ПОЛУЧЕНИЕ КРАЙНЕ МАЛЫХ И ОДНОРОДНЫХ ПО РАЗМЕРУ ПАРАМАГНИТНЫХ ИЛИ ПСЕВДОПАРАМАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ НА ОСНОВЕ ОКСИДА ЖЕЛЕЗА И, С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ, КОНТРАСТНЫХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ Т1-РЕЖИМА МРТ Российский патент 2015 года по МПК A61K49/08 A61K49/04 A61K47/02 A61K47/48 A61K9/16 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу получения одноразмерных парамагнитных или псевдопарамагнитных наночастиц на основе оксида железа, наночастицам на основе оксида железа, получаемым этим способом, и включающему их контрастному веществу для T1-режима МРТ. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения наночастиц оксида железа, крайне малых и имеющих одинаковый (однородный) размер 4 нм или менее, на основе термического разложения комплекса олеата железа, наночастицам оксида железа, получаемым этим способом, и контрастному веществу для T1-режима, включающему парамагнитные или псевдопарамагнитные наночастицы.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последнее время в медицине и биологии активно проводят множество исследований, касающихся различных типов наночастиц, например окрашивание клеток, разделение клеток, доставка лекарственных средств in vivo, доставка генов, диагностика и лечение заболевания или нарушения, молекулярная диагностика или т.п.

Для определения существенного значения медицинского применения таких наночастиц необходимо получать удовлетворительные результаты как in vitro, так и in vivo.

Другими словами, оказывающие положительное воздействие наночастицы, сначала прошедшие эксперименты на клетках, затем подвергают дополнительным тестам на животных для подтверждения того, что тестируемые наночастицы можно применять в медицине.

Магнитно-резонансная томография (МРТ) является хорошо известным способом получения анатомической, физиологической и/или биохимической информации об организме человека с помощью изображений релаксации спинов атомов водорода в магнитном поле и в настоящее время представляет собой превосходный инструмент для визуальной диагностики, позволяющий визуализировать органы животного или человека в реальном времени неинвазивным способом.

Для лучшего и разнообразного использования МРТ в биологии или медицине используют способ инъецирования постороннего вещества в организм для повышения контрастности МРТ-изображений. В связи с этим постороннее вещество часто обозначают как контрастное вещество. Такое контрастное вещество может являться веществом, в котором используют суперпарамагнитный или парамагнитный материал, вызывающий контрастность сигналов в участке, исследуемом с помощью МРТ, таким образом, позволяя четко определять участок.

На МРТ-изображениях контраст между тканями представляет собой явление, возникающее в результате различия релаксации между тканями, где релаксация относится к восстановлению ядерного спина молекул воды в тканях до равновесного состояния. Контрастное вещество влияет на такую релаксацию и, таким образом, может повышать различие в релаксации между тканями и вызывать различие в МРТ-сигналах, таким образом, позволяя четко определять контраст между тканями. Однако контрастное вещество может вызывать различия в применимости и точности в зависимости от характеристик и функций контрастного вещества, индивидуумов, которым инъецируют контрастное вещество или т.п.

Кроме того, когда контраст улучшают с использованием контрастного вещества, помогающего регулировать сигналы изображения конкретных органов и/или тканей так, чтобы они были более высокими или низкими, чем сигналы соседних органов и/или тканей, получают более выразительное (четкое) изображение. Контрастное вещество, повышающее уровень сигналов изображения на желаемом участке организма, МРТ-изображения которого получают, относительно другого участка (соседнего для желаемого участка), можно обозначать как "положительное" контрастное вещество ("контрастное вещество дл T1-режима"). С другой стороны, контрастное вещество, снижающее уровень сигналов изображения на желаемом участке относительно другого участка, можно обозначать как "отрицательное" контрастное вещество ("контрастное вещество для T2-режима"). Более конкретно, контрастное вещество для МРТ можно классифицировать на контрастное вещество для T1-режима, в котором используют высокий спин парамагнитного материала, и контрастное вещество дл T2-режима, в котором используют магнитную неоднородность вокруг парамагнитного или суперпарамагнитного материала. "Положительное" контрастное вещество относится к T1-релаксации, т.е. продольной релаксации. Такая продольная релаксация означает, что после того, как намагниченный компонент "Mz" по оси Z направления спина поглощает энергию импульса RF, прикладываемую со стороны оси X, намагниченный компонент располагается вдоль оси Y на плоскости XY и испускает энергию вовне, в свою очередь, возвращаясь к исходному значению (или состоянию) Mz. Описываемое выше действие обозначают как "T1-релаксация". Время, затраченное для возвращения Mz к 63% исходного значения, обозначают как "время релаксации T1", и по мере снижения времени релаксации T1 сигналы МРТ повышаются, что, в свою очередь, снижает время получения изображения.

