ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к способу предварительного придания направленности действия для направленной медицинской визуализации и/или клинической медицины, где применяют абиотические реакционноспособные химические группы, которые проявляют биоортогональную реакционную способность по отношению друг к другу. Изобретение также относится к набору для предварительного придания направленности действия, содержащему по меньшей мере один предварительно направляющий зонд и по меньшей мере один эффекторный зонд, где предварительно направляющий зонд содержит первичный направляющий фрагмент и первую биоортогональную реакционноспособную группу и где эффекторный зонд содержит эффекторный фрагмент, такой как метка или фармацевтически активное соединение, и вторую биоортогональную реакционноспособную группу. Изобретение также относится к предварительно направляющим средствам, применяемым в упомянутых выше способе и наборе. Изобретение конкретно имеет отношение к ядерной визуализации и лучевой терапии.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Во многих областях медицинской диагностики и терапии желательным является селективно доставлять агент, такой как терапевтическое средство (лекарственное средство) или диагностическое (например, для визуализации) средство, к конкретному участку или ограниченной области в организме субъекта, такого как пациент.
Активная направленность действия на орган или ткань достигается посредством прямого или опосредованного сочетания желательных активных фрагментов (например, средства, усиливающего контрастность, или цитотоксического соединения) в конструкцию для придания направленности действия, которая связывается с клеточными поверхностями или инициирует клеточный захват на целевом участке, представляющем интерес. Направляющие фрагменты, применяемые для придания направленности действия таким агентам, обычно представляют собой конструкции, которые имеют сродство к мишеням на поверхности клеток (например, мембранным рецепторам), структурным белкам (например, амилоидным бляшкам) или внутриклеточным мишеням (например, РНК, ДНК, ферменты, клеточные сигнальные пути). Эти фрагменты могут представлять собой антитела (фрагменты), белки, аптамеры, олигопептиды, олигонуклеотиды, олигосахариды, а также пептиды, пептоиды и органические лекарственные соединения, которые, как известно, накапливаются при конкретном заболевании или дисфункции. Альтернативно, контрастное/терапевтическое средство может быть направлено на метаболический путь, который регулируется с повышением во время заболевания (такого как инфекция или рак), такой как синтез ДНК, белка и мембранный синтез, и поглощение углеводов. В пораженных болезнью тканях упомянутые выше маркеры могут различать клетки, пораженные заболеванием, от здоровой ткани и предполагать уникальные возможности для раннего обнаружения, специфической диагностики и (направленной) терапии.
Важным критерием для успешного действия средств молекулярной визуализации/терапии в целом и средств ядерной визуализации/терапии в частности является то, что они проявляют высокую степень захвата мишенью, в то же время показывая быстрое выведение (через почечную и/или гепатобилиарную системы) из ткани, не являющейся мишенью, и из крови. Однако это часто является проблематичным: например, визуализационные исследования у людей показали, что максимальная концентрация меченного радиоактивным изотопом антитела на участке опухоли является достижимой в пределах 24 ч, но требуется более нескольких дней перед тем, как концентрация меченого антитела в кровообращении снижается до уровней, достаточно низких для проведения успешной визуализации.
Эти проблемы (особенно в случаях ядерной визуализации и терапии) с медленным или недостаточным накоплением в целевой ткани и медленным выведением из нецелевых областей привели к применению подходов, связанных с предварительным приданием направленности действия.
Предварительное придание направленности действия относится к стадии в способе предварительного придания направленности действия, где первичная мишень (например, поверхность клетки) обеспечивается предварительно направляющим зондом. Последний содержит вторичную мишень, которая постепенно будет подвергаться направленному действию со стороны дополнительного зонда (эффекторный зонд), снабженного вторичным направляющим фрагментом.
Таким образом, при предварительном придании направленности действия, предварительно направляющий зонд связывается с первичной мишенью. Предварительно направляющий зонд также несет вторичные мишени, которые облегчают специфическое сочетание с диагностическим (визуализационным) и/или терапевтическим средством, эффекторным зондом. После того как конструкция, образующая предварительно направляющий зонд, локализована на целевом участке (что требует времени, например, равного 24 ч), может применяться средство выведения для удаления избытка из крови, если природное выведение не является достаточным. На второй стадии инкубации (предпочтительно занимающей более короткое время, например, 1-6 часов) эффекторный зонд связывается с (предварительно)связанным предварительно направляющим зондом через его вторичный направляющий фрагмент. Вторичная мишень (присутствующая на предварительно направляющем зонде) и вторичный направляющий фрагмент (присутствующий на эффекторном зонде) должны связываться быстро, с высокой специфичностью и высоким сродством и должны быть устойчивы внутри организма.
Общая концепция предварительного придания направленности действия обрисована в общих чертах для визуализации на Фиг. 1. Здесь, эффекторный зонд представляет собой зонд для визуализации, содержащий обнаруживаемую метку для визуализационной модальности. Эффекторный зонд связывается с (предварительно)связанным предварительно направляющим зондом через его вторичные направляющие группы.
Общими примерами пар вторичная мишень/вторичный направляющий фрагмент являются биотин/стрептавидин или системы антитело/антиген. Чтобы быть эффективным, эффекторный зонд должен быстро выводиться из организма (например, через почки) для обеспечения желательного высокого накопления в опухоли, с относительно низким нецелевым накоплением. Следовательно, эти зонды обычно являются небольшими.
В ядерной визуализации и лучевой терапии концепция предварительного придания направленности действия имеет дополнительное преимущество, поскольку затратная по времени стадия предварительного придания направленности действия может осуществляться без использования радионуклида, в то время как вторичная направляющая стадия с использованием радионуклида может осуществляться быстрее. Последнее позволяет применять более короткоживущие радионуклиды, с преимуществом минимизации дозы облучения для пациента и, например, применения средств для ПЭТ вместо средств для ОФЭКТ. Кроме того, в целом, этот подход облегчает применение универсального контрастного вещества.
Объекты, в которых осуществляются высокоселективные взаимодействия в биологии в целом (такие как антитело-антиген), и при предварительном придании направленности действия в частности (биотин-стрептавидин, антитело/гаптены, антисмысловые олигонуклеотиды), являются очень крупными. В результате предварительное придание направленности действия с пептидами и небольшими органическими фрагментами в качестве первичных направляющих групп, а также метаболическая визуализация и внутриклеточная целевая визуализация оставались вне пределов достижимости, поскольку размер вторичных мишеней делал применение небольших первичных групп нецелесообразным.
Более того, работа существующих систем предварительного придания направленности действия затруднена факторами, ассоциированными с их биологической природой. Биотин представляет собой эндогенную молекулу, и его конъюгаты могут расщепляться сывороточным ферментом биотинидазой. Когда применяют антисмысловое предварительное придание направленности действия, олигонуклеотиды могут быть объектом атаки РНКазой и ДНКазой. Белки и пептиды также являются объектом воздействия природных путей разложения. Эти взаимодействия могут быть дополнительно ослаблены их нековалентной и динамической природой и ограничены временем пребывания на мишени. В результате время между добавлением двух компонентов при предварительном придании направленности действия является ограниченным, что может приводить к неоптимальным соотношениям мишени к не мишени. Также эндогенный биотин конкурирует с конъюгатами биотина за связывание со стрептавидином. В конце концов, стрептавидин является высокоиммуногенным.
Недавняя разработка направлена на то, чтобы избежать недостатков, ассоциированных с приданием предварительной направленности действия исключительно на основе природных/биологических направляющих конструкций (т.е. биотин/стрептавидин, антитело/гаптен, антисмысловые олигонуклеотиды).
В этом отношении может быть сделана ссылка на WO 2006/038185, в качестве раскрытия способа предварительного придания направленности действия, для направленной медицинской визуализации и/или клинической медицины, где применяют абиотические реакционноспособные химические группы, которые проявляют биоортогональную реакционную способность по отношению друг к другу. В этой ссылке биоортогонально взаимодействующие группы представляют собой партнеры реакции в сшивании Штаудингера, т.е. азид и фосфин. Описанный выбор сшивания Штаудингера в качестве химии связывания при предварительном придании направленности действия приводит к доступности реакционноспособных партнеров, которые являются абиотическими, которые образуют устойчивый аддукт при физиологических условиях и которые распознают только друг друга, в то же время, игнорируя их клеточные/физиологические окружения (т.е. они являются биоортогональными).
Еще одной ссылкой на применение в способе предварительного придания направленности действия абиотических реакционноспособных химических групп, которые проявляют биоортогональную реакционную способность по отношению друг к другу, является WO 2007/039858. В этом документе биоортогональные реакционноспособные группы представляют собой партнеры реакции в [3+2] азид - алкин циклоприсоединении.
Еще один тип химии связывания описан Neal K. Devaraj, Ralph Weissleder и Scott Hilderbrand в Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2297-2299. Это относится к применению биоортогональных циклоприсоединений тетразина для мечения живых клеток. Партнерами реакции здесь являются 3-(п-бензиламино)-1,2,4,5-тетразин и норборнен, а именно (1S,2S,4S)-бицикло[2,2,1]гепт-5-ен-2-илуксусная кислота, которые вступают в циклоприсоединение Дильса-Альдера с последующей ретрореакцией Дильса-Альдера, в которой высвобождается молекулярный азот (N2). Эта химия связывания также относится к реакции Дильса-Альдера с обратным захватом электронов. Сделана ссылка на предварительное придание направленности действия на человеческие клетки рака молочной железы SKBR3 с использованием моноклонального антитела трастузумаб (герцептин), меченного норборненом, с последующим мечением клеток тетразином, связанным с расположенным рядом ИК-флуоресцентным зондом VT680.
Приведенные выше типы химии связывания, несмотря на их применимость, также являются предметом дальнейшего улучшения. Это относится к тому, что по смыслу, между прочим, необходимы относительно высокие концентрации взаимодействующих веществ. Конкретно, данное означает, что эффекторные зонды, чтобы в достаточной степени связаться с предварительно направляющими зондами, требуют относительно длительного времени циркуляции и/или высоких концентраций. Желательно иметь возможность снизить необходимые концентрации эффекторных зондов, в то же время сохраняя преимущества упомянутого выше биоортогонального способа предварительного придания направленности действия.
Дополнительно, особенно со ссылкой на применение в ядерной визуализации и лучевой терапии, желательным является представить быструю и эффективную биоортогональную химию связывания.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для того чтобы лучшим образом принять меры для удовлетворения приведенных выше запросов, изобретение, в одном аспекте, предоставляет набор для направленной медицинской визуализации и/или клинической медицины, содержащий по меньшей мере один предварительно направляющий зонд и по меньшей мере один эффекторный зонд, где предварительно направляющий зонд содержит первичный направляющий фрагмент и первую биоортогональную реакционноспособную группу и где эффекторный зонд содержит эффекторный фрагмент, такой как метка или фармацевтически активное соединение, и вторую биоортогональную реакционноспособную группу, где любая из первой и второй биоортогональных реакционноспособных групп представляет собой диенофил, а другая из первой и второй биоортогональных реакционноспособных групп является диеном, где диенофил представляет собой 8-членный циклический диенофил, соответствующий формуле (1):
где каждый R независимо обозначает H или в по большей мере шести случаях заместитель, выбранный из группы, состоящей из алкила, O-алкила, S-алкила, F, Cl, Br, I, SO2, NO2, NR'R", причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил, C(=O)Оалкил, C(=O)Оарил, CONR'R", причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H, арил или алкил, ОСОалкил, ОСОарил, NR'СОалкил, причем R' представляет собой H или алкил, NR'СОарил, причем R' представляет собой или алкил, NR'C(=O)Оалкил, причем R' представляет собой H или алкил, NR'C(=O)Оарил, причем R' представляет собой H или алкил, OCONR'алкил, причем R' представляет собой H или алкил, OCONR'арил, причем R' представляет собой H или алкил, NR'CONR"алкил, причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил, NR'CONR"арил, причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил, NR'CSNR"алкил, причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил и NR'CSNR"арил, причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил; причем по меньшей мере один R, содержащийся в линкерном фрагменте, связан, необязательно через спейсер, с предварительно направляющим зондом или эффекторным зондом, и где X и Y, каждый независимо, обозначают H или заместитель, выбранный из группы, состоящей из алкила, O-алкила, S-алкила, F, Cl, Br, I, SO2, NO2 и NRR', причем R и R', каждый независимо, представляют собой H или алкил или вместе образуют связь; и где диен выбирают таким образом, чтобы он был способен к взаимодействию с диенофилом посредством протекающего циклоприсоединения Дильса-Альдера с последующей ретрореакцией Дильса-Альдера.
В еще одном аспекте изобретение предоставляет способ предварительного придания направленности действия, а также применяемые в нем предварительно направляющие средства и направленную медицинскую визуализацию или терапию, где этот набор применяют.
