model of asthma”, Nature Medicine, 10: 193-196 (2004). MANS пептид (myr-пептид 1) представляет собой миристоилированную N-концевую аминокислотную последовательность из 24 аминокислот белка, называемого «Миристоилированный богатый аланином субстрат С-киназы», который обычно обозначается как MARCKS белок. Показано, что фрагмент MARCKS из 24 аминокислот, миристоилированная N-концевая последовательность пептида (MANS), ингибирует высвобождение муцина in vitro, а также блокирует гиперсекрецию слизи в мышиной модели астмы. См. Li et al. and Singer et al., выше.

Известна важность миристоилирования для содействия транслокации пептидов через мембраны сквозь липидный бислой. В недавнем исследовании продемонстрировали эту важность, показав, что немиристоилированные пептиды не проходят сквозь клеточную мембрану по сравнению с миристоилированными пептидами. См. A.Harishchandran et al., “Interaction of a Pseudosubstrate Peptide of Protein Kinase C and its Myristoylated Form with Lipid Vesicles. Only the Myzistoylated Form Translocates into Lipid Bilayer.” Biochem. Biophys. Acta, 1713: 73-82 (2005).

Сущность изобретения

В одном аспекте представлен пептид, который состоит менее чем из 24 аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот из эталонной аминокислотной последовательности, определенной как ПЕПТИД 1, который также известен как MANS пептид, и (b) аминокислотной последовательности, по существу идентичной аминокислотной последовательности, определенной в (a). Одна или более аминокислот пептида необязательно независимо химически модифицированы, и пептид имеет муцин-ингибирующий эффект при введении млекопитающему в муцин-ингибирующем количестве.

В другом аспекте представлен пептид, который состоит менее чем из 24 аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот из эталонной аминокислотной последовательности, определенной как ПЕПТИД 1; и (b) аминокислотной последовательности, по существу идентичной последовательности, определенной в (a). N-концевая и C-концевая аминокислоты пептида необязательно независимо химически модифицированы. Пептид имеет муцин-ингибирующий эффект при введении млекопитающему в муцин-ингибирующем количестве и имеет больший муцин-ингибирующий эффект у млекопитающего, чем MANS пептид, при введении в равных концентрациях.

В следующем аспекте представлен пептид, который состоит менее чем из 24 аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот из эталонной аминокислотной последовательности, определенной как ПЕПТИД 1; и (b) аминокислотной последовательности, по существу идентичной аминокислотной последовательности, определенной в (a). N-концевая и C-концевая аминокислоты пептида необязательно независимо химически модифицированы. Пептид имеет большую растворимость в воде, чем MANS пептид, и имеет муцин-ингибирующий эффект при введении млекопитающему в муцин-ингибирующем количестве.

Еще в другом аспекте представлен способ ингибирования гиперсекреции муцина у млекопитающих. Способ включает введение пептида млекопитающим в муцин-ингибирующем количестве, которое ингибирует секрецию муцина. Пептид состоит менее чем из 24 аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот из эталонной аминокислотной последовательности, определенной как ПЕПТИД 1; и (b) аминокислотной последовательности, по существу идентичной последовательности, определенной в (a). Одна или более аминокислот пептида необязательно независимо химически модифицированы.

В следующем аспекте представлен способ ингибирования гиперсекреции муцина у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему пептида в муцин-ингибирующем количестве, которое ингибирует секрецию муцина. Пептид состоит менее чем из 24 аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот из эталонной аминокислотной последовательности, определенной как ПЕПТИД 1; и (b) аминокислотной последовательности, по существу идентичной последовательности, определенной в (a). N-концевая и C-концевая аминокислоты пептида необязательно независимо химически модифицированы, и пептид имеет больший муцин-ингибирующий эффект у млекопитающего, чем MANS пептид, при введении в равных концентрациях.

Еще в следующем аспекте представлен способ ингибирования гиперсекреции муцина у млекопитающего. Способ включает введение пептида млекопитающему в муцин-ингибирующем количестве, которое ингибирует секрецию муцина. Пептид состоит менее чем из 24 аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот из эталонной аминокислотной последовательности, определенной как ПЕПТИД 1; и (b) аминокислотной последовательности, по существу идентичной последовательности, определенной в (a). N-концевая и C-концевая аминокислоты пептида необязательно независимо химически модифицированы, и пептид имеет большую растворимость в воде, чем MANS пептид.

В другом аспекте представлен пептид, который состоит менее чем из 24 аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, состоящую из варианта аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной аминокислотной последовательности, определенной как ПЕПТИД 1. N-концевая и C-концевая аминокислоты пептида необязательно химически модифицированы. Пептид имеет муцин-ингибирующий эффект при введении млекопитающему в муцин-ингибирующем количестве, имеет большую растворимость в воде, чем MANS пептид, и имеет больший муцин-ингибирующий эффект у млекопитающего, чем MANS пептид, при введении в равных концентрациях.

Пептиды настоящего изобретения используют для уменьшения и/или ингибирования гиперсекреции муцина (т.е. уменьшения до нормального уровня или меньшего, чем нормальные уровни) при лечении заболеваний и при лечении симптомов заболеваний, в которых проявляется гиперсекреция муцина, так, как это видно в состояниях хронических заболеваний, таких как астма, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD) и хронический бронхит; в генетических заболеваниях, таких как кистозный фиброз; при аллергических состояниях (атопии, аллергическом воспалении); при бронхоэктазии; а также в ряде острых инфекционных респираторных заболеваний, таких как пневмония, ринит, грипп и простуда.

В следующем воплощении представлен пептид, который состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из: (а) аминокислотной последовательности, имеющей последовательность GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1); и (b) аминокислотной последовательности по существу идентичной последовательности, определенной в (а); в которой N-концевая аминокислота пептида не миристоилирована и C-концевая аминокислота пептида необязательно независимо химически модифицирована, причем пептид имеет эффект ингибирования гиперсекреции муцина при введении млекопитающему в количестве, которое ингибирует гиперсекрецию муцина. Этот пептид используют для лечения гиперсекреции муцина при легочных заболеваниях.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, предназначенным для различных целей, включающих ингибирование гиперсекреции муцина (т.е. ингибирование высвобождения муцина) и ингибирование продуцирования слизи (иногда обозначается здесь, как ингибирование секреции слизи) у млекопитающего. Однако, перед описанием дальнейших деталей этого изобретения, сначала будут определены следующие термины.

Определения

«Муцин-ингибирующий эффект», «муцин-ингибирующая активность» или «ингибирование секреции муцина» означает уменьшение количества секреции муцина (т.е. высвобождения муцина) и необязательно означает полное прекращение секреции муцина. Введение композиции, имеющей муцин-ингибирующий эффект, приводит к уменьшенной секреции муцина по сравнению с той, какая могла бы наблюдаться или могла бы ожидаться в отсутствие такой композиции. В одном аспекте количество уменьшения секреции муцина может составлять примерно от 5% количества, которое секретируется или гиперсекретируется выше нормальных уровней, до примерно 100% количества, которое секретируется или гиперсекретируется выше нормальных уровней секреции. В другом аспекте количество уменьшения секреции муцина может составлять примерно от 5% количества, которое секретируется или гиперсекретируется выше нормальных уровней (т.е. примерно от 5% количества, секретирующегося выше нормальных уровней), до количества, которое ниже нормального уровня секреции, такого как примерно 50% количества, секретируемого при нормальных уровнях секреции.

«Слизь-ингибирующий эффект», «слизь-ингибирующая активность» или «ингибирование продуцирования слизи» означает уменьшение количества продуцирования слизи и необязательно означает полное прекращение продуцирования слизи. Введение композиции, имеющей слизь-ингибирующий эффект, приводит к уменьшению количества продуцирования слизи по сравнению с тем, какое могло бы наблюдаться или могло бы ожидаться в отсутствие такой композиции.

«Муцин-ингибирующее количество» композиции это количество, которое уменьшает или ингибирует секрецию муцина (т.е. высвобождение муцина) по сравнению с той, какая могла бы наблюдаться или могла бы ожидаться в отсутствие такой композиции, такое количество, которое уменьшает секрецию муцина примерно от 5% до примерно 100% от количества муцина, которое гиперсекретируется выше нормальных уровней.

«Слизь-ингибирующее количество» композиции - это такое количество, которое уменьшает или ингибирует продуцирование слизи по сравнению с тем, какое могло бы наблюдаться в отсутствие такой композиции.

В эталонном пептиде GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1) в N-концевом положении эталонного пептида G находится в положении 1; A в положении 2 прилегает к G в положении 1; Q в положении 3 прилегает к A в положении 2; F в положении 4 прилегает к Q в положении 3; S в положении 5 прилегает к F в положении 4; K в положении 6 прилегает к S в положении 5; T в положении 7 прилегает к K в положении 6; A в положении 8 прилегает к T в положении 7; A в положении 9 прилегает к A в положении 8; K в положении 10 прилегает к A в положении 9; G в положении 11 прилегает к K в положении 10; E в положении 12 прилегает к G в положении 11; A в положении 13 прилегает к E в положении 12; A в положении 14 прилегает к A в положении 13; A в положении 15 прилегает к A в положении 14; E в положении 16 прилегает к A в положении 15; R в положении 17 прилегает к E в положении 16; P в положении 18 прилегает к R в положении 17; G в положении 19 прилегает к P в положении 18; E в положении 20 прилегает к G в положении 19; A в положении 21 прилегает к E в положении 20; A в положении 22 прилегает к A в положении 21; V в положении 23 прилегает к A в положении 22; A в положении 24 прилегает к V в положении 23, в котором положение 24 это C-концевое положение эталонного пептида.

«Вариант» эталонного пептида или вариант 4-23 аминокислотного сегмента эталонного пептида представляет собой пептид, который имеет аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности эталонного пептида или от аминокислотной последовательности сегмента эталонного пептида, соответственно, по меньшей мере в одном положении аминокислоты эталонного пептида или аминокислотной последовательности сегмента эталонного пептида, соответственно, но который сохраняет муцин- или слизь-ингибирующую активность, которая обычно варьируется между 0,1- и 10-кратной активностью эталонного пептида или сегмента, соответственно, предпочтительно между 0,2- и 6-кратной активностью эталонного пептида или сегмента, соответственно, более предпочтительно между 0,3- и 5-кратной активностью эталонного пептида или сегмента, соответственно. «Вариант» эталонной аминокислотной последовательности или вариант 4-23 аминокислотного сегмента эталонной аминокислотной последовательности представляет собой аминокислотную последовательность, которая отличается по меньшей мере одной аминокислотой от эталонной аминокислотной последовательности или от сегмента эталонной аминокислотной последовательности, соответственно, но имеет аминокислотную последовательность пептида, который сохраняет муцин- или слизь-ингибирующую активность пептида или сегмента, соответственно, кодируемого эталонной аминокислотной последовательностью, активность которого обычно варьируется между 0,1- и 10-кратной активностью пептида или сегмента эталонной последовательности, соответственно, предпочтительно между 0,2- и 6-кратной активностью пептида или сегмента эталонной последовательности, соответственно, более предпочтительно между 0,3- и 5-кратной активностью пептида или сегмента эталонной последовательности, соответственно. Вариант пептида с заменами аминокислот или вариант аминокислотной последовательности с заменами аминокислот может варьироваться (т.е. отличаться) от эталонного пептида или эталонной аминокислотной последовательности одной или более аминокислотными заменами в эталонной аминокислотной последовательности; делеционный вариант пептида или делеционный вариант аминокислотной последовательности может варьироваться (т.е. отличаться) от эталонного пептида или эталонной аминокислотной последовательности одной или более аминокислотными делециями в эталонной аминокислотной последовательности; и вариант пептида со вставками аминокислот или вариант аминокислотной последовательности со вставками аминокислот может варьироваться (т.е. отличаться) от эталонной последовательности пептида или эталонной аминокислотной последовательности одной или более аминокислотными вставками в эталонную последовательность. Вариант пептида или вариант аминокислотной последовательности может получиться путем замены одной или более аминокислот (например, заменой, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот) в эталонной последовательности, или может получиться путем делеции одной или более аминокислот (например, делеции, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот) в эталонной последовательности, или может получиться путем вставки одной или более аминокислот (например, вставки, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот) в эталонную последовательность, или путем их комбинации в любом порядке. Вариант 4-23 аминокислотного пептидного сегмента с заменами аминокислот или вариант 4-23 аминокислотной последовательности сегмента с заменами аминокислот может варьироваться (т.е. отличаться) от эталонного 4-23 аминокислотного пептидного сегмента или от эталонной 4-23 аминокислотной последовательности сегмента одной или более аминокислотными заменами в эталонной аминокислотной последовательности сегмента; делеционный вариант 4-23 аминокислотного пептидного сегмента или 4-22 аминокислотный делеционный вариант аминокислотной последовательности сегмента может варьироваться (т.е. отличаться) от 5-23 аминокислотного эталонного пептидного сегмента или 5-23 аминокислотной эталонной последовательности сегмента одной или более аминокислотными делециями в эталонной аминокислотной последовательности сегмента; и 4-23 аминокислотный вариант пептида со вставками аминокислот или 4-23 аминокислотный вариант аминокислотной последовательности со вставками аминокислот может варьироваться (т.е. отличаться) от 4-22 аминокислотной эталонной последовательности пептида или 4-22 аминокислотной эталонной аминокислотной последовательности одной или более аминокислотными вставками в эталонную последовательность. 4-23 аминокислотный вариант пептида или 4-23 аминокислотный вариант аминокислотной последовательности может получиться путем замены одной или более аминокислот (например, заменой, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот) в 4-23 аминокислотном сегменте эталонной аминокислотной последовательности, или может получиться путем делеции одной или более аминокислот (например, делецией, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот), соответственно, в большей эталонной аминокислотной последовательности, или может получиться путем вставки одной или более аминокислот (например, вставкой, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот), соответственно, в меньшую эталонную последовательность или путем их комбинации. Предпочтительно вариант пептида или аминокислотной последовательности отличается от эталонного пептида или от сегмента эталонного пептида, или от эталонной аминокислотной последовательности, или от сегмента эталонной аминокислотной последовательности, соответственно, менее чем на 10 аминокислотных замен, делеций и/или вставок; более предпочтительно менее чем на 8 аминокислотных замен, делеций и/или вставок; даже еще более предпочтительно менее чем на 6 аминокислотных замен, делеций и/или вставок; и даже еще более предпочтительно менее чем на 5 аминокислотных замен, делеций и/или вставок; и даже еще более предпочтительно менее чем на 4 аминокислотных замены, делеции и/или вставки. Наиболее предпочтительно вариант аминокислотной последовательности отличается от эталонного пептида или сегмента аминокислотной последовательности одной или двумя, или тремя аминокислотами.

«Идентичность последовательности» по отношению к аминокислотным последовательностям двух пептидов означает количество положений с идентичными аминокислотами, деленное на количество аминокислот в более короткой из двух последовательностей.

«По существу идентичный» по отношению к сравнению аминокислотных последовательностей двух пептидов или сравнению аминокислотных последовательностей двух пептидных сегментов (например, сегментов эталонной пептидной аминокислотной последовательности) означает, что аминокислотная последовательность пептидов или сегментов пептидов имеет по меньшей мере 75% идентичности последовательности, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичности последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности последовательности и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности последовательности.

Термин «пептид», использованный здесь, включает пептид, а также фармацевтически приемлемые соли пептида.

«Выделенный» пептид, использованный здесь, означает природный пептид, который отделили или по существу отделили от клеточных компонентов (например, нуклеиновых кислот и других пептидов), которые естественно сопровождают его, путем очистки, рекомбинантным синтезом или химическим синтезом, а также охватывает не природные рекомбинантно или химически синтезированные пептиды, которые были очищены или по существу очищены от клеточных компонентов, биологических материалов, химических предшественников и других химических веществ.

Следующие трехбуквенные и однобуквенные сокращения аминокислот использованы по всему тексту: Аланин: (Ala) A; Аргинин: (Arg) R, Аспарагин: (Asn) N, Аспарагиновая кислота: (Asp) D, Цистеин: (Cys) C, Глутамин: (Gln) Q, Глутаминовая кислота: (Glu) E, Глицин: (Gly) G, Гистидин: (His) H, Изолейцин: (Ile) I, Лейцин: (Leu) L, Лизин: (Lys) K, Метионин: (Met) M, Фенилаланин: (Phe) F, Пролин: (Pro) P, Серин: (Ser) S, Треонин: (Thr) T, Триптофан: (Trp) W, Тирозин: (Tyr) Y, Валин: (Val) V. Дополнительные трехбуквенные символы аминокислот, применяемые здесь, включают в скобках (Hyp) для гидроксипролина, (Nle) для норлейцина, (Orn) для орнитина, (Pyr) для пироглутаминовой кислоты и (Sar) для саркозина. Условно амино (или N-концевой) конец пептида находится на левом конце написанной аминокислотной последовательности пептида и карбоксильный (или C-концевой) конец находится на правом конце написанной аминокислотной последовательности. Аминокислотная последовательность пептида может быть написана однобуквенными символами, чтобы представить аминокислоты, которые ковалентно связаны в пептиде пептидными амидными связями.

Таблица IХ содержит список аминокислотных последовательностей в формате однобуквенных сокращений соответственно вместе с соответствующим пептидным номером и SEQ ID NO. Эталонная аминокислотная последовательность пептида внесена в список как пептид 1. Аминокислотные последовательности пептидов изобретения, имеющие аминокислотную последовательность от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот из эталонной аминокислотной последовательности, внесены в список как пептиды 2-231 вместе с аминокислотной последовательностью случайной N-концевой последовательности (RNS), включающей аминокислоты MANS пептида, обозначенной как пептид 232. Аминокислотные последовательности иллюстративных вариантов аминокислотных последовательностей пептидов изобретения, как описано здесь, также внесены в список как пептиды 233-245 и 247-251. Подразумевается, что эти внесенные в список варианты пептидов не являются лимитирующей группой пептидов, а представлены только, чтобы служить в качестве иллюстративных примеров вариантов пептидов изобретения. Также представлены иллюстративная обратная аминокислотная последовательность и иллюстративная случайная аминокислотная последовательность пептида по изобретению. Подразумевается, что представленные в таблице обратные и случайные аминокислотные последовательности не являются иллюстративными согласно изобретению.

Аминокислотная последовательность пептида, внесенного в список Таблицы IX, может быть химически модифицирована. Например, если аминокислотную последовательность пептида, внесенного в список Таблицы IX, химически модифицируют по N-концевой аминогруппе с образованием амида карбоновой кислоты, то полученный пептид иногда обозначают здесь комбинацией идентификатора карбоновой кислоты, представленного приставкой, которая связана дефисом с пептидным номером. Например, в отношении пептида 79 в качестве примера, N-концевой миристоилированный пептид 79 могут иногда здесь обозначать как «миристоилированный пептид 79» или «myr-пептид 79», N-концевой ацетилированный пептид 79 могут иногда здесь обозначать как «ацетил-пептид 79» или «Ac-пептид 79». Циклический вариант пептида 79 может быть обозначен как «циклический пептид 79» или «cyc-пептид 79». Также, например, если аминокислотную последовательность пептида, внесенного в список Таблицы IX, химически модифицируют по C-концевой карбоксильной группе, например, с помощью амина, такого как аммиак, с образованием C-концевого амида, то полученный пептид иногда обозначают здесь комбинацией идентификатора остатка амина, представленного суффиксом, который связан дефисом с номером пептида. Таким образом, например, C-концевой амид пептида 79 могут иногда обозначать как «пептид-NH₂». Когда N-концевую аминогруппу пептида (например, пептида 79) химически модифицируют, например, миристоильной группой, а также C-концевую карбоксильную группу химически модифицируют, например, аммонийной группой, с образованием амида, как описано выше, то полученный пептид могут иногда обозначать, используя условные обозначения и приставки, и суффикса, как например «myr-пептид 79-NH₂».

