СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ УГЛЕВОДНОГО И ЛИПИДНОГО ОБМЕНА ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ И ЭНЦЕФАЛОПАТИИ, ПРИМЕНЕНИЕ ТЕТРАПЕПТИДА И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ТАКИХ НАРУШЕНИЙ Российский патент 2013 года по МПК A61K38/07 A61P3/00 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и касается лекарственного средства пептидной природы, его фармацевтической композиции и способа лечения и профилактики и нарушений углеводного липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии.

В настоящее время значительно возрастает распространенность метаболического синдрома, т.е. комплекса метаболических, гормональных и клинических нарушений, в основе которых лежит инсулинорезистентность и компенсаторная гиперинсулинемия, приводящих, в конечном итоге, к развитию ожирения, артериальной гипертензии, нарушениям углеводного и липидного обменов, инсульта, инфаркта миокарда, сахарного диабета II типа (инсулин-независимого), нарушений функции противосвертывающей системы крови и др. серьезных заболеваний. Избыточное накопление жира в жировой ткани происходит при преобладании в пище углеводов. Увеличенному образованию жира из углеводов способствует активация под влиянием инсулина и пролактина обмена глюкозы по пентозному и гликолитическому пути (Rajesh et al, 2005). Инсулин тормозит выход жира из депо и облегчает накопление гликогена в печени. Снижая уровень глюкозы в крови, инсулин повышает аппетит. Нарушение всей этой сложной системы нейрогуморальной регуляции лежит в основе избыточного отложения жира в жировой ткани - ожирения (Кроненберг Г.М. и др., 2010). Нарушения углеводного и липидного обмена в сочетании с другими причинами могут приводить к дистрофическим изменениям ткани мозга, т.е., в свою очередь, к развитию энцефалопатии.

Известно, что ряд регуляторных пролинсодержащих пептидов (Pro-Gly-Pro, Pro-Gly, Gly-Pro, Phe-Pro-Gly-Pro) постоянно образуются в организме при деградации и синтезе коллагена и других белков (Ульянов и др., 2005), что позволяет рассматривать такие пептиды как эндогенные соединения. В экспериментах и клинических исследованиях была показана чрезвычайная полифункциональность регуляторных пептидов, в том числе простейших олигопептидов (Герштейн и др., 1998).

Пептиды играют важную роль в регуляции состояния центральной нервной системы. Воздействуя на активность мозга, пептиды способны изменять поведение, эмоциональный статус, уровень мотиваций, процессы запоминания и хранения информации (см., в частности, Патент РФ №2206573). Глипролины Pro-Gly-Pro, Pro-Gly, Pro-Gly-Pro-Arg, Pro-Gly-Arg, Gly-Pro-Arg обладают нейропротективными свойствами (Сторожевых Т.П. и др., 2007), обеспечивают сохранение нормальной функции инсулярной и противосвертывающей систем крови на фоне развития экспериментального аллоксанового диабета (см., в частности, Ашмарин И.П. и др., 2008).

Ряд аминокислот (пролин, лизин, аргинин, метионин, глутамин, и др.), в том числе незаменимая аминокислота - лейцин, участвуют в нормализации уровня триглицеридов и баланса липопротеидов, предотвращает отложение липопротеинов низкой плотности на стенках артерий; снижают риск целого спектра заболеваний, в том числе диабета, атеросклероза, атеротромбоза и др. (Мазуров В.И., 1984). Так, лейцин обладает способностью сжигать глюкозу (Nishitani et al., 2005) путем стимулирования процесса в цикле «глюкоза - аланин», благодаря чему в организме поддерживается стабильный уровень сахара, и сохраняется необходимая мышечная масса в условиях низкокалорийной диеты.