В еще одном дополнительном аспекте изобретение представляет собой соединение, соответствующее формуле (1), для применения в способе предварительного придания направленности действия у животного или человека.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение будет описано по отношению к конкретным вариантам осуществления и со ссылкой на некоторые чертежи, но изобретение не ограничивается ими, но ограничивается только формулой изобретения. Любые ссылочные знаки в формуле изобретения не должны рассматриваться как ограничивающие объем правовых притязаний. Описанные чертежи являются только схематическими и не являются ограничивающими. На чертежах размер некоторых элементов может быть преувеличен и не совпадать по масштабу для иллюстративных целей. Там, где термины "содержащий" и “включающий” применяют в настоящем описании и формуле изобретения, они не исключают другие элементы или стадии. Там, где неопределенный или определенный артикль применяют при ссылке на единственное число имени существительного, например "a" или "an", "the", это включает множественную форму этого существительного, если что-либо еще не утверждается конкретно.
Кроме того, следует отметить, что термин "содержащий" и “включающий”, используемый в описании и в формуле изобретения, не должен интерпретироваться как ограниченный средствами, перечисленными после его употребления; он не исключает другие элементы или стадии. Таким образом, объем охвата выражения "устройство, содержащее средства А и B" не должно быть ограничено устройствами, состоящими только из компонентов А и B. Это означает, что в отношении настоящего изобретения только уместными компонентами устройства являются А и B.
В некоторых химических формулах сделана ссылка на "алкил" и "арил". В этом отношении, "алкил", каждый независимо, указывает на алифатическую, с прямой цепью, разветвленную или циклическую алкильную группу из вплоть до десяти атомов углерода, возможно включающую 1-3 гетероатома, таких как O, N или S, и предпочтительно из 1-6 атомов углерода, и "арил", каждый независимо, указывает на ароматическую или гетероароматическую группу из вплоть до десяти атомов углерода, возможно включающую 1-3 гетероатома, таких как N или S. В некоторых формулах группы или заместители указаны со ссылкой на букву, такую как "A", "B", "X", "Y", и разнообразно пронумерованные "R" группы. Определения этих букв следует читать со ссылкой на каждую формулу, т.е. в различных формулах эти буквы, каждая независимо, могут иметь различные значения, если не указано иным образом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 отображает общую схему концепции предварительного придания направленности действия, как обсуждается выше;
Фиг.2. предоставляет схему реакции для реакции [4+2] Дильса-Альдера; между (3,6)-ди-(2-пиридил)-s-тетразином и E-циклооктеном с последующей ретрореакцией Дильса-Альдера, в которой образуются продукт и азот. Поскольку производное транс-циклооктена не содержит электроноакцепторных групп как в классической реакции Дильса-Альдера, этот тип реакции Дильса-Альдера отличается от классического типа и часто именуется как "реакция Дильса-Альдера с обратным захватом электронов". В последующем тексте последовательность обеих стадий реакции, т.е. первоначального циклоприсоединения Дильса-Альдера (обычно циклоприсоединения Дильса-Альдера с обратным захватом электронов) и последующей ретрореакции Дильса-Альдера будет именоваться в сокращенном виде как "ретрореакция Дильса-Альдера".
Фиг. 3 (a и b) отображают общие схемы предварительного придания направленности действия с использованием ретрохимии Дильса-Альдера;
Фиг. 4 - Фиг. 7 иллюстрируют схемы синтеза для соединений, используемых в Примерах.
Фиг. 8-9 иллюстрируют схемы синтеза для соединений, используемых в примере in vivo.
Фиг. 10-12 иллюстрируют применимость настоящего изобретения in vivo.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Ретрореакция Дильса-Альдера
Химия связывания ретро-Дильса-Альдера, как правило, включает пару взаимодействующих соединений, которые связываются с образованием неустойчивого промежуточного соединения, которое отщепляет небольшую молекулу (в зависимости от исходных соединений, которая может представлять собой, например, N2, CO2, RCN, в качестве единственного побочного продукта, через ретрореакцию Дильса-Альдера с образованием устойчивого продукта. Пары взаимодействующих соединений содержат в качестве одного взаимодействующего соединения (т.е. одной биоортогональной реакционноспособной группы) подходящий диен, такой как производное тетразина, и в качестве другого взаимодействующего вещества (т.е. другой биоортогональной реакционноспособной группы) циклооктен или циклооктин в соответствии с формулой (1).
Химия связывания ретро-Дильса-Альдера, как правило, включает пару взаимодействующих соединений, которые связываются с образованием неустойчивого промежуточного соединения, которое претерпевает перегруппировку в устойчивый аддукт через ретрореакцию Дильса-Альдера. Пары взаимодействующих соединений содержат в качестве одного взаимодействующего соединения (т.е. одной биоортогональной реакционноспособной группы) диен, такой как электронодефицитный тетразин, или т.п., и в качестве другого взаимодействующего вещества (т.е. другой биоортогональной реакционноспособной группы) напряженный циклооктен или циклооктин в соответствии с формулой (1).
Исключительно быстрая реакция, например, электронодефицитных (замещенных) тетразинов, например, с напряженным E-циклооктеном приводит в результате к промежуточному соединению сшивания, которое претерпевает перегруппировку в устойчивый дигидропиридазин посредством отщепления N2, в качестве единственного побочного продукта в [4+2] циклоприсоединении ретро-Дильса-Альдера. Это показано на Фиг. 2.
Два реакционноспособных соединения являются абиотическими и, таким образом, не претерпевают быстрого метаболизма in vivo. Они являются биоортогональными, например, они селективно взаимодействуют друг с другом в физиологических средах.
Ссылки на реакцию Дильса-Альдера с обратным захватом электронов и поведение пары реакционноспособных соединений включают Thalhammer, F.; Wallfahrer, U.; Sauer, J., Tetrahedron Letters, 1990, 31 (47), 6851-6854; Wijnen, J.W.; Zavarise, S.; Engberts, JBFN, Journal of Organic Chemistry, 1996, 61, 2001-2005; Blackman, M.L.; Royzen, M.; Fox, J.M., Journal of The American Chemical Society, 2008, 130 (41), 13518-19).
Следует понимать, что, в широком смысле, в соответствии с изобретением упомянутая выше химия связывания может быть применена по сути к любой паре молекул, групп или фрагментов, которые могут применяться в предварительном придании направленности действия. Т.е. один элемент из такой пары будет содержать первичный направляющий фрагмент, который обладает способностью к связыванию с первичной мишенью, и дополнительно содержит, по меньшей мере, одну вторичную мишень. Другой элемент будет представлять собой вторичный направляющий фрагмент, пригодный для применения в связывании с указанной вторичной мишенью, и дополнительно содержит фрагмент, пригодный для оказания терапевтического действия (обычно фармацевтически активное соединение), или предназначенный для метода визуализации (т.е. метку), или оба.
Таким образом, в соответствии с изобретением любой из предварительно направляющего зонда и эффекторного зонда функционализирован циклооктеном или циклооктином, а другой функционализирован с тетразином или другим подходящим диеном. Это проиллюстрировано на Фиг. 3. Схема сверху (Фиг. 3a) показывает предварительно направляющий зонд, содержащий дипиридилтетразин, связанный через линкерный фрагмент (предпочтительно содержащий гибкий спейсер) с антителом, в качестве первичного направляющего фрагмента, и эффекторный зонд, содержащий циклооктен (в качестве вторичного направляющего фрагмента), присоединенный через линкер (гибкий спейсер) к обнаруживаемой метке. Схема ниже (Фиг. 3b) показывает в точности противоположное, а именно предварительно направляющий зонд, содержащий циклооктен, и эффекторный зонд, содержащий тетразин.
Квалифицированный специалист в данной области осведомлен об изобилии диенов, которые являются реакционноспособными в ретрореакции Дильса-Альдера. Предпочтительные диены приведены ниже со ссылкой на формулы (2)-(7).
где R1 выбирают из группы, состоящей из алкила, арила, O-алкила, C(=O)O-алкила, O- и NH2; А и B, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из алкилзамещенного углерода, арилзамещенного углерода, азота, N+O-, N+R, причем R представляет собой алкил, при условии, что А и B не являются оба углеродом; X выбирают из группы, состоящей из O, N-алкила и C=O; Y представляет собой CR, причем R выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, C(=O)Оалкила.
Диен формулы (2) является особенно пригодным в качестве партнера реакции для циклооктинового диенофила, т.е. диенофила в соответствии с формулой (1) где X и Y, как определено в формуле (1), вместе образуют связь.
Диен, особенно подходящий в качестве партнера реакции для циклооктена, представляет собой
где R1 и R2, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, OH, C(=O)O-алкила, CF3, C(=O)NH-алкила и NO2; А выбирают из группы, состоящей из N-алкила, N-арила, C=O и CN-алкила; В представляет собой O; X выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, N и N+O-.
Сравнимый диен, особенно подходящий в качестве партнера реакции для циклооктина, представляет собой
где R1 и R2, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, OH, C(=O)O-алкила, CF3, C(=O)NH-алкила и NO2; А выбирают из группы, состоящей из CO, Салкил-алкила, CN-алкила, N-алкила и N-арила; В представляет собой O; X выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, N и N+O-.
Еще один диен, особенно подходящий в качестве партнера реакции для циклооктена, представляет собой
где R1 и R2, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, OH, C(=O)O-алкила, CF3, C(=O)NH-алкила и NO2; А выбирают из группы, состоящей из N, C-алкила, C-арила и N+O-; В представляет собой N; X выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, N и N+O-.
Сравнимый диен, особенно подходящий в качестве партнера реакции для циклооктина, представляет собой
где R1 выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, OH, C(=O)O-алкила, CF3 и NO2; R2 выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, CN, OH, C(=O)O-алкила, CF3 и NO2;
A выбирают из группы, состоящей из N, CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N+O-; В представляет собой N; X выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из CH, CCN, C-алкила, C-арила, N и N+O-.
Особенно применимыми производными тетразина являются электронодефицитные тетразины, т.е. тетразины, замещенные группами или фрагментами, которые, как правило, не рассматриваются в качестве электронодонорных, и предпочтительно несущие электроноакцепторные заместители.
Эти электронодефицитные тетразины, в общем случае, соответствуют следующей структурной формуле:
В этой формуле R1 и R2, каждый независимо, обозначают заместитель, выбранный из группы, состоящей из 2-пиридила, фенила или фенила, замещенного одной или более электроноакцепторными группами, такими как NO2, CN, COOH, COOR, CONH2, CONHR, CONR2, CHO, COR, SO2R, SO2OR, NO, Ar, где R представляет собой C1-C6 алкил и Ar обозначает ароматическую групп, особенно фенил, пиридил или нафтил.
В соединениях в соответствии с каждой из формул (2)-(7) могут быть дополнительно предоставлены группы R1 и R2 (включая их на X или Y), с подходящими линкерным или спейсерным фрагментами, как обсуждается ниже. Аналогично и независимо от этого может быть дополнительно предоставлен также диенофил формулы (1) с подходящими линкерным или спейсерным фрагментами, как обсуждается ниже.
Диенофил предпочтительно представляет собой E-циклооктен или циклооктин. Более предпочтительно, этот E-циклооктен или циклооктин является незамещенным (помимо линкера или спейсера), т.е. E-циклооктен в соответствии с формулой 8 или циклооктин формулы 9.
где X и Y имеют приведенное выше значение,
Преимущество применения [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера в стратегии предварительного придания направленности действия состоит в том, что как диен, так и циклооктен или циклооктин являются абиотическими и по существу нереакционноспособными по отношению к биомолекулам внутри или на поверхностях клеток и всех других областей, таких как сыворотка и т.д. Таким образом, соединения и способ изобретения могут применяться в живой клетке, ткани или организме. Более того, реакционноспособные группы являются относительно небольшими и могут быть введены в биологические образцы или живые организмы без существенного изменения биологического размера. Применяя [4+2] ретрореакцию Дильса-Альдера, возможно связывать первичные направляющие фрагменты, которые являются крупными по размеру, например антитела, с метками или другими молекулами, применяя небольшие партнеры в реакции, например тетразин или циклооктен. Даже более преимущественно, первичные направляющие фрагменты, которые являются относительно небольшими, например пептиды, могут быть связаны с метками или другими молекулами с использованием (подобранной пары) относительно небольших партнеров реакции, например, тетразина и циклооктена. Размер и свойства предварительно направляющего зонда и эффекторного зонда не испытывают сильного воздействия со стороны вторичной мишени и вторичного направляющего фрагмента, что позволяет применять схемы предварительного придания направленности действия для небольших направляющих фрагментов. Вследствие этого, другие ткани могут быть выбраны в качестве мишеней, т.е. назначение зондов не ограничено сосудистой системой и интерстициальным (межклеточным) пространством как в случае применяемого в настоящее время предварительного придания направленности действия с антителом-стрептавидином. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение применяют для направленной визуализации.
В соответствии с этим вариантом осуществления визуализация конкретной первичной мишени достигается посредством специфического связывания первичного направляющего фрагмента предварительно направляющего зонда и обнаружения этого связывания с использованием обнаруживаемых меток, содержащихся в эффекторном зонде.