Изобретение включает пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, включающие менее чем 24 аминокислоты с аминокислотными последовательностями, родственными аминокислотной последовательности MANS пептида (т.е. MANS пептид представляет собой миристоил-ПЕПТИД 1 и эталонная 24-аминокислотная последовательность MANS пептида представляет собой ПЕПТИД 1). Пептиды данного изобретения состоят из аминокислотных последовательностей, содержащих менее чем 24 аминокислоты, и могут состоять из: 8-14, 10-12, 9-14, 9-13, 10-13, 10-14, по меньшей мере, из 9, по меньшей мере, из 10, или из подобного количества аминокислот. Пептиды обычно представляют собой неразветвленные цепи, но также могут быть и циклическими пептидами. Кроме того, пептиды могут быть выделенными пептидами.

В отношении ПЕПТИДА 1, эталонной 24 аминокислотной последовательности, сегмент из 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной аминокислотной последовательности иногда обозначают здесь как 23-мер. Аналогично, сегмент из 22 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности иногда обозначают здесь как 22-мер; последовательность из 21 аминокислоты как 21-мер; последовательность из 20 аминокислот как 20-мер; последовательность из 19 аминокислот как 19-мер; последовательность из 18 аминокислот как 18-мер; последовательность из 17 аминокислот как 17-мер; последовательность из 16 аминокислот как 16-мер; последовательность из 15 аминокислот как 15-мер; последовательность из 14 аминокислот как 14-мер; последовательность из 13 аминокислот как 13-мер; последовательность из 12 аминокислот как 12-мер; последовательность из 11 аминокислот как 11-мер; последовательность из 10 аминокислот как 10-мер; последовательность из 9 аминокислот как 9-мер; последовательность из 8 аминокислот как 8-мер; последовательность из 7 аминокислот как 7-мер; последовательность из 6 аминокислот как 6-мер; последовательность из 5 аминокислот как 5-мер; и последовательность из 4 аминокислот как 4-мер. В одном аспекте любая из этих аминокислотных последовательностей, обозначенных «4-мер-23-мер», которые сами являются пептидами (иногда отмечены здесь как H₂N-пептид-COOH), может быть независимо химически модифицирована, например, химической модификацией, причем химическая модификация может быть выбрана из группы, состоящей из: (i) образования амида на N-концевой аминогруппе (H₂N-пептид-), такого как, например, с С1 или предпочтительно с С2 (уксусной кислотой) и до С22 карбоновой кислотой; (ii) образования амида на С-концевой карбоксильной группе (-пептид-СООН), такого как, например, с аммиаком или с С1-С22 первичным или вторичным амином; и (iii) их комбинации.

Пептиды имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности ПЕПТИД 1; (b) последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (a); и (c) варианта аминокислотной последовательности, определенной в (a), причем вариант выбран из группы, состоящей из варианта с заменами аминокислот, делеционного варианта, варианта со вставками аминокислот и их комбинации. В некоторых воплощениях пептиды имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 8 до 14 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности ПЕПТИД 1; (b) аминокислотной последовательности, по существу идентичной последовательности, определенной в (a); и (c) варианта аминокислотной последовательности, определенной в (a), причем вариант выбран из группы, состоящей из варианта с заменами аминокислот, делеционного варианта, варианта со вставками аминокислот и их комбинации. В еще одном воплощении пептиды имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 10 до 12 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности ПЕПТИД 1; (b) аминокислотной последовательности, по существу идентичной последовательности, определенной в (a); и (c) варианта аминокислотной последовательности, определенной в (a), причем вариант выбран из группы, состоящей из варианта с заменами аминокислот, делеционного варианта, варианта со вставками аминокислот и их комбинации. В дальнейших воплощениях пептиды имеют аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, 9-14, 9-13, 10-13, 10-14 или подобное количество последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности ПЕПТИД 1; аминокислотную последовательность, по существу им идентичную; или их вариант, причем вариант выбран из группы, состоящей из варианта с заменами аминокислот, делеционного варианта, варианта со вставками аминокислот и их комбинации. Как объяснено в дальнейшем ниже, одна или более аминокислот пептидов (например, N-концевые и/или C-концевые аминокислоты) могут быть необязательно независимо химически модифицированы; в некоторых воплощениях одна или более аминокислот пептида будут химически модифицированы, тогда как в других воплощениях ни одна из аминокислот пептида не будет химически модифицирована. В одном аспекте предпочтительная модификация может встречаться в амино (H₂N-) группе N-концевой аминокислоты пептида или пептидного сегмента (причем аминогруппа образует пептидную амидную связь, если присутствует внутри пептидной последовательности, а не в N-концевом положении). В другом аспекте предпочтительная модификация может встречаться в карбоксильной (-COOH) группе C-концевой аминокислоты пептида или пептидного сегмента (причем карбоксильная группа образует пептидную амидную связь, если присутствует внутри пептидной последовательности, а не в С-концевом положении). В другом аспекте предпочтительная модификация может встречаться как в N-концевой амино (H₂N-) группе, так и в С-концевой карбоксильной (-COOH) группе.

В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность пептида начинается с N-концевой аминокислоты эталонной последовательности ПЕПТИД 1. Например, пептиды могут иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности ПЕПТИД 1, которая начинается с N-концевой аминокислоты эталонной последовательности (т.е. ПЕПТИД 2, ПЕПТИД 4, ПЕПТИД 7, ПЕПТИД 11, ПЕПТИД 16, ПЕПТИД 22, ПЕПТИД 29, ПЕПТИД 37, ПЕПТИД 46, ПЕПТИД 56, ПЕПТИД 67, ПЕПТИД 79, ПЕПТИД 92, ПЕПТИД 106, ПЕПТИД 121, ПЕПТИД 137, ПЕПТИД 154, ПЕПТИД 172, ПЕПТИД 191 или ПЕПТИД 211); (b) аминокислотной последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (a); и (c) варианта аминокислотной последовательности, определенной в (a).

В других воплощениях аминокислотная последовательность пептида заканчивается С-концевой аминокислотой эталонной последовательности ПЕПТИД 1. Например, пептиды могут иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности ПЕПТИД 1, которая заканчивается С-концевой аминокислотой эталонной последовательности (т.е. ПЕПТИД 3, ПЕПТИД 6, ПЕПТИД 10, ПЕПТИД 15, ПЕПТИД 21, ПЕПТИД 28, ПЕПТИД 36, ПЕПТИД 45, ПЕПТИД 55, ПЕПТИД 66, ПЕПТИД 78, ПЕПТИД 91, ПЕПТИД 105, ПЕПТИД 120, ПЕПТИД 136, ПЕПТИД 153, ПЕПТИД 171, ПЕПТИД 190, ПЕПТИД 210 и ПЕПТИД 231); (b) аминокислотной последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (a); и (c) варианта аминокислотной последовательности, определенной в (a).

В других воплощениях аминокислотная последовательность пептида не начинается с N-концевой аминокислоты эталонной последовательности ПЕПТИД 1, а чаще начинается с аминокислоты в положении 2 и до аминокислоты в положении 21 эталонной последовательности ПЕПТИД 1. Например, пептиды могут иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности ПЕПТИД 1, которая начинается с любой из аминокислот между положениями 2 и 21 эталонной последовательности. Эти пептиды могут быть длиной от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот и могут представлять пептиды в середине эталонной последовательности ПЕПТИД 1; (b) аминокислотной последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (a); и (c) варианта аминокислотной последовательности, определенной в (a). Эти пептиды раскрыты в Таблице IX.

Пептидные аминокислотные последовательности, которые используют в данном изобретении, чтобы ингибировать гиперсекрецию муцина у млекопитающего, и которые используют, чтобы уменьшить количество гиперсекреции муцина у млекопитающего, и которые используют в способах ингибирования гиперсекреции муцина и в способах уменьшения гиперсекреции муцина, включают аминокислотные последовательности выделенных пептидов и аминокислотные последовательности пептидов данного изобретения, которые необязательно содержат N-концевые и/или C-концевые химически модифицированные группы, причем пептидные аминокислотные последовательности выбраны из группы, состоящей из 23-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 23 аминокислот): ПЕПТИД 2; и ПЕПТИД 3; 22-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 22 аминокислот): ПЕПТИД 4; ПЕПТИД 5; и ПЕПТИД 6; 21-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 21 аминокислоты): ПЕПТИД 7; ПЕПТИД 8; ПЕПТИД 9; и ПЕПТИД 10; 20-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 20 аминокислот): ПЕПТИД 11; ПЕПТИД 12; ПЕПТИД 13; ПЕПТИД 14; и ПЕПТИД 15; 19-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 19 аминокислот): ПЕПТИД 16; ПЕПТИД 17; ПЕПТИД 18; ПЕПТИД 19; ПЕПТИД 20; и ПЕПТИД 21; 18-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 18 аминокислот): ПЕПТИД 22; ПЕПТИД 23; пептид 25; пептид 26; пептид 27; и пептид 28; 17-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 17 аминокислот): пептид 29; пептид 30; пептид 31; пептид 32; пептид 33; пептид 34; пептид 35; и пептид 36; 16-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 16 аминокислот): пептид 37; пептид 38; пептид 39; пептид 40; пептид 41; пептид 42; пептид 43; пептид 44; и пептид 45; 15-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 15 аминокислот): пептид 46; пептид 47; пептид 48; пептид 49; пептид 50; пептид 51; пептид 52; пептид 53; пептид 54; и пептид 55; 14-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 14 аминокислот): пептид 56; пептид 57; пептид 58; пептид 59; пептид 60; пептид 61; пептид 62; пептид 63; пептид 64; пептид 65; и пептид 66; 13-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 13 аминокислот): пептид 67; пептид 68; пептид 69; пептид 70; пептид 71; пептид 72; пептид 73; пептид 74; пептид 75; пептид 76; пептид 77; и пептид 78; 12-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 12 аминокислот): пептид 79; пептид 80; пептид 81; пептид 82; пептид 83; пептид 84; пептид 85; пептид 86; пептид 87; пептид 88; пептид 89; пептид 90; и пептид 91; 11-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 11 аминокислот): пептид 92; пептид 93; пептид 94; пептид 95; пептид 96; пептид 97; пептид 98; пептид 99; пептид 100; пептид 101; пептид 102; пептид 103; пептид 104; и пептид 105; 10-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 10 аминокислот): пептид 106; пептид 107; пептид 108; пептид 109; пептид 110; пептид 111; пептид 112; пептид 113; пептид 114; пептид 115; пептид 116; пептид 117; пептид 118; пептид 119; и пептид 120; 9-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 9 аминокислот): пептид 121; пептид 122; пептид 123; пептид 124; пептид 125; пептид 126; пептид 127; пептид 128; пептид 129; пептид 130; пептид 131; пептид 132; пептид 133; пептид 134; пептид 135; и пептид 136; 8-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 8 аминокислот): пептид 137; пептид 138; пептид 139; пептид 140; пептид 141; пептид 142; пептид 143; пептид 144; пептид 145; пептид 146; пептид 147; пептид 148; пептид 149; пептид 150; пептид 151; пептид 152; и пептид 153; 7-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 7 аминокислот): пептид 154; пептид 155; пептид 156; пептид 157; пептид 158; пептид 159; пептид 160; пептид 161; пептид 162; пептид 163; пептид 164; пептид 165; пептид 166; пептид 167; пептид 168; пептид 169; пептид 170; и пептид 171; 6-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 6 аминокислот): пептид 172; пептид 173; пептид 174; пептид 175;

пептид 176; пептид 177; пептид 178; пептид 179; пептид 180; пептид 181; пептид 182; пептид 183; пептид 184; пептид 185; пептид 186; пептид 187; пептид 188; пептид 189; и пептид 190; 5-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 5 аминокислот): пептид 191; пептид 192; пептид 193; пептид 194; пептид 195; пептид 196; пептид 197; пептид 198; пептид 199; пептид 200; пептид 201; пептид 202; пептид 203; пептид 204; пептид 205; пептид 206; пептид 207; пептид 208; пептид 209; и пептид 210; и 4-меров (т.е. пептидов, имеющих последовательность из 4 аминокислот): пептид 211; пептид 212; пептид 213; пептид 214; пептид 215; пептид 216; пептид 217; пептид 218; пептид 219; пептид 220; пептид 221; пептид 222; пептид 223; пептид 224; пептид 225; пептид 226; пептид 227; пептид 228; пептид 229; пептид 230; и пептид 231.

Предпочтительные аминокислотные последовательности выделенных пептидов и химически модифицированных по N-концевой и/или C-концевой группе пептидов данного изобретения выбраны из группы, состоящей из 23-меров: ПЕПТИД 2; и ПЕПТИД 3; 22-меров: ПЕПТИД 4; ПЕПТИД 5; и ПЕПТИД 6; 21-меров: ПЕПТИД 7; ПЕПТИД 8; ПЕПТИД 9; и ПЕПТИД 10; 20-меров: ПЕПТИД 11; ПЕПТИД 12; ПЕПТИД 13; ПЕПТИД 14; и ПЕПТИД 15; 19-меров: ПЕПТИД 16; ПЕПТИД 17; ПЕПТИД 18; ПЕПТИД 19; ПЕПТИД 20; и ПЕПТИД 21; 18-меров: ПЕПТИД 22; ПЕПТИД 23; пептид 24; пептид 25; пептид 26; пептид 27; и пептид 28; 17-меров: пептид 29; пептид 30; пептид 31; пептид 32; пептид 33; пептид 34; пептид 35; и пептид 36; 16-меров: пептид 37; пептид 38; пептид 39; пептид 40; пептид 41; пептид 42; пептид 43; пептид 44; и пептид 45; 15-меров: пептид 46; пептид 47; пептид 48; пептид 49; пептид 50; пептид 51; пептид 52; пептид 53; и пептид 54; 14-меров: пептид 56; пептид 57; пептид 58; пептид 59; пептид 60; пептид 61; пептид 62; пептид 63; и пептид 64; 13-меров: пептид 67; пептид 68; пептид 69; пептид 70; пептид 71; пептид 72; пептид 73; пептид 74; и пептид 75; 12-меров: пептид 79; пептид 80; пептид 81; пептид 82; пептид 83; пептид 84; пептид 85; пептид 86; и пептид 87; 11-меров: пептид 92; пептид 93; пептид 94; пептид 95; пептид 96; пептид 97; пептид 98; пептид 99; и пептид 100; 10-меров: пептид 106; пептид 107; пептид 108; пептид 109; пептид 110; пептид 111; пептид 112; пептид 113; и пептид 114; 9-меров: пептид 122; пептид 123; пептид 124; пептид 125; пептид 126; пептид 127; пептид 128; и пептид 129; 8-меров: пептид 139; пептид 140; пептид 141; пептид 142; пептид 143; пептид 144; и пептид 145; 7-меров: пептид 157; пептид 158; пептид 159; пептид 160; пептид 161; и пептид 162; 6-меров: пептид 176; пептид 177; пептид 178; пептид 179; и пептид 180; 5-меров: пептид 196; пептид 197; пептид 198; и пептид 199; и 4-меров: пептид 217; и пептид 219.

Более предпочтительные аминокислотные последовательности выделенных пептидов и химически модифицированных по N-концевой и/или C-концевой группе пептидов данного изобретения выбраны из группы, состоящей из 23-меров: пептид 2; и пептид 3; 22-меров: пептид 4; пептид 5; и пептид 6; 21-меров: пептид 7; пептид 8; пептид 9; и пептид 10; 20-меров: пептид 11; пептид 12; пептид 13; пептид 14; и пептид 15; 19-меров: пептид 16; пептид 17; пептид 18; пептид 19; пептид 20; и пептид 21; 18-меров: пептид 22; пептид 23; пептид 24; пептид 25; пептид 26; пептид 27; и пептид 28; 17-меров: пептид 29; пептид 30; пептид 31; пептид 32; пептид 33; пептид 34; пептид 35; и пептид 36; 16-меров: пептид 37; пептид 38; пептид 39; пептид 40; пептид 41; пептид 42; пептид 43; пептид 44; и пептид 45; 15-меров: пептид 46; пептид 47; пептид 48; пептид 49; пептид 50; пептид 51; пептид 52; пептид 53; и пептид 54; 14-меров: пептид 56; пептид 57; пептид 58; пептид 59; пептид 60; пептид 61; пептид 62; пептид 63; и пептид 64; 13-меров: пептид 67; пептид 68; пептид 69; пептид 70; пептид 71; пептид 72; пептид 73; пептид 74; пептид 80; пептид 81; пептид 82; пептид 83; пептид 84; пептид 85; пептид 86; и пептид 87; 11-меров: пептид 92; пептид 93; пептид 94; пептид 95; пептид 96; пептид 97; пептид 98; пептид 99; и пептид 100; 10-меров: пептид 106; пептид 108; пептид 109; пептид 110; пептид 111; пептид 112; пептид 113; и пептид 114; 9-меров: пептид 124; пептид 125; пептид 126; пептид 127; пептид 128; и пептид 129; 8-меров: пептид 141; пептид 142; пептид 143; пептид 144; и пептид 145; 7-меров: пептид 159; пептид 160; пептид 161; и пептид 162; 6-меров: пептид 178; пептид 179; и пептид 180; 5-меров: пептид 198; и пептид 199; и 4-мера: пептид 219.

Еще в других воплощениях аминокислотная последовательность пептида включает последовательно расположенные остатки A, K, G и E как в пептиде 219 эталонной последовательности ПЕПТИД 1. Например, пептиды могут иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности ПЕПТИД 1, которая включает последовательно расположенные остатки A, K, G и E как в пептиде 219 эталонной последовательности ПЕПТИД 1 (например, ПЕПТИД 219, ПЕПТИД 45, ПЕПТИД 79, ПЕПТИД 67, ПЕПТИД 80 и т.д.); (b) аминокислотной последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (a); и (c) варианта аминокислотной последовательности, определенной в (a).

Примеры пептидных сегментов, которые содержат аминокислотную последовательность AKGE эталонного пептида аминокислотной последовательности ПЕПТИД 1, включают (a) 23-меры: пептид 2; и пептид 3; 22-меры: пептид 4; пептид 5; и пептид 6; 11-меры: пептид 7; пептид 8; пептид 9; и пептид 10; 20-меры: пептид 11; пептид 12; пептид 13; пептид 14; и пептид 15; 19-меры: пептид 16; пептид 17; пептид 18; пептид 19; пептид 20; и пептид 21; 18-меры: пептид 22; пептид 23; пептид 24; пептид 25; пептид 26; пептид 27; и пептид 28; 17-меры: пептид 29; пептид 30; пептид 31; пептид 32; пептид 33; пептид 34; пептид 35; и пептид 36; 16-меры: пептид 37; пептид 38; пептид 39; пептид 40; пептид 41; пептид 42; пептид 43; пептид 44; и пептид 45; 15-меры: пептид 46; пептид 47; пептид 48; пептид 49; пептид 50; пептид 51; пептид 52; пептид 53; и пептид 54; 14-меры: пептид 56; пептид 57; пептид 58; пептид 59; пептид 60; пептид 61; пептид 62; пептид 63; и пептид 64; 13-меры: пептид 67; пептид 68; пептид 69; пептид 70; пептид 71; пептид 72; пептид 73; пептид 74; и пептид 75; 12-меры: пептид 79; пептид 80; пептид 81; пептид 82; пептид 83; пептид 84; пептид 85; пептид 86; и пептид 87; 11-меры: пептид 93; пептид 94; пептид 95; пептид 96; пептид 97; пептид 98; пептид 99; и пептид 100; 10-меры: пептид 108; пептид 109; пептид 110; пептид 111; пептид 112; пептид 113; и пептид 114; 9-меры: пептид 124; пептид 125; пептид 126; пептид 127; пептид 128; и пептид 129; 8-меры: пептид 141; пептид 142; пептид 143; пептид 144; и пептид 145; 7-меры: пептид 159; пептид 160; пептид 161; и пептид 162; 6-меры: пептид 178; пептид 179; и пептид 180; 5-меры: пептид 198; и пептид 199; и 4-мер: пептид 219, (b) последовательность, по существу подобную аминокислотной последовательности, определенной в (a); и (c) вариант аминокислотной последовательности, определенной в (a), причем вариант выбран из группы, состоящей из варианта с заменами аминокислот, делеционного варианта, варианта со вставками аминокислот и их комбинации, где сегмент включает или состоит из 4-23 последовательно расположенных аминокислот.