Аналогично, "отрицательное" контрастное вещество относится к T2-релаксации, т.е. поперечной релаксации. Как описано выше, после того как намагниченный компонент "Mz" в направлении оси Z спина поглощает энергию импульса RF, прикладываемую со стороны оси X, намагниченный компонент располагается вдоль оси Y на плоскости XY и спонтанно затухает и/или испускает энергию в сторону соседних спинов, в свою очередь, возвращаясь к исходному значению Mz. В связи с этим другой спиновый компонент "My", в равной степени распределенный на плоскости XY, снижается по экспоненте, и это обозначают как "T2-релаксацию". Время, затраченное на снижение My до 37% исходного значения, обозначают как "время релаксации T2", и значение My, измеряемое посредством измерительной рамки, установленной на оси Y, как функция времени, где значение My снижается с течением времени, обозначают как спад свободной индукции (FID). Ткани с коротким временем релаксации T2 при МРТ представлены как темные области.

В коммерчески доступных контрастных веществах для МРТ парамагнитные соединения используют в качестве "положительных" контрастных веществ, в то время как суперпарамагнитные наночастицы используют в качестве "отрицательных" контрастных веществ.

В настоящее время контрастное вещество для T2-режима включает наночастицы оксида железа, такого как SPIO (суперпарамагнитный оксид железа). В этом случае T2-контраст является отрицательным контрастом, т.е. используют способ с отрицательным контрастом, где желаемые участки являются более темными, чем окружающие. Таким образом, этот способ не оказывает выраженные эффекты контраста и обладает тем недостатком, что вызывает эффект расплывания, контрастируя область, большую, чем фактическая.

С другой стороны, контрастное вещество для T1-режима обладает преимуществом, обеспечивая положительный контраст для яркого отображения желаемого участка, и содержит материал с высоким спином. Поэтому обычно используют комплекс гадолиния с 7 электронами с параллельными спинами на 4f-орбиталях. Однако комплекс гадолиния имеет очень короткое время удержания in vivo и/или в сосудах по причине относительно небольшой молекулярной массы, вызывая затруднения в точной диагностике. Кроме того, указанное выше контрастное вещество для T1-режима нельзя использовать для индивидуумов с нарушениями почек из-за опасности развития нефрогенного системного фиброза, и недавно было получено предупреждение от Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США. Таким образом, существует острая потребность в разработке улучшенного контрастного вещества для T1-режима, с помощью которого можно преодолевать недостатки комплекса гадолиния, включая, например, короткое время удержания, высокую токсичность для пациентов с заболеваниями почек или т.п.

Среди новых тенденций в разработке контрастных веществ для T1-режима описывают статью, относящуюся к использованию наночастиц оксида марганца с 5 электронами с параллельными спинами на 3d-орбиталях (H.B. Na et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 5397).

Наночастицы оксида марганца обладают преимуществами, такими как высокий эффект T1-релаксации, характерный для ионов марганца, и легкое связывание с молекулами-мишенями и легкое внутриклеточное инъецирование, характерное для наночастиц. Однако в случае когда наночастицы оксида марганца встраивают в эндосому, ионы марганца выходят из наночастицы по причине кислого внутреннего окружения. Таким образом, если такие ионы марганца остаются в организме, они могут вызывать нарушения работы кальциевых каналов (L.K. Limbach, et al., Environ. Sci. Technol. 2007, 41, 4158).

Для преодоления указанных выше недостатков можно предложить использование оксида железа в качестве контрастного вещества для T1-режима, где оксид железа имеет пять электронов с параллельными спинами, а также большую биосовместимость, чем марганец.