Первичная мишень
"Первичная мишень", как используют в настоящем изобретении, относится к мишени для обнаружения в способе диагностики и/или способе визуализации, и/или подлежащей модуляции, связыванию, или иным образом предназначенной для действия фармацевтически активного соединения или другой терапевтической модальности.
Первичная мишень может быть выбрана из каких-либо подходящих мишеней внутри организма человека или животного или на патогене или паразите, например, из группы, содержащей клетки, такие как клеточные мембраны и клеточные стенки, рецепторы, такие как рецепторы клеточной мембраны, внутриклеточные структуры, такие как тельца Гольджи или митохондрии, ферменты, рецепторы, ДНК, РНК, вирусы или вирусные частицы, антитела, белки, углеводы, моносахариды, полисахариды, цитокины, гормоны, стероиды, рецептор соматостатина, моноаминоксидаза, мускариновые рецепторы, симпатическая нервная система миокарда, рецепторы лейкотриенов, например, на лейкоцитах, рецептор урокиназного активатора плазминогена (uPAR), фолатный рецептор, маркер апоптоза, маркер (анти-)ангиогенеза, гастриновый рецептор, допаминергическая система, серотонинергическая система, ГАМКергическая система, адренергическая система, холинергическая система, опиоидные рецепторы, GPIIb/IIIa рецептор и другие относящиеся к тромбам рецепторы, фибрин, рецептор кальцитонина, рецептор туфтсина, рецептор интегрина, рецепторы VEGF/EGF, матриксная металлопротеаза (MMP), рецептор P/E/L-селектина, рецептор LDL, P-гликопротеин, рецепторы нейротензина, рецепторы нейропептидов, рецепторы вещества Р, NK-рецептор, CCK-рецепторы, сигма-рецепторы, рецепторы интерлейкинов, тирозинкиназа вируса herpes simplex, человеческая тирозинкиназа.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения первичная мишень представляет собой белок, такой как рецептор. Альтернативно, первичная мишень может являться метаболическим путем, который регулируется с повышением во время заболевания, например инфекции или рака, таким как синтез ДНК, синтез белка, мембранный синтез и поглощение углеводов. В пораженных болезнью тканях упомянутые выше маркеры могут отличаться от здоровой ткани и предлагать уникальные возможности для раннего обнаружения, специфической диагностики и терапии, особенно направленной терапии.
Предварительно направляющий зонд
Предварительно направляющий зонд содержит фрагмент, который обладает способностью к связыванию с первичной мишенью, представляющей интерес.
Направляющие фрагменты, обычно представляют собой конструкции, которые имеют сродство к мишеням (целям) на поверхности клеток (например, мембранные рецепторы), структурные белки (например, амилоидные бляшки) или внутриклеточные мишени (например, РНК, ДНК, ферменты, клеточные сигнальные пути). Эти фрагменты могут представлять собой антитела (фрагменты), белки, аптамеры, олигопептиды, олигонуклеотиды, олигосахариды, а также пептиды, пептоиды и органические лекарственные соединения, которые, как известно, накапливаются при конкретном заболевании или дисфункции.
Конкретные варианты осуществления пригодных первичных направляющих фрагментов для применения в наборах настоящего изобретения описаны в настоящем документе и включают связывающиеся с рецепторами пептиды и антитела. Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению небольших направляющих фрагментов, таких как пептиды, таким образом, чтобы получать проникающий в клетку направляющий зонд.
"Первичный направляющий фрагмент", как использован в настоящем изобретении, относится к части направляющего зонда, которая связывается с первичной мишенью. Конкретными примерами первичных направляющих фрагментов являются пептиды или белки, которые связываются с рецептором. Другие примеры первичных направляющих фрагментов представляют собой антитела или их фрагменты, которые связываются с клеточным соединением. Антитела могут включать небелковые соединения, а также белки или пептиды. Другие первичные направляющие фрагменты могут состоять из аптамеров, олигопептидов, олигонуклеотидов, олигосахаридов, а также пептоидов и органических лекарственных соединений. Первичный направляющий фрагмент предпочтительно связывается с высокой специфичностью, с высоким сродством, и связь с первичной мишенью предпочтительно является устойчивой внутри организма.
Для обеспечения специфической направленности на перечисленные выше первичные мишени первичный направляющий фрагмент направляющего зонда может содержать соединения, включающие, но не ограниченные ими, антитела, фрагменты антител, например Fab2, Fab, scFV, полимеры (направленное действие на опухоль посредством ЭПР-эффекта), белки, пептиды, например октреотид и производные, VIP, MSH, LHRH, хемотаксические пептиды, бомбезин, эластин, пептидомиметики, углеводы, моносахариды, полисахариды, вирусы, лекарственные средства, химиотерапевтические средства, агонисты и антагонисты рецепторов, цитокины, гормоны, стероиды. Примеры органических соединений, предусмотренных в контексте настоящего изобретения, представляют собой или являются их производными, эстрогены, например эстрадиол, андрогены, прогестины, кортикостероиды, паклитаксел, этопозид, доксорубицин, метотрексат, фолиевую кислоту и холестерин.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения первичная мишень представляет собой рецептор и подходящие первичные направляющие фрагменты включают, но не ограничены ими, лиганд такого рецептора или его часть, которая еще связывается с рецептором, например, связывающийся с рецептором пептид в случае белковых лигандов, связывающихся с рецептором.
Другие примеры первичных направляющих фрагментов белковой природы включают интерфероны, например альфа-, бета- и гамма-интерферон, интерлейкины и белковый фактор роста, такой как фактор роста опухоли, например альфа-, бета-фактор роста опухоли, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), uPAR направляющий белок, аполипопротеин, LDL, аннексин V, эндостатин и ангиостатин.
Альтернативные примеры первичных направляющих фрагментов включают ДНК, РНК, PNA и LNA, которые являются, например, комплементарными с первичной мишенью.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения применяют небольшие липофильные первичные направляющие фрагменты, которые могут связываться с внутриклеточной первичной мишенью.
В соответствии с дополнительным конкретным вариантом осуществления изобретения первичная мишень и первичный направляющий фрагмент выбирают таким образом, чтобы это приводило к специфическому или увеличенному направленному действию на ткань или заболевание, такое как рак, воспаление, инфекция, сердечно-сосудистое заболевание, например тромбоз, атеросклеротическое повреждение, участок гипоксии, например инсульт, опухоль, сердечно-сосудистое нарушение, мозговое нарушение, апоптоз, ангиогенез, орган и репортерные ген/фермент. Это может достигаться посредством выбора первичных мишеней со специфичной по отношению к ткани, клетке или заболеванию экспрессии. Например, мембранные рецепторы фолиевой кислоты опосредуют внутриклеточное накопление фолата и его аналогов, таких как метотрексат. Экспрессия ограничена в нормальной ткани, но рецепторы сверхэкспрессируются в разнообразных типах опухолевых клеток.
В соответствии с одним вариантом осуществления предварительно направляющий зонд и эффекторный зонд могут представлять собой мультимерные соединения, содержащие множество первичных и/или вторичных мишеней и/или направляющих фрагментов.
Предварительно направляющий зонд дополнительно содержит упомянутую выше первую биоортогональную реакционноспособную группу. Эта группа служит в качестве "вторичной мишени", т.е. в качестве части направляющего зонда, который предоставляет первый партнер реакции для химии связывания ретро-Дильса-Альдера.
Указанная вторичная мишень может представлять собой также партнер в реакции связывания, как описано выше. Т.е. в одном варианте осуществления она является электронодефицитным тетразином. В еще одном варианте осуществления она представляет собой напряженный циклооктен. В предварительно направляющем зонде первичный направляющий фрагмент и первая биоортогональная реакционноспособная группа могут быть непосредственно связаны друг с другом. Они могут также быть связаны друг с другом через линкер, и, кроме того, они могут обе быть связаны с первичной направляющей матрицей, например биополимером, таким как полипептид. Подходящие линкерные фрагменты включают, но не ограничены ими, цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ).
Эффекторный зонд
Эффекторный зонд содержит эффекторный фрагмент, который обладает способностью к предоставлению желательного диагностического, визуализационного и/или терапевтического эффекта. Эффекторный зонд дополнительно содержит вторичный направляющий фрагмент.
Вторичный направляющий фрагмент относится к части эффекторного зонда, которая образует партнер реакции для доступной вторичной мишени, т.е. биоортогональной реакционноспособной группе (или группам), содержащейся в предварительно направляющем зонде. Следует понимать, что в той степени, в которой вторичная мишень представляет собой циклооктен, вторичный направляющий фрагмент будет являться тетразином, и наоборот.
Эффекторный фрагмент может, например, являться обнаруживаемой меткой. "Обнаруживаемая метка", как использовано в настоящем документе, относится к части эффекторного зонда, которая позволяет проводить обнаружение зонда, например, когда он присутствует в клетке, ткани или организме. Одним типом обнаруживаемой метки, предусмотренным в пределах контекста настоящего изобретения, является средство, обеспечивающее контраст. Различные типы обнаруживаемых меток предусмотрены в пределах контекста настоящего изобретения и описаны в настоящем документе ниже.
Таким образом, в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения наборы и способы для предварительного придания направленности действия настоящего изобретения применяют в визуализации, особенно медицинской визуализации. Чтобы идентифицировать первичную мишень, в качестве эффекторного зонда применяют зонд для визуализации, содержащий одну или более обнаруживаемых меток. Конкретными примерами обнаруживаемых меток зонда для визуализации являются фрагменты, обеспечивающие контраст, применяемые в традиционных визуализационных системах, такие как конструкции для визуализации в МРТ, спиновые метки, оптические метки, конструкции, чувствительные к ультразвуку, фрагменты, чувствительные к рентгеновскому излучению, радионуклиды, (био)люминесцентные и красители FRET-типа. Служащие примерами обнаруживаемые метки, предусмотренные в пределах контекста настоящего изобретения, включают, и необязательно ограничены ими, флуоресцентные молекулы, например аутофлуоресцентные молекулы, молекулы, которые флуоресцируют при контакте с реагентом, и т.д., радиоактивные метки; биотин, например, обнаруживают посредством связывания биотина авидином; флуоресцентные метки, визуализационные конструкции для МРТ, содержащие парамагнитный металл, визуализационные реагенты, например, те, что описаны в патентах США № 4741900 и 5326856) и т.п. Радионуклид, применяемый для визуализации, может представлять собой, например, изотоп, выбранный из группы, состоящей из 3H, 11C, 13N, 15О, 18F, 19F, 51Cr, 52Fe, 52Mn, 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Zn, 62Cu, 63Zn, 64Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 70As, 71As, 72As, 74As, 75Se, 75Br, 76Br, 77Br, 80Br, 82Br, 82Rb, 86Y, 88Y, 89Sr, 89Zr, 97Ru, 99Tc, 110In, 111In, 113In, 114In, 117Sn, 120I, 122Xe, 123I, 124I, 125I, 166Ho, 167Tm, 169Yb, 193Pt, 195Pt, 201Tl и 203Pb.
Другие элементы и изотопы, такие как используемые для терапии, могут также применяться для визуализации в некоторых областях применения.
МРТ-визуализируемый фрагмент может представлять собой парамагнитный ион или суперпарамагнитную частицу. Парамагнитный ион может представлять собой элемент, выбранный из группы, состоящей из Gd, Fe, Mn, Cr, Co, Ni, Cu, Pr, Nd, Yb, Tb, Dy, Ho, Er, Sm, Eu, Ti, Pa, La, Sc, V, Mo, Ru, Ce, Dy, Tl. Фрагмент, чувствительный к ультразвуку, может содержать микропузырек, оболочка которого состоит из фосфолипида и/или (биодеградируемого) полимера, и/или альбумина сыворотки человека. Микропузырек может быть заполнен фторированными газами или жидкостями.
Чувствительные к рентгеновскому излучению фрагменты включают, но не ограничены ими, йод, барий, сульфат бария, гастрографин или могут содержать везикулы, липосомы или полимерные капсулы, заполненные соединениями йода и/или сульфатом бария. Более того, обнаруживаемые метки, предусмотренные в пределах контекста настоящего изобретения, также включают пептиды или полипептиды, которые могут обнаруживаться посредством связывания с антителом, например посредством связывания обнаруживаемого меченого антитела или посредством обнаружения связанного антитела при исследовании типа сэндвич. В одном варианте осуществления обнаруживаемые метки представляют собой небольшого размера органические метки для ПЭТ и ОФЭКТ, такие как 18F, 11C или 123I. Вследствие их небольшого размера, органические метки для ПЭТ или ОФЭКТ идеально подходят для регистрации внутриклеточных событий, так как они не оказывают сильного воздействия на свойства направляющего устройства в целом и его мембранный транспорт в частности. Зонд для визуализации, содержащий ПЭТ-метку и любой из активных фрагментов в реакции ретро-Дильса-Альдера, в качестве вторичного направляющего фрагмента является липофильным и способен к пассивной диффузии в клетки и из них, пока он находит своего партнера для связывания. Кроме того, оба компонента не препятствуют пересечению гематоэнцефалического барьера и, таким образом, обеспечивают визуализацию областей в мозге.