В другом воплощении предпочтительная пептидная последовательность имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 10 до 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности пептид 1; (b) последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (a); и (c) варианта аминокислотной последовательности, определенной в (a), причем вариант выбран из группы, состоящей из варианта с заменами аминокислот, делеционного варианта, варианта со вставками аминокислот и их комбинации, где предпочтительные аминокислотные последовательности включают 23-мер: пептид 2; 22-мер: пептид 4; 21-мер: пептид 7; 20-мер: пептид 11; 19-мер: пептид 16; 18-мер: пептид 22; 17-мер: пептид 29; 16-мер: пептид 37; 15-мер: пептид 46; 14-мер: пептид 56; 13-мер: пептид 67; 12-мер: пептид 79; 11-мер: пептид 92; и 10-мер: пептид 106.

В дальнейших воплощениях аминокислотная последовательность пептида начинается с N-концевой аминокислоты эталонной последовательности ПЕПТИД 1 и включает последовательно расположенные остатки A, K, G и E как в пептиде 219 эталонной последовательности ПЕПТИД 1, тогда как в других воплощениях аминокислотная последовательность пептида заканчивается С-концевой аминокислотой эталонной последовательности ПЕПТИД 1 и включает последовательно расположенные остатки A, K, G и E как в пептиде 219 эталонной последовательности ПЕПТИД 1.

Пептиды могут включать одну и более аминокислотных делеций, замен и/или вставок по отношению к эталонной аминокислотной последовательности. Предпочтительно, замены могут быть консервативными аминокислотными заменами или замены могут быть не консервативными аминокислотными заменами. В некоторых воплощениях пептиды, включающие пептиды с аминокислотными последовательностями, которые по существу идентичны эталонной аминокислотной последовательности или являются ее вариантами, не будут иметь делеций или вставок по сравнению с соответствующими последовательно расположенными аминокислотами эталонной аминокислотной последовательности, но при этом могут иметь консервативные или не консервативные замены. Аминокислотные замены, которые могут быть сделаны в эталонной аминокислотной последовательности пептидов изобретения, включают, но не ограничиваются ими, следующие замены: аланин (A) может быть заменен лизином (K), валином (V), лейцином (L) или изолейцином (I); глутаминовая кислота (E) может быть заменена аспарагиновой кислотой (D); глицин (G) может быть заменен пролином (P); лизин (K) может быть заменен аргинином (R), глутамином (Q) или аспаргином (N); фенилаланин (F) может быть заменен лейцином (L), валином (V), изолейцином (I) или аланином (A); пролин (P) может быть заменен глицином (G); глутамин (Q) может быть заменен глутаминовой кислотой (E) или аспарагином (N); аргинин (R) может быть заменен лизином (K), глутамином (Q) или аспарагином (N); серин (S) может быть заменен треонином (T); треонин (T) может быть заменен серином (S); валин (V) может быть заменен лейцином (L), изолейцином (I), метионином (M), фенилаланином (F), аланином (A) или норлейцином (Nle). Например, замены, которые могут быть произведены в эталонной аминокислотной последовательности пептидов изобретения, включают замену фенилаланина (F) на аланин (А) (например, аминокислота в положении 4 эталонной аминокислотной последовательности), замену глутамина (Q) на глутаминовую кислоту (E) (например, аминокислота в положении 3 эталонной аминокислотной последовательности), замену аланина (А) на лизин (К) (например, аминокислота в положении 2 и/или 8 эталонной аминокислотной последовательности), и/или замену треонина (T) на серин (S) (например, аминокислота в положении 7 эталонной аминокислотной последовательности).

Когда замены включают в аминокислотные последовательности пептидов изобретения (причем пептиды включают как не модифицированные, так и химически модифицированные пептиды, например, с помощью N-концевой и/или C-концевой модификации, такой как образование амида), по отношению к эталонной аминокислотной последовательности предпочтительно, по меньшей мере 80% идентичности последовательности между аминокислотной последовательностью пептида и эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 5 до 23 аминокислот и включающие одну аминокислотную замену по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, будут иметь от примерно 80% до примерно 96% (т.е. ~95,7%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 10 до 23 аминокислот и включающие одну аминокислотную замену по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, будут иметь от примерно 90% до примерно 96% (т.е. ~95,7%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 20 до 23 аминокислот и включающие одну аминокислотную замену по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, будут иметь от примерно 95% до примерно 96% (т.е. ~95,7%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 10 до 23 аминокислот и включающие две аминокислотных замены по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, будут иметь от примерно 80% до примерно 92% (т.е. ~91,3%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 16 до 23 аминокислот и включающие две аминокислотных замены по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, будут иметь от примерно 87,5% до примерно 92% (т.е. ~91,3%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 20 до 23 аминокислот и включающие две аминокислотных замены по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, будут иметь от примерно 90% до примерно 92% (т.е. ~91,3%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 15 до 23 аминокислот и включающие три аминокислотных замены по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, будут иметь от примерно 80% до примерно 87% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 20 до 23 аминокислот и включающие три аминокислотных замены по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, будут иметь от примерно 85% до примерно 87% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 20 до 23 аминокислот и включающие четыре аминокислотных замены по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, будут иметь от примерно 80% до примерно 83% (т.е. ~82,6%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью.

В пептидах данного изобретения по отношению к последовательно расположенным аминокислотам последовательности эталонного пептида (который является 24-мером) заменой одной аминокислоты в последовательности из 23 последовательно расположенных аминокислот (23-мер), выбранных из эталонной последовательности из 24 аминокислот, получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 95,65% (или ~96%) идентичности последовательности с аминокислотным сегментом в эталонном пептиде, с которым 23-мер имеет идентичность. Аналогично, заменой двух, трех, четырех и пяти аминокислот в указанном 23-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 91,30% (или ~91%), 86,96% (или ~87%), 82,61% (или ~83%) и 78,27% (или ~78%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух, трех, четырех и пяти аминокислот в 22-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 95,45% (или ~95%), 90,91% (или ~91%), 86,36% (или ~86%), 81,82% (или ~82%) и 77,27% (или ~77%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух, трех, четырех и пяти аминокислот в 21-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 95,24% (~95%), 90,48% (~91%), 85,71% (~86%), 80,95 (~81%) и 76,19% (~76%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух, трех, четырех и пяти аминокислот в 20-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 95,00% (95%), 90,00% (90%), 85,00% (85%), 80,00% (80%) и 75,00% (75%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух, трех и четырех аминокислот в 19-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 94,74% (~95%), 89,47% (~89%), 84,21% (~84%) и 78,95% (~78%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух, трех и четырех аминокислот в 18-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 94,44% (~94%), 88,89% (~89%), 83,33% (~83%) и 77,78% (~79%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух, трех и четырех аминокислот в 17-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 94,12% (~94%), 88,23% (~88%), 82,35% (~82%) и 76,47% (~76%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух, трех и четырех аминокислот в 16-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 93,75% (~94%), 87,50% (~88%), 81,25% (~81%) и 75,00% (75%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух и трех аминокислот в 15-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 93,33% (~93%), 86,67% (~87%) и 80,00% (80%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух и трех аминокислот в 14-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 92,86% (~93%), 85,71% (~86%) и 78,57% (79%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух и трех аминокислот в 13-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 92,31% (~92%), 84,62% (~85%) и 76,92% (~77%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной, двух и трех аминокислот в 12-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 91,67% (~92%), 83,33% (~83%) и 75,00% (75%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной и двух аминокислот в 11-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 90,91% (~91%) и 81,82% (~82%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной и двух аминокислот в 10-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 90,00% (90%) и 80,00% (80%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной и двух аминокислот в 9-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 88,89% (~89%) и 77,78% (~78%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной и двух аминокислот в 8-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 87,50% (~88%) и 75,00% (75%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Аналогично, заменой одной аминокислоты в 7-мере, 6-мере, 5-мере и 4-мере получают пептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет 85,71% (~86%), 83,33% (~83%), 80,00% (80%) и 75,00% (75%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного пептида, соответственно. Предпочтительные аминокислотные последовательности этого изобретения имеют больше чем 80% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонной последовательности, более предпочтительно, если идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью эталонной последовательности составит 81%-96%, и более предпочтительно, если идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью эталонной последовательности составит 80%-96%. Предпочтительные аминокислотные последовательности необязательно могут быть химически связаны по N-концевой аминогруппе пептида амидной связью с компонентом линейной С₂-С₂₂ алифатической карбоновой кислоты, более предпочтительно с компонентом линейной С₂-С₁₆ алифатической карбоновой кислоты, наиболее предпочтительно с компонентом линейной С₂ или С₁₆ алифатической карбоновой кислоты и необязательно химически связаны по С-концевой карбоксильной группе пептида амидной связью с аминогруппой, такой как аммиак или первичная или вторичная аминогруппа, такая как линейная С₁-С₁₆ алифатическая первичная аминогруппа.

Примеры вариантов пептида с заменой аминокислот 79, 12-мера, включают, например пептид 238, где Q в положении 3 пептида 79 заменили на E в последовательности 238; пептид 233, где A в положении 2 пептида 79 заменили на K в пептиде 233; пептид 234, где A в положении 8 пептида 79 заменили на K в пептиде 234; пептид 235, где A в положениях 2 и 8 пептида 79 заменили на K в пептиде 235; пептид 237, где F в положении 4 пептида 79 заменили на A в пептиде 237; пептид 239, где K в положении 10 пептида 79 заменили на A в пептиде 239; пептид 240, где G в положении 11 пептида 79 заменили на A в пептиде 240; и пептид 241, где E в положении 12 пептида 79 заменили на A в пептиде 241.

Примеры вариантов пептида 106 с заменой аминокислот, 10-мера, включают, например пептид 236, где F в положении 4 пептида 106 заменили на A в пептиде 236; пептид 242, где G в положении 1 пептида 106 заменили на A в пептиде 242; пептид 243, где Q в положении 3 пептида 106 заменили на A в пептиде 243; пептид 244, где S в положении 5 пептида 106 заменили на A в пептиде 244; пептид 245, где K в положении 6 пептида 106 заменили на A в пептиде 245; пептид 247, где T в положении 7 пептида 106 заменили на A в пептиде 247; пептид 248, где K в положении 10 пептида 106 заменили на A в пептиде 248; пептид 249, где оба K в положениях 6 и 10 пептида 106 заменили на A в пептиде 249.

Примеры варианта пептида 137 с заменой аминокислот, 8-мера, включают, например пептид 250, где F в положении 4 пептида 137 заменили на A в пептиде 250.

Примеры варианта пептида 219 с заменой аминокислот, 4-мера, включают, например пептид 251, где K в положении 2 пептида 219 заменили на A в пептиде 251.

Вариант пептида с заменой аминокислот, как здесь описано, может быть представлен в виде выделенного пептида или в виде химически модифицированного пептида, такого как, например, N-концевой амид, такой как миристоиламид, ацетиламид и подобные, как описано здесь, и такого как, например, С-концевой амид, такой как амид, образованный с аммиаком, и такого как одновременно и N-концевой, и C-концевой амид.

Когда делеции включены в аминокислотные последовательности пептидов изобретения по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, то предпочтительно по меньшей мере 80% идентичности последовательности между аминокислотной последовательностью пептида и эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 5 до 23 аминокислот и включающие одну аминокислотную делецию по отношению к эталонному пептиду, будут иметь от 80% до примерно 96% (т.е. ~95,7%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 10 до 23 аминокислот и включающие одну аминокислотную делецию по отношению к эталонному пептиду, будут иметь от примерно 90% до примерно 96% (т.е. ~95,7%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 20 до 23 аминокислот и включающие одну аминокислотную делецию по отношению к эталонному пептиду, будут иметь от примерно 95% до примерно 96% (т.е. ~95,7%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 10 до 23 аминокислот и включающие две аминокислотные делеции по отношению к эталонному пептиду, будут иметь от примерно 80% до примерно 92% (т.е. ~91,3%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 16 до 23 аминокислот и включающие две аминокислотные делеции по отношению к эталонному пептиду, будут иметь от примерно 87,5% до примерно 92% (т.е. ~91,3%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 20 до 23 аминокислот и включающие две аминокислотные делеции по отношению к эталонному пептиду, будут иметь от примерно 90% до примерно 92% (т.е. ~91,3%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 15 до 23 аминокислот и включающие три аминокислотные делеции по отношению к эталонному пептиду, будут иметь от примерно 80% до примерно 87% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 20 до 23 аминокислот и включающие три аминокислотные делеции по отношению к эталонному пептиду, будут иметь от примерно 85% до примерно 87% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью. Пептиды, имеющие от 20 до 23 аминокислот и включающие четыре аминокислотные делеции по отношению к эталонному пептиду, будут иметь от примерно 80% до примерно 83% (т.е. ~82,6%) идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью.

Как установлено выше, одна или более аминокислот пептидов также могут быть химически модифицированы. Любая известная в данной области аминокислотная модификация может быть произведена с аминокислотами пептидов, с использованием любого известного в данной области способа.

В некоторых воплощениях N-концевая и/или С-концевая аминокислота может быть модифицирована. Например, N-концевая аминокислота пептидов может быть алкилирована, амидирована или ацилирована по N-концевой аминогруппе (H₂N-), и, например, С-концевая аминокислота пептидов может быть амидирована или этерифицирована по С-концевой карбоксильной группе (-COOH). Например, N-концевая аминогруппа может быть модифицирована ацилированием путем включения любой ацильной или жирнокислотной ацильной группы, образуя амид, включающий ацетильную группу (т.е. CH₃-C(=O)-) или миристоильную группу. В некоторых воплощениях N-концевая аминогруппа может быть модифицирована путем включения любой ацильной группы, имеющей формулу -C(O)R, в которой R представляет линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую 1-15 атомов углерода, или может быть модифицирована путем включения любой ацильной группы, имеющей формулу -C(O)R¹, в которой R¹ представляет линейную алкильную группу, содержащую 1-15 атомов углерода. С-концевая аминокислота пептидов также может быть химически модифицирована. Например, С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты может быть химически модифицирована путем включения аминогруппы вместо гидроксильной группы (т.е. амидирована). В некоторых воплощениях N-концевая и/или С-концевая аминокислоты химически не модифицированы.

Пептид может быть ацилирован по аминогруппе N-концевой аминокислоты, образуя N-концевой амид с кислотой, выбранной из группы, состоящей из:

(i) С₂-С₂₄ алифатической карбоновой кислоты (насыщенной или необязательно не насыщенной) (например, N-концевой амид уксусной кислоты, пропановой кислоты, бутановой кислоты, гексановой кислоты, октановой кислоты, декановой кислоты, додекановой кислоты, тетрадекановой кислоты (миристиновой кислоты), гексадекановой кислоты, 9-гексадекановой кислоты, октадекановой кислоты, 9-октадекановой кислоты, 11-октадекановой кислоты, 9,12-октадкадиеновой кислоты, 9,12,15-октадекатриеновой кислоты, 6,9,12- октадекатриеновой кислоты, эйкозановой кислоты, 9-эйкозеновой кислоты, 5,8,11,14-эйкозатетраеновой кислоты, 5,8,11,14,17-эйкозапентаеновой кислоты, докозановой кислоты, 13-докозеновой кислоты, 4,7,10,13,16,19-докозагексаеновой кислоты, тетракозановой кислоты и подобные);

(ii) трифторуксусной кислотой; и

(iii) бензойной кислотой; и

(iv) С₁-С₂₄ алифатической алкилсульфоновой кислотой, которая образует алифатический алкилсульфонамид, в котором структура углеродной цепи С₁-С₂₄ алифатического алкила сульфоновой кислоты аналогична структуре алифатических алкильных цепей карбоновой кислоты в алифатических алкильных карбоновых кислотах, описанных выше. Например, пептид может быть ацилирован с использованием группы карбоновой кислоты, представленной как (С₁-С₂₃)-алкил-C(O)OH, посредством конденсации с дегидратацией путем активации карбоксильной группы кислоты с образованием амида, представленного как (С₁-С₂₃)-алкил-C(O)-NH-пептид. Аналогично, сульфонамид может быть образован реакцией производных сульфоновой кислоты (представленных как (С₁-С₂₃)-алкил-S(O₂)-X, где X галоген или OCH₃ или другая совместимая уходящая группа) с N-концевой аминогруппой с образованием сульфонамида, представленного как (С₁-С₂₃)-алкил-S(O₂)-NH-пептид.

В другом воплощении N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты может быть алкилирована С₁-С₂₄ алифатической алкильной группой, причем структура этой алифатической алкильной группы такая, как описано выше. Алкилирование может быть произведено, например, с использованием алифатического алкилгалогенида или эфира алифатической алкилсульфоновой кислоты (мезилат, тозилат и т.д.), предпочтительно с использованием первичного алкилгалогенида или первичного эфира алкилсульфоновой кислоты. N-концевая аминокислота может быть также модифицирована по концевой аминогруппе путем включения любой ацильной или алифатической ацильной жирнокислотной группы с образованием амида, включающего ацетильную группу (т.е. -C(O)CH₃), миристоильную группу, бутаноильную группу, гексаноильную, октаноильную группу, деканоильную группу, додеканоильную группу, тетрадеканоильную группу, гексадеканоильную группу, 9-гексодеценоильную группу, октадеканоильную группу, 9-октадеценоильную группу, 11-октадеценоильную группу, 9,12-октадекадиеноильную группу, 9,12,15-октадекатриеноильную группу, 6,9,12-октадекатриеноильную группу, эйкозаноильную группу, 9-эйкозеноильную группу, 5,8,11,14-эйкозатетраеноильную группу, 5,8,11,14,17-эйкозапентаеноильную группу, докозаноильную группу, 13- докозеноильную группу, 4,7,10,13,16,19-докозагексаеноильную группу, тетракозаноильную группу, причем каждая группа ковалентно присоединена к концевой аминогруппе пептида амидной связью.

С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептидов изобретения также может быть химически модифицирована. Например, С-концевая аминокислота может быть химически модифицирована с помощью реакции С-концевой карбоксильной группы пептида с амином с образованием амидной группы, такой как амид аммония; амид С₁-С₂₄ алифатического алкиламина, предпочтительно линейного алифатического алкиламина; амид гидроксил-замещенного С₂-С₂₄ алифатического алкиламина; амид линейной 2-(С₁-С₂₄ алифатический алкил)оксиэтиламиногруппы; и амид омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этиламиногруппы (также обозначенной как омега-метокси-PEG-альфа-аминогруппа или омега-метокси-(полиэтиленгликоль)-аминогруппа), где n составляет от 0 до 10. С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида также может быть в форме эфира, выбранного из группы, состоящей из эфира С₁-С₂₄ алифатического алкилового спирта и эфира 2-(омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этанольной группы, где n составляет от 0 до 10.

С-концевая карбоксильная группа пептида, который может быть представлен формулой пептид-C(O)OH, может также быть амидирована путем превращения в активированную форму, такую как галогенид карбоновой кислоты, ангидрид карбоновой кислоты, N-гидроксисукцинимидный эфир, пентафторфениловый эфир (OPfp), 3-гидрокси-2,3-дигидро-4-оксо-бензо-триазоновый эфир (ODhbt), и подобные, чтобы облегчить реакцию с аммиаком или первичным или вторичным амином, предпочтительно аммиаком и первичным амином, при этом предпочтительно, чтобы другие реакционноспособные группы в пептиде были защищены синтетическими химически совместимыми защитными группами, хорошо известными в области техники пептидного синтеза, особенно пептидного твердофазного синтеза, такими защитными группами как бензиловый эфир, трет-бутиловый эфир, фениловый эфир и т.д. Полученный амид пептида может быть представлен формулой пептид-C(O)-NR³R⁴ (причем амид находится на С-конце пептида), в котором R³ и R⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; С₁-С₂₄ алкила, такого как метил, этил, бутил, изобутил, циклопропилметил, гексил, додецил, тетрадецил и подобные, как описано выше.

С-концевая карбоновая кислота С-концевой аминокислоты может быть также превращена в амид гидрокси-замещенного С₂-С₂₄ алифатического алкиламина (причем гидроксильная группа присоединяется к атому углерода легче, чем атом азота аминогруппы), такого как 2-гидроксиэтиламин, 4-гидроксибутиламин и 12-гидроксидодециламин и подобных.