Типичные наночастицы оксида железа (в особенности, магнетит или маггемит) являются суперпарамагнитными при температуре, близкой к комнатной. В результате таких суперпарамагнитных свойств, т.е. высокой намагниченности, уровень T2 повышается, и могут возникать свойства магнитной восприимчивости, таким образом, вызывая проблемы, такие как искажение сигнала. Таким образом, сообщают, что магнетит не подходит для использования в качестве контрастного вещества для T1-режима (Y.-W. Jun, et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5732).

Однако указанные выше проблемы можно решать, контролируя размер наночастиц оксида железа. Более конкретно, со снижением размера частиц оксида железа, можно снижать их магнитные свойства, что, в свою очередь, снижает их магнитную неоднородность. Таким образом, можно прогнозировать использование наночастиц оксида железа в качестве контрастного вещества для T1-режима. Например, в патенте США № 6638494 (заявитель: Herbert Pilgrim) описывают повышение T1-релаксивности (r1) посредством снижения размера частиц суперпарамагнитного оксида железа. Согласно патенту наночастицы оксида железа, синтезированные совместным осаждением, имеющие размер частиц от 1 до 10 нм, и средний размер (d50: срединный) от 2 до 4 нм, и гидрофильную поверхность, демонстрировали T1-релаксивность в диапазоне от 2 до 50 л/ммоль·с, и r2/r1 составляет 5 или менее. Однако хотя средний размер (срединный) частиц невелик, диапазон размера частиц достаточно широк, например от 1 до 10 нм, таким образом, вызывая неравномерность размера частиц. Если размер частицы оксида железа составляет 4 нм или более, T2-эффекты могут быстро повышаться с размером частиц. Таким образом, хотя средний размер невелик, улучшение T1-релаксивности не столь высоко, если частицы имеют неодинаковый размер. Таким образом, эти наночастицы также не подходят для использования в качестве контрастного вещества для T1-режима.

Среди недавних исследований сообщали об использовании наночастиц оксида железа с размером от 4 до 6 нм в качестве контрастного вещества для T1-режима (E. Taboada et al., Langmuir, 2007, 23, 4583; U.I. Tromsdorf et al., Nano Lett. 2009, 9, 4434). Однако из-за относительно большого размера частиц, T2-эффекты все еще являются значительными, таким образом, наночастицы вызывают ограничения их использования в качестве контрастного вещества для T1-режима.

Combidex® (AMAG Co.), в настоящее время находящийся на клинических испытаниях на предмет его использования в качестве контрастного вещества для режима T2 для лимфоузлов, также исследовали в отношении его T1-контрастирующих свойств. Однако, т.к. средний размер наночастиц оксида железа являлся относительно большим в диапазоне от 4 до 6 нм и размер структурных частицы неодинаков, известно, что его T2-эффект преобладает над T1-эффектом (Claire Corot et al., Advanced Drug Delivery Reviews 58 (2006) 1471).

Кроме того, существует способ получения имеющих одинаковый размер частиц оксида железа посредством термического разложения. Однако необходимы строгие требования к получению наночастиц оксида железа, имеющих размер 4 нм или менее, что, в свою очередь, нежелательно при коммерческом применении (Jongnam Park, et al., Nature Mate., 3(2004), 891).

Кроме того, даже если можно получать наночастицы, имеющие размер 4 нм или менее, сырье является дорогим и/или обладает сильными токсическими свойствами, таким образом не имея большого значения в отношении коммерческого применения (Xiaowei Teng, J. Mater. Chem., 14 (2004), 774).