Когда эффекторный зонд предназначен для включения в свой состав обнаруживаемой метки на основе металла, такого как лантанид (например, Gd), для усиления контраста при МРТ, его предпочтительно предоставляют в виде хелата. В таком случае эффекторный зонд предпочтительно содержит структурный фрагмент, способный к образованию координационного комплекса с таким металлом. Его хорошим примером являются макроциклические хелаты лантанида(III), являющиеся производными 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (H4dota), и 1,4,7,10-тетраазациклододекан-α,α',α,"α'"-тетраметил-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (H4dotma).
Эффекторный фрагмент может также представлять собой терапевтический фрагмент, такой как фармацевтически активное соединение. Примеры фармацевтически активных соединениий предоставлены в данном документе. Терапевтический зонд может необязательно также содержать обнаруживаемую метку.
Таким образом, в соответствии с еще одним вариантом осуществления наборы и способы для предварительного придания направленности действия изобретения применяют для направленной терапии. Это достигается посредством применения эффекторного зонда, содержащего вторичный направляющий фрагмент и один или более фармацевтически активных агентов (т.е. лекарственного средства или радиоактивного изотопа для лучевой терапии). Подходящие лекарственные средства для применения в контексте направленной доставки лекарств являются известными в данной области. Необязательно, терапевтический зонд может также содержать обнаруживаемую метку, такую как один или более агентов для визуализации. Радионуклид, применяемый для терапии, может представлять собой изотоп, выбранный из группы, состоящей из 24Na, 32P, 33P, 47Sc, 59Fe, 67Cu, 76As, 77As, 80Br, 82Br, 89Sr, 90Nb, 90Y, 103Ru, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 121Sn, 127Te, 131I, 140La, 141Ce, 142Pr, 143Pr, 144Pr, 149Pm, 149Tb, 151Pm, 153Sm, 159Gd, 161Tb, 165Dy, 166Dy, 166Ho, 169Er, 172Tm, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 198Au, 199Au, 211At, 211Bi, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 214Bi, 223Ra и 225Ac.
Альтернативно, лекарственное средство в терапевтическом зонде выбирают из сенсибилизаторов для фотодинамической терапии.
В эффекторном зонде вторичный направляющий фрагмент, т.е. вторая биоортогональная реакционноспособная группа и эффекторный фрагмент могут быть непосредственно связаны друг с другом. Они могут также быть связаны друг с другом через линкер, и, кроме того, они могут быть оба связаны с вторичной направляющей матрицей. Линкер может независимо быть выбран из тех же самых фрагментов, например полиэтиленгликолей, как обсуждается выше. Вторичная направляющая матрица может представлять собой, например, биополимер, такой как полипептид.
Изобретение также относится к способу предварительного придания направленности действия, с использованием ретрореакции Дильса-Альдера. В данном документе предварительно направляющий зонд, содержащий первичный направляющий фрагмент (например, антитело и фрагмент антитела или пептид, связывающийся с рецептором), функционализированы подходящим диеном, предпочтительно соединением в соответствии с любой из формул (2)-(7), указанных выше, или циклооктеном или циклооктином в соответствии с формулой (1) выше, соответственно, вводится инъекционно субъекту. После связывания с мишенью (например, первичным или метастатическим опухолевым повреждением, атеросклеротической бляшкой, пораженной инфарктом областью, участком воспаления или инфекции и т.д.) и выведения из циркуляции и из ткани, не являющейся мишенью (например, крови, печени, селезенки, почки и т.д.), посредством инъекции вводится эффекторный зонд, содержащий вторичный направляющий фрагмент, напримернесущий E-циклооктен или производное тетразина соответственно (т.е. реакционноспособный контрагент биоортогональной реакционноспособной группы, присутствующей в предварительно направляющем зонде), и лекарство или визуализируемую метку. Эффекторный зонд связывается с первичным направляющим фрагментом и предоставляет высокую степень контраста или селективно лечит участок заболевания.
Изобретение также относится к направлению действия на общий метаболический путь, который регулируется с повышением во время заболевания (такого как инфекция или рак), такой как синтез ДНК, белка и мембранный синтез и захват углеводов. Подходящие зонды содержат меченные диеном или диенофилом аминокислоты, сахара, нуклеиновые кислоты и холин, аналогичные метаболическим индикаторам, используемым в настоящее время в данной области, [11C]-метионину, [18F]-фтордезоксиглюкозе (ФДГ), дезокси-[18F]-фтортимидину (FLT) и [11C]-холину. Клетки с высоким метаболизмом или пролиферацией имеют более высокий захват этих билдинг-блоков. В данном способе, например, производные тетразина или E-циклооктена попадают в эти или другие пути и накапливаются в и/или на клетках. После достаточного сосредоточения и выведения свободного зонда меченные для обнаружения или несущие лекарственное средство (проникающие в клетку) тетразиновый зонд или E-циклооктеновй зонд (или зонды, несущие другие диены/диенофилы в соответствии с изобретением) отправляются для связывания накопленного E-циклооктена, соответственно метаболита тетразина. Преимущество по сравнению с типом визуализации с обычной ФДГ (фтор-18 фтордезоксиглюкозой) состоит в том, что доступно достаточное время для обеспечения высокого сосредоточения направляющего фрагмента перед включением радиоактивности, таким образом, увеличивается отношение мишени к не мишени. Альтернативно, метаболический путь и/или метаболит, который является специфичными для заболевания, могут подвергаться направленному действию.
Изобретение также относится к приданию предварительной направленности действия на внутриклеточные мишени. Вследствие их небольшого размера органические ПЭТ-метки (18F, 11C) идеально подходят для регистрации внутриклеточных событий, так как они не оказывают сильного воздействия на свойства направляющего устройства в целом и его мембранный транспорт в частности (в противоположность крупным и полярным конструкциям конъюгатов радиоактивный металл-хелат). Несмотря на то что замещенный тетразиновый фрагмент и E-циклооктен, применяемые в изобретении, необязательно являются небольшими, они являются относительно неполярными и могут применяться для внутриклеточной визуализации белков, мРНК, сигнальных путей и т.д. Вторичный (ПЭТ-меченный) замещенный тетразиновый фрагмент или E-циклооктеновый зонд (т.е. эффекторный зонд) способен к пассивной диффузии в клетки и из них, до тех пор пока он не находит своего партнера для связывания. Эти свойства также обеспечивают применение ретрореакции Дильса-Альдера для предварительного придания направленности действия в мозге, так как оба компонента не имеют препятствий для пересечения гематоэнцефалического барьера.
Изобретение также имеет отношение к предварительно направленной амплификации сигнала и/или инсталляции поливалентности. По меньшей мере одно первичное направляющее устройство соединяется с дендримером или полимером, содержащим множество тетразиновых фрагментов. После связывания с рецептором посредством инъекции вводится (один или более) циклооктен или циклооктин, соединенные с одним или более контрастными фрагментами для ядерной визуализации (например, хелатом с радиоактивным металлом, радиоактивным галогеном и т.д.) или МРТ (например, хелаты Gd). Последующая ретрореакция Дильса-Альдера приводит к высокой концентрации контрастного вещества для МРТ в ткани-мишени. Кроме того, поливалентность на участке мишени будет увеличивать кинетику реакции с конъюгатом циклооктенового или циклооктинового эффектора, обеспечивая эффективное накопление мишенью, например контрастных веществ для МРТ. Естественно, циклооктен или циклооктин могут также применяться в конъюгате направляющего устройства и тетразине (или другом диене изобретения), соединенном с репортером.
Путь и наборы для конъюгации
Изобретение дополнительно относится к применению ретрореакции Дильса-Альдера в качестве пути для конъюгации средств визуализации и лекарственных средств с направляющими конструкциями, такими как пептиды. Эффектор может содержать органические меченные для ПЭТ простетические группы, комплексы металлов для ПЭТ/ОФЭКТ/МРТ и микропузырьки для ультразвуковой визуализации, но также α и β- излучатели для лучевой терапии и, в целом, цитотоксическое противораковое средство. Средства для визуализации/терапии может представлять собой функционализированный подвешенным тетразином или другим подходящим диеном фрагмент и направляющую группу с производным циклооктена или циклооктина, или наоборот.
Настоящий путь является особенно преимущественным для средств ядерной визуализации и лучевой терапии: с учетом распада радионуклида является благоприятным проводить наиболее затратную по времени стадию (действительное направляющее действие в организме субъекта) как стадию предварительного придания направленности действия. Выбор в соответствии с изобретением описанной выше очень быстрой ретрохимии Дильса-Альдера для вторичного направляющего действия позволяет применять широкий ряд радионуклидов, включая более короткоживущие, чем с использованием существующих способов. Эффекторные зонды, функционализированные циклооктеном или циклооктином, и подходящий диен, например несущие тетразин предварительно направляющие зонды, могут сочетаться при крайне низких концентрациях in vivo без необходимости в продолжительной циркуляции в крови эффекторного фрагмента (такого как радионуклид). Следует понимать, что это в равной степени относится к несущим циклооктен/циклооктин предварительно направляющим зондам, соединенным с диеном, особенно тетразином, функционализированным эффекторным зондам. Кроме того, реакционноспособные группы преимущественно являются устойчивыми, и, таким образом, представляют более длительную реакционную способность, без слишком легкой склонности к боковым реакциям.
Следует понимать, что изложенное выше предоставляет преимущества, такие как минимизация дозы радиации для пациента. Также это ведет к обеспечению применения средств для ПЭТ, т.е. Позитронной Эмиссионной Томографии, вместо средств для ОФЭКТ, т.е. Однофотонной Эмиссионной Компьютерной Томографии.
Настоящее изобретение является особенно подходящим для применения в мультимодальной визуализации, необязательно с использованием различных визуализационных средств для визуализации той же мишени. Альтернативно, зонд для визуализации содержит по меньшей мере 2 различные метки для обеспечения мультимодальной визуализации.
Применение [4+2] ретрохимии Дильса-Альдера в молекулярной визуализации открывает путь для предварительного придания направленности действия всем типам и размерам направляющих конструкций. Это позволяет внутриклеточной и метаболической визуализации выигрывать от высокого накопления в мишени и низкого фона, достижимых в результате наращивания предварительного придания направленности действия. Аналогичным образом, предварительно направленные схемы амплификации сигнала, например политетразиновые и/или полиалкеновые дендримеры или липосомы, становятся доступными для более мелких и более разнообразных направляющих устройств.
Поскольку партнеры реакции являются абиотическими и биоортогональными, предварительное придание направленности действия с использованием [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера, как описано выше, не затрудняется посредством эндогенной конкуренции и метаболизма/разложения и позволяет образовать устойчивую ковалентную связь. Выбор целевого метаболического пути и соответствующего тетразин-метаболитного производного посредством его высокого притока в, например, опухолевые клетки по сравнению с нормальными клетками позволяет осуществить инсталляцию высокой плотности искусственных тетразиновых рецепторов или других химических инструментов в клетки или на поверхности клеток-мишеней, обходя использование эндогенных рецепторов клеточной поверхности, которые могут иногда находиться на низких уровнях.
Дополнительные конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к наборам, содержащим метаболический предшественник и зонд для визуализации, более конкретно зонд для визуализации, содержащий обнаруживаемую метку, которая представляет собой контрастное вещество, используемое в традиционных визуализационных системах. Такая обнаруживаемая метка может представлять собой, но не ограничена ими, метку, выбранную из группы, состоящей из МРТ-визуализируемых конструкций, спиновых меток, оптических меток, средств, чувствительных к ультразвуку, средств, чувствительных к рентгеновскому излучению, радионуклидов и красителей FRET-типа. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения применяют репортерные зонды. Такой репортерный зонд может представлять собой субстрат фермента, более конкретно фермента, который не является эндогенным для клетки, но был введен путем генной терапии или инфекции с чужеродным агентом. Неэндогенный как относящийся к гену в клетке или ткани применяют здесь для указания на то, что ген не присутствует естественным образом и/или не экспрессируется в такой клетке или ткани. Альтернативно, такой репортерный зонд представляет собой молекулу, которую вводят в клетку посредством рецептора или насоса, которая может быть эндогенной или вводиться в клетку посредством генной терапии или инфекции чужеродным агентом. Альтернативно, репортерный зонд представляет собой молекулу, которая взаимодействует с некоторыми (изменяющимися) состояниями внутри окружения клетки или ткани.
Изобретение также включает средства для применения в наборах, описанных выше. Одно такое средство представляет собой предварительно направляющее средство, содержащее первичный направляющий фрагмент и биоортогональную реакционноспособную группу, где биоортогональная реакционноспособная группа является партнером в реакции для [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера. Конкретные партнеры в реакции описаны в настоящем документе выше, т.е. в целом представляют собой либо электронодефицитный тетразин или другой подходящий диен, как обсуждается выше, или циклооктен (предпочтительно, E-циклооктен) или циклооктин. Изобретение также относится к применению таких средств в направленной медицинской визуализации или направленной терапии, и к этим средствам для применения в таком способе. Конкретно, изобретение относится к применению таких средств в способе предварительного придания направленности действия и к таким средствам для применения в таком способе. Еще одно такое средство представляет собой зонд для визуализации, содержащий обнаруживаемую метку и биоортогональную реакционноспособную группу, где биоортогональная реакционноспособная группа является партнером в реакции для [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера.