При постоянном осуществлении в организме процессов протеолиза коллагена и других родственных ему белков происходит образование в конечном итоге простейших пептидов, содержащих такие аминокислоты, как глицин, пролин, оксипролин (Molinero et al, 2008), в том числе Pro-Gly-Pro, Pro-Gly, Pro-Gly-Pro-Arg, Pro-Gly-Arg, Gly-Pro-Arg, которые обеспечивают сохранение нормальной функции инсулярной и противосвертывающей систем крови (см., в частности, Патент РФ №2206573). Учитывая, что гипергликемия способствует накоплению жира в жировых депо, а вышеназванные глипролины обладают гипогликемическим действием, можно предположить, что эти же короткие пептиды, особенно включающие лейцин в свою структуру, способны участвовать в обмене не только углеводов, но и жиров.

Таким образом, пептиды, практически лишенные побочных эффектов, обладая нейропротективными свойствами, способностью позитивно влиять на инсулярную систему и липидный обмен, могут быть включены в схемы профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии.

Для лечения метаболических нарушений имеются различные препараты.

Однако ни один из них не сочетает одновременно высокую эффективность, длительность действия, быстроту наступления эффекта и отсутствие негативного последействия при длительном применении. Природные пептиды для профилактики и лечения метаболических нарушений в настоящее время не используются.

Задача, решаемая настоящей группой изобретений, состоит в создании высокоэффективного лекарственного средства, обладающего широким спектром действия, удобным в применении и с минимальными побочными эффектами, при этом результат, достигаемый при решении поставленной задачи, состоит в повышении эффективности профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обменов при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии.

Для достижения поставленного результата предлагается способ профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии, включающий интраназальное введение лекарственного средства на основе тетрапептида общей формулы Pro-Gly-Pro-Leu.

Для достижения поставленного результата предлагается также в качестве средства профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии применить тетрапептид общей формулы Pro-Gly-Pro-Leu. Кроме того, в рамках настоящего изобретения для достижения поставленного результата предлагается фармацевтическая композиция для профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии, содержащая в качестве активного вещества тетрапептид общей формулы Pro-Gly-Pro-Leu; при этом композиция может быть выполнена для интраназального введения, например, следующего состава: тетрапептид в количестве 1-10 г/л, нипагин в количестве 0,9-1,1 г/л в качестве консерванта, дистиллированная вода - остальное.

Изобретение иллюстрируется графиком влияния различных доз Pro-Gly-Pro-Leu (PGPL) на выживаемость зернистых клеток мозжечка при гиперстимуляции глутаматных рецепторов, вызванных 300 мкМ NMDA (N-метил-D-аспартат) в присутствии 5 мМ Ca²⁺.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение. Исследования проведены на экспериментальных животных.

Пример 1. Исследование влияния тетрапептида PGPL на параметры липидного обмена и накопление новых жировых отложений в организме крыс, находящихся на жировой диете

Эксперименты были проведены на 30 экспериментальных животных, 20 из которых содержались в течение 15 суток на жировой диете, обогащенной насыщенными жирными кислотами и холестерином. Определение влияния тетрапептида PGPL на липидный обмен проводили следующим образом. Крысам-самцам с массой тела 270-400 г вводили интраназально в течение 11 суток тетрапептид PGPL в ежедневной дозе 175 мкг/кг массы тела в объеме 0.02 мл на 200 г массы тела или 0,85%-ый раствор NaCl в том же объеме (контрольная группа 1). 10 нормальных здоровых крыс, находившихся на обычном лабораторном рационе и не получавших никаких препаратов, составили контрольную группу 2. Через 1 час после последнего введения тетрапептида PGPL у животных брали кровь на анализы. Показатели жирового обмена в плазме крови исследовали энзиматическим колориметрическим методом. Определяли концентрацию общего холестерина (ОХ), концентрацию холестерина (Хс) липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) и концентрацию триглицеридов (ТГ). Суммарную концентрацию холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) определяли по следующей формуле:

Хс(ЛПНП+ЛПОНП)=ОХ-Хс(ЛПВП).

Полученные данные анализов показателей крови приведены в таблице 1.