Таким образом, еще не сообщали о синтезе и поточном производстве наночастиц оксида железа, имеющих крайне малый и одинаковый размер 4 нм или менее, высоко производительным способом при низких затратах, а также исследовании контрастного вещества для T1-режима и его использовании, в чем все еще существует потребность.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Т.к. существующее контрастное вещество для T1-режима магнитно-резонансной томографии, а именно комплекс гадолиния, имеет достаточно небольшую молекулярную массу, то, таким образом, он демонстрирует слишком короткое время удержания in vivo и в сосудах. Кроме того, комплекс может вызывать проблемы у пациентов с заболеваниями почек, связанные с высокой токсичностью. Т.к. наночастицы оксида железа являются кристаллом, они обладают относительно размером частиц, что, таким образом, приводит к повышению времени удержания in vivo и в сосудах, и они обладают минимальной токсичностью. С учетом таких преимуществ планируют разработку нового контрастного вещества для T1-режима с использованием наночастиц оксида железа. Однако наночастицы оксида железа, получаемые общепринятыми способами, являются такими большими, что все еще вызывают проблему сильного преобладания T2-эффекта над T1-эффектом, и, таким образом, они не подходят для использования в качестве контрастного вещества для T1-режима.

Таким образом, цель настоящего изобретения относится к способу получения наночастиц оксида железа, где наночастицы можно использовать в качестве контрастного вещества для T1-режима, имеют крайне малый и одинаковый размер частиц, и их легко получать и осуществлять их поточное производство.

Более конкретно, указанная выше цель относится к способу получения наночастиц оксида железа, где наночастицы имеют парамагнитные или псевдопарамагнитные (далее в настоящем описании обозначаемые как "(псевдо) парамагнитные") свойства, одинаковый размер (средний размер ±1 нм) и небольшой средний размер 4 нм или менее по сравнению с общепринятыми наночастицами оксида железа с суперпарамагнитными свойствами.

Другая цель настоящего изобретения относится к наночастицам оксида железа, обладающим (псевдо) парамагнитными свойствами, одинаковым размером (средний размер ±1 нм) и крайне малым средним размером 4 нм или менее и не описанным в предшествующем уровне техники.

Другая цель настоящего изобретения относится к контрастному веществу для T1-режима МРТ, включающему описываемые выше (псевдо) парамагнитные наночастицы оксида железа, и, более конкретно, контрастному веществу для T1-режима МРТ, включающему наночастицы оксида железа с различными преимуществами, где: контрастное вещество обладает улучшенным T1-контрастным эффектом без искажения изображения, но с получением ярких изображений; находится в форме наночастицы с целью повышения скорости внутриклеточного проникновения и внутриклеточной поглощающей способности; вызывает мишенеспецифичный контрастный эффект; его легко доставлять к мишени, и оно безопасно выводится из организма; минимизирует побочные эффекты или т.п. Кроме того, настоящее изобретение относится к контрастному веществу для T1-режима, обладающему желаемым временем удержания in vivo и в сосудах, являющимся не слишком коротким (т.е. относительно продолжительным) по сравнению с общепринятыми контрастными веществами для T1-режима на основе Gd.

РЕШЕНИЕ ТЕХНИЧЕСКОЙ ЗАДАЧИ

Для преодоления указанных выше проблем в предшествующем уровне техники авторы настоящего изобретения проводили интенсивные и обширные исследования и осуществляли синтез наночастиц оксида железа, имеющих крайне малый и одинаковый размер 4 нм или менее, на основе термического разложения комплекса олеата железа с помощью простого способа. Настоящее изобретение осуществляли с использованием синтезированных наночастиц оксида железа в качестве контрастного вещества для T1-режима.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения наночастиц оксида железа, включающему (a) проведение реакции: комплекса железа, содержащего железо в качестве центрального атома и карбоксилатную группу с 4-25 атомами углерода ("C4-C25-карбоксилатную группу"), связанную с центральным атомом в форме лиганда; C4-C25-жирной кислотой и C4-C25-алифатическим спиртом или C4-C25-алифатическим амином при температуре от 150 до 350°C для получения наночастиц оксида железа, и дополнительно включающему, после операции (a), (b) диспергирование преципитата в органическом растворителе, где преципитат получают охлаждением и промыванием описываемых выше наночастиц.

Получаемые описываемым выше способом наночастицы оксида железа могут иметь размер 4 нм или менее и (псевдо) парамагнитные свойства, таким образом, являясь применимыми в качестве контрастного вещества для T1-режима МРТ.

