СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ НЕЭКВИВАЛЕНТНОСТИ НАНОАЛМАЗОВ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/50 C01B31/06 B82Y5/00 

Настоящее изобретение относится к области фармакологии, биофармации и фармацевтики и касается способа определения биологической неэквивалентности образцов наноалмазов, который может найти применение в контроле качества промышленно выпускаемых и модифицированных наноалмазов, а также при производстве лекарственных средств и систем доставки лекарственных веществ на основе наноалмаза.

Наноалмазы являются отдельной группой углеродных наночастиц. Особое место среди них занимают детонационные наноалмазы, которые получают путем детонации взрывчатых веществ или их смесей в специальной камере. В результате детонации образуется шихта, в состав которой и входят частицы наноалмаза. Для выделения наноалмаза шихту подвергают окислительной обработке в жестких условиях [1].

Полученный детонационный наноалмаз обладает рядом отличительных физико-химических характеристик: сверхмалым размером первичных частиц (4-6 нм), высокоразвитой удельной поверхностью (до 400 м²/г), высокой концентрацией функциональных групп на ней и химически инертным ядром частицы [1].

Существует несколько вариантов технологий выделения и очистки детонационного наноалмаза, каждый из которых влияет на физико-химические характеристики получаемых частиц и может повлиять на их биологические свойства. Кроме того, известно, что дальнейшее химическое модифицирование наноалмаза также влияет на его биологические свойства.

Так, в работе [2] изучена токсичность образцов наноалмазов марки «ultraFine Diamond» (Россия) и производства General Electric (США) на линии клеток легочного эпителия аденокарциномы человека А549. Наноалмаз марки «ultraFine Diamond» (Россия) получен методом детонационного синтеза, а конечная стадия его очистки может варьироваться от обработки хлорной кислотой, перманганатом калия до очистки азотной кислотой [3]. Поэтому конечные свойства марки наноалмаза марки «ultraFine Diamond», в зависимости от стадии его конечной обработки, могут быть различны [3]. Наноалмаз производства General Electric (США) получен методом статического синтеза с последующей кислотной обработкой [4]. В случае наноалмаза производства США клеточная выживаемость оказалась выше, чем у наноалмаза, произведенного в России. В свою очередь, модифицирование (окисление смесью кислот) образцов наноалмаза этих двух марок приводит к снижению клеточной выживаемости [3].

В работе [5] использовались наноалмазы, полученные в NanoCarbon Research Institute Co., Ltd (Япония). Технология получения данных наноалмазов включает в себя окислительную обработку и последующее перемалывание порошка наноалмаза в шаровой мельнице с помощью циркониевых шариков [6]. Показано, что выживаемость клеток в случае их обработки наноалмазом составляет 80-90% по сравнению с контролем. Последующее модифицирование поверхности наноалмаза полиэтиленгликолем приводит к понижению выживаемости клеток до 70-80%, а его аминирование - до 55% [5].

Обязательным условием применения наноалмаза в медицине в качестве носителя в системах доставки лекарственных веществ является идентичность его как химических и физико-химических, так и фармакотоксикологических характеристик. Для возможности применения наноалмаза в биомедицинских приложениях уже из приведенных выше работ [2-6] однозначно следует необходимость поиска и разработки способа контроля бионеэквивалентности наноалмазов, полученных по разным технологиям и прошедшими разную химическую очистку, в том числе химическое модифицирование.

В настоящее время в патентной и научной литературе не описаны способы выявления различий биологического действия - биологической неэквивалентности образцов углеродных наночастиц, в том числе наноалмазов, полученных по различной технологии и/или различным образом химически модифицированных.

Целью изобретения является разработка экспрессного и доступного способа определения биологической неэквивалентности образцов наноалмаза.

Заявляемый способ заключается в сравнительном определении влияния образцов наноалмаза на мембранный потенциал митохондрий печени крыс. Сущность способа заключается в следующем. В измерительную ячейку вносят смесь свежевыделенных митохондрий печени крысы, субстрат окисления и индикатор, добавляют суспензию наноалмаза и регистрируют скорость изменения концентрации свободного индикатора, по которой и определяют изменение мембранного потенциала митохондрий. На основе сравнения скоростей изменения мембранных потенциалов, полученных при действии анализируемого и стандартного образцов, судят о наличии или отсутствии биологической неэквивалентности этих образцов. В качестве стандартного образца (образца сравнения) может быть выбран любой изучаемый образец наноалмаза в зависимости от цели его дальнейшего применения.