Таблица 1 Условия опыта ОХ, ммоль/л Хс (ЛПНП+ЛПОНП), ммоль/л Хс (ЛПВП), ммоль/л ТГ, ммоль/л Контрольная группа 2 (здоровые крысы) n=10 0,84±0,025 0,16±0,018 0,68±0,04 0,44±0,023   Контрольная группа 1 n=10 1,14±0,03 0,33±0,03 0,81±0,03 0,56±0,04 (100%) (100%) (100%) (100%) Опыт n=10 0,76±0,04 0,14±0,01 0,62±0,05 0,46±0,029 (67%)** (42%)** (77%)** (82%)*

Достоверность различий по отношению к соответствующим параметрам контрольной группы, принятым за 100%: ** р<0.01, * р<0.05  

Как видно из данных таблицы, тетрапептид PGPL улучшает параметры жирового обмена. Исследуемый пептид восстанавливал нормальные значения показателей липидного профиля при одновременном употреблении в пищу продуктов с высоким содержанием животных жиров, обогащенных холестерином, насыщенными жирными кислотами и углеводами, что в конечном итоге приводит к увеличению в крови уровня общего холестерина и атерогенных липопротеидов низкой и очень низкой плотности, а также триглицеридов. Последнее связано с антихолестериновым действием исследуемого пептида, что впервые обнаружено в результате проведенных исследований.

Одновременно с определением в крови крыс липидного профиля производилось взвешивание крыс, результаты которого представлены в таблице 2.

Таблица 2 Условия опыта Опыт (n=10) Контроль (n=10) До опыта, (г) 396,4±13,9 414±9,78   (100%) (100%) После 11-го введения     пептида на фоне жировой 407,0±16,2 465±18,3 диеты, (г) (103%) (112%) Привес через 15 суток     нахождения на жировой 11,4±1,4** 51,0±4,81 диете, (г)    

Подытоживая, через 11 суток применения тетрапептида PGPL (или NaCl) на фоне жировой диеты опытные крысы поправились в среднем на 11,4 г, а контрольные - на 51 г по сравнению с исходными значениями веса, т.е. прибавка в весе у контрольной группы была практически в 4,5 раза больше, чем у опытной. Следовательно, пептид PGPL (в частности, в ежедневной дозе 175 мкг/кг) при одновременном поступлении жирной пищи в организм за 2 недели способствовал снижению веса тела животных почти в 4,5 раза по сравнению с контролем, когда животные находились на такой же жировой диете и вместо пептида получали NaCl.

Таким образом, лейцинсодержащий глипролин PGPL может быть отнесен к препаратам гиполипидемического действия, снижающим вес и блокирующим накопление новых жировых отложений в организме.

Пример 2. Исследование влияния тетрапептида PGPL на уровень гликемии у крыс, находящихся на углеводной и жировой диете

Эксперименты были проведены на 60 беспородных белых крысах-самцах с массой тела 250-340 г, содержащихся на естественном лабораторном рационе. Экспериментальную стойкую гипергликемию у животных вызывали ежедневным внутрижелудочным введением 40%-ного раствора глюкозы в дозе 0.7 мл на 300 г массы тела в течение 7-ми дней. Затем животные были разделены на 2 группы (опытную и контрольную), которые продолжали получать глюкозу. Одновременно опытной группе крыс вводили интраназально раствор пептида PGPL (по 200 мкг/кг в объеме 0.02 мл) четырехкратно через каждые 24 ч, а контрольной группе таким же образом и в том же объеме вводили 0.85%-ый раствор NaCl. На 5-ые сутки в день эксперимента крысам сначала вводили раствор глюкозы, затем через 30 мин - раствор пептида (опыт) или 0.85%-ый раствор NaCl (контроль). Кровь на анализы брали через 1 ч после введения пептида (или NaCl) и далее отменяли введение препаратов. Следующий анализ крови проводили через 5 суток после отмены всех препаратов.

Экспериментальную гиперхолестеринемию у крыс осуществляли жировой диетой, обогащенной насыщенными жирными кислотами и холестерином в течение 15 суток. Одновременно с этим опытные животные интраназально получали ежедневно (1 раз в сутки) в течение 11 суток препарат на основе пептида PGPL в дозе 175 мкг/кг в объеме 0.02 мл. Кровь на анализы брали через 1 ч после последнего введения пептида (опыт) или 0,85%-ного раствора NaCl (контроль).

