ПРИМЕНЕНИЕ ТЕТРАПЕПТИДА Arg-Pro-Gly-Pro В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ, СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК A61K38/07 A61P3/06 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и касается лекарственного средства пептидной природы для лечения состояния гиперхолестеринемии и ожирения.

Установлено, что регуляторные пептиды глипролинового ряда Pro-Gly-Pro, Pro-Gly, а также Pro-Gly-Pro-Arg, Pro-Gly-Arg, Gly-Pro-Arg, с дополнительным C-концевым аргинином, снижают повышенный уровень глюкозы крови при развитии экспериментального инсулинзависимого диабета и обеспечивают сохранение нормальной функции инсулярной и противосвертывающей систем крови (Ашмарин, 2008; Ляпина и др., 2011). Известно, что нарушение углеводного обмена сопровождается изменением жирового обмена в организме. Такие аминокислоты, как аргинин, пролин, лейцин и некоторые другие, снижают риск развития сахарного диабета, а также атеротромбоза и атеросклероза (Egger et al., 2008; Kostapanos et al., 2008). Избыток холестерина в организме откладывается в местах повреждений стенки сосудов и вызывает в последующем образование атеросклеротической бляшки (Ли и др. 2000), что приводит к развитию сосудистых заболеваний, которые сопровождаются тромбообразованием, поэтому при гиперхолестеринемии наряду с другими мероприятиями проводят и антитромботическую терапию (Watson et al., 2004). Аминокислота аргинин, являющаяся предшественником оксида азота, а также аргининсодержащие пептиды участвуют в метаболизме жиров и углеводов (Golubeva, Grigorjeva, 2011).

Известен природный трипептид Pro-Gly-Pro, обладающий протекторной антидиабетогенной и антитромботической активностью (Патент РФ №2252778). Данный известный пептид может использоваться в качестве профилактики и лечения гиперхолестеринемии, гипергликемии и повышенной свертываемости крови, и он является прототипом предлагаемого изобретения.

Недостатком известного прототипа является его недостаточная стабильность в организме под действием N- и С-концевых монопептидаз.

Результат, получаемый при использовании настоящего изобретения, состоит в повышении эффективности профилактики и лечения гиперхолестеринемии.

Результат достигается посредством применения в качестве средства профилактики и лечения гиперхолестеринемии тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro.

Результат достигается также посредством способа профилактики и лечения гиперхолестеринемии, включающего интраназальное введение пациенту лекарственного средства на основе тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro в эффективном количестве.

Результат достигается также использованием фармацевтической композиции для профилактики и лечения гиперхолестеринемии, включающей пептид с

гипохолестеринемическим действием в качестве активного вещества и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество в качестве консерванта, где в качестве пептида использован пептид общей формулы Arg-Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемая соль, в частности, в количестве 0,1÷1,0 вес.%; такая композиция также может быть приемлемой для интраназального введения, например, в виде раствора следующего состава: пептид Arg-Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемая соль - 1÷10 г/л; нипагин - 0,9÷1,1 г/л в качестве консерванта, дистиллированная вода - до 1 литра.

Результат достигается также созданием способа получения фармацевтической композиции для профилактики и лечения гиперхолестеринемии, включающий смешивание активного и вспомогательных веществ, где в качестве активного вещества используют пептид общей формулы Arg-Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемую соль, например, в количестве 0,1+1,0 вес.%; получение такой композиции возможно, в частности, в форме, приемлемой для интраназального введения, например, в виде раствора следующего состава: пептид Arg-Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемая соль - 1÷10 г/л; нипагин - 0,9+1,1 г/л в качестве консерванта, дистиллированная вода - до 1 литра.

Нижеследующие примеры иллюстрируют возможность достижения поставленного результата при использовании заявленной группы изобретений.

Пример 1.

Эксперименты были проведены на 60 экспериментальных животных, содержащихся на жировой диете, обогащенной насыщенными жирными кислотами и холестерином (мука пшеничная и хлеб - 35%, сахарный песок - 10%, животные жиры (маргарин с гидрогенизированными жирами, майонез, сыр) - 35%, субпродукты - 10%, холестерин - 1%, сухой корм - 9%).

Выявление профилактического гипохолестеринемического действия тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro проводили следующим образом. Крысам - самцам с массой тела 450-550 г вводили интраназально в течение 10 суток через каждые 24 часа тетрапептид Arg-Pro-Gly-Pro в дозе 200 мкг/кг массы тела (опытная группа) в объеме 0,02 мл физиологического раствора или 0,85%-ный раствор NaCl (контрольная группа) при одновременном содержании их на жировой диете.