С-концевая карбоновая кислота может быть также превращена в амид гидроксил замещенного С₂-С₂₄ алифатического алкиламина, в котором гидроксильная группа может быть ацетилирована, образуя эфир с С_2-С₂₄ алифатической карбоновой кислотой, как описано выше. Предпочтительно в амиде пептида на С-конце пептида, представленном формулой пептид-C(O)-R⁵R⁶, где R⁵ представляет водород, R⁶ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₂₄ алифатического алкила и гидрокси-замещенного С₂-С₂₄ алкила.

С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты может быть также превращена в амид линейного 2-(С₁-С₂₄ алифатический алкил)оксиэтиламина. Такой амид может быть получен, например, реакцией С₁-С₂₄ алифатического спирта с гидридом калия в диглиме с 2-хлороэтанолом, чтобы получить линейный С₁-С₂₄ алифатический алкилэтанол, который может быть превращен в амин путем окисления до альдегида с последующим восстановительным аминированием до амина (например, используя аммиак), или путем превращения в алкилгалогенид (например, используя тионилхлорид) с последующей обработкой амином, таким как аммиак.

С-концевая карбоновая кислота С-концевой аминокислоты может быть также превращена в амид омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этиламина, где n составляет от 0 до 10, который может быть получен из соответствующего омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этанола, например, путем превращения спирта в амин, как описано выше.

В другом воплощении С-концевая карбоксильная группа может быть превращена в амид пептида, представленный формулой пептид-C(O)-NR⁷R⁸, в котором R⁷ представляет водород, R⁸ представляет линейную 2-(С₁-С₂₄ алифатический алкил)оксиэтильную группу, в которой С₁-С₂₄ алифатическая алкильная часть такая же, как описано выше, и включает такие группы, как метоксиэтил (т.е. CH₃O-CH₂CH₂-), 2-додецилоксиэтил и подобные; или R⁷ представляет водород, R⁸ представляет омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этильную группу, где n поли(этиленокси) части составляет от 0 до 10, то есть образуются такие группы, как 2-метоксиэтил (т.е. CH₃O-CH₂CH₂-), омега-метоксиэтоксиэтил (т.е. CH₃O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-) и до CH₃O-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₂CH₂-.

С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида может быть также в форме эфира С₁-С₂₄ алифатического алкилового спирта, причем алифатическая алкильная часть спирта такая, как описано выше. С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида может быть также в форме эфира 2-(омега-метокси-поли(этиленокси)_n)-этанольной группы, где n составляет от 0 до 10, который может быть получен из реакции 2-метоксиэтанола в форме 2-метоксиэтанолата натрия со стехиометрическим количеством этиленоксида, причем стехиометрическое количество зависит от размера n.

Боковая цепь в аминокислоте пептидов также может быть химически модифицирована. Например, фенильная группа в фенилаланине или тирозине может быть замещена заместителем, выбранным из группы, состоящей из:

С₁-С₂₄ алифатической алкильной группы (т.е. линейной или разветвленной, и/или насыщенной или ненасыщенной, и/или содержащей циклическую группу), такой как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, циклопропил, 2-метилциклопропил, циклогексил, октил, децил, додецил, гексадецил, октадецил, эйкозанил, докозанил, тетракозанил, 9-гексадеценил, 9-октадеценил, 11-октадеценил, 9,12-октадекадиенил, 9,12,15-октадекатриенил, 6,9,12-октадекатриенил, 9-эйкозенил, 5,8,11,14-эйкозатетраенил, 5,8,11,14,17-эйкозапентаенил, 13-докозенил и 4,7,10,13,16,19-докозагексаенил;

С₁-С₂₄ алифатической алкильной группы, замещенной гидроксильной группой по меньшей мере у одного атома углерода вдали от сайта ненасыщенности, примеры таких гидроксиалкильных групп включают гидроксиметил, гидроксиэтил, гидроксидодецил и подобные;

С₁-С₂₄ алифатической группы, замещенной гидроксильной группой, которая этерифицирована С₂-С₂₄ алифатической карбоксильной группой такой кислоты, как уксусная кислота, бутановая кислота, гексановая кислота, октановая кислота, декановая кислота, додекановая кислота, тетрадекановая кислота, гексадекановая кислота, 9-гексадеценовая кислота, октадекановая кислота, 9-октадеценовая кислота, 11-октадеценовая кислота, 9,12-октадекадиеновая кислота, 9,12,15-октадекатриеновая кислота, 6,9,12-октадекатриеновая кислота, эйкозановая кислота, 9-эйкозеновая кислота, 5,8,11,14-эйкозатетраеновая кислота, 5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота, докозановая кислота, 13-докозеновая кислота, 4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая кислота, тетракозановая кислота и подобные, дикарбоновая кислота, такая как янтарная кислота, или гидроксикислота, такая как молочная кислота, где общее количество атомов углерода эфирных заместителей находится в интервале от 3 до 25;

галогена, такого как фтор-, хлор- и йод-; нитро-; амино-, такой как NH₂, метиламино, диметиламино; трифторметил-; карбоксил (-COOH);

С₁-С₂₄ алкокси (такой как может быть образован при алкилировании тирозина), такой как метокси, этокси, пропилокси, изопропилокси, бутилокси, изобутилокси, циклопропилокси, 2-метилциклопропилокси, циклогексилокси, октилокси, децилокси, додецилокси, гексадецилокси, октадецилокси, эйкозанилокси, докозанилокси, тетракозанилокси, 9-гексадеценилокси, 9-октадеценилокси, 11-октадеценилокси, 9,12-октадекадиенилокси, 9,12,15-октадекатриенилокси, 6,9,12-октадекатриенилокси, 9-эйкозенилокси, 5,8,11,14-эйкозатетраенилокси, 5,8,11,14,17-эйкозапентаенилокси, 13-докозенилокси и 4,7,10,13,16,19-докозагексаенилокси; и

С₂-С₂₄ гидроксиалкилокси, такой как 2-гидроксиэтилокси, и их эфиры с карбоновыми кислотами, как описано выше, или с трифторуксусной кислотой.

Гидроксильная группа серина может быть этерифицирована с заместителем, выбранным из группы, состоящей из:

группы С₂-С₂₄ алифатической карбоновой кислоты, такой как описано выше;

группы трифторуксусной кислоты;

группы бензойной кислоты.

Эпсилон аминогруппа лизина может быть химически модифицирована, например, путем образования амида с: группой С₂-С₂₄ алифатической карбоновой кислоты (например, реакцией амина с химически активированной формой карбоновой кислоты, такой как хлорангидрид кислоты, ангидрид, N-гидроксисукцинимидный эфир, пентафторфениловый эфир (OPfp), 3-гидрокси-2,3-дигидро-4-оксо-бензо-триазоновый (ODhbt) эфир, и подобные), так как описано выше, или группой бензойной кислоты, или группой аминокислоты. Кроме того, эпсилон аминогруппа лизина может быть химически модифицирована алкилированием одной или двумя С₁-С₂₄ алифатическими алкильными группами.

Карбоксильная группа в глутаминовой кислоте может быть модифицирована путем образования амида с амином, таким как: аммиак, С₁-С₂₄ первичный алифатический алкиламин (алкильная часть которого такая, как описано выше), включающий метиламин; или аминогруппу аминокислоты.

Карбоксильная группа в глутаминовой кислоте может быть модифицирована путем образования эфира с С₁-С₂₄ алифатической гидроксильной группой, как описано выше, предпочтительно эфир образуется с первичным спиртом С₁-С₂₄ алифатического алкила, таким как метанол, этанол, пропан-1-ол, n-додеканол и подобные, как описано выше.

Пептиды изобретения имеют муцин-ингибирующий эффект и/или слизь-ингибирующий эффект при введении млекопитающим в муцин- и/или слизь-ингибирующем количестве. Пептиды могут также иметь (1) больший муцин-ингибирующий эффект у млекопитающего, чем имеет MANS пептид, при введении в равных концентрациях, (2) больший слизь-ингибирующий эффект у млекопитающего, чем имеет MANS пептид, при введении в равных концентрациях, и/или (3) иметь большую растворимость в воде, чем MANS пептид.

И MARCKS пептид и MANS пептид каждый включает миристоильную группу, связанную с аминогруппой N-концевой аминокислоты амидной связью. Однако, как выявлено здесь, ингибирующая гиперсекрецию муцина активность пептидов изобретения не связана с присутствием миристоильной группы на N-концевой аминокислоте последовательности пептида. На самом деле, обнаружено, что определенные пептиды изобретения, которые не содержат N-концевых химических модификаций, проявляют ингибирующую гиперсекрецию муцина активность. Также обнаружено, что определенные пептиды изобретения, которые содержат N-концевые химические модификации с группами, отличными от миристоильной, такими как ацетильная группа в N-концевом амиде, проявляют ингибирующую гиперсекрецию муцина активность. На самом деле, N-концевая ацетилированная версия MANS пептида (не миристоилированная) может проявлять в способах изобретения ингибирующую гиперсекрецию муцина активность. Кроме того, пептидные последовательности аминокислот, включающие аминокислотную последовательность MANS пептида и их варианты, как здесь описано, могут проявлять в способах изобретения ингибирующую гиперсекрецию муцина активность.

В одном аспекте это изобретение представляет способ ингибирования гиперсекреции муцина у млекопитающих, включающий введение млекопитающему пептида, ингибирующего гиперсекрецию муцина в количестве, которое ингибирует гиперсекрецию муцина, причем пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) аминокислотной последовательности, имеющей последовательность GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1); и (b) аминокислотной последовательности, по существу идентичной последовательности, определенной в (а); в которой N-концевая аминокислота пептида не миристоилирована, и C-концевая аминокислота пептида необязательно независимо химически модифицирована, причем пептид имеет эффект ингибирования гиперсекреции муцина при введении млекопитающему в количестве, ингибирующем гиперсекрецию муцина. В одном воплощении N-концевая аминокислота этого пептида предпочтительно ацетилирована. В другом воплощении пептид проявляет по меньшей мере одно из свойств: (a) больший эффект ингибирования гиперсекреции муцина у млекопитающего, чем проявляет SEQ ID NO. 1, в которой N-концевая аминокислота миристоилирована, при введении указанному млекопитающему в равных концентрациях, или (b) большая растворимость в воде, чем у SEQ ID NO. 1, в которой N-концевая аминокислота миристоилирована, при равных концентрациях в одной и той же жидкости.

В некоторых воплощениях N-концевая аминогруппа может быть модифицирована путем включения ацильной группы, имеющей формулу -C(O)R, в которой R представляет линейную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 15 атомов углерода, или может быть модифицирована путем включения ацильной группы, имеющей формулу C(O)R¹, в которой R¹ представляет линейную алкильную группу, имеющую от 1 до 15 атомов углерода. С-концевая аминокислота пептидов также может быть химически модифицирована. Например, С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты может быть химически модифицирована путем включения аминогруппы на место гидроксильной группы (т.е. амидирована). В некоторых воплощениях N-концевая и/или С-концевая аминокислоты химически не модифицированы.

В некоторых воплощениях пептиды могут иметь больший период полужизни в бронхоальвеолярной лаважной жидкости (BALF), чем в плазме человека, и могут также иметь больший период полужизни в слизи человека (например, в слизи человека с кистозным фиброзом), чем в плазме человека.

Пептиды могут применять в способах ингибирования секреции муцина и/или продуцирования слизи у млекопитающих, способах лечения гиперсекреции муцина и/или слизи у млекопитающих, способах лечения легочных заболеваний млекопитающих, вызывающих гиперсекрецию муцина и/или слизи (таких как, например, астма, хронический бронхит, COPD и кистозный фиброз). Состояния, которые могут быть подходящими для лечения пептидами, включают, но не ограничены ими, воспалительные, вирусные или бактериальные заболевания дыхательных путей (например, астма, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), простуда, ринит, острый или хронический бронхит, пневмония и питомниковый кашель), аллергические состояния (например, атопия, аллергическое воспаление), бронхоэктазия, эмфизема, бронхиальная астма и определенные генетические состояния (например, кистозный фиброз). Пептиды также могут быть подходящими как для лечения состояний и заболеваний, так и для использования в способах, описанных в патентной заявке США №№ 10/180753 (публикация № US 2003/0013652) и 09/256154 и международной заявке PCT/US00/05050 (номер международной публикации WO 00/50062), полное содержание которых приведено здесь путем ссылки.

Кроме гиперсекреции муцина, ассоциированной с заболеванием, термин гиперсекреция муцина также включает ATP-индуцированную гиперсекрецию муцина также как гиперсекрецию муцина, индуцированную секреторным средством, и стимулированную гиперсекрецию муцина.

В предпочтительном воплощении данное изобретение представляет пептид, ингибирующий гиперсекрецию муцина и имеющий аминокислотную последовательность из 4-23 последовательно расположенных аминокислот из эталонной аминокислотной последовательности ПЕПТИД 1, в которой пептид, ингибирующий гиперсекрецию муцина, выбран из:

(a) группы, состоящей из пептида 2, пептида 3, пептида 4, пептида 5, пептида 6, пептида 7, пептида 8, пептида 9, пептида 10, пептида 11, пептида 12, пептида 13, пептида 14, пептида 15, пептида 16, пептида 17, пептида 18, пептида 19, пептида 20, пептида 21, пептида 22, пептида 23, пептида 24, пептида 25, пептида 26, пептида 27, пептида 28, пептида 29, пептида 30, пептида 31, пептида 32, пептида 33, пептида 34, пептида 35, пептида 36, пептида 37, пептида 38, пептида 39, пептида 40, пептида 41, пептида 42, пептида 43, пептида 44, пептида 45, пептида 46, пептида 47, пептида 48, пептида 49, пептида 50, пептида 51, пептида 52, пептида 53, пептида 54, пептида 56, пептида 57, пептида 58, пептида 59, пептида 60, пептида 61, пептида 62, пептида 63, пептида 64, пептида 67, пептида 68, пептида 69, пептида 70, пептида 71, пептида 72, пептида 73, пептида 74, пептида 75, пептида 79, пептида 80, пептида 81, пептида 82, пептида 83, пептида 84, пептида 85, пептида 86, пептида 87, пептида 92, пептида 93, пептида 94, пептида 95, пептида 96, пептида 97, пептида 98, пептида 99, пептида 100, пептида 106, пептида 107, пептида 108, пептида 109, пептида 110, пептида 111, пептида 112, пептида 113, пептида 114, пептида 122, пептида 123, пептида 124, пептида 125, пептида 126, пептида 127, пептида 128, пептида 129, пептида 139, пептида 140, пептида 141, пептида 142, пептида 143, пептида 144, пептида 145, пептида 157, пептида 158, пептида 159, пептида 160, пептида 161, пептида 162, пептида 176, пептида 177, пептида 178, пептида 179, пептида 180, пептида 196, пептида 197, пептида 198, пептида 199, пептида 217 и пептида 219, как описано выше; и

(b) аминокислотной последовательности, имеющей 80%-96% идентичности последовательности с последовательностью, определенной в (a);

где аминогруппа N-концевой аминокислоты аминокислотной последовательности пептида, ингибирующего гиперсекрецию муцина, необязательно ковалентно связана амидной связью с карбоновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из миристиновой кислоты и уксусной кислоты, и

где карбоксильная группа С-концевой аминокислоты аминокислотной последовательности пептида, ингибирующего гиперсекрецию муцина, необязательно ковалентно связана амидной связью с аммиаком.

Пептид может быть введен локально или системно (например, в форме фармацевтической композиции пептида изобретения и фармацевтически приемлемого носителя) и может быть введен в любую часть тела млекопитающего, включающую, но не ограничиваясь ими, те части тела, которые производят слизь и/или муцин (например, предпочтительно в респираторные проходы, носовую полость, ротовую полость, трахею, легкие, желудочно-кишечный тракт, глаз, репродуктивный тракт и т.д.). Пептиды могут быть введены различными путями, включая, но не ограничиваясь ими, местное введение, парентеральное введение, ректальное введение, легочное введение, назальное введение, ингаляцию, инсуффляцию и пероральное введение. Легочное введение может быть выполнено, например, с использованием аэрозоля, распылителя, ингалятора с сухим порошком, дозированного ингалятора и подобных.

Пептиды могут быть приготовлены и введены в качестве фармацевтической композиции, подходящей для любого фармацевтически эффективного пути введения. Пептиды изобретения (или фармацевтическая композиция на их основе) могут быть в форме, подходящей для перорального применения (например, в виде таблеток, лепешек, твердых или мягких капсул, водных или масляных суспензий, эмульсий, дисперсных порошков или гранул, сиропов или эликсиров), для местного применения (например, в виде кремов, мазей, гелей или водных или масляных растворов, или суспензий), для введения ингаляцией (например, в виде тонко измельченного порошка или жидкого аэрозоля), или для введения инсуффляцией (например, в виде тонко измельченного порошка), или для парентерального введения (например, в качестве стерильного водного или масляного раствора для внутривенного, подкожного или внутримышечного дозирования или в виде суппозитария для ректального дозирования).

Пептиды могут быть введены в дыхательные пути млекопитающего любым подходящим способом, включающим генерирование аэрозоля, который включает пептид. Такой аэрозоль может быть твердым или жидким и может быть на водной основе. Подходящие по размеру частицы такого аэрозоля могут быть произведены различными путями, известными в области техники. Частицы такого аэрозоля обычно меньше, чем 50 микрометров по размеру, предпочтительно в пределах от примерно 0,1 микрометра до примерно 10 микрометров по размеру, более предпочтительно в пределах от примерно 1 микрометра до примерно 10 микрометров по размеру, и еще более предпочтительно в пределах от примерно 2 микрометров до примерно 7 микрометров по размеру, и предпочтительно от примерно 2 до примерно 7 микрометров.

Назальное введение пептида (или фармацевтической композиции пептида) может быть выполнено, например, путем применения спрея водного раствора или суспензии пептида, или путем применения водных растворов или суспензий пептида в качестве капли или капельки, такой как образует капельница или пипетка, например, в форме фармацевтически приемлемого, предпочтительно стерильного солевого раствора (NaCl), который необязательно может быть буферирован. Стерилизация водного раствора может быть выполнена, например, с помощью стерильной фильтрации водного раствора, включающего пептид, необязательно в присутствии фармацевтически приемлемых добавок, таких как консерванты, антиоксиданты, буферные соли, модификаторы тонуса и подобные. Стерилизация водной суспензии, включающей пептид, может быть выполнена, например, с помощью облучения или стерильной фильтрации, когда суспензионный материал по размеру частиц меньше чем 0,2 микрометра, например, суспензия, включающая мицеллу, липосому, такую как стабилизированную фосфолипидами липосому, или подобную частицу, которая может пройти сквозь фильтр 0,2 микрометра. Водный раствор (например, изотонический солевой раствор или гипертонический солевой раствор, и необязательно сахар, который химически не реагирует с пептидом) терапевтически эффективного количества пептида изобретения может быть стерилизован, например, с помощью стерильной фильтрации, затем аликвоту, содержащую терапевтически эффективное количество пептида, помещают в стерильную посуду, лиофилизуют с образованием сухого порошка и запаивают предпочтительно в присутствии инертной атмосферы или газа, используя стерильную пробку или колпачок. Перед применением сухой порошок может быть регидратирован путем добавления достаточного количества воды для образования единичной дозы изотонического раствора, которая может быть введена как аэрозоль в дыхательные пути млекопитающего.

Количество пептида или фармацевтической композиции на его основе, вводимого млекопитающему, может варьироваться в зависимости от многочисленных факторов, включая, но не ограничиваясь ими, особенность пептида, тип млекопитающего, степень заболевания млекопитающего, вес млекопитающего и возраст млекопитающего. Кроме того, может быть желательным поддерживать некоторый уровень секреции муцина/продуцирования слизи (например, нормальный или базальный уровень) у млекопитающего, прошедшего лечение пептидом. В одном воплощении человек является предпочтительным млекопитающим с точки зрения необходимости лечения, и количества вводимого пептида, которое вводится в единичной или множественной дозе, достаточной, чтобы ингибировать гиперсекрецию муцина. Единичная доза пептида настоящего изобретения может варьироваться в пределах от 0,1 мг до 30 мг на килограмм веса тела, предпочтительно от примерно 0,1 мг до примерно 15 мг на килограмм веса тела, и более предпочтительно от примерно 0,1 мг до примерно 7,5 мг на килограмм веса тела. Количество доз и продолжительность лечения зависит от реакции пациента на лечение. Корректировка по количеству единичной дозы, количеству доз и продолжительности лечения может быть определена медицинским работником в зависимости от симптомов и от серьезности этих симптомов.