Изобретение также относится к зонду для визуализации, содержащему обнаруживаемую метку и биоортогональную реакционноспособную группу, где биоортогональная реакционноспособная группа является партнером в реакции для [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера. Изобретение дополнительно относится к терапевтическому зонду, содержащему фармацевтически активное соединение и биоортогональную реакционноспособную группу, где биоортогональная реакционноспособная группа является партнером в реакции для [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера.
Частью изобретения является также способ предварительного придания направленности действия, включающий введение предварительно направляющего средства, как описано выше, субъекту и предоставление средству возможности циркулировать в системе субъекта в течение периода времени, эффективного для достижения связывания первичного направляющего фрагмента с первичной мишенью, с последующим выведением несвязанного средства из организма. Как правило, период времени для этого составляет от 12 до 96 часов, особенно приблизительно 48 часов.
Дополнительно изобретение предоставляет способ визуализации, включающий осуществление способа предварительного придания направленности действия, как описано выше, с последующим введением зонда для визуализации также в соответствии с изобретением, где биоортогональные реакционноспособные группы в предварительно направляющем средстве и в зонде для визуализации вместе образуют реакционноспособные партнеры для [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера. Аналогично изобретение предоставляет способ направленного медицинского лечения субъекта, включающий осуществление способа предварительного придания направленности действия, как описано выше, с последующим введением терапевтического зонда также в соответствии с изобретением, где биоортогональные реакционноспособные группы в предварительно направляющем средстве и в зонде для визуализации вместе образуют реакционноспособные партнеры для [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера.
Изобретение также относится к упомянутым выше предварительно направляющим средствам для применения в визуализации или терапевтическом способе, как описано выше.
В общем, на основе химии ретро-Дильса-Альдера, биоортогональная предварительно направленная молекулярная визуализация и терапия служат для создания огромных преимуществ для пациентов. С одной стороны, они служат для сбора данных при получении превосходных по качеству изображений тканей-мишеней, таких как рак и сердечно-сосудистые повреждения. С другой стороны, присущие характерные эффекты, являющиеся результатом введения радиоактивных соединений и, в целом, потенциально токсических лекарственных средств, могут быть значительно снижены, при увеличении эффективной дозы, которая достигает заболевшей ткани. Кроме того, значительно будет увеличиваться количество прослеживаемых молекулярных событий, которые лежат в основе заболевания. В частности, эта технология может обеспечить допуск для направленного действия на ткани, расположенные далеко от кровеносных сосудов, и облегчит визуализацию насыщенного информацией внутриклеточного окружения.
Изобретение будет проиллюстрировано со ссылкой на следующие неограничивающие Примеры и сопроводительные неограничивающие Фигуры.
Пример 1
В качестве примера связывания фрагмента, полученного из тетразина, с антителом, как приведено на Фиг. 3a, получают молекулу 1 (см. Фиг. 4). Пример соответствующего зонда 2, полученного из E-циклооктена, представлен на Фиг. 5. Обе молекулы содержат цепи ПЭГ. Молекула 1 содержит N-гидроксисукцимидиловый фрагмент, который применяют для сочетания молекулы с аминогруппами, присутствующими в антителе. Фрагмент, полученный из DOTA в 2, может применяться для переноса иона редкоземельного металла, такого как Gd для МР визуализации или Lu-177 для ядерной визуализации и терапии (ОФЭКТ).
Синтез 1 приведен на Фиг. 4. Исходная производная от тетразина молекула 5 получена в соответствии с Blackman et al. (Blackman, M.L.; Royzen, M.; Fox, J.M., Journal of The American Chemical Society, 2008, 130 (41), 13518-19). Ее превращают в кислоту 6 посредством реакции с янтарным ангидридом с последующим образованием его N-гидроксисукцимидилового сложного эфира 7. Этот N-гидроксисукцимидиловый сложный эфир применяют для образования кислоты 9 посредством реакции с промышленно доступным (IRIS biochem) ПЭГ-производным 8, который, в свою очередь, превращается в его N-гидроксисукцимидиловый сложный эфир 1.
Синтез 2 приведен на Фиг. 5. (E)-циклоокт-4-енол (10) получают в соответствии с Yap et al. (Yap, GPA; Royzen, M.; Fox, J.M., Journal of The American Chemical Society, 2008, 130 (12), 3760-61). С помощью промышленно доступного (Aldrich) производного изоцианата 11 его превращают в сложный эфир 12 с последующим омылением до кислоты 13. N-гидроксисукцимидиловый сложный эфир 14, образованный из 13, получают для взаимодействия с DOTA и ПЭГ-производным амином 18 с образованием конечного продукта 2. Производное DOTA 18 получают после снятия защитных групп с 17, который, в свою очередь, получают из производного DOTA 15 и ПЭГ-производного 16, причем оба являются доступными на рынке (от Macrocyclics и IRIS biotech соответственно).
Пример 2
По сравнению с Примером 1, этот пример иллюстрирует обратную пару молекул, а именно 1) производное E-циклооктена 3, предназначенное для образования предварительно направляющего фрагмента после конъюгации с антителом; и 2) производный от тетразин/DOTA зонд 4, который может служить в качестве эффекторного зонда, как приведено на Фиг. 3b, показаны на Фиг. 6 и 7 соответственно.
Производное E-циклооктена 3 образуется посредством реакции доступного на рынке (IRIS biochem) ПЭГ-производного 8 с N-гидроксисукцимидиловым сложным эфиром 14 (см. Фиг. 5) с образованием кислоты 19, с последующим образованием N-гидроксисукцимидилового производного из этой кислоты.
Синтез производного от тетразин/DOTA зонда 4 приведен на Фиг. 7. Этот зонд получают посредством реакции DOTA и ПЭГ-производного амина 18 (см. Фиг. 5) с N-гидроксисукцимидиловым сложным эфиром 7 (см. Фиг. 4).
Пример 3: Визуализация in vivo
Все реагенты и растворители были получены из коммерческих источников (Sigma-Aldrich, Acros, ABCR, Invitrogen и Merck для реагентов, Biosolve, Merck и Cambridge Isotope Laboratories для нормальных и дейтерированных растворителей) и применялись без дополнительной очистки, если не утверждается иначе. 1-Амино-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-додекаоксанонатриаконтан-39-овая кислота (S11) и трет-бутил-(35-амино-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-ундекаоксапентатриаконтил)карбамат (S3) были получены от Polypure (Norway) и Iris Biotech (Germany) соответственно. 2,2',2"-(10-(2-((2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси)-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триил)триуксусная кислота (S6) в виде соли с HPF6 и приблизительно 3 экв. трифторуксусной кислоты (ТФУ) получали от Macrocyclics (США). Растворы ритуксимаба (MabThera®) были приобретены у Roche (Switzerland). Растворы хлорида [111In]индия и [125I]йодида натрия были приобретены у PerkinElmer (США). Воду перегоняли и деионизировали (18 мΩсм-1) посредством системы фильтрации воды milli-Q (Millipore, США). Буферы для мечения обрабатывали смолой Chelex-100 (BioRad Laboratories, США) в течение ночи, затем фильтровали через 0,22 мкм и хранили при 4°C. Пробирки для йодирования йодогеном, наборы для анализа с бисинхониновой кислотой (BCA) и окрашивающие растворы белка гелькод-синего были приобретены у Pierce Protein Research (Thermo Fisher Scientific, США). Таблетки для получения забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) pH 7,4 были приобретены у Calbiochem (Merck, Germany). Блоки центробежной фильтрации Amicon Ultra-4 и Ultra-15 (50 кДа, предел ММ) были приобретены у Millipore. Мышиную сыворотку получали от Innovative Research (США).
Спектры ЯМР регистрировали в дейтерированном хлороформе (CDCl3) или гексадейтерированном диметилсульфоксиде (ДМСО-D6), применяя спектрометр Bruker DPX300 или спектрометр Bruker Avance600 (Bruker BioSpin, Netherlands). Множественные сигналы 13C-NMR (q=четвертичный, t=третичный, s=вторичный и p=первичный) различали, используя импульсный режим DEPT. Масс-спектры высокого разрешения ЭРИ (МСВР) регистрировали на масс-спектрометре Agilent ESI-TOF (Agilent Technologies, США), в режиме измерения положительных ионов. Препаративную колоночную хроматографию осуществляли на устройстве Combiflash Companion (Teledyne Isco, США), с использованием колонок с оксидом кремния (SiliCycle, Canada). Препаративную ВЭЖХ осуществляли, используя устройство Agilent 1200, оборудованное колонкой C18 Zorbax (21,2×150 мм, частицы 5 мкм), применяя градиент воды и ацетонитрила (ACN), содержащие 0,1% ТФУ. Аналитическую радио-ВЭЖХ осуществляли на системе Agilent 1100, оборудованной детектором радиоактивности Gabi (Raytest, Germany). Образцы загружали на колонку Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6×150 мм, 5 мкм частицы), которую элюировали при 1 мл/мин с линейным градиентом ACN в воде, содержащей 0,1% ТФУ (2 мин при 10% ACN с последующим увеличением до 45% ACN за 11 мин). Длина волны УФ была предварительно установлена при 254 нм. Эксклюзионную по размерам (SEC) ВЭЖХ осуществляли на системе Agilent 1200, оборудованной детектором радиоактивности Gabi. Образцы загружали на колонку BioSep-SEC-S 2000 (300×7,8 мм, частицы 5 мкм, Phenomenex, США) и элюировали 20 мМ фосфатом, 150 мМ NaCl, pH 6,8, при 1 мл/мин. Длина волны УФ была предварительно установлена при 260 и 280 нм.
Выходы 111In-мечения определяли посредством радио-ТСХ, используя полоски ITLC-SG (Pall, США), элюируемые 200 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой в 0,9% водн. NaCl, и визуализируемые на аппарате для визуализации с люминофором (FLA-7000, Fujifilm, Japan). При этих условиях свободный 111In мигрирует с Rf=0,9, в то время как 111In-тетразин остается на месте нанесения. Выходы 125I-мечения также определяли с помощью радио-ТСХ, используя полоски ITLC-SG, элюируемые 20 мМ раствором лимонной кислоты (pH 5,2) и визуализируемые на аппарате для визуализации с люминофором. При этих условиях свободный 125I мигрирует с Rf=0,9, в то время как 125I-mAb остаются на месте нанесения.
Анализ методом изоэлектрического фокусирования (IEF) и SDS-PAGE осуществляли на системе Phastgel, используя гели IEF-3-9 и 7,5% гомогенные гели PAGE (GE Healthcare Life Sciences, США) соответственно. Калибровочный раствор для IEF (широкий PI, pH 3-10) был получен от GE Healthcare, раствор со стандартами ММ белков (двойной окрашенный стандарт Precision Plus) был получен от BioRad. При электрофорезе гели окрашивали в течение 2 ч гелькод-синим, удаляли краситель в течение ночи в воде и затем подвергали цифровой обработке с помощью общепринятого плоскостного сканера планшетного типа.
Концентрацию растворов CC49 и ритуксимаба определяли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (поглощение при 280 нм; Thermo Fisher Scientific, Netherlands) или с помощью BCA-теста.
Синтез DOTA-тетразина (S7)
Общая схема синтеза 2,2',2"-(10-(2,40,44-триоксо-44-((6-(6-(пиридин-2-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)пиридин-3-ил)амино)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-ундекаокса-3,39-диазатетратетраконтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триил)триуксусной кислоты (S7) показана на Фиг. 8.
5-Оксо-5-(6-(6-(пиридин-2-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)пиридин-3-иламино)пентановая кислота (S2)
6-(6-(Пиридин-2-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)пиридин-3-амин (S1) был синтезирован в соответствии с литературной методикой (M. L. Blackman, M. Royzen, J. M. Fox, J. Am. Chem. Soc. 130, 13518 (2008).). Смесь S1 (103 мг, 0,410 ммоль) и глутарового ангидрида (234 мг, 2,05 ммоль) в тетрагидрофуране (12 мл) нагревали при 70°C в течение 18 ч в герметично закрытой колбе.
После охлаждения осадок промывали дихлорметаном (ДХМ) (2×12 мл) и этилацетатом (12 мл) с получением S2 в виде пурпурового твердого вещества (62 мг, 42%). 1H ЯМР (ДМСО-D6, 300 МГц, δ): 12,13 (c, 1H), 10,58 (c, 1H), 9,05 (д, J=2,3 Гц, 1H), 8,94 (д, J=4,2 Гц, 1H), 8,62 (д, J=8,8 Гц, 1H), 8,60 (д, J=8,8 Гц, 1H), 8,43 (дд, J1=2,3 Гц, J2=8,8 Гц, 1H), 8,16 (тд, J1=7,8 Гц, J2=1,7 Гц, 1H), 7,73 (ддд, J1=1,1 Гц, J2=4,4 Гц, J3=7,4 Гц), 2,50 (т, J=7,3 Гц, 2H), 2,33 (т, J=7,3 Гц, 2H), 1,86 (кв, J=7,3 Гц, 2H). 13C ЯМР (ДМСО-D6, 75 МГц, δ): 174,1 (кв), 172,0 (кв), 163,0 (кв), 162,7 (кв), 150,6 (т), 150,2 (кв), 143,8 (кв), 141,3 (т), 138,4 (кв), 137,7 (т), 126,5 (т), 126,1 (т), 124,8 (т), 124,1 (т), 35,4 (с), 32,9 (с), 20,2 (с). МСВР (ЭРИ, m/z): рассчитано для C17H16N7O3 + ([M+H]+): 366,1314; обнаружено: 366,1313.