Через 1 час после последнего введения тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro у животных натощак брали кровь на анализы. Полученные данные анализов показателей концентрации холестерина и крови приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, через 1 час после последнего 10-кратного интраназального применения пептида совместно с жировой диетой в опытной группе крыс на 20% по сравнению с контролем достоверно снизилась концентрация общего холестерина. При этом в опыте повысились антикоагулянтная активность (тест АЧТВ) на 25%, СФА, НФ и ФФ на 110, 62% и 279% соответственно, ААП - на 93,8% по отношению к контролю. По данным электрокоагулограммы установлено достоверное удлинение показателя T (продолжительности свертывания крови), что указывает на высокую степень антикоагулянтных свойств плазмы опытных крыс по сравнению с контрольными.

По сравнению с соответствующими значениями в контрольной группе крыс, концентрация общего холестерина и параметры гемостаза у опытных крыс, получавших пептид, равнозначны или даже превышают те же показатели у здоровых крыс (норма).

Таким образом, тетрапептид Arg-Pro-Gly-Pro при его многократном в течение 10 суток интраназальном введении в ежедневной дозе 200 мкг/кг предупреждает развитие экспериментальной гиперхолестеринемии при провокации ее жировой диетой и оказывает защитное антитромботическое действие, повышая антикоагулянтную и все виды фибринолитической активности (суммарной, неферментативной, ферментативной). Интраназальное применение 0,85%-ного раствора NaCl вместо тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro в данных условиях эксперимента приводило к развитию гиперхолестеринемии.

Пример 2.

Установление лечебного гипохолестеринемического и противосвертывающего действия тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro проводили следующим образом. Животные в течение 4 недель содержались на жировом рационе, после чего при дальнейшем нахождении крыс на диете опытной группе вводили пептид Arg-Pro-Gly-Pro 7-кратно интраназально в дозе 200 мкг/ кг массы тела в объеме 0,02 мл, а контрольная группа (введение 0,85%-ного NaCl) получала в те же сроки в том же объеме вместо пептида 0,85%-ный NaCl. Эксперименты были проведены на 40 животных.

Через 1 час после последнего (7-го) введения пептида или 0,85%-ного NaCl и через 6 суток после отмены препаратов при продолжающемся содержании животных на жировом рационе у них натощак брали кровь на анализы.

Взятие крови осуществляли из v. jugularis в количестве 2 мл с использованием в качестве консерванта 3,8%-ный раствор натрия лимоннокислого в соотношении кровь: консервант как 9:1. Образцы крови центрифугировали в двух режимах - сначала при 1000 об/мин в течение 5 мин для получения богатой тромбоцитами плазмы, используемой при определении агрегации тромбоцитов, а затем при 3000 об/мин в течение 10-12 мин для получения бедной тромбоцитами плазмы для определения других параметров гемостаза, концентрации общего холестерина плазмы крыс.

Для оценки жирового обмена в плазме крови определяли концентрацию общего холестерина (ОХ) энзиматическим колориметрическим методом с использованием набора реагентов фирмы Ольвекс-Диагностикум (Россия). Результат выражали в ммоль/л и в %.

Результаты экспериментов представлены в таблице 2. Как видно из таблицы, введение тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro на фоне жирового рациона приводит к лечебному нормохолестериновому действию: отмечается нормальный уровень холестерина у опытных крыс, соответствующий его уровню у здоровых животных. При этом показатели гемостаза (СФА. НФ. АЧТВ) в отличие от контроля достоверно приближались или даже превышали уровень, наблюдаемый у здоровых животных. По данным электрокоагулограммы наблюдались достоверные изменения в параметре Т - продолжительности свертывания крови.

Через 6 суток после отмены введения пептида Arg-Pro-Gly-Pro было показано, что уровень холестерина и показатели функции противосвертывающей системы (СФА, НФ. АЧТВ) соответствовали нормальным значениям, наблюдаемым у здоровых крыс. Агрегация тромбоцитов имела тенденцию к снижению, но не достигала нормы (таблица 3).

Таким образом, продемонстрировано, что многократное в течение 7 суток интраназальное применение тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro на фоне холестериновой диеты через 6 суток после отмены его введения животным при продолжающемся поступлении в организм жирной пищи защищало организм от развития гиперхолестеринемии и способствовало нормализации основных параметров гемостаза. В контроле (интраназальное введение 0,85%-ного физиологического раствора на фоне жировой диеты) наблюдалось развитие гиперхолестеринемии, о чем свидетельствовало повышение концентрации холестерина крови, снижение антикоагулянтного и фибринолитического звеньев противосвертывающей системы и повышение агрегации тромбоцитов.

Пример 3.

Способность тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro предотвращать накопление массы тела крыс при длительном содержании их на жировом рационе.