Предшественник железа, используемый в получении наночастиц оксида железа, может содержать атом железа и группу C10-C22-жирной кислоты в форме лиганда, связанного с атомом железа, и, более предпочтительно, является комплексом олеата железа (далее в настоящем описании обозначаемым как "олеат железа").

Кроме того, жирная кислота и/или алифатический спирт (или алифатический амин), используемые в получении наночастиц оксида железа, могут включать C10-C22-жирные кислоты и/или алифатические спирты (или алифатические амины). Более предпочтительно, жирная кислота и алифатический спирт являются олеиновой кислотой и олеиловым спиртом, в то время как алифатический амин является олеиламином.

В то же время, с учетом практических условий обработки описываемое выше получение наночастиц оксида железа можно осуществлять реакцией нагревания материалов, т.е. комплекса железа, жирной кислоты и алифатического спирта (или алифатического амина), в смешанном состоянии от комнатной температуры до 200-310°C при скорости повышения температуры 5°C/мин или более, и позволяя реакции протекать при температуре от 200 до 310°C в течение периода времени от 5 до 60 минут.

В соответствии с другой целью настоящее изобретение также относится к крайне малым и одноразмерным наночастицам оксида железа, получаемым описываемым выше способом получения. В связи с этим каждая из наночастиц оксида железа может иметь размер 4 нм или менее и проявлять (псевдо) парамагнитные свойства. Размер получаемой по настоящему изобретению наночастицы оксида железа можно контролировать, регулируя молярные отношения реагирующих материалов, таких как C4-C25-жирная кислота, C4-C25-алифатический спирт (или алифатический амин), вводимых при получении.

Т.к. поверхность наночастиц оксида железа покрыта органическими материалами, являющимися производными реакционных материалов, они являются гидрофобными и хорошо диспергируемыми в неполярных органических растворителях, таких как гексан, толуол и т.п.

Кроме того, настоящее изобретение относится к гидрофильным наночастицам оксида железа, полученным модификацией поверхности гидрофобных наночастиц гидрофильными материалами с использованием способов лигандного обмена или инкапсуляции.

Гидрофильные наночастицы оксида железа по настоящему изобретению можно получать модификацией поверхности оксида железа полиэтиленгликолем ("PEG"), фосфолипид-PEG, PEG-фосфатом, моносахарид-фосфатом, производными моносахарид-фосфатов, бетаинами или лимонной кислотой. Более предпочтительно, поверхность оксида железа можно модифицировать молекулой PEG-фосфата (PO-PEG), содержащей PEG, связанный с фосфатной группой или фосфиноксидной группой, глюкозо-6-фосфатом, глюкозо-6-фосфат-этаноламином, глюкозо-6-фосфат-PEG, бетаином или лимонной кислотой.

Кроме того, настоящее изобретение относится к коллоидному раствору, включающему гидрофильные наночастицы оксида железа, в котором наночастицы диспергированы в воде.

Кроме того, настоящее изобретение относится к контрастному веществу для T1-режима магнитно-резонансной томографии, включающему коллоидный раствор гидрофильных наночастиц оксида железа.

По настоящему изобретению, даже когда наночастица оксида железа является наночастицей, синтезированной любым известным способом, наночастица может являться (псевдо) парамагнитной, если она имеет размер 4 нм или менее, и, таким образом, наночастицы могут проявлять улучшенный T1-контрастный эффект.

Альтернативный способ получения наночастиц оксида железа по настоящему изобретению может включать проведение реакции: комплекса железа, содержащего железо в качестве центрального атома и C4-C25-карбоксилатную группу, связанную с центральным атомом в форме лиганда; и C4-C25-жирной кислоты при температуре от 290 до 310°C со скоростью повышения температуры от 3 до 3,5°C/мин для получения наночастиц оксида железа. Другой альтернативный способ получения наночастиц оксида железа по настоящему изобретению может включать сначала проведение реакции: комплекса железа, содержащего железо в качестве центрального атома и C4-C25-карбоксилатную группу, связанную с центральным атомом в форме лиганда; и C4-C25-жирной кислоты при температуре от 265 до 275°C, с последующим проведением их повторной реакции при температуре от 315 до 325°C для получения наночастиц оксида железа.