Трет-бутил (37,41-диоксо-41-((6-(6-(пиридин-2-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)пиридин-3-ил)амино)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-ундекаокса-36-азагентетраконтил)карбамат (S4)
N,N-Диизопропилэтиламин (95 мкл, 0,41 ммоль) добавляли к перемешиваемой смеси S2 (15 мг, 0,041 ммоль), S3 (29 мг, 0,045 ммоль) и гексафторфосфата (бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфония (19 мг, 0,043 ммоль) в диметилформамиде (ДМФА) (1 мл). После перемешивания в течение 16 ч при комнатной температуре (КТ) смесь упаривали и продукт очищали посредством колоночной хроматографии на оксиде кремния, применяя градиент метанола в ДХМ (0-10%) с получением S4 в виде твердого вещества пурпурового цвета (30 мг, 74%). 1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц, δ): 9,07 (д, J=2,2 Гц, 1H), 8,97 (д, J=4,6 Гц, 1H), 8,73 (д, J=8,8 Гц, 1H), 8,72 (д, J=8,8 Гц, 1H), 8,63 (дд, J1=2,3 Гц, J2=8,8 Гц, 1H), 8,03 (тд, J1=7,8 Гц, J2=1,7 Гц, 1H), 7,59 (ддд, J1=1,1 Гц, J2=4,6 Гц, J3=7,4 Гц), 7,01 (с, 1H), 5,14 (с, 1H), 3,9-3,2 (широкий с, 48H), 2,60 (т, J=7,1 Гц, 2H), 2,37 (т, J=7,1 Гц, 2H), 2,09 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,43 (с, 9H). 13C ЯМР (CDCl3, 75 МГц, δ): 173,8 (кв), 173,1 (кв), 163,8 (кв), 163,7 (кв), 151,3 (т), 150,5 (кв), 144,0 (кв), 142,7 (т), 139,2 (кв), 137,9 (т), 127,0 (т), 126,9 (т), 125,5 (т), 124,7 (т), 79,5 (кв), 70,5 (с), 70,1 (с), 40,7 (с), 39,7 (с), 36,5 (с), 35,5 (с), 28,8 (п), 21,9 (с). МСВР (ЭРИ, m/z): рассчитано для C46H74N9O15 + ([M+H]+): 992,5304; обнаружено: 992,5301.
2,2',2"-(10-(2,40,44-Триоксо-44-((6-(6-(пиридин-2-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)пиридин-3-ил)амино)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-ундекаокса-3,39-диазатетратетраконтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триил)триуксусная кислота (S7)
Продукт S4 (30 мг, 0,030 ммоль) перемешивали в течение 30 мин при КТ в смесь ТФУ (1,5 мл) и ДХМ (5 мл). После упаривания остаток (в основном, S5) растворяли в ДМФА (5 мл), добавляли S6 (27 мг, 0,028 ммоль) и триэтиламин (40 мкл, 0,27 ммоль) и смесь перемешивали в течение 2 ч при КТ. После упаривания неочищенное вещество растворяли в ДМСО и очищали препаративной ВЭЖХ. После лиофилизации S7 (24 мг, 69%) получали в виде пурпуровой соли ТФУ, что подтверждалось анализом 13C-ЯМР (δ=158,7 м.д., кв, J=32,3 Гц и δ=117,6 м.д., кв, J=298,2 Гц). 1H ЯМР (ДМСО-D6, 600 МГц, δ): 9,22 (д, J=2,4 Гц, 1H), 9,10 (дд, J1=4,7 Гц, J2=1,1 Гц, 1H), 8,78 (д, J=8,7 Гц, 1H), 8,75 (д, J=7,8 Гц, 1H), 8,59 (дд, J1=2,4 Гц, J2=8,7 Гц, 1H), 8,32 (тд, J1=7,8 Гц, J2=1,7 Гц, 1H), 8,08 (ддд, J1=1,1 Гц, J2 =4,7 Гц, J3=7,8 Гц), 3,9-3,1 (м, 80H), 2,60 (т, J=7,3 Гц, 2H), 2,34 (т, J=7,3 Гц, 2H), 2,02 (кв, J=7,3 Гц, 2H). 13C ЯМР (ДМСО-D6, 150 МГц, δ): 172,8 (кв), 172,5 (кв), 163,8 (кв), 163,5 (кв), 151,3 (т), 150,9 (кв), 144,5 (кв), 142,0 (т), 139,3 (кв), 138,5 (т), 127,3 (т), 126,9 (т), 125,6 (т), 124,9 (т), 70,5 (с), 70,3 (с), 69,9 (с), 69,5 (с), 39,2 (с), 36,4 (с), 35,2 (с), 21,7 (с). МСВР (ЭРИ, m/z): рассчитано для C57H92N13O20 + ([M+H]+): 1278,6582; Обнаружено: 1278,6557.
Синтез TCO-NHS, S13
Синтез (E)-2,5-диоксопирролидин-1-ил 1-(4-((циклоокт-4-ен-1-илокси)метил)фенил)-1-оксо-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-додекаокса-2-азагентетраконтан-41-оата (S13) показан на Фиг. 9.
(E)-2,5-Диоксопирролидин-1-ил 4-((циклоокт-4-енилокси)метил)бензоат (S10)
(E)-Циклоокт-4-енол (S8, основной изомер, содержащий приблизительно 13% Z-изомера) был синтезирован в соответствии с литературной методикой (M. Royzen, G.P. A. Yap, J.M. Fox, J. Am. Chem. Soc. 130, 3760 (2008)). 60% дисперсию гидрида натрия (1,8 г, 45 ммоль) добавляли к охлаждаемому на бане со льдом раствору S8 (1,70 г, 13,5 ммоль) в 60 мл ДМФА. После перемешивания в течение 4 ч при КТ по частям добавляли 4-бромметилбензойную кислоту (3,85 г, 17,9 ммоль) и суспензию перемешивали в течение ночи при КТ. Смесь выливали в воду (100 мл), трет-бутилметиловый эфир (100 мл) добавляли с последующим добавлением 37% хлористоводородной кислоты (5 мл). После разделения водный слой экстрагировали трет-бутилметиловым эфиром (2×100 мл). Объединенные органические слои промывали водой (25 мл), сушили над MgSO4 и упаривали. Остаток пропускали через тонкий слой оксида кремния в смеси 4:1 гексан/этилацетат. Остаток, полученный после упаривания, растворяли в гептане (50 мл) при 70°C и затем охлаждали, получая S9. Продукт растворяли в ДХМ (40 мл), добавляли N-гидроксисукцинимид (0,57 г, 4,9 ммоль), смесь охлаждали в бане со льдом с последующим добавлением N,N'-дициклогексилкарбодиимида (1,03 г, 4,99 ммоль). Через 30 мин баню удаляли и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 18 ч. После фильтрации и упаривания остаток очищали посредством колоночной хроматографии на оксиде кремния, применяя градиент этилацетата в гептане (0-15%). Далее остаток растворяли в трет-бутилметиловом эфире (20 мл) и выливали в гептан (50 мл), получая S10 (1,42 г, 29%) в виде белого твердого вещества. 1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц, δ): 8,10 (д, J=8,5 Гц, 2H), 7,45 (д, J=8,5 Гц, 2H), 5,60 (м, 1H), 5,34 (м, 1H), 4,54 (д, J=13,4 Гц, 1H), 4,47 (д, J=13,4 Гц, 1H), 3,09 (м, 1H), 2,91 (с, 4H), 2,43-1,40 (м, 10H). 13C ЯМР (CDCl3, 75 МГц, δ): 169,0 (кв), 161,5 (кв), 146,7 (кв), 135,1 (т), 132,1 (т), 130,4 (т), 127,0 (т), 123,7 (кв), 85,3 (т), 68,0 (с), 40,5 (с), 37,7 (с), 34,2 (с), 32,7 (с), 31,4 (с), 25,4 (с). МСВР (ЭРИ, m/z): рассчитано для C20H23NO5Na+ ([M+Na]+): 380,1474; обнаружено: 380,1472.
(E)-2,5-Диоксопирролидин-1-ил-1-(4-((циклоокт-4-ен-1-илокси)метил)фенил)-1-оксо-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-додекаокса-2-азагентетраконтан-41-оат (S13)
Раствор S10 (100 мг, 0,280 ммоль) в ДХМ (2 мл) добавляли по каплям к раствору S11 (175 мг, 0,283 ммоль) и триэтиламина (290 мкл, 2,08 ммоль) в ДХМ (2 мл), перемешиваемому в бане со льдом. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Неочищенное промежуточное соединение S12, полученное после упаривания, растворяли в ДХМ (5 мл) и охлаждали в бане со льдом. Добавляли бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (170 мг, 0,664 ммоль) и пиридин (28 мкл, 0,35 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Смесь отфильтровывали и упаривали и продукт очищали посредством колоночной хроматографии на оксиде кремния, применяя градиент метанола в ДХМ (5-10%), получая S13 в виде вязкого масла (119 мг, 39%). 1H ЯМР (CDCl3, 600 МГц, δ): 7,79 (д, J=8,2 Гц, 2H), 7,36 (д, J=8,2 Гц, 2H), 7,00 (с, 1H), 5,59 (м, 1H), 5,33 (м, 1H), 4,49 (д, J=12,5 Гц, 1H), 4,42 (д, J=12,5 Гц, 1H), 3,85 (т, J=6,5 Гц, 2H), 3,8-3,5 (м, 48H), 3,09 (м, 1H), 2,90 (т, J=6,5 Гц, 2H), 2,85 (с, 4H), 2,43-1,40 (м, 10H). 13C ЯМР (CDCl3, 150 МГц, δ): 167,0 (кв), 165,4 (кв), 164,8 (кв), 140,8 (кв), 133,5 (т), 131,7 (кв), 130,4 (т), 125,3 (т), 83,4 (т), 68,7 (с), 68,4 (с), 68,0 (с), 67,6 (с), 68,4 (с), 63,9 (с), 38,9 (с), 37,9 (с), 36,1 (с), 32,6 (с), 31,1 (с), 30,3 (с), 29,8 (с), 23,7 (с). МСВР (ЭРИ m/z): рассчитано для C47H76N2O18Na+ ([M+Na]+): 957,5171; обнаружено: 957,5174.
Получение антител
CC49 получали из клеточной линии гибридомы CC49, полученной из Американской Коллекции Типовых Культур (ATCC, США). Клетки гибридомы выращивали в биореакторе CELLine CL 1000 (Integra Biosciences AG, Switzerland) в не содержащей сыворотки среде для гибридом (H-SFM, Gibco, США), дополненной пенициллином (10 Ед/мл) и стрептомицином (10 мкг/мл). Каждые две недели клеточный супернатант собирали и CC49 очищали посредством аффинной хроматографии с белком G с использованием набора MabTrap (GE Healthcare Biosciences, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Очищенные CC49 промывали PBS, используя центробежный агрегат Amicon Ultra-15. Эта методика позволила получить раствор CC49, содержащий единичные образцы с приблизительно 150 кДа, что было подтверждено с помощью SDS-PAGE и SEC-ВЭЖХ анализа.
Модификация антител
Типовым образом 2 мг CC49 (5 мг/мл раствор в PBS) модифицировали 10 молярными эквивалентами TCO-NHS (S13, 127,6 мкг в 12,8 мкл ДМСО) в общем объеме, равном 500 мкл PBS. pH доводили до 9 с помощью буфера с 2M карбонатом натрия. Реакции осуществляли при встряхивании в течение 30 мин при КТ в темноте. Последовательно TCO-модифицированные mAb тщательно промывали PBS, используя центробежное устройство Amicon Ultra-15. Эта методика позволяла получить в среднем 7,4 TCO групп на антитело, как определяли по титрованию с тетразином (см. ниже). Увеличение ММ в результате конъюгации с TCO не обнаруживали на SDS-PAGE. Как ожидалось, модификация mAb приводила в результате к снижению изоэлектрической точки (от 6,5-6,8 до приблизительно 5,8), как наблюдали с помощью IEF-анализа. Такую же методику применяли для получения TCO-модифицированного ритуксимаба (Rtx-TCO) для контроля в экспериментах in vivo со сходными результатами.