В одном воплощении выделенный пептид состоит менее чем из 24 последовательно расположенных аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот (или в других воплощениях 8-14 последовательно расположенных аминокислот, или 10-12 последовательно расположенных аминокислот) эталонной последовательности ПЕПТИД 1, где аминокислотная последовательность начинается с N-концевой аминокислоты эталонной последовательности; (b) последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (a); (c) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот (или в других воплощениях 8-14 последовательно расположенных аминокислот, или 10-12 последовательно расположенных аминокислот) эталонной последовательности ПЕПТИД 1, где аминокислотная последовательность заканчивается С-концевой аминокислотой эталонной последовательности; и (d) последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (с). N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты и/или C-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты необязательно может быть химически модифицирована следующим образом:

(1) N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида необязательно представлена в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида С₂-С₂₄ алифатической карбоновой кислоты,

амида трифторуксусной кислоты,

амида бензойной кислоты, и

амида С₁-С₂₄ алифатической алкилсульфоновой кислоты; или

N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида необязательно алкилирована группой, выбранной из группы, состоящей из:

С₁-С₂₄ алифатической алкильной группы,

линейной 2-(С₁-С₂₄ алифатический алкил)оксиэтильной группы,

омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этильной группы, где n составляет от 0 до 10; и

(2) С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида необязательно представлена в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида аммония,

амида С₁-С₂₄ алифатического алкиламина,

амида гидрокси-замещенного С₂-С₂₄ алифатического алкиламина,

амида линейной 2-(С₁-С₂₄ алифатический алкил)оксиэтиламиногруппы, и

амида омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этиламиногруппы, где n составляет от 0 до 10; или

С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида необязательно представлена в форме эфира, выбранного из группы, состоящей из:

эфира С₁-С₂₄ алифатического алкилового спирта,

эфира 2-(омега-метокси-поли(этиленокси)_n)-этанольной группы, где n составляет от 0 до 10.

Пептид имеет эффект ингибирования высвобождения муцина при введении млекопитающему в муцин-ингибирующем количестве. Пептид может также иметь больший муцин-ингибирующий эффект у млекопитающего, чем MANS пептид, при введении в равных концентрациях и/или большую растворимость в воде, чем MANS пептид.

В другом воплощении выделенный пептид состоит менее чем из 24 аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, состоящую из варианта аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот (или, в других воплощениях, 8-14 последовательно расположенных аминокислот, или 10-12 последовательно расположенных аминокислот) эталонной последовательности ПЕПТИД 1, где аминокислотная последовательность начинается с N-концевой аминокислоты эталонной последовательности или где аминокислотная последовательность заканчивается С-концевой аминокислотой эталонной последовательности. N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты и/или C-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты необязательно может быть химически модифицирована следующим образом:

(1) N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида необязательно представлена в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида С₂-С₂₄ алифатической карбоновой кислоты,

амида трифторуксусной кислоты,

амида бензойной кислоты, и

амида С₁-С₂₄ алифатической алкилсульфоновой кислоты; или

N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида необязательно алкилирована группой, выбранной из группы, состоящей из:

С₁-С₂₄ алифатической алкильной группы,

линейной 2-(С₁-С₂₄ алифатический алкил)оксиэтильной группы,

омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этильной группы, где n составляет от 0 до 10; и

(2) С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида необязательно представлена в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида аммония,

амида С₁-С₂₄ алифатического алкиламина,

амида гидрокси-замещенного С₂-С₂₄ алифатического алкиламина,

амида линейной 2-(С₁-С₂₄ алифатический алкил)оксиэтиламиногруппы, и

амида омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этиламиногруппы, где n составляет от 0 до 10; или

С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида необязательно представлена в форме эфира, выбранного из группы, состоящей из:

эфира С₁-С₂₄ алифатического алкилового спирта,

эфира 2-(омега-метокси-поли(этиленокси)_n)-этанольной группы, где n составляет от 0 до 10.

Пептид имеет муцин-ингибирующий эффект при введении млекопитающему в муцин-ингибирующем количестве. Пептид может также иметь больший муцин-ингибирующий эффект у млекопитающего, чем MANS пептид, при введении в равных концентрациях и/или большую растворимость в воде, чем MANS пептид.

В дальнейшем воплощении способ ингибирования гиперсекреции муцина у млекопитающего включает введение млекопитающему выделенного пептида в муцин-ингибирующем количестве, которое ингибирует секрецию муцина. Выделенный пептид состоит менее чем из 24 аминокислот и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот (или, в других воплощениях, 8-14 последовательно расположенных аминокислот, или 10-12 последовательно расположенных аминокислот) эталонной последовательности ПЕПТИД 1, где аминокислотная последовательность начинается с N-концевой аминокислоты эталонной последовательности; (b) последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (a); (c) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот (или, в других воплощениях, 8-14 последовательно расположенных аминокислот, или 10-12 последовательно расположенных аминокислот) эталонной последовательности ПЕПТИД 1, где аминокислотная последовательность заканчивается С-концевой аминокислотой эталонной последовательности; и (d) последовательности, по существу подобной аминокислотной последовательности, определенной в (с). N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты и/или C-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты необязательно может быть химически модифицирована следующим образом:

(1) N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида необязательно представлена в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида С₂-С₂₄ алифатической карбоновой кислоты,

амида трифторуксусной кислоты,

амида бензойной кислоты, и

амида С₁-С₂₄ алифатической алкилсульфоновой кислоты; или

N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида необязательно алкилирована группой, выбранной из группы, состоящей из:

С₁-С₂₄ алифатической алкильной группы,

линейной 2-(С₁-С₂₄ алифатический алкил)оксиэтильной группы,

омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этильной группы, где n составляет от 0 до 10; и

(2) С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида необязательно представлена в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида аммония,

амида С₁-С₂₄ алифатического алкиламина,

амида гидрокси-замещенного С₂-С₂₄ алифатического алкиламина,

амида линейной 2-(С₁-С₂₄ алифатический алкил)оксиэтиламиногруппы, и

амида омега-метокси-поли(этиленокси)_n-этиламиногруппы, где n составляет от 0 до 10; или

С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида необязательно представлена в форме эфира, выбранного из группы, состоящей из:

эфира С₁-С₂₄ алифатического алкилового спирта,

эфира 2-(омега-метокси-поли(этиленокси)_n)-этанольной группы, где n составляет от 0 до 10.

Пептид может иметь больший муцин-ингибирующий эффект у млекопитающего, чем MANS пептид, при введении в равных концентрациях и/или большую растворимость в воде, чем MANS пептид.

Пептиды изобретения могут быть получены любым подходящим способом, включая метод твердофазного пептидного синтеза, такого как, например, с использованием флуоренилметилоксикарбонильной (FMoc) стратегии и подходящего пептидного синтезатора, такого как пептидный синтезатор CS-Bio, или с использованием трет-бутилоксикарбонильной (Boc) стратегии и подходящего пептидного синтезатора, такого как ABI 430A Пептидный Синтезатор. Защищенные аминокислоты, подходящие для использования как в FMoc, так и в Boc синтезе, доступны, например, от Calbiochem, EMD Bioscience, San Diego, CA. В твердофазном пептидном синтезе С-концевую карбоксильную группу целевого пептида ковалентно присоединяют к полимерной подложке в форме N-альфа-защищенной аминокислоты. Защитную группу N-альфа-аминогруппы затем удаляют и конденсируют вторую N-альфа-защищенную аминокислоту с закрепленной аминокислотой путем образования амидной связи с незащищенной N-альфа-аминогруппой аминокислоты, связанной со смолой. Эти стадии повторяют с соответствующими защищенными аминокислотами целевой пептидной последовательности, пока не будет получена целевая последовательность. В конце синтеза связь между С-концевой аминокислотой и полимерной подложкой расщепляют, высвобождая пептид. Пептид может быть выделен и очищен ВЭЖХ. Используемые способы очистки ВЭЖХ включают ионообменную хроматографию и обращенно-фазовую хроматографию. Растворы пептидов могут быть выпарены или лиофилизованы, чтобы получить выделенный пептид в твердой форме. Пептиды, содержащие окисляемые группы, такие как остатки метионина, цистеина, триптофана, предпочтительно поддерживают в атмосфере, свободной от кислорода, и когда их включают в композицию и хранят в форме раствора или суспензии, то используют свободные от кислорода растворители.

Конденсация активированных эфиров с аминоконцом пептида, связанного со смолой во время синтеза, может быть произведена, например, с использованием избытка, например, 4-кратного избытка аминокислоты и бензотриазол-1-ил-окси-трис-диметиламино-фосфония гексафторфосфата, и избытка, такого как 6-кратный избыток N,N-диизопропилэтиламина. Пептиды в ходе FMoс синтеза отщепляют от смолы с помощью трифторуксусной кислоты/тиоанизола/триизопропилсилана/метанола (например, в соотношении 90:5:2,5:2,5, об./об./об./об.) при 20°С в течение 4 часов, и пептиды в ходе Boc синтеза отщепляют с помощью, например, HF/анизола (9:1, об./об.) при 4°С в течение 1 часа.

Во FMoc пептидной стратегии первую FMoc аминокислоту закрепляют на нерастворимой полимерной подложке посредством кислотолабильного линкера. Снятие защиты выполняют обработкой аминокислоты основанием, таким как пиперидин. Вторую FMoc аминокислоту конденсируют, используя предварительно активированные соединения или in situ активацию (реакции конденсации могут быть произведены in situ с использованием активирующих реагентов, таких как известные в пептидной химии DCC, HBTU, TBTU, BOP, BOP-Cl и подобных). После того, как целевой пептид синтезирован, с пептида, связанного со смолой, снимают защиту, и он отщепляется от твердой подложки посредством кислотного гидролиза слабыми кислотами, такими как трифторуксусная кислота (TFA) или TMSBr в присутствии поглотителя, такого как, например, тиольное соединение, фенол и вода. В одном аспекте перед снятием защиты функциональной группы боковой цепи и отщеплением от смолы концевая аминогруппа пептида может быть обработана карбоновыми кислотами (например, алифатической карбоновой, трифторуксусной, бензойной и подобными), например, разновидностями алифатических карбоновых кислот, такими как активированная форма алифатической карбоновой кислоты, такая как пентафтор эфир, аналогично способу образования пептидной связи с образованием амида карбоновой кислоты, или разновидностями алифатической сульфоновой кислоты (таким как сульфонил хлорид), с образованием сульфонамида на N-конце пептида. В качестве альтернативы N-концевой амин может быть алкилирован, например, алифатическим алкилирующим агентом (например, алифатическим мезилатом или тозилатом), полученным с помощью реакции соответствующего сульфонилхлорида и основания, такого как пиридин, с алифатическим спиртом, причем спирт может быть получен восстановлением (например, литий алюмогидридом) алифатической карбоновой кислоты. В другом аспекте соответствующие D-аминокислоты (например, до четырех D-аминокислот) с остальными L-аминокислотами могут быть использованы в процедуре пептидного синтеза, чтобы получить пептид изобретения, который необязательно может быть химически модифицирован, как описано выше. В другом аспекте, когда образована целевая пептидная аминокислотная последовательность, например, твердофазным синтезом и когда выбраны группы, защищающие боковую цепь, так, чтобы выдержать стадию расщепления эфира и высвобождения пептида со смолы, то образуется пептид с защищенной боковой цепью и имеющий свободную карбоновую кислоту на C-конце пептида. С-концевая карбоновая кислота может быть превращена в активированный эфир (например, пентафторфениловый эфир) и обработана амином, таким как аммиак, образуя амид (представленный как пептид-C(O)-NH₂), или, как описано выше, обработана алифатическим амином, образуя алифатический амид пептида, и любые оставшиеся защитные группы могут быть удалены, чтобы получить целевой пептид изобретения. Кроме того, С-концевой карбоновый сложный эфир может быть образован из С-концевой карбоновой кислоты и алифатического спирта с помощью конденсации с дегидратацией, такой как с использованием карбодиимидного реагента. Содержащие кислотные функциональные группы аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота могут быть превращены в амиды и эфиры способом, аналогичным вышеописанному способу, и эпсилон аминогруппа лизина может быть превращена в амиды и алифатические амины, как описано выше для химии концевых аминогрупп.

Примеры защищенных аминокислот, которые используют в FMoc твердофазном синтезе пептидов изобретения, включают следующие не ограничивающие примеры: пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аланина; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-N-альфа-(2-Fmoc-окси-4-метоксибензил)-аланина; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-глицина; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-N-альфа-(2-Fmoc-окси-4-метоксибензил)-глицина; g-2-фенилизопропиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-глутаминовой кислоты; альфа-4-{N-[1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил]амино}бензиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-глутаминовой кислоты; гамма-4-{N-[1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил]амино}бензиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-глутаминовой кислоты; альфа-аллиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-глутаминовой кислоты; g-бензиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-глутаминовой кислоты; альфа-трет-бутиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-глутаминовой кислоты; гамма-трет-бутиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-глутаминовой кислоты; пентафторфениловый эфир гамма-трет-бутилового эфира N-альфа-Fmoc-L-глутаминовой кислоты; пентафторфениловфй эфир N-альфа,эпсилон-Di-Fmoc-L-лизина; N-альфа,эпсилон-Di-Fmoc-L-лизин; N-альфа-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил-N-эпсилон-Fmoc-L-лизин; N-альфа-Fmoc-L-лизин; N-альфа-Fmoc-N-альфа-(2-Fmoc-окси-4-метоксибензил)-N-эпсилон-трет-бутоксикарбонил-L-лизин; N-альфа-Fmoc-N-эпсилон-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)-3-метилбутил-L-лизин; N-альфа-Fmoc-N-эпсилон-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)-этил-L-лизин; N-альфа-Fmoc-N-эпсилон-2-хлор-CBZ-L-лизин; N-альфа-Fmoc-N-эпсилон-4-метилтритил-L-лизин; N-альфа-Fmoc-N-эпсилон-ацетил-L-лизин; N-альфа-Fmoc-N-эпсилон-бензилоксикарбонил-L-лизин; N-альфа-Fmoc-N-эпсилон-трет-Boc-L-лизин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-N-эпсилон-трет-Boc-L-лизин; N-альфа-Fmoc-N-эпсилон-трифторацетил-L-лизин; N-альфа-Fmoc-4-хлор-L-фенилаланин; N-альфа-Fmoc-4-циано-L-фенилаланин; N-альфа-Fmoc-4-фтор-L-фенилаланин; N-альфа-Fmoc-4-нитро-L-фенилаланин; N-альфа-Fmoc-L-фенилаланин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-L-фенилаланина; N-альфа-Fmoc-N-альфа-(2-Fmoc-окси-4-метоксибензил)-фенилаланин; N-альфа-Fmoc-N-альфа-метил-L-фенилаланин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-L-пролина; N-альфа-Fmoc-гамма-(4,4'-диметоксибензгидрил)-L-глутамин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-гамма-тритил-L-глутамина; N-альфа-Fmoc-L-глутамин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-L-глутамина; N-альфа-Fmoc-N-гамма-тритил-L-глутамин; N-метокси-N-метиламид N-альфа-Fmoc-N^G-(4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил)-L-аргинина; N-альфа-Fmoc-N^G-2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил-L-аргинин; N-альфа-Fmoc-N^G-2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил-L-аргинин; N-альфа-Fmoc-N^G-4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил-L-аргинин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-N^G-4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил-L-аргинина; N-альфа-Fmoc-N^G-нитро-L-аргинин; N-альфа-Fmoc-N^G-тозил-L-аргинин; N-альфа-Fmoc-О-(2-ацетамидо-2-дезокси-3,4,6-три-О-ацетил-альфа-D-галактопиранозил)-L-серин; N-альфа-Fmoc-L-серин; N-альфа-Fmoc-О-бензил-L-фосфосерин; N-альфа-Fmoc-О-бензил-L-серин; N-альфа-Fmoc-О-трет-бутил-L-серин; N-альфа-Fmoc-О-трет-бутил-L-серин N-гидроксисукцинимид; N-альфа-Fmoc-О-тритил-L-серин; N-альфа-Fmoc-L-треонин; N-альфа-Fmoc-О-бензил-L-фосфотреонин; N-альфа-Fmoc-О-бензил-L-треонин; N-альфа-Fmoc-О-трет-бутил-L-треонин; N-альфа-Fmoc-О-тритил-L-треонин; N-альфа-Fmoc-О-(2-ацетамидо-2-дезокси-3,4,6-три-О-ацетил-альфа-D-галактопиранозил)-L-треонин; N-альфа-Fmoc-L-валин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-L-валина; N-альфа-Fmoc-N-альфа-(2-Fmoc-окси-4-метоксибензил)-валин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-N-альфа-(2-Fmoc-окси-4-метоксибензил)-валина; N-альфа-Fmoc-N-альфа-метил-L-валин; N-альфа-Fmoc-О-(бис-диметиламино-фосфоно)-L-тирозин; N-альфа-Fmoc-L-тирозин; N-альфа-Fmoc-О-2,6-дихлорбензил-L-тирозин; N-альфа-Fmoc-О-2-бромо-CBZ-L-тирозин; N-альфа-Fmoc-О-2-хлортритил-L-тирозин; N-альфа-Fmoc-О-бензил-L-фосфотирозин; N-альфа-Fmoc-О-метил-L-тирозин; N-альфа-Fmoc-О-фосфо-L-тирозин; N-альфа-Fmoc-О-трет-бутил-L-тирозин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-О-трет-бутил-L-тирозина; бета-1-адамантиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; бета-2-адамантиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; бета-2-фенилизопропиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; бета-4-{N-[1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил]-амино}бензиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; альфа-4-{N-[1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил]-амино}бензиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; альфа-аллиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; бета-бензиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; альфа-трет-бутиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; бета-трет-бутиловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; пентафторфениловый эфир бета-трет-бутилового эфира N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; пентафторфениловый эфир бета-1-адамантилового эфира N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; пентафторфениловый эфир бета-2-адамантилового эфира N-альфа-Fmoc-L-аспарагиновой кислоты; N-альфа-Fmoc-L-лейцин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-L-лейцина; N-альфа-Fmoc-N-альфа-(2-Fmoc-окси-4-метоксибензил)-лейцин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-N-альфа-(2-Fmoc-окси-4-метоксибензил)-лейцина; N-альфа-Fmoc-N-альфа-метил-L-лейцин; N-альфа-Fmoc-L-изолейцин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-L-изолейцина; N-альфа-Fmoc-N-альфа-метил-L-изолейцин; N-альфа-Fmoc-бета-2,4,6-триметоксибензил-L-аспарагин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-бета-тритил-L-аспарагина; N-альфа-Fmoc-L-аспарагин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-L-аспарагина; N-альфа-Fmoc-N-бета-(3,4,6-три-О-ацетил-2-(ацетиламино)-дезокси-2-бета-глюкопиранозил)-L-аспарагин; N-альфа-Fmoc-N-бета-тритил-L-аспарагин; N-альфа-Fmoc-N-im-метилтритил-L-гистидин; циклогексиламмониевая соль N-альфа-Fmoc-N-im-трет-Boc-L-гистидина; N-альфа-Fmoc-N-im-тозил-L-гистидин; N-альфа-Fmoc-N-im-тритил-L-гистидин; N-альфа-Fmoc-S-ацетамидометил-L-цистеин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-S-ацетамидометил-L-цистеина; N-альфа-Fmoc-S-бензил-L-цистеин; N-альфа-Fmoc-S-п-метоксибензил-L-цистеин; N-альфа-Fmoc-S-п-метокситритил-L-цистеин; N-альфа-Fmoc-S-трет-бутил-L-цистеин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-S-трет-бутил-L-цистеина; N-альфа-Fmoc-S-трет-бутилтио-L-цистеин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-S-трет-бутилтио-L-цистеина; N-альфа-Fmoc-S-тритил-L-цистеин; пентафторфениловый эфир N-альфа-Fmoc-S-тритил-L-цистеина. Эти и другие аминокислотные реагенты, которые используются в твердофазном синтезе пептидов, коммерчески доступны, например, от Calbiochem Corporation. Алифатические карбоновые кислоты также доступны от Sigma-Aldrich Chemical Company.