Настоящее изобретение не ограничено указанными выше целями, и, наоборот, другие цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и четко понятны благодаря предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Кроме того, следует понимать, что другие цели, свойства и аспекты настоящего изобретения можно осуществлять средствами и/или способами и их сочетаниями, описываемыми в заявленной формуле изобретения.

БЛАГОПРИЯТНЫЕ ЭФФЕКТЫ

По настоящему изобретению (псевдо) парамагнитные наночастицы оксида железа, имеющие крайне малый и одинаковый размер 4 нм или менее, можно воспроизводимо и массово производить с использованием сырья при низких затратах с помощью более легкого способа получения по сравнению с существующими способами предшествующего уровня техники. Кроме того, размер наночастиц можно легко контролировать.

Кроме того, наночастицы оксида железа, производимые указанным выше способом, имеют одинаковое распределение по размеру, по сравнению с существующими способами предшествующего уровня техники, таким образом, обеспечивая постоянные T1-контрастные эффекты.

Кроме того, настоящее изобретение относится к контрастному веществу для T1-режима, включающему (псевдо) парамагнитные наночастицы оксида железа, таким образом, делающему возможным высокое качество T1-контраста, которое нельзя получать существующими способами предшествующего уровня техники.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Указанные выше и другие цели, свойства и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего описания предпочтительных вариантов осуществления, приведенных в сочетании с сопутствующими чертежами, в которых:

на фиг.1 представлены изображения наночастиц оксида железа размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом, полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM), более конкретно: (a) полученное с помощью TEM изображение; (b) полученное с помощью TEM изображение в широком диапазоне; (c) полученное с помощью трансмиссионной электронной микроскопии изображение высокого разрешения (HR-TEM) и (d) микродифракционная электронограмма (SAED);

на фиг.2 представлен спектр дифракции рентгеновских лучей (XRD) наночастиц размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом;

на фиг.3 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 2 способом;

на фиг.4 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 1,8 нм, синтезированных описываемым в примере 3 способом;

на фиг.5 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 3,3 нм, синтезированных описываемым в примере 4 способом;

на фиг.6 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 3,5 нм, синтезированных описываемым в примере 5 способом;

на фиг.7 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 1,6 нм, синтезированных описываемым в примере 6 способом;

на фиг.8 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 2,4 нм, синтезированных описываемым в примере 7 способом;

на фиг.9 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 3,5 нм, синтезированных описываемым в примере 8 способом;

на фиг.10 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 9 способом;

на фиг.11 (a) представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 2,7 нм, синтезированных описываемым в примере 10 способом; (b) представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа, синтезированных описываемым в сравнительном примере 1 способом; и (c) представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа, синтезированных описываемым в сравнительном примере 2 способом;

на фиг.12 (a) представлены M-H-графики при 5 K и 300 K соответственно, для наночастиц размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом; (b) представлены изменения M-H-графика при 300 K для наночастиц с изменением размера частиц; (c) представлены M-T-графики при охлаждении в нулевом магнитном поле и охлаждении в магнитном поле для наночастиц размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 2 способом, соответственно; (d) представлен M-T-график для наночастиц размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом; (e) представлен M-T-график для наночастиц размером 12 нм, синтезированных описываемым в сравнительном примере 3 способом; (f) представлены M-H-графики при 5 K и 300 K соответственно, для наночастиц размером 1,6 нм, синтезированных описываемым в примере 6 способом; (g) представлен M-T-график для наночастиц из примера 6; и (h) представлены M-H-графики при 5 K и 300 K соответственно, для наночастиц размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 9 способом;

на фиг.13 показано распределение среднечисловых гидродинамических размеров (среднее число 11,8 нм) наночастиц размером 3 нм, диспергированных в воде с использованием PEG-фосфата (PO-PEG) описываемым в примере 13 способом;

на фиг.14 представлены мнимые изображения при T1-режиме МРТ дисперсий, полученных сначала модификацией поверхности наночастиц оксида железа PEG-фосфатом (PO-PEG) и фосфолипид-PEG соответственно, с размером частиц, и затем вторичным диспергированием наночастиц с модифицированной поверхностью в воде; в частности, в случае, когда PO-PEG используют для обработки наночастиц размером 2,3 нм, 3 нм, 4 нм и 7 нм, каждый из них обозначают как 2,3P, 3P и 4P соответственно; аналогично, в случае когда фосфолипид-PEG используют для обработки указанных выше наночастиц, каждую из них обозначают как 2,3L, 3L, 4L и 7L;