Результаты экспериментов представлены в таблицах 3 (динамика изменений показателей крови при интраназальном введении пептида PGPL в дозе 1 мг/кг крысам 1 раз в сутки в течение 5-ти суток на фоне сахарной нагрузки) и 4 (уровень сахара крови животных через 1 час после 11-суточного введения PGPL (опыт) или NaCl (контроль) с одновременным нахождением животных на холестериновой диете в течение 15 суток).

Таблица 3 Условия опыта Опыт (введен PGPL) n=10 Контроль (введен NaCl) n=10 Норма (здоровые животные) n=10 Уровень сахара через 1 ч после 5-кратного введения PGPL или NaCl, ммоль/л 3.42±0.21** 9.83±1.0^## 5.0±0.65* Уровень сахара через 5 дней после отмены введения препаратов, ммоль/л 3.79±0.36** 9.83±1.0^## 5.0±0.65**

Таблица 4 Условия опыта Уровень сахара крови (ммоль/л) (в период окончания эксперимента) Норма, n=10 3,75±0,15 Контроль, n=10 6,0±1,2 (100%) Опыт, n=10 4,3±0,3 (71%)** Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих показателей нормы - ^## р<0.01, ^# р<0.05 или контроля **р<0.01, *р<0.05

Анализ крови животных через 1 ч после последнего 5-го интраназального введения крысам исследуемого пептида PGPL на фоне одновременного введения раствора глюкозы показал, что уровень сахара в крови опытных крыс был на 65% ниже контрольных значений.

Через 5 суток после отмены всех вводимых препаратов уровень сахара в крови опытной группы животных оставался достоверно сниженным по отношению к контролю (таблица 3), следовательно, применение пептида PGPL (в частности, пятикратное применение 1 раз/сутки в дозе 200 мкг/кг) на фоне сахарной нагрузки оказывает защитное гипогликемическое действие, способствуя поддержанию нормального уровня сахара в крови опытных животных.

Из таблицы 4 видно, что при содержании животных на жировой диете с одновременным интраназальным введением пептида PGPL (в частности, в дозе 175 мкг/кг), в опытной группе крыс уровень сахара через 1 ч после последнего 11-го введения был достоверно ниже значений показателей сахара в контрольной группе и практически соответствовал уровню сахара у нормальных крыс. Таким образом, лейцинсодержащий глипролин PGPL, применяемый в период поступления в организм крыс жировой диеты, защищал организм животных от гипергликемии, вызываемой жирной и сладкой пищей.

Пример 3. Исследование влияния тетрапептида PGPL на кальциевый гомеостаз и выживаемость нейронов головного мозга при гиперстимуляции глутаматных рецепторов

Эксперименты были проведены на 7-9-дневных первичных культурах зернистых клетках мозжечка крысы с экспрессированными глутаматными рецепторами и подавлением пролиферации глиальных клеток. Использовали одночасовое воздействие 100-200 мкМ глутамата. Выживаемость нейронов, подвергнутых токсическому действию глутамата, оценивали биохимическим методом.

Результаты влияния различных доз PGPL на выживаемость зернистых клеток мозжечка при гиперстимуляции глутаматных рецепторов, вызванных 300 мкМ NMDA (N-метил-D-аспартат) в присутствии 5 мМ Ca²⁺, представлены на графике. В присутствии консерванта В-27 (ростовые факторы и инсулин) и высокой концентрации K⁺ (25 мМ), тетрапептид PGPL в дозе 200 мкМ практически не оказывал влияния на гибель зернистых клеток мозжечка. В то же время введение PGPL в дозах 5-200 мкМ уменьшало гибель нейронов. Так, 300 мкМ NMDA в присутствии 5 мМ Ca²⁺ вызывал гибель примерно 80% нейронов, предынкубация нейронов с PGPL в течение 60 мин, затем он присутствовал во время всего эксперимента, дозово-зависимым способом увеличивал выживаемость нейронов от 10 до 35%. Наиболее значимую защиту клеток от эксайтотоксичности выявили в дозе PGPL 200 мкМ.