Результаты исследования представлены в Таблице 4. Как видно из таблицы, опытные крысы на протяжении 1,5 месячного эксперимента незначительно (на 4-6%) увеличили массу тела, в то время как в контроле они поправились на 14-15%. Эти данные указывают на способность пептида предотвращать накопление массы тела при длительном содержании на жировом рационе.

Таким образом, исследуемый пептид оказывал как профилактический, так и лечебный гипохолестеринемический эффект. Он или восстанавливал нормальные значения показателей холестерина при его лечебном применении или препятствовал повышению концентрации холестерина даже при одновременном употреблении в пищу продуктов, которые обычно способствуют увеличению холестерина крови. Это, возможно, связано с гипохолестериновым действием самого пептида, что впервые обнаружено нами, и со способностью входящего в его состав аргинина нормализовать жировой обмен. Также впервые установлены антикоагулянтно-фибринолитические и антитромбоцитарные эффекты этого пептида в крови крыс, постоянно употребляющих жирную пищу с избытком насыщенных жирных кислот.

Пример 4.

Была приготовлена фармацевтическая композиция для лечения гиперхолестеринемии, состоящая из (в миллиграммах):

Arg-Pro-Gly-Pro - 1-10 г/л;

нипагин - 0,9-1,1 г/л в качестве консерванта;

дистиллированная вода - до 1 литра.

Пример 5.

Сравнение профилактического и лечебного гипохолестеринемического и противосвертывающего действия трипептида Pro-Gly-Pro (прототип) с тетрапептидом Arg-Pro-Gly-Pro при их интраназальном введении проводили следующим образом. Для изучения профилактического действия пептидов крысам-самцам вводили интраназально в течение 10 суток через каждые 24 часа тетрапептид Arg-Pro-Gly-Pro или трипептид Pro-Gly-Pro в дозе 200 мкг/кг массы тела в объеме 0,02 мл физиологического раствора при одновременном содержании их на жировой диете, обогащенной насыщенными жирными кислотами. Через 1 час после последнего введения тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro или трипептида Pro-Gly-Pro у животных натощак брали кровь на анализы. Для изучения лечебного эффекта тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro (группа 1) или трипептида Pro-Gly-Pro (группа 2) предварительно животные содержались на жировой диете в течение 1 месяца, после чего каждой из групп интраназально вводили соответствующий пептид в дозе 200 мкг/кг массы тела в объеме 0,02 мл физиологического раствора в течение 6-7 суток через каждые 24 часа. Кровь на анализы брали через 1 час и 6 суток после отмены введения препаратов. Определяли концентрацию холестерина, фибринолитическую и антикоагулянтную активность плазмы, а также агрегацию тромбоцитов. В таблице 5 приведены экспериментальные данные по сравнительному действию тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro и трипептида Pro-Gly-Pro.

Сравнительные данные, приведенные в таблице 5, показывают, что профилактическое гипохолестеринемическое действие при интраназальном введении трипептида Pro-Gly-Pro и тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro в указанных дозах было одинаковым - концентрация холестерина в крови снижалась на 20% по сравнению с контролем на фоне развития гиперхолестеринемии. Однако антитромбоцитарный эффект, свидетельствующий о повышении реологических свойств крови и снижении вязкости крови, при действии тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro был значительно (на 44%) выше. При сравнении лечебных эффектов двух пептидов отмечается более выраженная тенденция к снижению концентрации холестерина у тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro по сравнению с трипептидом Pro-Gly-Pro, а снижение агрегации тромбоцитов наблюдается только при действии Arg-Pro-Gly-Pro.

Наиболее значительная разница при сравнении действия двух пептидов установлена по изменению суммарного привеса за все время проведения эксперимента: при применении тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro суммарный привес был на 22% ниже этого же показателя при использовании трипептида Pro-Gly-Pro, что свидетельствует о возможности применения тетрапептида при ожирении.

Таким образом, применение тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro в качестве средства профилактики и лечения гиперхолестеринемии и процессов тромбообразования при его интраназальном использовании превосходит прототип.

Таблица 1 Показатели гемостаза и концентрация общего холестерина (ОХ) через 1 час после 10-кратного введения крысам тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro (опыт) или NaCl (контроль) на фоне холестериновой диеты (M±m) ГРУППЫ ХОЛЕСТЕРИН, СФА, НФ, ФФ, ААП, АЧТВ, AT, ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ КРЫС ммоль/л ММ² ММ² ММ² ММ² СЕК ОТН.ЕД СВЕРТЫВАНИЯ Т, СЕК Контроль 0.868±0,046 26,3±1,11 19,7±0,8 6,6±0,8 98,4±9,2 28,3±1,26 4,2±0,8 3,0±0,6   (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) Опыт 0,69±0,04 56,8±4,1 31,9±2,5 24,9±2,4 130,3±19 35,5±1,21 2,8±0,4 5,3±0,7   (80%)** (210%)** (162%)** (379%)** (132,4%)* (125%)** (66,7%)* (178%)** Норма 0,749±0,014 36±0,4 26,3±0,7 11,8±0,3 188±17 34±1,29 1,85±0,3 3,6±0,4

Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля с 0,85%-ным раствором NaCl.