Митохондрии являются центральным звеном в цепи энергетических клеточных процессов, которые в присутствии субстрата окисления (например, сукцината натрия/калия, пирувата натрия/калия и др.) активно генерируют мембранный потенциал на внутренней мембране [7]. Для определения мембранного потенциала используют индикаторы, которые реагируют на изменение его величины. В качестве таких индикаторов могут выступать различные гидрофобные ионы (тетрафенилфосфоний, тетрафенилборан) и различные зонды, чувствительные к поверхностному и трансмембранному потенциалу, (например, родамин-123, оксонол-6, N,N-диметил-N-нонил-N-темпоиламмонийбромид и др.) [8]. Известно, что связь мембранного потенциала митохондрий (Δφ) с концентрацией свободной (регистрируемой) формы индикатора (C_out) и концентрацией индикатора внутри митохондрий (C_in) описывается уравнением Нернста [9]:

Δφ=(RT/zF)×ln(C_in/C_out),

где R - универсальная газовая постоянная, равная 8,31 Дж/(моль·К);

T - абсолютная температура (K);

z - заряд иона (для тетрафенилфосфония z=1);

F - постоянная Фарадея, равная 96485,35 Кл/моль.

Из уравнения Нернста следует, что с повышением мембранного потенциала индикатор, например тетрафенилфосфоний, начинает проникать внутрь митохондрий, при этом концентрация его свободной формы в ячейке понижается. При понижении мембранного потенциала, напротив, происходит высвобождение индикатора из внутреннего пространства митохондрий, тем самым увеличивая количество свободного индикатора.

Для оценки воздействия наноалмаза на мембранный потенциал митохондрий нами предлагается использовать величину не самого мембранного потенциала, а скорость его изменения, о которой судят по изменению значения концентрации свободного индикатора в ячейке в единицу времени (мин).

Заявляемый способ более подробно описывается следующим. К сравниваемым образцам наноалмаза, взятым в количестве 0,1-0,25 мг, добавляют по 2 мл дистиллированной воды. Добавлением раствора гидроксида калия доводят pH суспензии до значения 7,2-7,4. Измерения проводят с помощью потенциометрической компьютеризированной установки с тетрафенилфосфоний-селективным электродом [10]. В измерительную ячейку помещают 20 мкл митохондрий, выделенных из гомогената печени крыс по стандартной методике [11], которая заключается в том, что митохондрий выделяют из печени взрослого самца крысы линии Wistar в соответствии со стандартной процедурой, включающей дифференциальное центрифугирование и хранение выделенных митохондрий на льду [11].

Инкубацию митохондрий во всех пробах проводят в стандартной среде: 125 мМ хлорида калия, 15 мМ 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновой кислоты, 1,5 мМ фосфата при pH 7,25 в присутствии 4 мМ сукцината калия. Добавляют индикатор (до концентрации 1 мкМ). Затем добавляют аликвоту (10-50 мкл) суспензии исследуемого образца наноалмаза и регистрируют скорость изменения концентрации свободного индикатора. По результатам измерений строят графики зависимости влияния сравниваемых образцов наноалмаза на мембранный потенциал в координатах “концентрация свободного индикатора - время” (Фиг.1).

До добавления в ячейку с митохондриями суспензий исследуемых образцов наноалмаза характер всех кривых практически не различается. Показательным является участок кривых после добавления к митохондриям анализируемых образцов наноалмаза (внесение которых отмечено на Фиг.1 стрелками). Выбирают линейную часть участка кривой после добавления образца и рассчитывают изменение концентрации тетрафенилфосфония во времени, выражая результат в виде скорости изменения концентрации индикатора в минуту.

На основании статистически достоверного сравнения (±0,025 - погрешность измерения) этих величин делают вывод о наличии или отсутствии биологической неэквивалентности сравниваемых образцов наноалмаза.

Краткое описание графических материалов.

Фиг.1. Кривые падения мембранного потенциала митохондрий под влиянием образцов промышленных и модифицированных образцов наноалмаза (время добавки образцов наноалмаза к митохондриям отмечено стрелками). 1 - контроль; 2 - гидрированный наноалмаз марки «УДА-ТАН»; 3 - наноалмаз марки «УДА-ТАН»; 4 - наноалмаз марки «Standard ND»; 5 - хлорированный наноалмаз марки «УДА-ТАН».

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Согласно заявляемому способу анализировались 4 образца наноалмазов, в том числе два образца промышленных наноалмазов: наноалмаз марки «УДА-ТАН» (СКТБ «Технолог», Россия) и наноалмаз марки «Standart ND» («Adamas Nanotechnologies», США) (образцы 3 и 4, соответственно). Наноалмаз марки “УДА-ТАН” получен детонационным синтезом со стадией очистки 50-60%-ной азотной кислотой при температуре 230-240°C и давлении 80-90 атм и с последующим аммонолизом под давлением при 200°C (pH=10) [1, стр.76-108].