Влияния PGPL на нарушения кальциевого гомеостаза и, в частности, на развитие отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) в нейронах мозжечка при эксайтотоксичности, вызванной NMDA, было изучено в экспериментах на сестринских культурах клеток в тот же день, что и при проведении опытов на выживаемость нейронов. Результаты эксперимента представлены в таблице 5.

Таблица 5   Сум. число клеток, имевших ОКД Сум. число клеток, имевших ОКД, % общее число клеток контроль 135 62 150 PGPL 25 25 149

Как видно на таблицы 5, PGPL в дозе 200 мкМ задерживал развитие ОКД. Если в контрольных культурах NMDA вызвал развитие ОКД в 62% нейронов, то предынкубация нейронов с PGPL и его нахождение в буферном растворе вместе с NMDA уменьшал число нейронов с ОКД до 25%.

Пример 4. Исследование влияния тетрапептида PGPL на выживаемость культивируемых клеток феохромоцитомы крысы РС₁₂ в условиях окислительного стресса

Клетки подвергали 30-минутной инкубации в среде с 1 мМ H₂O₂. Такое воздействие приводило к развитию некротических процессов, в частности, к нарушению целостности клеточной мембраны, обнаруживаемому уже через несколько часов после индукции окислительного стресса. В качестве вещества сравнения использовали пептид Pro-Gly-Pro в концентрации 100 мкМ.

Результаты защитного действие пептида PGPL на клетки PC12 в условиях окислительного стресса эксперимента представлены в таблице 6.

Таблица 6     Содержание некротических клеток (%) Контроль(без окислительного стресса)   7,9±1,9 Окислительный стресс:     +H₂O₂ 70,2±5,0^### +PGP 100 мкМ 34,5±8,1*** +PGPL 10 мкМ 43,8±4,7*** +PGPL 100 мкМ 31,7±5,5*** +PGPL 300 мкМ 39,6±11,0** Данные приведены в виде среднее ± стандартное отклонение. ^### р<0,001 относительно контроля; *** р<0,001, ** р<0,01 относительно клеток, подвергшихся окислительному стрессу (t-тест Стьюдента).

Внесение Pro-Gly-Pro-Leu (в концентрациях 10, 100 и 300 мкМ) в среду после отмывки клеток от H₂O₂ приводило к практически двукратному снижению содержания некротических клеток. При этом наибольший положительный эффект наблюдали при концентрации пептида, равной 100 мкМ. Сравнение цитопротективных эффектов Pro-Gly-Pro-Leu и Pro-Gly-Pro при их концентрации 100 мкМ не выявило существенных различий в эффективности действия этих пептидов в используемой тест-системе. Эти данные указывают на то, что пептид Pro-Gly-Pro-Leu обладает свойственным для целого ряда глипролинов нейропротективным потенциалом.

Подытоживая, тетрапептид Pro-Gly-Pro-Leu является уникальным лекарственным средством пептидной природы для профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии различного генеза. Фармацевтическая композиция на его основе и способа лечения и профилактики нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии удовлетворяет требованиям эффективности и безопасности.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ, применение и фармацевтическая композиция для профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза и диабетической энцефалопатии, включающие введение тетрапептида общей формулы Pro-Gly-Pro-Leu. Предложенная группа изобретений позволяет повысить эффективность профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обменов при метаболическом синдроме и энцефалопатии за счет использования тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 4 пр.

1. Способ профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии, включающий интраназальное введение лекарственного средства на основе тетрапептида общей формулы Pro-Gly-Pro-Leu.

2. Применение тетрапептида общей формулы Pro-Gly-Pro-Leu в качестве средства профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии.

3. Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения нарушений углеводного и липидного обмена при метаболическом синдроме и энцефалопатии атеросклеротического, сосудистого генеза, диабетической энцефалопатии, содержащая в качестве активного вещества тетрапептид общей формулы Pro-Gly-Pro-Leu.

4. Композиция по п.3, выполненная с возможностью интраназального введения.

5. Композиция по п.3 или 4, выполненная следующего состава: тетрапептид в количестве 1-10 г/л, нипагин в количестве 0,9-1,1 г/л в качестве консерванта, дистиллированная вода - остальное.