Пептиды могут также быть получены твердофазным синтезом с использованием Boc стратегии, в которой первую Boc аминокислоту прикрепляют к нерастворимой полимерной подложке посредством HF-расщепляемого линкера. Снятие защиты путем удаления группы Boc выполняют путем обработки Boc аминокислоты TFA. Вторую Boc аминокислоту затем конденсируют, используя предварительно активированные производные или in situ активацию. После того как целевой пептид синтезирован, с пептида, связанного со смолой, снимают защиту, и он открепляется от твердой подложки посредством расщепления с помощью сильных кислот, таких как HF, TFMSOTf или TMSOTf. Добавку такого соединения, как тиол, добавляют, чтобы защитить пептид от карбокатионов, генерируемых при расщеплении. Следующие защитные группы совместимы с HF расщеплением: Arg(Mts); Cys(4-MeOBzl); His(Z); Arg(Tos); Glu(OBzl); Lyz(Cl-Z); Asp(OBzl); Glu(OcHex); Ser(Bzl); Asp(OcHex); His(Bom); Thr(Bzl); Cys(Acm); His(Dnp); Trp(CHO); Cys(4-MeBzl); His(Tos); Tyr(Br-Z); Asp(OtBu); His(Trt). Следующие защитные группы совместимы с TFMSOTf расщеплением: Arg(Mts); His(Bom); Met(O); Asp(OBzl); His(Dnp); Ser(Bzl); Cys(Acm); His(Tos); Thr(Bzl); Cys(4-MeBzl); His(Z); Trp(CHO); Glu(OBzl); Lyz(Cl-Z); Tyr(Br-Z). Следующие защитные группы совместимы с TMSOTf расщеплением: Arg(Mts); Glu(OcHex); Trp(CHO); Arg(Mbs); His(Bom); Trp(Mts); Asp(OBzl); Lyz(Cl-Z); Tyr(Br-Z); Asp(OcHex); Met(O); Tyr(Bzl); Cys(Acm); Ser(Bzl); Tyr(Cl-Bzl); His(Bom); Thr(Bzl). Конденсация аминокислот с карбоксильными кислотами аминов для образования пептидных амидных связей может быть выполнена в Boc стратегии с использованием карбодиимидов, таких как дициклогексилкарбодиимид (DCC), диизопропилкарбодиимид (DIC), трет-бутил метил и трет-бутилэтил-карбодиимиды; BOP; PyBroP; PyBOP; HBTU; TBTU и HATU, причем каждому из этих реагентов для активации необходимы основания, и каждый действует путем образования симметричного ангидрида. В качестве альтернативы могут быть использованы реагенты смешанных ангидридов карбоновой и угольной кислот или карбоновой и фосфиновой кислот, приготовленные с помощью реакции изобутил- или изопропилхлороформата и замещенных фосфин хлоридов с N-альфа защищенной аминокислотой, или N-карбоксиангидриды (NCA) или может быть использован ангидрид Leuchs. Также как в Fmoc стратегии, N-концевая аминогруппа и С-концевая карбоксильная кислота могут быть химически модифицированы согласно стратегии вышеописанного синтеза.

ПРИМЕРЫ

Изобретение будет в дальнейшем объяснено следующими иллюстративными примерами, причем имеется в виду, что этими примерами изобретение не ограничивается. Эти примеры представляют результаты тестирования специфических пептидов, которые являются характерными представителями пептидов, выявленных в заявке. Пептиды внесены в список со всеми модификациями N-концевой аминогруппы N-концевой аминокислоты и/или С-концевой карбоксильной группы С-концевой аминокислоты с левой и с правой стороны аминокислотной последовательности, соответственно, и обозначены как Пептид # тестируемых пептидов. Таблица IX содержит ключ к пептидным последовательностям. Myr- и Ac- аббревиатуры миристоила и ацетила, соответственно, которые ковалентно связаны амидными связями с N-концевой аминокислотой в соответствующей аминокислотной последовательности пептида; -NH₂ обозначает амид аммония, который ковалентно связан с С-концом аминокислотной последовательности пептида.

Пример 1А - Относительная эффективность тестируемых пептидов в мышиной модели астмы

I. Протоколы и методы

Эксперименты были разработаны, чтобы тестировать действительно ли MANS пептид и другие тестируемые родственные пептиды ингибируют гиперсекрецию в мышиных дыхательных путях in vivo. Овальбумин-сенсибилизированная мышиная модель аллергического воспаления и астмы, использованная в этих исследованиях, такая же, как описано у Singer et al. (2004), supra. В качестве негативного контроля, контрольный пептид, содержащий N-концевую миристоильную группу и те же аминокислоты, что и MANS пептид, но расположенные в случайном порядке (т.е. случайная N-концевая последовательность, RNS, миристоил-пептид 232), был протестирован параллельно с предполагаемыми активными пептидами. BP2 мышей возрастом 6-8 недель иммунизировали дважды в неделю, вводя 1 мкг овальбумина внутривенно. После 14-дневной сенсибилизации животных обрабатывали распыленным овальбумином, который через 72 часа вызывает продолжительную гиперплазию клеток Гоблета. В момент времени, равный 72 часам, доставляли секреторное средство метахолин (60 мМ), используя систему распыления Buxco, обеспечивающую высококачественный аэрозоль в течение 90 секунд. За 15 минут до введения секреторного средства внутритрахейно вводили 50 мкл тестируемого пептида в 3 различных концентрациях (10 мкМ, 100 мкМ или 140 мкМ). RNS пептид тестировали только при наивысшем уровне дозы (50 мкл 140 мкМ раствора). MANS также, как и RNS пептид, были легко растворены в 120 мМ растворе ацетата натрия, рН 7. Различные контроли, использованные в эксперименте, сведены в Таблицу I ниже. Каждый эксперимент проводили, используя по 6 мышей на каждую точку, и каждый набор экспериментов повторяли 3 раза. Чтобы протестировать вариации от линии к линии, эксперимент повторили с Balb/C мышами по сходному протоколу. Как стимулированная, так и не стимулированная секреция муцина у мышей, обработанных 120 мM раствором ацетата натрия (данные не показаны), были идентичны с солевым контролем. После введения метахолина животных умерщвляли, и для анализа секретированного муцина предпринимали бронхоальвеолярный лаваж (BAL) с 6 животными в каждой группе.

Таблица I показывает основной протокол эксперимента.

Таблица I - основной протокол метахолин-индуцированной гиперсекреции муцина в присутствии тестируемого пептида Тестируемая группа #
Мышей Обработка Пептиды Введение секреторного средства Солевой контроль 6 Свободный от эндотоксина раствор 0,9% NaCl Нет Да Солевой контроль 6 Свободный от эндотоксина раствор 0,9% NaCl Нет Нет Тестируемый пептид 6 Свободный от эндотоксина раствор 0,9% NaCl + 140 мкМ каждого тестируемого пептида Каждый тестируемый пептид Да Тестируемый пептид 6 Свободный от эндотоксина раствор 0,9% NaCl + 100 мкМ каждого тестируемого пептида Каждый тестируемый пептид Да Тестируемый пептид 6 Свободный от эндотоксина раствор 0,9% NaCl + 100 мкМ каждого тестируемого пептида Каждый тестируемый пептид Нет Тестируемый пептид 6 Свободный от эндотоксина раствор 0,9% NaCl + 10 мкМ каждого тестируемого пептида Каждый тестируемый пептид Да Тестируемый пептид 6 Свободный от эндотоксина раствор 0,9% NaCl + 10 мкМ каждого тестируемого пептида Каждый тестируемый пептид Нет Негативный (контрольный) пептид (RNS) 6 Свободный от эндотоксина раствор 0,9% NaCl + 140 мкМ пептида RNS RNS Да

II. Анализ BAL жидкости

Мышей умерщвляли с помощью транслокации шейных позвонков с последующим быстрым обнажением трахеи и постановкой катетера через небольшой надрез. Собрали 0,5 мл жидкости после бронхоальвеолярного лаважа (BAL) с последующим 3 х разведением в 1 мл PBS, содержащем PMSF (5 мM), EDTA (5 мM) и DTT (5 мM). BAL жидкость разделили на клеточную и бесклеточную фракции посредством короткого центрифугирования, предваряющего любой предпринятый анализ. Бесклеточные супернатанты анализировали на присутствие муцина посредством метода ELISA, используя анти-муциновые антитела, для которых показано, что они реагируют с мышиным муцином. Более точно, в данном анализе использовали мышиные анти-MUC5AC антитела, которые распознают углеводородную часть секретируемого муцина. Данные, полученные для каждого BAL образца, нормализовали по отношению к общему количеству белка, как определено в анализе по Бредфорду. Содержание муцина отобразили как разность величины, полученной с анти-муциновыми антителами, и величины, полученной с контрольными не муциновыми антителами. Все данные ELISA статистически обработали, используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Были рассмотрены экспериментальные данные, достоверно отличающиеся от контроля, когда р<0,05.

Таблицы II, III, IV, V и VI суммируют влияние различных пептидов на секрецию муцина в Balb/C и BP2 мышах. Как показано в таблице II, при 100 мкМ концентрации различных тестируемых пептидов, секреция муцина находится в интервале от 8% до 56% от контроля (т.е. в отсутствие пептида).

Таблица II - Секреция муцина в мышиной модели астмы (Эксперименты на Balb/C мышах) Пептид (пептидный # идентификатор) % от контроля Средняя погрешность Нет пептида 100 4,2 MANS, myr-пептид 1 33,8 5,8 RNS, myr-пептид 232 96 5,2 myr-пептид 79 50 10,8 myr-пептид 233 21 14,2 myr-пептид 234 8 4,2 myr-пептид 235 13 3,3 пептид 79 10 3,3 myr-пептид 234-NH₂ 27,8 1,6 myr-пептид 106 33,6 5,8 пептид 106 33,8 3,3 myr-пептид 106-NH₂ 29,3 4,2 myr-пептид 236-NH₂ 51 2,0 Ас-пептид 106 21,5 18,3 myr-пептид 137 55 4,2 myr-пептид 137-NH₂ 56 3,3 Все пептиды тестировали при концентрации 100 мкМ. Все величины достоверны относительно контроля (р<0,001), за исключением myr-пептида 137 (р<0,1) и RNS.

Таблица III - Секреция муцина в мышиной модели астмы (Эксперименты на Balb/C мышах) Пептид (пептидный # идентификатор) % от контроля Средняя погрешность Нет пептида 100 8,1 MANS, myr-пептид 1 40 11,8 RNS, myr-пептид 232 81** 2,8 myr-пептид 11 54 5,1 myr-пептид 37 35** 11,8 myr-пептид 79 48 10,3 myr-пептид 15 38* 10,6 myr-пептид 45 35** 10,3 myr-пептид 91 68 14,7 myr-пептид 153 50 7,3 Все пептиды тестировали при концентрации 100 мкМ.
*=величины достоверные относительно контроля (р<0,05); **=величины достоверные относительно контроля (р<0,01).

Таблица IV - Секреция муцина в мышиной модели астмы (Эксперименты на Balb/C мышах) Пептид (пептидный # идентификатор) % от контроля Средняя погрешность Нет пептида 100 5,3 MANS, myr-пептид 1 (100 мкМ) 29** 4,2 RNS, myr-пептид 232 (100 мкМ) 108 8,5 пептид 237 (10 мкМ) 67*+ 8,5 пептид 237 (100 мкМ) 8** 3,8 myr-пептид 106 (10 мкМ) 74*+ 10,6 myr-пептид 106 (100 мкМ) 24** 9,6 пептид 106 (10 мкМ) 64* 4,2 пептид 106 (100 мкМ) 40** 9,6 myr-пептид 106-NH₂ (10 мкМ) 67*+ 4,2 myr-пептид 106-NH₂ (100 мкМ) 17** 5,3 *=величины достоверные относительно контроля (р<0,05); **=величины достоверные относительно контроля (р<0,01), +=величины достоверные относительно 100 мкМ обработки (р<0,05).

Таблица V - Секреция муцина в мышиной модели астмы (Эксперименты на BP2 мышах) (% от контроля)   Секреция муцина (% от контроля) Пептид (Конц.) 10 мкМ 100 мкМ 140 мкМ MANS пептид 35 12 8 RNS пептид - 100 100

Эксперименты были разработаны, чтобы определить продолжительность действия тестируемых пептидов в мышиной модели астмы. Как описано в Способе 1A, Balb/C мышей иммунизировали овальбумином. Через 14 дней животным вводили овальбумин в виде аэрозоля. Через 72 часа доставили посредством аэрозолизации секреторное средство метахолин. Тестируемые пептиды (50 л 100 М раствора) вводили внутритрахейно за 30 мин, 60 мин или 120 мин перед введением метахолина. Животных умерщвляли и предпринимали BAL анализ секретируемого муцина. Результаты этого эксперимента даны в Таблице VI.

Таблица VI - Продолжительность действия тестируемых пептидов у мышей (эксперименты на Balb/C мышах) (% от контроля) Пептид 30 мин 60 мин 120 мин Контроль 100 100 100 MANS, myr-пептид 1 7 44 50 RNS, myr-пептид 232 100 100 100 Ac-пептид 106 21 72 70 пептид 106 23 48 57

Альтернативная тестируемая мышиная модель и способ, количественно определяющий муцин в легких мышей, пригодны, чтобы оценить активность пептидов настоящего изобретения. Этот способ описан Evans et al. (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol.31, pp 382-394, 2004). Коротко, Balb/C самок мышей (возрастом 5-8 недель, 20-25 г каждая) сенсибилизируют еженедельно в течение четырех недель внутрибрюшинными инъекциями 100 мкл раствора, содержащего 2,2 мг алюминиевых квасцов и 20 мкг овальбумина в нормальном солевом растворе. Через 7 дней после последней внутрибрюшинной инъекции мышам вводят посредством введения аэрозоля более 30 минут 2,5% раствор овальбумина, растворенного в нормальном солевом растворе. Аэрозоль генерируют распылителем сжатого воздуха AeroMist CA-209 (CIS-US, Inc., Bedford, MA).

Через три дня после введения овальбумина по 50 мкл тестируемого пептида доставляют в течение примерно 2-3 минут в каждую ноздрю мыши аликвотами по 10 мкл. Пятнадцатью минутами позже мышей обрабатывают около 5 минут распыленным 100 мМ раствором ATP. Через 20 минут мышей анестезируют внутрибрюшинной инъекцией смеси кетамина, ксилазина и ацепромазина, и легкие перфузируют солевым раствором через правый сердечный желудочек, чтобы очистить кровь от легочных тканей. Под глубокой анестезией животных трахеостомируют, используя 20-калибровую канюлю с тупым кончиком, и умерщвляют посредством обескровливания через брюшную аорту. Фиксатор (4% параформальдегид в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,0) вливают внутритрахейно под давлением 10-15 см, и легкие фиксируют in situ в течение 30 минут, удаляют из грудной полости и фиксируют в течение ночи при 4°С. Легкие помещают в парафин и разрезают на 6 мкм секции.

Для флюоресцентного мечения муцина ткани прокрашивают, используя процедуру флуоресцентного окрашивания по Шиффу с помощью йодной кислоты (PAFS). Сначала ткани окисляют в 1% йодной кислоте (10 мин), промывают, обрабатывают акрифлавиновым флуоресцентным реагентом Шиффа (0,5% акрифлавин HCl вес/об., 1% метабисульфит натрия вес/об., 0,01 н. HCl) в течение 20 мин, промывают в деионизованной дважды Н₂О, и промывают 2х по 5 мин в кислом спирте (0,1 н. HCl в 70% этаноле). Предметные стекла обезвоживают в градиенте раствора этанола и дают возможность высохнуть на воздухе в темноте. Однажды высушенные PAFS-окрашенные препараты приклеивают к покровным стеклам препаративной средой с Канадским бальзамом (50% смолы Канадского бальзама, 50% метил салицилата; Fisher Chemicals).

Для количественной оценки муцина PAFS-окрашенные препараты исследуют под 40х объективом. Фиксируют изображения 10 областей аксиальных бронхов, регулировкой камеры управляют, используя MagnaFire 2.1 (Optronics). Воспроизведение PAFS изображений предпринимают путем возбуждения образцов, используя двухступенчатый возбуждающий фильтр (пики 500 нм и 573 нм), и наблюдение образцов осуществляют, используя двухступенчатый эмиссионный фильтр с пиками при 531 нм (зеленый) и 628 нм (красный). Для каждой области изображение сначала получают, используя только красный поглощающий канал камеры (экспозиция 590 мс). То же самое изображение затем еще раз фиксируют, используя оба канала камеры - и красный, и зеленый (590 мс красный, 450 мс зеленый). Для морфометрического анализа затем измеряют объемную плотность и интенсивность флуоресценции окрашивания муцина, используя ImagePro Plus. Объемную плотность окрашивания муцина в эпителии дыхательных путей подсчитывают стереологически. Коротко, отношение окрашенной площади поверхности к общей площади поверхности эпителия, поделенное на длину границы измерения, которая является продуктом общей площади поверхности эпителия, длины базисной мембраны и геометрической константы 4/π. В результате, данные представлены как объем внутриклеточного содержания муцина на единицу площади поверхности базисной мембраны. Секреция муцина выражена как фракция общего содержания эпителия.

Пример 1B - Влияние введения распыленного пептида Аc-пептида 106 на гиперсекрецию муцина в мышиной модели метаплазии клеток Гоблета и обструкции дыхательных путей

Эффективность распыленного пептида Ac-пептида 106 на гиперсекрецию муцина в мышиной модели астмы была определена при двух концентрациях. Коротко, 5-8-недельных Balb/C мышей иммунизировали овальбумином еженедельно, как описано выше в Примере 1А, в течение 3 недель. На 28 день мышам вводили в течение 30 минут распыленный 2,5% овальбумин в нормальном солевом растворе. Через три дня после введения овальбумина каждой группе мышей (n=2) вводили распыленный изотонический раствор Ac-пептида 106 в концентрациях 10 мМ или 30 мМ в течение 1 часа с помощью распылителя AeroMist CA-209. Общий средний аэродинамический диаметр частиц составил 1,49 мкм (в пределах 0,4-4,7 мкм). Для данных концентраций Ac-пептида 106 и для данного размера частиц рассчитанное отложение Ac-пептида 106 в легких составило 0,38 мг/кг веса тела и 1,1 мг/кг веса тела, соответственно.

Введение Ac-пептида 106 следовало немедленно за введением аэрозоля секреторного средства аденозин трифосфата (ATP) (100 мМ в солевом растворе) в течение 5 минут. Мышей умерщвляли, легкие собрали в течение 20 минут. Легкие промывали в солевом растворе, зафиксировали парафармальдегидом, поместили в парафин и секционировали. Провели количественный анализ секций на присутствие муцина согласно количественному иммуногистохимическому методу Evans et al. (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol.31, pp 382-394, 2004). Результаты показали, что Ac-пептид 106 был эффективен как ингибитор на 30-67% ATP-индуцированной гиперсекреции муцина при концентрациях 0,38 и 1,1 мг/кг веса тела, соответственно.

Пример 2 - Качественная оценка растворимости тестируемых пептидов в 0,5 нормальном солевом растворе

Различные тестируемые пептиды (1-5 мг каждого) аккуратно взвешивали в индивидуальных стеклянных 2 мл флаконах с завинчивающимися крышками и к ним добавляли аликвоты по 25 мкл 0,5 н. солевого раствора при 25°С и нормальном давлении, рН 6,5. Растворимость оценивали визуально. Если тестируемый пептид растворялся полностью в первой аликвоте солевого раствора, то его растворимость рассчитывали, и утверждали большее значение, чем рассчитанное количество. Таким образом, если 3,5 мг тестируемого пептида растворяется немедленно в первой 25 мкл аликвоте 0,5 н. солевого раствора, то его растворимость устанавливают как >140 мг/мл. Подобным образом, если 1,7 мг тестируемого пептида не растворяется в 1,7 мл 0,5 н. солевого раствора, то его растворимость устанавливают как <1 мг/мл. Результаты оценки растворимости различных тестируемых пептидов собраны в список в Таблице VII.