* р<0.05, **р<0.01. Где: Суммарная (СФА), неферментная (НФ), ферментативная (ФФ) фибринолитическая активность, активность тканевого активатора плазминогена (ААП), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), агрегация тромбоцитов (AT), продолжительность свертывания плазмы - T по данным электрокоагулограммы.

Таблица 4 Масса тела крыс (г) в разных условиях эксперимента на фоне холестериновой диеты до и после введения пептида Arg-Pro-Gly-Pro (М±т) Условия Контроль Опыт Исходная масса тела 426,0±10,4 (100%) 431,0±7,2 (100%) Масса тела после 10-кратн. введения RPGP 488,0±11,7 (114%) 435,0±13,6 (101%) Привес за время введения препаратов +62,0±5,1 +4,0±3,2** Масса тела после 7-кратного введения RPGP 489,0±12,3 (115%) 447,0±10,4 (104%) Привес за время введения препаратов +1,0±1,2 +12,0±5,2 Масса тела через 6 сут после отмены препаратов на фоне продолжающейся диеты 491,0±12,8 (116%) 458,0±9,8 (106%) Привес за 6 сут (после отмены пептида) +5,0±4,3 +11,0±4,6 Суммарный привес за все время нахождения на диете +65,0±6,1 (100%) +27,0±5,4 (41,5%)**

Достоверность различий относительно контроля: * p<0.05; ** - P<0.01

Таблица 5 Сравнение профилактического и лечебного гипохолестеринемического и противосвертывающего действия трипептида Pro-Gly-Pro (прототип) с тетрапептидом Arg-Pro-Gly-Pro (предлагаемый препарат) Показатели Pro-Gly-Pro
(прототип) Arg-Pro-Gly-Pro (предлагаемый препарат) Профилактический эффект (% от контроля - введение 0.85% NaCl, принятого за 100%) Холестерин 80 80 Агрегация тромбоцитов 110.8 66.7 Лечебный эффект (% от контроля - введение 0.85% NaCl, принятого за 100%) через 1 час после последнего введения / через 6 суток после последнего введения Холестерин 84.3/80 83.0/77 Агрегация тромбоцитов 100/100 93/91.7 Суммарный привес за все время проведения эксперимента % от исходной массы тела | 63.6 41.5

Группа изобретений относится к области медицины и фармакологии и касается лекарственного средства пептидной природы для лечения гиперхолестеринемии и процессов тромбообразования. Группа изобретений относится к применению тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro в качестве средства профилактики и лечения гиперхолестеринемии и тромбообразования. Использование тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro приводит к повышению эффективности профилактики и лечения гиперхолестеринемии и тромбообразования. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

1. Применение тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro в качестве средства профилактики и лечения гиперхолестеринемии.

2. Способ профилактики и лечения гиперхолестеринемии, включающий интраназальное введение лекарственного средства на основе тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro в эффективном количестве.

3. Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения гиперхолестеринемии, включающая пептид с гипохолестеринемическим действием в качестве активного вещества и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество в качестве консерванта, отличающаяся тем, что в качестве пептида использован пептид общей формулы Arg-Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемая соль.

4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что содержание пептида или его фармацевтически приемлемой соли составляет 0,1÷1,0 вес.%.

5. Композиция по пп.3 или 4, отличающаяся тем, что она выполнена приемлемой для интраназального введения.

6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что она выполнена в виде раствора следующего состава: пептид Arg-Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемая соль - 1÷10 г/л; нипагин - 0,9÷1,1 г/л в качестве консерванта, дистиллированная вода - до 1 литра.

7. Способ получения фармацевтической композиции для профилактики и лечения гиперхолестеринемии, включающий смешивание активного и вспомогательных веществ, отличающийся тем, что в качестве активного вещества используют пептид общей формулы Arg-Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемую соль.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что содержание пептида или его фармацевтически приемлемой соли составляет 0,1÷1,0 вес.%.

9. Способ по пп.7 или 8, отличающийся тем, что композицию получают в форме, приемлемой для интраназального введения.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что композицию получают в виде раствора следующего состава: пептид Arg-Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемая соль - 1÷10 г/л; нипагин - 0,9÷1,1 г/л в качестве консерванта, дистиллированная вода - до 1 литра.