Мечение антител радиоактивными изотопами
Нативные или TCO-модифицированные CC49 (200 мкг) в PBS (500 мкл) переносили в пробирку для йодирования, которую предварительно ополаскивали 1 мл PBS. Добавляли [125I]йодид натрия (10-15 мБк), раствор инкубировали в течение 5 мин при КТ при осторожном встряхивании, после которого его переносили в блок Amicon Ultra-4. Пробирку для йодирования споласкивали дважды 500 мкл PBS и промывки объединяли со смесью для мечения. 125I-меченные mAb тщательно промывали PBS и последовательно извлекали из Amicon. С помощью этой методики получали выход радиоактивного йодирования, равный 88,3±9,3 (n=5) для нативных CC49 и 30,4±4,3% (n=6) для TCO-модифицированных CC49. После очистки на Amicon радиохимическая чистота обоих меченных радиоактивным изотопом mAb составляла свыше 98%, что подтверждалось радио-ТСХ и анализом SDS-PAGE. Такую же методику применяли для мечения радиоактивным йодом Rtx-TCO для контроля в экспериментах in vivo со сходными результатами. Для экспериментов на животных удельную активность (УА, SA) очищенных 125I-меченных mAb регулировали до 2 кБк/мкг добавлением соответствующего количества соответствующих немеченых mAb.
Мечение тетразина радиоактивными изотопами
DOTA-модифицированный тетразин (зонд S7) растворяли (1 мг/мл) в 0,2M ацетате аммония pH 7,0 и хранили при -80°C перед применением. Одну аликвоту S7 объединяли с подходящим количеством хлорида [111In]индия и инкубировали в течение 10 мин при 37°C в условиях плавного встряхивания. Затем добавляли 5 мкл 10 мМ диэтилентриаминпентауксусной кислоты и раствор инкубировали в течение дополнительных 5 мин. Обычно при использовании этого способа получали количественный выход мечения и радиохимическую чистоту свыше 98%, что подтверждалось радио-ВЭЖХ и радио-ТСХ. Для экспериментов на животных раствор 111In-тетразина разбавляли стерильным физиологическим раствором. УА раствора 111In-тетразина, применяемого для экспериментов in vitro и для исследований биораспределения, составляла обычно 50-100 кБк/мкг S7; УА для визуализационных экспериментов составляла 1-2 мБк/мкг S7.
Реакционная способность in vitro
Реакционную способность 111In-тетразина по отношению к CC49-TCO тестировали в PBS (n=3), 50% мышиной сыворотке (n=3) и крысиной крови с гепарином. Типовым образом 50 мкг TCO-модифицированных mAb инкубировали с 0,43, 4,30 и 6,40 мкг 111In-меченого S7 (1, 10 и 15 молярных экв. по отношению к mAb) при 37°C в общем объеме, равном 100 мкл. Смеси немодифицированных CC49 и 15 экв 111In-меченого S7 применяли для оценки неспецифического связывания. Через 10 мин аликвоту каждой смеси анализировали посредством SDS-PAGE и люминесцентного визуализационного устройства. Авторы наблюдали быструю реакцию между обоими компонентами in vitro в полуэквимолярных условиях и при низкой концентрации (3,3 мкМ) в пределах 10 мин в PBS, сыворотке и крови. Такую же методику применяли для оценки реакционной способности 111In-тетразина по отношению к Rtx-TCO. Реакция между 111In-тетразином и CC49-TCO во всех трех средах завершалась в пределах 10 мин (Таблица 1).
Никакого ощутимого связывания между меченым тетразином и немодифицированными CC49 или другими компонентами сред не было обнаружено, что демонстрировало отсутствие неспецифических взаимодействий.
Исследования in vivo
Все эксперименты на животных осуществляли в соответствии с принципами обращения с лабораторными животными (публикация NIH 85-23, пересмотрено 1985) и Национального закона Нидерландов "Wet op de Dierproeven" (Stb 1985, 336). Клеточную линию рака толстой кишки человека LS174T получали из ATCC и поддерживали в минимальной незаменимой среде Игла (Sigma), дополненной 10% инактивированной сывороткой зародыша телят (Gibco), пенициллином (100 Ед/мл), стрептомицином (100 мкг/мл) и 2 мМ Glutamax. Самок голых мышей Balb/C (20-25 г масса тела, Charles River Laboratories, Netherlands) инокулировали подкожно 5×106 клеток в 100 мкл стерильного PBS. Масса опухоли во время экспериментов по визуализации и биораспределению составляла 0,38±0,28 г. Животных с различными размерами опухоли статистически распределяли по различным экспериментальным группам.
Мышам-опухоленосителям (n=4) вводили посредством внутривенной инъекции 125I-CC49 или 125I-CC49-TCO (100 мкг/100 мкл на мышь, приблизительно 0,2 мБк). В выбранные временные отметки (5 мин, 3 и 6 ч, 1, 2 и 3 дня) образцы крови забирали из большой подкожной вены. Через четыре дня после инъекции мышей подвергали анестезии изофлураном, и кровь забирали посредством пункции сердца. Образцы крови взвешивали и разбавляли до 1 мл с помощью PBS. Радиоактивность образцов измеряли в γ-счетчике (Wizard 1480, PerkinElmer) наряду со стандартами для определения процента от инъицированной дозы на грамм (%ИД/г, %ID/г). Период полураспада меченных радиоактивным изотопом mAb в крови рассчитывали по площади под кривыми (AUC, GraphPad Prism v. 5.01) на Фиг. 10, используя T1/2=Ln2xAUC/C0. В данном исследовании TCO-модифицированные CC49 проявляли более короткие значения периода полураспада в крови (11,0 ч) по сравнению со значениями для немодифицированных mAb (19,8 ч). Авторы относят этот факт на счет изменения изоэлектрической точки, вызванного функционализацией 7,4 остатков Lys в mAb. Для исследования полного потенциала этой системы авторы выбрали относительно короткий 24-часовой интервал между введением mAb и зонда.
Эксперименты по биораспределению
Двойные изотопные эксперименты по биораспределению осуществляли посредством внутривенной инъекции мышам-опухоленосителям (n=3) 125I-меченных mAb (CC49-TCO, CC49 или Rtx-TCO, 100 мкг/100 мкл на мышь, приблизительно 0,2 мБк)и через 24 ч, 111In-тетразина (21 мкг/75 мкл на мышь, приблизительно 0,8 мБк). Результаты представлены визуально на Фиг. 11. Через три часа после введения тетразина животных подвергали анестезии изофлураном и умерщвляли посредством смещения шейных позвонков. Кровь забирали посредством пункции сердца, органы и ткани, представляющие интерес, собирали, блоттировали досуха и взвешивали. Радиоактивность образцов измеряли в γ-счетчике наряду со стандартами для определения %ID/г. Каналы регистрации излучения были установлены при 10-80 кэВ и 100-510 кэВ для 125I и 111In соответственно. Радиоактивность образцов измеряли повторно через 3 недели после эксперимента для проверки значений 125I в случае потенциального перекрестного загрязнения 111In. Во время оценки in vivo йодированные образцы не подвергались значительному дегалогенированию, что очевидно доказывалось низким количеством 125I, измеренному в щитовидных железах и желудках, и показали типичную схему распределения длительно циркулирующих антител. Остаточные 125I-mAb все еще обнаруживали в крови (приблизительно 10%ИД/г) и в органах с высоким содержанием крови, таких как сердце и легкие (которые блоттировали досуха, но не подвергали перфузии физиологическим раствором перед счетом), через 27 ч после инъекции. Все образцы проявляли гепатобилиарное выведение (125I-активность в печени и кишечнике) и некоторую экскрецию почками (более мелкие радиометаболиты). Низкий захват наблюдали в мышцах, костях и мозге. В опухолях как CC49, так и CC49-TCO проявляли высокое накопление при отношении опухоль-к-крови (T/B), равном 3,2±2,2 и 2,8±0,8, и отношении опухоль-к-мышцам (T/M), равном 22,0±10,8 и 34,2±23,8 соответственно. Изменчивость в захвате опухолью наблюдали в обеих группах, которая, наиболее вероятно, была следствием быстрого и нерегулярного роста опухоли (и, следовательно, изменчивости размера опухоли). Однако накопление опухолью обеих CC49-конструкций было значительно более высоким, чем для Rtx-TCO (T/B=0,6±0,0, T/M=4,9±0,8), указывая на антигенспецифичное связывание.
Распределение 111In-тетразина у мышей, предварительно обработанных CC49-TCO или Rtx-TCO, являлось зеркальным отображением распределения 125I. В этих группах высокий захват 111In наблюдали в крови, сердце, легком и печени, в то время как низкую активность обнаруживали в селезенке, мышцах, костях и мозге. Органы, в которых не было обнаружено существенных различий между захватом 125I-CC49-TCO и 125I-RtX-TCO (кровь, сердце, легкие, селезенка, мышцы, кости и мозг), также не показали различий в накоплении 111In-тетразина. 5,2-кратный более высокий захват 111In-тетразина был обнаружен в опухолях, содержащих 18,8±4,7 %ИД/г 125I-CC49-TCO по сравнению с опухолями, содержащими 6,3±1,2 %ИД/г 125I-RtX-TCO. С другой стороны, почти никакого захвата 111In не было обнаружено в большинстве тканей группы, предварительно обработанной немодифицированными 125I-CC49. Важно отметить, что в то время как захват опухолью 125I-CC49 был наивысшим среди трех групп, захват опухолью 111In в той же самой группе был в 16 раз ниже, чем в группе 125I-CC49-TCO. Также удерживание кровью 111In-тетразина было почти необнаруживаемым в этой группе, несмотря на присутствие 8,7±5,9 %ИД/г 125I-CC49. Только почки проявляли относительно высокий захват 111In во всех 3 группах как следствие выведения меченного радиоактивным изотопом тетразина.
Обнаружение того, что тетразин накапливается только в органах и тканях, которые содержат TCO-модифицированные виды, показывает, что химическая реакция между этими двумя объектами происходит in vivo. Авторы определили выход реакции ДА (DA) in vivo посредством расчета абсолютного количества TCO и тетразина, присутствующих в ткани, по %ИД/г 125I и 111In соответственно. В соответствии с высокой реакционной способностью и селективностью между тетразином и mAb-TCO, наблюдаемыми in vitro, 56,7±2,0% и 52,1±3,0% TCO-фрагментов, присутствующих в крови и опухоли, соответственно, взаимодействовали с тетразиновым зондом в группе, предварительно обработанной CC49-TCO. Эти значения выходов являются примечательными, принимая во внимание низкую концентрацию компонентов, включенных в реакцию (0,42±0,20 и 0,93±0,23 нмоль/г в крови и опухоли, соответственно, для TCO и максимальную, равную 2,3 нмоль/г в крови для тетразина, непосредственно после инъекции), сложность окружения реакции и короткое биологическое время полужизни тетразина (11,8 мин).
Эксперименты по визуализации
Мышам-опухоленосителям посредством инъекции вводили 111In-тетразин (21 мкг/75 мкл на мышь, 20-42 МБк) через 24 ч после получения 100 мкг mAb (CC49-TCO, CC49 или Rtx-TCO). Приблизительно через 1 ч мышей подвергали анестезии и позиционировали на подставке для животных, оборудованной носовой конусной маской для анестезии и датчиком для регистрации дыхания. Однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ) осуществляли через 2 ч после инъекции тетразина, применяя четырехдетекторную систему визуализации ОФЭКТ/КТ с мультиколлиматорами, с точечной апертурой для небольших животных (NanoSPECT, Bioscan Inc., США). Сбор данных ОФЭКТ (1 ч в целом) проводили с микроотверстиями диаметром 1,4 мм и при времени сбора данных, равном 120-140 сек на вид (24 проекции). Канал регистрации излучения для 111In был установлен при 245 кэВ ± 15% и 171 кэВ ± 20%. Мышей подвергали эвтаназии со сверхдозой анестезии через 3 ч после инъекции тетразина. Последовательно, после вскрытия проводили сканирования с высоким разрешением с микроотверстиями диаметром 1,0 мм и при времени сбора данных, равном 750 сек на вид (32 проекции). Перед каждой сессией ОФЭКТ осуществляли КТ-сканирование (2 сек на проекцию, 360 проекции) для получения анатомической информации по распределению радиоактивности. После сбора данных данные подвергали итеративной реконструкции с использованием программного обеспечения изготовителя (InVivoScope 1,39, программная вставка 1). Области интереса (ОИ) обводили при тройном повторе вручную для печени, почек и бедренных мышц. Для калибровки сканера для количественной оценки радиоактивности ткани применяли фантом, заполненный известным количеством 111In.
Выраженный захват опухолью 111In-тетразина был продемонстрирован посредством ОФЭКТ/КТ визуализации живых мышей вплоть до 3 ч после инъекции (Фиг. 12A/D; отношение опухоль-к-мускулатуре (T/M)=13,1). Ограниченный захват в нецелевой ткани относили за счет реакции с остаточными циркулирующим CC49-TCO. Важно отметить, что у мышей, обработанных немодифицированными CC49, опухоль нельзя было отличить от окружающей ткани (Фиг. 12B/E, T/M=0,5). Почти никакой радиоактивности не удерживалось в крови и органах, не являющихся мишенью, так как зонд быстро выводился через мочевой путь, что являлось признаком его биоортогональности. Мыши, обработанные TCO-модифицированным ритуксимабом, у которых отсутствует специфичность к TAG72, показали ожидаемое удерживание 111In-тетразина в крови и органах, не являющихся мишенью, и значительно пониженное накопление опухолью (Фиг. 12C/F).