Растворимость различных пептидов в полунормальном солевом растворе может быть также определена с помощью одного из двух следующих полуколичественных методов - Метода 1 и Метода 2. Метод 1 может быть использован для тех пептидов, чья растворимость в полунормальном солевом растворе будет меньше чем примерно 10 мг/мл, тогда как Метод 2 может быть использован для пептидов, которые будут растворимы в полунормальном солевом растворе при концентрации более чем примерно 30 мг/мл.

Метод 1

Каждый пептид растворяют в диметилсульфоксиде (DMSO) до концентрации 1 мг/мл. Аликвоту этого раствора разводят в пять раз в полунормальном солевом растворе, чтобы получить раствор 0,2 мг/мл. Полученный пептидный раствор подвергают ВЭЖХ анализу, используя С18/5 микроколонку. Буферы для элюирования состоят из 0,1% раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в воде (буфер А) и 0,1% раствора TFA в 100% ацетонитриле (буфер В). Пептиды разводят в градиенте буфера В от 5% до 45% в течение 20 мин. Площадь под кривой (AUC) для каждого пептидного пика может быть таким образом определена. Эта AUC величина может быть использована как стандарт (AUC-Std), чтобы определять концентрацию каждого соответствующего пептида в супернатанте насыщенного раствора.

Насыщенный раствор каждого пептида может быть приготовлен путем добавления подходящего количества пептида к 1 мл полунормальному солевому раствору до получения мутной суспензии. Последний затем центрифугируют при 10000g в течение примерно 10 мин. Супернатант затем подвергают ВЭЖХ анализу. Супернатант затем разводят в полунормальном солевом растворе, и если это необходимо, то разводят перед ВЭЖХ анализом. AUC (AUC-Sat) величину, полученную из этого анализа, используют, чтобы определить концентрацию пептида в насыщенном растворе по следующей формуле:

Концентрация пептида в насыщенном растворе=AUC-Std × 0,2/AUC-Sat.

Метод 2

Этот метод может обеспечить оценку растворимости пептида в полунормальном солевом растворе. Метод состоит из добавления взвешенного количества (обозначенного как «хх» миллиграммов) пептида к 1 мл полунормального солевого раствора до растворения. Результаты представляют как >хх мг/мл, где хх количество пептида, добавленного к полунормальному солевому раствору.

Таблица VII - Пептидная растворимость при 20°С в 0,5 н. солевом растворе, рН 6,5 № последовательности Растворимость в 0,5 н. солевом растворе (мг/мл) myr-пептид 1 <5,0 Ac-пептид 1 >125 myr-пептид 232 >15 myr-пептид 11 >2,0 myr-пептид 37 >2,0 myr-пептид 79 >2,0 myr-пептид 238 >2,0 myr-пептид 233 >3,0 myr-пептид 234 >3,0 myr-пептид 235 >60 пептид 79 >60 myr-пептид 79-NH₂ <1,0 myr-пептид 237 <1,0 myr-пептид 237-NH₂ <1,0 пептид 237 >80 myr-пептид 234-NH₂ <2,0 Ac-пептид 79-NH₂ >60 Ac-пептид 79 >100 Ac-пептид 239 >50 Ac-пептид 240 N/A Ac-пептид 241 >50 myr-пептид 106 >10 пептид 106 >70 myr-пептид 106-NH₂ <10 myr-пептид 236 <10 myr-пептид 236-NH₂ <10 пептид 106-NH₂ >100 Ac-пептид 106 >100 циклический-пептид 106 >150 Ac-пептид 242 >100 Ac-пептид 243 >50 Ac-пептид 236 >80 Ac-пептид 244 >120 Ac-пептид 245 >100 Ac-пептид 247 >100 Ac-пептид 248 >100 Ac-пептид 249 <1 myr-пептид 121 <1,0 Ac-пептид 121 >20 myr-пептид 137 <1,0 myr-пептид 137-NH₂ N/A Ac-пептид 250 N/A Ac-пептид 137 >200 myr-пептид 15 >80 myr-пептид 45 >80 myr-пептид 91 <20 myr-пептид 153 <10 myr-пептид 143 <1,0 Ac-пептид 143 >230 myr-пептид 179 <1,0 Ac-пептид 179 >150 myr-пептид 219 <1,0 Ac-пептид 219 >200 Ac-пептид 219-NH₂ >200 Ac-пептид 251 >200 Ac-пептид 93-NH₂ >90 Ac-пептид 108-NH₂ >150 Ac-пептид 124-NH₂ >100 Ac-пептид 141-NH₂ >200 Ac-пептид 159-NH₂ >200 Ac-пептид 246 <30 Ac-пептид 252 <30

Пример 3 - Стабильность тестируемых пептидов в биологических жидкостях

Различные тестируемые пептиды анализировали, чтобы определить чувствительность тестируемых пептидов к протеолизу в биологических жидкостях, таких как плазма человека, жидкость BAL человека и слизь пациентов с CF. Кроме того, для образцов, обнаруживших уменьшение концентрации, предприняли кинетические анализы первого порядка для того, чтобы определить период полужизни тестируемых пептидов. Образцы анализировали или в день получения или хранили при -20°С и анализировали в течение последующих двух дней.

I. Сбор и обработка биологических жидкостей

А. Плазма человека:

Образцы свежей крови человека собирали в вакуумные пробирки для сбора крови с цитратным буфером (в отсутствие EDTA или гепарина). Красные кровяные клетки (RBC) удаляли центрифугированием крови при 4000g в течение 10 мин при 4°С. Аликвоты плазмы (0,9 мл) затем смешивали с 0,1 мл раствора тестируемого пептида с концентрацией 0,5 мг/мл в буфере 75 мМ ацетата натрия при рН 7,0 и инкубировали на водяной бане, поддерживая температуру 37°С. Идентичные аликвоты по 10 мкл отбирали через интервалы времени 5, 15, 30, 60 и 180 минут и немедленно «блокировали», добавляя 990 мкл раствора, состоящего из 50% ацетонитрила + 50% воды, содержащей 0,2% муравьиную кислоту. Образцы затем подвергали анализу жидкостной хроматографии-масс спектрометрии (ЖХМС).

В. BALF человека:

Образцы BALF, собранные у COPD пациентов, были получены и заморожены. Образцы BALF размораживали, смешивали вместе и центрифугировали при 10000g в течение 10 мин при 4-8°С. Супернатант (0,9 мл) смешивали с 0,1 мл раствора тестируемого пептида с концентрацией 0,5 мг/мл в буфере 75 мМ ацетата натрия при рН 7,0, и затем процессировали и анализировали, как описано выше.

С. Слизь человека с CF:

Замороженную слизь (слюну) пациентов с CF размораживали и смешивали с 2 объемами буфера 75 мМ ацетата натрия при рН 7,0 при помощи стеклянного гомогенизатора тканей, центрифугировали при 10000g в течение 10 мин при 4-8°С. Осадок ресуспендировали в 1 объеме ацетатного буфера и центрифугировали. Два супернатанта объединяли и использовали, как следует далее. Супернатант (450 мкл) смешивали с 50 мкл раствора пептида с концентрацией 0,5 мг/мл в буфере 75 мМ ацетата натрия при рН 7,0, и затем процессировали и анализировали, как описано выше.

II. Концентрационный анализ

Все образцы анализировали, используя ЖХ/МС/МС (MDS/SCIEX, API 4000 Модель). Хроматографию проводили, используя Phenomenex Luna C18 колонку, масс-спектрометрию проводили, используя ионизацию с электрораспылением положительных ионов.

А. Анализ пептидов Ac-ПЕПТИДА 79-NH ₂ , ПЕПТИДА 106-NH ₂ , Ac-ПЕПТИДА 106 в плазме человека и жидкости BAL, и анализ пептидов myr-ПЕПТИДА 106, ПЕПТИДА 106, ПЕПТИДА 106-NH ₂ , Ас-ПЕПТИДА 106 и cyc-ПЕПТИДА 106 (циклический пептид) в плазме человека и слизи человека с CF

Калибровочные стандарты анализировали с помощью ЖХМС при концентрациях 0,100 мкг/мл, 1,00 мкг/мл, 10,0 мкг/мл и 100 мкг/мл для каждого пептида, за исключением калибровочных стандартов, для пептидов myr-ПЕПТИДА 106, ПЕПТИДА 106, ПЕПТИДА 106-NH₂ и циклического пептида cyc-ПЕПТИДА 106 в слизи человека, которые анализировали при концентрациях 0,100 мкг/мл, 1,00 мкг/мл, 10,0 мкг/мл и 75 мкг/мл. Стандарты готовили в 1% BALF человека, плазме или в слизи, растворенных в смеси 50/50 вода/ацетонитрил и содержащих 0,2% муравьиную кислоту. Величины чувствительности прибора для каждого набора стандартов подбирали, используя обратно пропорциональную квадрату концентрации линеаризованную линию наименьших квадратов. Концентрации образцов рассчитывали, используя угол наклона и пересечение с этой линией. Концентрации за границей предела калибровки определяли экстраполяцией калибровочной кривой.

В. Анализ пептидов myr-ПЕПТИДА 234-NH ₂ , myr-ПЕПТИДА 234, ПЕПТИДА 106 и myr-ПЕПТИДА 106 в плазме человека и в BALF

Идентичные калибровочные стандарты анализировали при концентрации 50 мкг/мл каждого пептида. Величины чувствительности прибора для каждого набора стандартов подбирали посредством пересечения с 0, используя невзвешенную линеаризованную линию наименьших квадратов. Концентрации образцов рассчитывали, используя наклон и пересечение этой линии.

С. Анализ пептидов ПЕПТИДА 237, myr-ПЕПТИДА 106-NH ₂ , myr-ПЕПТИДА 236 и myr-ПЕПТИДА 236-NH ₂ в плазме человека и в BALF

Для анализа пептидной концентрации в плазме, идентичные калибровочные стандарты анализировали при концентрациях 25 мкг/мл и 50 мкг/мл каждого пептида. Величины чувствительности прибора для каждого набора стандартов подбирали посредством пересечения с 0, используя невзвешенную линеаризованную линию наименьших квадратов. Концентрации образцов рассчитывали, используя наклон и пересечение этой линии. Концентрации за границей предела калибровки определяли экстраполяцией калибровочной кривой.

Для анализа пептидной концентрации в образцах BALF один калибровочный стандарт концентрацией 50 мкг/мл, приготовленный в смеси BALF, воды, ацетонитрила и муравьиной кислоты, анализировали с каждым набором образцов.

III. Кинетические профили

Кинетические профили первого порядка определяли, используя программу Уотсона для всех образцов, которые проявляли заметное понижение концентрации. Уотсон приводит в соответствие логарифмически трансформированные данные с линией наименьших квадратов, чтобы определить такие параметры, как С_max (максимальная концентрация), пересечение, коэффициент кинетики, наклон и Т_1/2 (период полужизни). Полученные кинетические параметры были основаны на линейном подборе, а не на фактических величинах концентрации.

Нулевые точки калибровочных стандартов в растворе не включали в состав кинетических профилей. Однако настоящая кинетика первого порядка не требует включения данных по нулевой точке отсчета для того, чтобы точно описать изменение концентрации как функцию от времени.

Периоды полужизни тестируемых пептидов в плазме человека (Плазма т_1/2), BALF человека (BALF т_1/2) и CF слизи человека (Слизь т_1/2) внесены в список в Таблице VIII.

Таблица VIII Идентификатор Пептида # Плазма т_1/2
(часы)
(1^ый эксп.) Плазма т_1/2
(часы)
(2^ой эксп.) BALF т_1/2
(часы)
(1^ый эксп.) BALF т_1/2
(часы)
(2^ой эксп.) Слизь т_1/2
(часы)
(1^ый эксп.) Слизь т_1/2
(часы)
(2^ой эксп.) myr-пептид 234-NH₂ 3,82 -- 1,70 -- -- -- myr-пептид 234 * -- 1,08 -- -- -- пептид 106 0,28 0,15 1,88 -- 0,23 0,37 myr-пептид 106 1,23 0,90 1,03 -- 9,53 3,00 пептид 237 0,49 -- * * -- -- myr-пептид 106-NH₂ * -- 10,52 12,81 -- -- myr-пептид 236 0,72 -- 3,55 2,94 -- -- myr-пептид 236-NH₂ * -- 4,16 4,08 -- -- Ac-пептид 79-NH₂ 2,64 -- * -- -- -- пептид 106-NH₂ 0,30 0,13 4,00 -- 0,08 0,13 Ac-пептид 106 * 0,03 1,89 -- 0,55 0,47 циклический-пептид 106 -- 1,04 -- -- 1,10 2,00 #: myr и Ac являются соответственно миристоильной и ацетильной группами, ковалентно связанными с пептидом по N-концевому сайту аминогруппы; -NH₂ представляет собой ковалентно связанный амид по С-концевой карбоксильной группе пептида; seq no и cyc являются аббревиатурами, обозначающими номер последовательности и циклический, соответственно.
--: Эксперимент не проводили.
*: Недостаточно экспериментальных данных, чтобы рассчитать период полужизни.

Пептид, обозначенный как myr-пептид 236, является миристоил-ПЕПТИДОМ 236. Все остальные пептиды, используемые в эксперименте, описаны выше.

Пример 4 - Влияние MANS пептида на секрецию слизи в верхних дыхательных путях приматов

Целью эксперимента было определить способность MANS пептида ингибировать секрецию слизи в верхних дыхательных путях взрослых здоровых резус-макак. Использованный тест является стандартным методом для оценки назальной секреторной активности, и приматы обычно обеспечивают хорошую корреляцию с такой активностью у человека.

Методы

Для этого эксперимента использовали 17 здоровых молодых взрослых самцов резус-макак, не имеющих какой-либо предыстории ринитов. Ни одна из обезьян не болела ринитами до или после исследования. Назальную секрецию слизи каждой обезьяны измеряли в ее левой ноздре перед любой обработкой. Эту величину принимают за 100%

секреции слизи. Обезьян затем случайным образом разделили на 4 следующие группы:

Группа 1: Нормальный солевой раствор, контроль (n=3);

Группа 2: Ацетат натрия, контроль растворителя (n=4);

Группа 3: RNS пептид, негативный контроль (n=5);

Группа 4: MANS пептид, тестируемый пептид (n=5).

Солевой раствор помещали в левую ноздрю всех 17 обезьян перед любой обработкой. Правые ноздри обрабатывали 2,0 мл или солевого раствора, ацетата натрия, RNS пептида или MANS пептида. Таким образом, у каждого животного был свой собственный внутренний контроль. Назальный лаваж проводили на обеих ноздрях каждого животного через 1 час после обработки тестируемыми композициями. Все лаважи немедленно замораживали при -80°С и анализировали на предмет содержания слизи с помощью метода ELISA.

А. Тестируемые композиции:

Нормальный солевой раствор, стерилизованный фильтрованием; Ацетат натрия, 150 мкМ, стерилизованный фильтрованием; RNS Пептид - 140 мкМ раствор в 150 мкМ растворе, стерилизованного фильтрованием, ацетата натрия и MANS Пептид - 140 мкМ раствор в 150 мкМ растворе, стерилизованного фильтрованием, ацетата натрия.

В. Тестируемые животные:

Резус-макаки; число животных: 17; пол: все здоровые самцы; возраст: 3-4 года; вес тела: 4-7 кг, в среднем 5,03 кг; период акклиматизации: 7 дней; метод идентификации: уникальная татуировка в виде 5-значного ID номера; история: всех животных за 12-24 месяца до этого теста использовали для исследования вакцины, а именно иммунизации против менингита. Все животные также получали обычную иммунизацию против кори и столбняка во время младенчества.

С. Ведение животных:

Уход за животными: условия соответствуют стандартным плановым процедурам, которые основаны на «Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных». Пища: стандартную диету резус-макакам обеспечивали ежедневно; вода: свободно доступную муниципальную воду доставляли посредством автоматической водопроводной системы; размещение: животных размещали индивидуально в проверенных коррозийно-стойких стальных клетках, идентифицированных с помощью карточки, показывающей число животных, код теста, пол, код животного; окружающая среда: комнатную температуру измеряли ежедневно. Температурные границы для комнаты находились в пределах 20-26°С. Влажность в комнате измеряли ежедневно, границы влажности находились в пределах 40-70%. Световой цикл контролировали, используя автоматический таймер (12 часов света, 12 часов темноты); персонал: вовлеченные сотрудники были соответствующе квалифицированы и обучены работе с приматами.

Результаты

Результаты представляют данные о том, что RNS пептид, буфер ацетата натрия или нормальный солевой раствор не имеют никакого влияния на секрецию слизи, тогда как почти 75% MANS пептидов ингибируют секрецию слизи.

Пример 5 - Метод культур клеток тканей для определения секретирующегося муцина в бронхиальных эпителиальных клетках человека

HBE1 представляет собой вирус-трансформированную бронхиальную эпителиальную клеточную линию человека, способную к секреции муцина при культивировании в пограничных условиях воздуха и жидкости. HBE1 клетки культивировали в пограничных условиях воздуха и жидкости, как описано ранее (Li et al., J.Biol.Chem., volume 276, pp 40982-40990, 2001). Коротко, HBE1 клетки культивировали в пограничных условиях воздуха и жидкости путем рассевания подходящего количества клеток в 12-луночные чистые культуральные планшеты (Costar, Cambrige, MA), которые были покрыты тонким слоем коллагена типа I, выделенного из крысиного хвоста (Collaborative Biomedical, Bedford, MA). Вначале, в течение 5-7 дней при влажности воздуха 95% и 5% СО₂ в окружающем пространстве клетки культивировали погруженными в среду до тех пор, пока клетки не будут располагаться близко друг к другу. В это время создавали пограничные условия воздуха и жидкости путем удаления апикальной части среды и осуществляли питание клеток латерально. После этого среду меняли ежедневно. Клетки дополнительно культивировали еще 14 дней, чтобы достичь полной дифференциации. Накопленный муцин на апикальной поверхности клеток удаляли с помощью промывания солевым раствором в фосфатном буфере, рН 7,2. Чтобы собрать базовую секрецию муцина, клетки инкубировали в течение 30 мин в одной среде и собирали муцин, секретированный в апикальную среду, и оценивали его количество с помощью ELISA. Чтобы определить гиперсекрецию муцина, индуцированную секреторным средством, индуцирующим муцин, клетки экспонировали в течение 30 мин со средой, содержащей 0,5 мкМ форболмиристатацетата (PMA), после чего муцин собирали и оценивали его количество с помощью ELISA. Для того чтобы определить ингибирование посредством тестируемого пептида PMA-индуцированной гиперсекреции муцина, клетки преинкубировали в среде, содержащей 25 или 50 мкМ тестируемого пептида в течение 15 мин с последующей инкубацией с 0,5 мкМ PMA в течение 30 мин. Шесть лунок использовали для каждого тестируемого пептида и для каждого контроля. Муцин, секретированный в апикальную среду, собирали и оценивали его количество с помощью метода сэндвич ELISA, используя специфические для муцина антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой (MUC5A) (Zymed Laboratories, San Francisco, CA).

Обработка клеток HBE1 с 0,5 мкМ PMA привела к увеличению секреции муцина на 20%. PMA-индуцированное увеличение секреции муцина блокировали на 100% предварительной обработкой с 25 мкМ MANS пептидом или обработкой с 25 мкМ Ac-пептидом № 106. Ac-пептид № 219 при концентрации 25 мкМ не только ингибировал на 100% PMA-индуцированную секрецию муцина, но и ингибировал секрецию муцина до уровня на 20% меньшего, чем в нестимулированной контрольной среде. Ac-пептид № 251 имел минимальный эффект ингибирования только на 6% PMA-индуцированного увеличения секреции муцина.

Таблица IX содержит список пептидов данного изобретения и соответствующих им аминокислотных последовательностей и соответствующих SEQ ID NO.