Подробности технологии производства наноалмаза марки «Standart ND» неизвестны.

Наноалмазы с гидрированной (образец 2) и хлорированной (образец 5) поверхностями были получены путем химического модифицирования образца 3 в соответствии с методиками [12].

Митохондрии выделялись из печени взрослого самца крысы линии Wistar в соответствии со стандартной процедурой дифференциальным центрифугированием [11]. Все требования по уходу и работе с животными были тщательно соблюдены. Печень гомогенизировали в охлажденном льдом буфере, содержащем 70 мМ сахарозы, 10 мМ 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диола и 1 мМ этиленгликоль-бис(2-аминоэтилового эфира)-N,N,N,N-тетрауксусной кислоты (pH 7,4). Гомогенат центрифугировали при 600 g в течение 7 минут при 4°C, отбирали фракцию супернатанта и ее снова центрифугировали при 9000 g в течение 10 мин для осаждения митохондрий. Митохондрии дважды промывали в вышеуказанной среде без этиленгликоль-бис(2-аминоэтилового эфира)-N,N,N,N-тетрауксусной кислоты и снова центрифугировали. Далее осадок митохондрий, содержащий 60 мг белка, суспендировали в промывочной среде и хранили на льду.

В качестве контроля измеряли мембранный потенциал митохондрий без добавления наноалмазов (кривая 1 на Фиг.1). К сравниваемым образцам наноалмаза, каждый из которых брали в количестве 0,1 мг, добавляли по 2 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивали смесь и добавлением раствора гидроксида калия доводили pH полученных суспензий до значения 7,4.

Для анализа каждого образца в ячейку помещали 20 мкл митохондрий, выделенных по методике [10]. В качестве индикатора использовали раствор хлорида тетрафенилфосфония, который добавляли до значения его концентрации в смеси, равного 1 мкМ. Далее, в качестве субстрата окисления использовали сукцинат калия и регистрировали концентрацию свободного тетрафенилфосфония в измерительной ячейке. Затем для каждого образца наноалмаза в измерительную ячейку добавляли 30 мкл ранее приготовленной его суспензии и регистрировали изменение концентрации тетрафенилфосфония на линейных участках кривых после добавления исследуемых образцов наноалмаза (Фиг.1). Далее выбирали линейную область участка кривой после добавления образца и рассчитывали изменение концентрации тетрафенилфосфония во времени, выражая результат в виде скорости изменения концентрации индикатора в минуту. Измерение повторяли в строго идентичных условиях не менее трех раз. На основании полученных значений скорости изменения концентрации тетрафенилфосфония для каждого образца вычисляли среднее значение и величину статистической погрешности. На основании статистически достоверного различия значений скоростей изменения концентрации индикатора для разных образцов наноалмаза делали вывод о наличии у них биологической неэквивалентности. Результаты измерений приведены в Таблице.

В качестве образца сравнения использовали образец наноалмаза российского производства (образец 3).

Таблица Результаты эксперимента по определению бионеэквивалентности исследуемых образцов наноалмаза (НА) (относительно образца 3) заявляемым способом. № образца Образец Скорость изменения концентрации индикатора, мкМ/мин Бионеэквивалентность 1 Контроль 0,021±0,01 - 2 Гидрированный наноалмаз марки «УДА-ТАН» 0,025±0,025 Нет 3 Наноалмаз марки «УДА-ТАН» (образец сравнения) 0,035±0,025 - 4 Наноалмаз марки «Standard ND» 0,377±0,025 Есть 5 Хлорированный наноалмаз марки «УДА-ТАН» 0,284±0,025 Есть

Из данных Таблицы следует, что скорость снижения мембранного потенциала в случае воздействия образцов промышленного наноалмаза российского производства и наноалмаза с гидрированной поверхностью составляет 0,035±0,025 и 0,025±0,025 мкМ/мин, соответственно. Так как различие скоростей статистически недостоверно, был сделан вывод о биологической эквивалентности образцов 2 и 3 (т.е. об отсутствии бионеэквивалентности). В то же время скорость снижения мембранного потенциала для образцов 4 и 5 составляет 0,377±0,025 и 0,284±0,025 мкМ/мин, соответственно, что, с учетом статистически достоверного различия скоростей, позволяет сделать вывод об их биологической неэквивалентности не только между собой, но и по отношению к остальным образцам наноалмазов.

Список литературы

1. В.Ю. Долматов. Детонационные наноалмазы. Получение, свойства, применение. / СПб: Изд. НПО «Профессионал», 2011. 536 с.