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
КОНЪЮГАТ, СОДЕРЖАЩИЙ ЛИГАНД РЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОТЕНЗИНА, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2743781C2 |
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ С ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ С АЛЬБУМИНОМ | 2018 |
|
RU2753880C1 |
РЕАГЕНТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КАТИОНОВ МЕТАЛЛОВ НА ОСНОВЕ 2,2’-БИПИРИДИНА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2016 |
|
RU2668133C2 |
РЕАГЕНТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КАТИОНОВ МЕТАЛЛОВ НА ОСНОВЕ ИЗОХИНОЛИНА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2016 |
|
RU2668134C2 |
СОЕДИНЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИЕ РАСЩЕПЛЯЕМЫЙ ЛИНКЕР, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2018 |
|
RU2795168C2 |
УЛЬТРАЯРКИЕ ДИМЕРНЫЕ ИЛИ ПОЛИМЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ | 2017 |
|
RU2762328C2 |
ПРОИЗВОДНЫЕ ИЛИДА СУЛЬФОКСОНИЯ В КАЧЕСТВЕ ЗОНДОВ ДЛЯ ЦИСТЕИНОВОЙ ПРОТЕАЗЫ | 2019 |
|
RU2815018C2 |
ХИМИЧЕСКИЕ ЛИНКЕРЫ И ИХ КОНЪЮГАТЫ | 2005 |
|
RU2402548C2 |
АНТАГОНИСТЫ GRPR ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ GRPR-ПОЗИТИВНОГО ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ | 2013 |
|
RU2821944C2 |
УЛЬТРАЯРКИЕ ДИМЕРНЫЕ ИЛИ ПОЛИМЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ СО СПЕЙСЕРНЫМИ ЛИНКЕРНЫМИ ГРУППАМИ | 2017 |
|
RU2753706C2 |
Группа изобретений относится к набору для направленной медицинской визуализации и/или клинической медицины и к способу применения набора. Заявленный набор содержит предварительно направляющий зонд и эффекторный зонд, где предварительно направляющий зонд содержит первичный направляющий фрагмент и первую биоортогональную реакционноспособную группу и где эффекторный зонд содержит эффекторный фрагмент, такой как метка или фармацевтически активное соединение, и вторую биоортогональную реакционноспособную группу. Любая из первой и второй биоортогональных реакционноспособных групп представляет собой диенофил в виде напряженного 8-членного цикла (циклооктен или циклооктин), а диен представляет собой электронодефицитный тетразин или другой подходящий диен. Способ применения набора включает введение предварительно направляющего зонда субъекту и предоставление зонду возможности циркулировать в системе субъекта в течение периода времени, эффективного для достижения связывания первичного направляющего фрагмента с первичной мишенью с последующим выведением несвязанного средства из организма, с последующим введением эффекторного зонда. Изобретение включает использование [4+2] реакции ретрохимии Дильса-Альдера с обратным захватом электронов для обеспечения связывания между предварительно направляющим зондом и эффекторным зондом, что обеспечивает быстрое протекание реакции in vivo. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 3 пр.
1. Набор для направленной медицинской визуализации и/или клинической медицины, содержащий по меньшей мере один предварительно направляющий зонд и по меньшей мере один эффекторный зонд, где предварительно направляющий зонд содержит первичный направляющий фрагмент и первую биоортогональную реакционноспособную группу и где эффекторный зонд содержит эффекторный фрагмент, такой как метка или фармацевтически активное соединение, и вторую биоортогональную реакционноспособную группу, где любая из первой и второй биоортогональных реакционноспособных групп представляет собой диенофил, а другая из первой и второй биоортогональных реакционноспособных групп является диеном, где диенофил представляет собой напряженный 8-членный циклический диенофил, соответствующий формуле (1):
где каждый R независимо обозначает Н или в по большей мере шести случаях заместитель, выбранный из группы, состоящей из алкила, О-алкила, S-алкила, F, Cl, Br, I, SO2, NO2, NR'R”, причем R' и R”, каждый независимо, представляют собой Н или алкил, С(=O)Оалкил, С(=O)Оарил, CONR'R”, причем R' и R”, каждый независимо, представляют собой Н, арил или алкил, ОСОалкил, ОСОарил, NR'СОалкил, причем R' представляет собой Н или алкил, NR'СОарил, причем R' представляет собой или алкил, NR'С(=O)Оалкил, причем R' представляет собой Н или алкил, NR'С(=O)Оарил, причем R' представляет собой Н или алкил, OCONR'алкил, причем R' представляет собой Н или алкил, OCONR'арил, причем R' представляет собой Н или алкил, NR'CONR”алкил, причем R' и R”, каждый независимо, представляют собой Н или алкил, NR'CONR”арил, причем R' и R", каждый независимо, представляют собой Н или алкил, NR'CSNR"алкил, причем R' и R”, каждый независимо, представляют собой Н или алкил, и NR'CSNR"арил, причем R' и R”, каждый независимо, представляют собой Н или алкил; причем по меньшей мере один R, содержащийся в линкерном фрагменте, присоединен необязательно через спейсер к предварительно направляющему зонду или эффекторному зонду, где Х и Y, каждый независимо, обозначают Н, или заместитель, выбранный из группы, состоящей из алкила, О-алкила, S-алкила, F, Cl, Br, I, SO2, NO2, и NRR', причем R и R', каждый независимо, представляют собой Н или алкил или вместе образуют связь; и где диен выбирают таким образом, чтобы он был способен к взаимодействию с диенофилом посредством прохождения циклоприсоединения Дильса-Альдера с последующей ретрореакцией Дильса-Альдера и где диен выбирают из группы, состоящей из соединений формул (2), (3), (4), (5) и (6), как определено ниже:
где R1 выбирают из группы, состоящей из алкила, арила, O-алкила, С(=O)О-алкила, О- и NH2; А и В, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из алкилзамещенного углерода, арилзамещенного углерода, азота, N+O-, N+R причем R представляет собой алкил, при условии, что А и В не являются оба углеродом; Х выбирают из группы, состоящей из О, N-алкила и С=O и Y представляет собой CR, причем R выбирают из группы, состоящей из Н, алкила, арила, С(=O)Оалкила;
где R1 и R2, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из Н, алкила, арила, ОН, С(=O)O-алкила, CF3 и NO2; A выбирают из группы, состоящей из N-алкила, N-арила, С=O и CN-алкила; В представляет собой О; Х выбирают из группы, состоящей из СН, С-алкила, С-арила, СС(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из СН, С-алкила, С-арила, N и N+O-;
где R1 и R2, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из Н, алкила, арила, ОН, С(=O)O-алкила, CF3 и NO2; А выбирают из группы, состоящей из СО, Салкил-алкила, CN-алкила, N-алкила,. и N-арила; В представляет собой О; Х выбирают из группы, состоящей из СН, С-алкила, С-арила, СС(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из СН, С-алкила, С-арила, N и N+O-;
где R1 и R2, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из Н, алкила, арила, ОН, С(=O)O-алкила, CF3 и NO2; A выбирают из группы, состоящей из N, С-алкила, С-арила, и N+O-; В представляет собой N; Х выбирают из группы, состоящей из СН, С-алкила, С-арила, СС(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из СН, С-алкила, С-арила, N и N+O-;
где R1 выбирают из группы, состоящей из Н, алкила, арила, ОН, С(=O)O-алкила, CF3 и NO2; R2 выбирают из группы, состоящей из Н, алкила, арила, CN, ОН, С(=O)O-алкила, CF3 и NO2;
А выбирают из группы, состоящей из N, СН, С-алкила, С-арила, СС (=O)O-алкила, и N+O-; В представляет собой N; Х выбирают из группы, состоящей из СН, С-алкила, С-арила, СС(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из СН, CCN, С-алкила, С-арила, N и N+O-,
где указанный эффекторный зонд содержит структурный фрагмент, способный к образованию координационного комплекса с металлом.
2. Набор по п.1, где указанный структурный фрагмент представляет собой H4dota или H4dotma.
3. Набор по п.1 или 2, где диен соответствует формуле
где R1 и R2, каждый независимо, обозначают заместитель, выбранный из группы, состоящей из 2-пиридила, фенила или фенила, замещенного одной или более электроноакцепторными группами, такими как NO2, CN, COOH, COOR, CONH2, CONHR, CONR2, СНО, COR, SO2R, SO2OR, NO и Ar, где R представляет собой C1-C6 алкил и Ar обозначает ароматическую группу, особенно фенил, пиридил или нафтил.
4. Набор по п.1, где указанный диенофил соответствует формуле (8)
или формуле (9)
5. Набор по п.1, где предварительно направляющий зонд содержит в качестве первичного направляющего фрагмента антитело.
6. Набор по п.1, где эффекторный зонд содержит в качестве эффекторного фрагмента обнаруживаемую метку, предпочтительно, контрастное вещество для применения в системах визуализации, выбранное из группы, состоящей из средств для визуализации в МРТ, спиновых меток, оптических меток, средств, чувствительных к ультразвуку, средств, чувствительных к рентгеновскому излучению, радионуклидов, красителей FRET-типа, (био)люминесцентных или флуоресцентных молекул или меток, биотина, реагентов для парамагнитной визуализации и реагентов для суперпарамагнитной визуализации.
7. Набор по п.1, где эффекторный зонд содержит в качестве эффекторного фрагмента фармацевтически активное соединение.
8. Набор по п.7, где фармацевтически активное соединение представляет собой изотоп, выбранный из группы, состоящей из 24Na, 32Р, 33Р, 47Sc, 59Fe, 67Cu, 76As, 77As, 80Br, 82Br, 89Sr, 90Nb, 90Y, 103Ru, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 121Sn, 127Te, 131I, 140La, 141Ce, 142Pr, 143Pr, 144Pr, 149Pm, 149Tb, 151Pm, 153Sm, 159Gd, 161Tb, 165Dy, 166Dy, 166Ho, 169Er, 172Tm, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 198Au, 199Au, 211At, 211Bi, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 214Bi, 223Ra и 225Ac.
9. Способ применения набора, содержащего, по меньшей мере, один предварительно направляющий зонд и, по меньшей мере, один эффекторный зонд по любому из предшествующих пунктов, включающий введение предварительно направляющего зонда субъекту и предоставление зонду возможности циркулировать в системе субъекта в течение периода времени, эффективного для достижения связывания первичного направляющего фрагмента с первичной мишенью с последующим выведением несвязанного средства из организма, с последующим введением эффекторного зонда, где биоортогональные реакционноспособные группы в предварительно направляющем зонде и в эффекторном зонде вместе образуют реакционноспособные партнеры для [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера.
10. Способ по п.9, где указанный эффекторный зонд содержит радионуклеотид, применяемый для визуализации, выбранный из группы, состоящей из 3H, 11С, 13N, 15О, 18F, 19F, 51Cr, 52Fe, 52Mn, 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Zn, 62Cu, 63Zn, 64Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 70As, 71As, 72As, 74As, 75Se, 75Br, 76Br, 77Br, 80Br, 82Br, 82Rb, 86Y, 88Y, 89Sr, 89Zr, 97Ru, 99Tc, 110In, 111In, 113In, 114In, 117Sn, 120I, 122Xe, 123I, 124I, 125I, 166Ho, 167Tm, 169Yb, 193Pt, 195t, 201Tl и 203Pb.
11. Способ по п.9, где указанный эффекторный зонд содержит радионуклеотид, применяемый для терапии, выбранный из группы, состоящей из 24Na, 32P, 33P, 47Sc, 59Fe, 67Cu, 76As, 77As, 80Br, 82Br, 89Sr, 90Nb, 90Y, 103Ru, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 121Sn, 127Te, 131I, 140La, 141Ce, 142Pr, 143Pr, 144Pr, 149Pm, 149Tb, 151Pm, 153Sm, 159Gd, 161Tb, 165Dy, 166Dy, 166Ho, 169Er, 172Tm, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 198Au, 199Au, 211At, 211Bi, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 214Bi, 223Ra и 225Ac.
12. Набор по пп.7 или 8 для применения в направленной терапии, предпочтительно лучевой терапии.
Пресс для выдавливания из деревянных дисков заготовок для ниточных катушек | 1923 |
|
SU2007A1 |
MELISSA L | |||
BLACKMAN "Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity" J | |||
AM | |||
CHEM | |||
SOC | |||
Станок для изготовления деревянных ниточных катушек из цилиндрических, снабженных осевым отверстием, заготовок | 1923 |
|
SU2008A1 |
RUDIGER PIPKORN "Inverse-electron-demand Diels-Alderreaction as a highly efficient chemoselective ligation procedure: Synthesis and |
Авторы
Даты
2015-01-27—Публикация
2010-04-12—Подача