Таблица IX. Пептиды и аминокислотные последовательности Пептид No. Последовательность Последовательности ID No. пептид 1 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 1 пептид 2 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 2 пептид 3 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 3 пептид 4 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 4 пептид 5 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 5 пептид 6 QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 6 пептид 7 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 7 пептид 8 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 8 пептид 9 QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 9 пептид 10 FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 10 пептид 11 GAQFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 11 пептид 12 AQFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 12 пептид 13 QFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 13 пептид 14 FSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 14 пептид 15 SKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 15 пептид 16 GAQFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 16 пептид 17 AQFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 17 пептид 18 QFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 18 пептид 19 FSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 19 пептид 20 SKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 20 пептид 21 KTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 21 пептид 22 GAQFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 22 пептид 23 AQFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 23

пептид 24 QFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 24 пептид 25 FSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 25 пептид 26 SKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 26 пептид 27 KTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 27 пептид 28 TAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 28 пептид 29 GAQFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 29 пептид 30 AQFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 30 пептид 31 QFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 31 пептид 32 FSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 32 пептид 33 SKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 33 пептид 34 KTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 34 пептид 35 TAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 35 пептид 36 AAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 36 пептид 37 GAQFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 37 пептид 38 AQFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 38 пептид 39 QFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 39 пептид 40 FSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 40 пептид 41 SKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 41 пептид 42 KTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 42 пептид 43 TAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 43 пептид 44 AAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 44 пептид 45 AKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 45 пептид 46 GAQFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO. 46 пептид 47 AQFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 47 пептид 48 QFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 48 пептид 49 FSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 49

пептид 50 SKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 50 пептид 51 KTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 51 пептид 52 TAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 52 пептид 53 AAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 53 пептид 54 AKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 54 пептид 55 KGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 55 пептид 56 GAQFSKTAAKGEAA SEQ ID NO. 56 пептид 57 AQFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO. 57 пептид 58 QFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 58 пептид 59 FSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 59 пептид 60 SKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 60 пептид 61 KTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 61 пептид 62 TAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 62 пептид 63 AAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 63 пептид 64 AKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 64 пептид 65 KGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 65 пептид 66 GEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 66 пептид 67 GAQFSKTAAKGEA SEQ ID NO. 67 пептид 68 AQFSKTAAKGEAA SEQ ID NO. 68 пептид 69 QFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO. 69 пептид 70 FSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 70 пептид 71 SKTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 71 пептид 72 KTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 72 пептид 73 TAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 73 пептид 74 AAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 74 пептид 75 AKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 75

пептид 76 KGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 76 пептид 77 GEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 77 пептид 78 EAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 78 пептид 79 GAQFSKTAAKGE SEQ ID NO. 79 пептид 80 AQFSKTAAKGEA SEQ ID NO. 80 пептид 81 QFSKTAAKGEAA SEQ ID NO. 81 пептид 82 FSKTAAKGEAAA SEQ ID NO. 82 пептид 83 SKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 83 пептид 84 KTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 84 пептид 85 TAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 85 пептид 86 AAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 86 пептид 87 AKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 87 пептид 88 KGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 88 пептид 89 GEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 89 пептид 90 EAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 90 пептид 91 AAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 91 пептид 92 GAQFSKTAAKG SEQ ID NO. 92 пептид 93 AQFSKTAAKGE SEQ ID NO. 93 пептид 94 QFSKTAAKGEA SEQ ID NO. 94 пептид 95 FSKTAAKGEAA SEQ ID NO. 95 пептид 96 SKTAAKGEAAA SEQ ID NO. 96 пептид 97 KTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 97 пептид 98 TAAKGEAAAER SEQ ID NO. 98 пептид 99 AAKGEAAAERP SEQ ID NO. 99 пептид 100 AKGEAAAERPG SEQ ID NO. 100 пептид 101 KGEAAAERPGE SEQ ID NO. 101

пептид 102 GEAAAERPGEA SEQ ID NO. 102 пептид 103 EAAAERPGEAA SEQ ID NO. 103 пептид 104 AAAERPGEAAV SEQ ID NO. 104 пептид 105 AAERPGEAAVA SEQ ID NO. 105 пептид 106 GAQFSKTAAK SEQ ID NO. 106 пептид 107 AQFSKTAAKG SEQ ID NO. 107 пептид 108 QFSKTAAKGE SEQ ID NO. 108 пептид 109 FSKTAAKGEA SEQ ID NO. 109 пептид 110 SKTAAKGEAA SEQ ID NO. 110 пептид 111 KTAAKGEAAA SEQ ID NO. 111 пептид 112 TAAKGEAAAE SEQ ID NO. 112 пептид 113 AAKGEAAAER SEQ ID NO. 113 пептид 114 AKGEAAAERP SEQ ID NO. 114 пептид 115 KGEAAAERPG SEQ ID NO. 115 пептид 116 GEAAAERPGE SEQ ID NO. 116 пептид 117 EAAAERPGEA SEQ ID NO. 117 пептид 118 AAAERPGEAA SEQ ID NO. 118 пептид 119 AAERPGEAAV SEQ ID NO. 119 пептид 120 AERPGEAAVA SEQ ID NO. 120 пептид 121 GAQFSKTAA SEQ ID NO. 121 пептид 122 AQFSKTAAK SEQ ID NO. 122 пептид 123 QFSKTAAKG SEQ ID NO. 123 пептид 124 FSKTAAKGE SEQ ID NO. 124 пептид 125 SKTAAKGEA SEQ ID NO. 125 пептид 126 KTAAKGEAA SEQ ID NO. 126 пептид 127 TAAKGEAAA SEQ ID NO. 127

пептид 128 AAKGEAAAE SEQ ID NO. 128 пептид 129 AKGEAAAER SEQ ID NO. 129 пептид 130 KGEAAAERP SEQ ID NO. 130 пептид 131 GEAAAERPG SEQ ID NO. 131 пептид 132 EAAAERPGE SEQ ID NO. 132 пептид 133 AAAERPGEA SEQ ID NO. 133 пептид 134 AAERPGEAA SEQ ID NO. 134 пептид 135 AERPGEAAV SEQ ID NO. 135 пептид 136 ERPGEAAVA SEQ ID NO. 136 пептид 137 GAQFSKTA SEQ ID NO. 137 пептид 138 AQFSKTAA SEQ ID NO. 138 пептид 139 QFSKTAAK SEQ ID NO. 139 пептид 140 FSKTAAKG SEQ ID NO. 140 пептид 141 SKTAAKGE SEQ ID NO. 141 пептид 142 KTAAKGEA SEQ ID NO. 142 пептид 143 TAAKGEAA SEQ ID NO. 143 пептид 144 AAKGEAAA SEQ ID NO. 144 пептид 145 AKGEAAAE SEQ ID NO. 145 пептид 146 KGEAAAER SEQ ID NO. 146 пептид 147 GEAAAERP SEQ ID NO. 147 пептид 148 EAAAERPG SEQ ID NO. 148 пептид 149 AAAERPGE SEQ ID NO. 149 пептид 150 AAERPGEA SEQ ID NO. 150 пептид 151 AERPGEAA SEQ ID NO. 151 пептид 152 ERPGEAAV SEQ ID NO. 152 пептид 153 RPGEAAVA SEQ ID NO. 153

пептид 154 GAQFSKT SEQ ID NO. 154 пептид 155 AQFSKTA SEQ ID NO. 155 пептид 156 QFSKTAA SEQ ID NO. 156 пептид 157 FSKTAAK SEQ ID NO. 157 пептид 158 SKTAAKG SEQ ID NO. 158 пептид 159 KTAAKGE SEQ ID NO. 159 пептид 160 TAAKGEA SEQ ID NO. 160 пептид 161 AAKGEAA SEQ ID NO. 161 пептид 162 AKGEAAA SEQ ID NO. 162 пептид 163 KGEAAAE SEQ ID NO. 163 пептид 164 GEAAAER SEQ ID NO. 164 пептид 165 EAAAERP SEQ ID NO. 165 пептид 166 AAAERPG SEQ ID NO. 166 пептид 167 AAERPGE SEQ ID NO. 167 пептид 168 AERPGEA SEQ ID NO. 168 пептид 169 ERPGEAA SEQ ID NO. 169 пептид 170 RPGEAAV SEQ ID NO. 170 пептид 171 PGEAAVA SEQ ID NO. 171 пептид 172 GAQFSK SEQ ID NO. 172 пептид 173 AQFSKT SEQ ID NO. 173 пептид 174 QFSKTA SEQ ID NO. 174 пептид 175 FSKTAA SEQ ID NO. 175 пептид 176 SKTAAK SEQ ID NO. 176 пептид 177 KTAAKG SEQ ID NO. 177 пептид 178 TAAKGE SEQ ID NO. 178 пептид 179 AAKGEA SEQ ID NO. 179

пептид 180 AKGEAA SEQ ID NO. 180 пептид 181 KGEAAA SEQ ID NO. 181 пептид 182 GEAAAE SEQ ID NO. 182 пептид 183 EAAAER SEQ ID NO. 183 пептид 184 AAAERP SEQ ID NO. 184 пептид 185 AAERPG SEQ ID NO. 185 пептид 186 AERPGE SEQ ID NO. 186 пептид 187 ERPGEA SEQ ID NO. 187 пептид 188 RPGEAA SEQ ID NO. 188 пептид 189 PGEAAV SEQ ID NO. 189 пептид 190 GEAAVA SEQ ID NO. 190 пептид 191 GAQFS SEQ ID NO. 191 пептид 192 AQFSK SEQ ID NO. 192 пептид 193 QFSKT SEQ ID NO. 193 пептид 194 FSKTA SEQ ID NO. 194 пептид 195 SKTAA SEQ ID NO. 195 пептид 196 KTAAK SEQ ID NO. 196 пептид 197 TAAKG SEQ ID NO. 197 пептид 198 AAKGE SEQ ID NO. 198 пептид 199 AKGEA SEQ ID NO. 199 пептид 200 KGEAA SEQ ID NO. 200 пептид 201 GEAAA SEQ ID NO. 201 пептид 202 EAAAE SEQ ID NO. 202 пептид 203 AAAER SEQ ID NO. 203 пептид 204 AAERP SEQ ID NO. 204 пептид 205 AERPG SEQ ID NO. 205

пептид 206 ERPGE SEQ ID NO. 206 пептид 207 RPGEA SEQ ID NO. 207 пептид 208 PGEAA SEQ ID NO. 208 пептид 209 GEAAV SEQ ID NO. 209 пептид 210 EAAVA SEQ ID NO. 210 пептид 211 GAQF SEQ ID NO. 211 пептид 212 AQFS SEQ ID NO. 212 пептид 213 QFSK SEQ ID NO. 213 пептид 214 FSKT SEQ ID NO. 214 пептид 215 SKTA SEQ ID NO. 215 пептид 216 KTAA SEQ ID NO. 216 пептид 217 TAAK SEQ ID NO. 217 пептид 218 AAKG SEQ ID NO. 218 пептид 219 AKGE SEQ ID NO. 219 пептид 220 KGEA SEQ ID NO. 220 пептид 221 GEAA SEQ ID NO. 221 пептид 222 EAAA SEQ ID NO. 222 пептид 223 AAAE SEQ ID NO. 223 пептид 224 AAER SEQ ID NO. 224 пептид 225 AERP SEQ ID NO. 225 пептид 226 ERPG SEQ ID NO. 226 пептид 227 RPGE SEQ ID NO. 227 пептид 228 PGEA SEQ ID NO. 228 пептид 229 GEAA SEQ ID NO. 229 пептид 230 EAAV SEQ ID NO. 230 пептид 231 AAVA SEQ ID NO. 231

пептид 232 GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF SEQ ID NO. 232 пептид 233 GKQFSKTAAKGE SEQ ID NO. 233 пептид 234 GAQFSKTKAKGE SEQ ID NO. 234 пептид 235 GKQFSKTKAKGE SEQ ID NO. 235 пептид 236 GAQASKTAAK SEQ ID NO. 236 пептид 237 GAQASKTAAKGE SEQ ID NO. 237 пептид 238 GAEFSKTAAKGE SEQ ID NO. 238 пептид 239 GAQFSKTAAAGE SEQ ID NO. 239 пептид 240 GAQFSKTAAKAE SEQ ID NO. 240 пептид 241 GAQFSKTAAKGA SEQ ID NO. 241 пептид 242 AAQFSKTAAK SEQ ID NO. 242 пептид 243 GAAFSKTAAK SEQ ID NO. 243 пептид 244 GAQFAKTAAK SEQ ID NO. 244 пептид 245 GAQFSATAAK SEQ ID NO. 245 пептид 246 KAATKSFQAG SEQ ID NO. 246 пептид 247 GAQFSKAAAK SEQ ID NO. 247 пептид 248 GAQFSKTAAA SEQ ID NO. 248 пептид 249 GAQFSATAAA SEQ ID NO. 249 пептид 250 GAQASKTA SEQ ID NO. 250 пептид 251 AAGE SEQ ID NO. 251 пептид 252 GKASQFAKTA SEQ ID NO. 252

Наряду с тем, что изобретение описали в деталях и со ссылкой на его специфические воплощения, будет бесспорно для всякого квалифицированного в области техники, что различные изменения и модификации могут быть осуществлены без выхода за рамки сущности и объема изобретения.

Изобретение относится к пептидам, ингибирующим гиперсекрецию муцина. Пептиды имеют аминокислотную последовательность, содержащую до 24 аминокислотных остатков последовательности GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA, которая может иметь по меньшей мере одну аминокислотную замену в указанной последовательности, выбранную из группы, состоящей из замены А на К, замены F, К, G, Q, S, Т и/или Е на А; или замены Q на Е. Также представлена фармацевтическая композиция и применение заявленных пептидов для ингибирования гиперсекреции муцина. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 9 табл.

1. Выделенный концевой модифицированный пептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) последовательности из 24 аминокислот, имеющей последовательность GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1), или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере одну аминокислотную замену в указанной эталонной последовательности, выбранную из группы, состоящей из замены А на К, замены F, К, G, Q, S, Т и/или Е на А; или замены Q на Е;
(b) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1), или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере одну аминокислотную замену в указанной эталонной последовательности, выбранную из группы, состоящей из замены А на К, замены F, К, G, Q, S, Т и/или Е на А; или замены Q на Е, причем аминокислотная последовательность пептида начинается с N-концевой аминокислоты эталонной последовательности; и
(с) аминокислотной последовательности, имеющей от 4 до 23 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1), или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере одну аминокислотную замену в указанной эталонной последовательности, выбранную из группы, состоящей из замены А на К, замены F, К, G, Q, S, Т и/или Е на А; или замены Q на Е, причем аминокислотная последовательность пептида начинается с аминокислоты в положении 2 до аминокислоты в положении 21 эталонной последовательности (SEQ ID NO: 1); и причем
(i) С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида амидирована и N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида ацетилирована, или
(ii) С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида амидирована и N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида химически не модифицирована, или
(iii) С-концевая карбоксильная группа С-концевой аминокислоты пептида химически не модифицирована и N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида ацетилирована, и когда аминокислотная последовательность пептида представляет собой (а) или (b), N-концевая аминокислота не миристоилирована; и
когда аминокислотная последовательность (b) и (с) состоит из 4 аминокислот, указанная последовательность содержит SEQ ID NO: 211-221 или 223-230;
где пептид имеет эффект ингибирования гиперсекреции муцина при введении млекопитающему в количестве, ингибирующем гиперсекрецию муцина.

2. Пептид по п.1, где аминокислотная последовательность пептида начинается с N-концевой аминокислоты эталонной последовательности.

3. Пептид по п.1, где аминокислотная последовательность пептида начинается с аминокислоты в положении 2 до аминокислоты в положении 21 эталонной последовательности.

4. Пептид по п.1, где аминокислотная последовательность пептида заканчивается С-концевой аминокислотой эталонной последовательности.

5. Пептид по п.1, где аминокислотная последовательность пептида включает последовательно расположенные остатки AKGE (SEQ ID NO: 219) эталонной последовательности.

6. Пептид по любому из пп.1-5, где аминокислотная последовательность пептида состоит из 4-16 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере одну аминокислотную замену в указанной эталонной последовательности, выбранную из группы, состоящей из замены А на К, замены F, К, G, Q, S, Т и/или Е на А; или замены Q на Е.

7. Пептид по любому из пп.1-5, где аминокислотная последовательность пептида состоит из 8-14 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере одну аминокислотную замену в указанной эталонной последовательности, выбранную из группы, состоящей из замены А на К, замены F, К, G, Q, S, Т и/или Е на А; или замены Q на Е.

8. Пептид по любому из пп.1-5, где аминокислотная последовательность пептида состоит из 10-12 последовательно расположенных аминокислот эталонной последовательности или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере одну аминокислотную замену в указанной эталонной последовательности, выбранную из группы, состоящей из замены А на К, замены F, К, G, Q, S, Т и/или Е на А; или замены Q на Е.

9. Пептид по любому из пп.1-5, где одна или несколько дополнительных аминокислот пептида независимо алкилированы, амидированы, ацилированы или этерифицированы.

10. Пептид по любому из пп.1-5, где N-концевая аминокислота пептида ацетилирована по N-концевой аминогруппе.

11. Пептид по п.1, который выбран из группы, состоящей из ацетил-ПЕПТИД 106, ацетил-ПЕПТИД 103-NН₂, ПЕПТИД 106-NH₂, ПЕПТИД 234-NH₂ и ацетил-ПЕПТИД 219.

12. Пептид по п.1, который выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234 и SEQ ID NO: 235.

13. Пептид по п.1, который выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 233-245 и SEQ ID NO: 247-251.

14. Пептид по любому из пп.1-5, 11, 12 или 13, где последовательность содержит аминокислотную последовательность эталонной последовательности, имеющей по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из замены А на К, замены F, К, G, Q, S, Т и/или Е на А; или замены Q на Е.

15. Пептид по п.1, имеющий аминокислотную последовательность GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1), где N-концевая аминокислота пептида ацетилирована.

16. Пептид по любому из пп.1-5 или 12-13, где С-концевая аминокислота пептида амидирована по С-концевой карбоксильной группе аминогруппой, выбранной из группы, состоящей из: аммиака, С1-С24 алифатической алкиламиногруппы, гидроксил замещенной С2-С24 алифатической алкиламиногруппы, линейной 2-(С1-С24 алифатический алкил)оксиэтиламиногруппы или омега-метокси-поли(этиленокси)n-этиламиногруппы, где n составляет от 0 до 10.

17. Пептид по любому из пп.1-5 или 12-13, который проявляет, по меньшей мере, одно из свойств: (а) больший эффект ингибирования гиперсекреции муцина у млекопитающего, чем проявляет последовательность SEQ ID NO: 1, у которой N-концевая аминокислота миристоилирована, при введении указанному млекопитающему в равных концентрациях, или (b) большая растворимость в воде, чем у последовательности SEQ ID NO: 1, у которой N-концевая аминокислота миристоилирована, при равных концентрациях в одной и той же жидкости.

18. Фармацевтическая композиция, ингибирующая гиперсекрецию муцина, содержащая терапевтически эффективное количество пептида по любому из пп.1-17 и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

19. Пептид по любому из пп.1-5, 11-13, 15 для применения в качестве лекарственного средства, обладающего активностью, ингибирующей гиперсекрецию муцина.

20. Пептид по любому из пп.1-5, 11-13, 15 для применения при лечении гиперсекреции муцина.

21. Пептид по п.20, где гиперсекреция муцина является симптомом легочного заболевания.

22. Пептид по п.21, где легочное заболевание представляет собой астму, хронический бронхит, COPD, кистозный фиброз или ринит.

23. Применение пептида по любому из пп.1-17 для производства лекарственного средства для лечения гиперсекреции муцина.

24. Применение по п.23, где гиперсекреция муцина является симптомом легочного заболевания.

25. Применение по п.24, где легочное заболевание представляет собой астму, хронический бронхит, COPD, кистозный фиброз или ринит.

26. Способ ингибирования гиперсекреции муцина у млекопитающего, включающий введение млекопитающему ингибирующего гиперсекрецию муцина количества фармацевтической композиции по п.18, которая ингибирует гиперсекрецию муцина.

27. Способ по п.26, где гиперсекреция муцина является симптомом легочного заболевания.

28. Способ по п.27, где легочное заболевание представляет собой астму, хронический бронхит, COPD, кистозный фиброз или ринит.