2. К.-К. Liu, C.-L. Cheng, С.-С. Chang and Ju.-I Chao. Biocompatible and detectable carboxylated nanodiamond on human cell // Nanotechnology. 2007. V.18. 325102 (10 pp.).

3. F. Huang, Yi Tong, Sh. Yun. Synthesis Mechanism and Technology of Ultrafine Diamond from Detonation // Физика твердого тела. 2004. Т.46. №4. С.601-604.

4. В.Б. Муратов, А.А. Васильев, В.В. Гарбуз, Т.И. Дуда. Влияние газообразующих примесей на теплоемкость нанокристаллического алмаза детонационного синтеза // Наноструктурное материаловедение. 2011. №1. С.23-31.

5. X.-Q. Zhang, M. Chen, R. Lam, X. Xu, E. Osawa, D. Ho. Polymer-Functionalized Nanodiamond Platforms as Vehicles for Gene Delivery // ACS Nano. 2009. V.3. N.9. P.2609-2616.

6. E. Osawa. Remarks on the handling of colloidal solutions of 5-nm diamond particles / NCRI Technical Bulletin, 2009. №.3. P.1-8.

7. Д. Нельсон, M. Кокс. Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т.2: Биоэнергетика и метаболизм. / Пер. с англ. - M.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2014. С.306-342.

8. Б. Геннис. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. / M.: Мир. 1997. С.319-321.

9. N. Kamo, M. Muratsugu, R. Hongoh, and Y. Kobatake. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state // J. Membrane Biol. 1979. V.49. P.105-121.

10. Н.И. Федотчева, В.В. Теплова, Н.В. Белобородова. Роль тиоловых антиоксидантов в восстановлении функций митохондрий, модифицированных микробными метаболитами. // Биофизика. 2012. Т.57. №5. С.820-826.

11. N.I. Fedotcheva, R.E. Kazakova, M.N. Kondrashova, N.V. Beloborodova. Toxic effects of microbial phenolic acids on the functions of mitochondria // Toxicology Letters. 2008. V.180. P.182-188.

12. G.V. Lisichkin, I.I. Kulakova, A.Yu. Gerasimov, A.V. Karpukhin, R.Yu Yakovlev. Halogenation of detonation-synthesis nanodiamond surface // Mendeleev Communication. 2009. №19. P.309-310.

Изобретение относится к области фармакологии, биофармации и фармацевтики и касается способа определения биологической неэквивалентности образцов наноалмазов путем сравнительного определения влияния образцов наноалмаза на мембранный потенциал митохондрий животных. Способ заключается в том, что в соответствующую измерительную ячейку установки для измерения потенциала митохондрий, снабженную тетрафенилфосфоний-селективным электродом, помещают инкубационную среду, субстрат окисления и в качестве индикатора хлорид тетрафенилфосфония, регистрируют изменение концентрации тетрафенилфосфония и при достижении постоянной концентрации тетрафенилфосфония добавляют выделенные из организма животных митохондрии. По изменению сигнала электрода регистрируют изменение мембранного потенциала митохондрий, при достижении постоянного потенциала добавляют соответствующие водные суспензии исследуемых образцов наноалмазов с pH 7,2-7,4 и измеряют величину скорости изменения мембранного потенциала митохондрий. Наличие статистически достоверного различия скоростей изменения мембранного потенциала митохондрий свидетельствует о биологической неэквивалентности сравниваемых образцов наноалмазов. Изобретение обеспечивает экспрессный и доступный способ определения биологической неэквивалентности наноалмазов. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил., 1 пр.

1. Способ определения биологической неэквивалентности наноалмазов путем сравнительного определения влияния образцов наноалмаза на мембранный потенциал митохондрий животных, заключающийся в том, что в соответствующую измерительную ячейку установки для измерения потенциала митохондрий, снабженную тетрафенилфосфоний-селективным электродом, помещают инкубационную среду, содержащую водный раствор хлорида калия, 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновой кислоты, фосфатный буфер, субстрат окисления и в качестве индикатора хлорид тетрафенилфосфония, регистрируют изменение концентрации тетрафенилфосфония и при достижении постоянной концентрации тетрафенилфосфония добавляют выделенные из организма животных митохондрии, по изменению сигнала электрода регистрируют изменение мембранного потенциала митохондрий, при достижении постоянного потенциала добавляют соответствующие водные суспензии исследуемых образцов наноалмазов с pH 7,2-7,4 и измеряют величину скорости изменения мембранного потенциала митохондрий, при этом наличие статистически достоверного различия скоростей изменения мембранного потенциала митохондрий свидетельствует о биологической неэквивалентности сравниваемых образцов наноалмазов.

2. Способ по п.1, где в качестве субстрата окисления используют сукцинат калия.