на фиг.15 представлены результаты мнимых МРТ-изображений клеток для наночастиц размером 3 нм и наночастиц размером 12 нм соответственно; в частности на (a) представлено мнимое МРТ-изображение клеток для наночастиц размером 3 нм; и на (b) представлено ложное МРТ-изображение клеток для наночастиц размером 12 нм;

на фиг.16 представлены четкие контрастные изображения яремных вен, сонных артерий и дуги аорты, полученные с использованием наночастицы по настоящему изобретению, по сравнению с комплексом гадолиния Gadovist® (Bayer Schering Co.). На (a) представлено контрастное МРТ-изображение сосудов in vivo, полученное с использованием наночастиц размером 3 нм; и на (b) представлено контрастное МРТ-изображение сосудов in vivo, полученное с использованием Gadovist®;

на фиг.17 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 4 нм, синтезированных описываемым в примере 20 способом;

на фиг.18 представлены результаты анализа MTT для MCF-7 клеток с использованием гидрофильно-модифицированных наночастиц оксида железа по примеру 21;

на фиг.19 представлены результаты анализа молекулярной массы наночастиц оксида железа посредством MALDI-TOF в примере 22;

на фиг.20 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 12 нм, синтезированных описываемым в сравнительном примере 3 способом;

на фиг.21 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 12 нм, синтезированных описываемым в сравнительном примере 4 способом;

на фиг.22 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 7 нм, синтезированных описываемым в сравнительном примере 5 способом;

на фиг.23 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 4 нм, инкапсулированных в форме агрегата с последующим негативным окрашиванием, описываемым в сравнительном примере 6 способом; и

на фиг.24 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 6 нм, синтезированных по сравнительному примеру 7,

на фиг.25 представлены усиленные контрастные МРТ-изображения сосудов, полученные с использованием наночастиц размером 3 нм, покрытых глюкозо-6-фосфатом, описываемых в примере 17.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Указанные выше цели, свойства и преимущества станут более очевидными из следующего описания предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения со ссылкой на сопутствующие чертежи, приведенные далее в настоящей заявке. Таким образом, специалист в области, к которой относится настоящее изобретение, легко осуществит технические идеи или сущность настоящего изобретения. Кроме того, терминология, используемая в настоящем описании, включает значения, общепринятые специалистами в этой области, если не указано иначе. Когда технические конфигурации, известные в предшествующем уровне техники, как считают, делают содержание настоящего изобретения неясным, их подробное описание опускают.

Далее в настоящем описании предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения будут подробно описываться со ссылкой на сопутствующие чертежи.

Способ получения наночастиц оксида железа по настоящему изобретению включает (a) проведение реакции: комплекса железа, содержащего железо в качестве центрального атома и карбоксилатную группу с 4-25 атомами углерода ("C4-C25-карбоксилатную группу", далее в настоящем описании обозначаемую, как указано выше), связанную с центральным атомом в форме лиганда; C4-C25-жирной кислотой; и C4-C25-алифатическим спиртом или C4-C25-алифатическим амином при температуре от 150 до 350°C для получения наночастиц оксида железа и дополнительно включает после получения (a) (b) диспергирование преципитата в органическом растворителе, где преципитат получают охлаждением и промыванием описываемых выше наночастиц.

Предшественник железа, используемый в получении (a) наночастиц оксида железа, может иметь атом железа и связанную с ним группу C10-C22-жирной кислоты в форме лиганда, и примеры таких лигандов могут включать: стеариновую кислоту; олеиновую кислоту; линолевую кислоту; пальмитиновую кислоту; пальмитолеиновую кислоту; миристиновую кислоту; лауриновую кислоту; арахидоновую кислоту; бегеновую кислоту или т.п. Более предпочтительно, предшественник железа, используемый в настоящем описании, является олеатом железа.

Жирная кислота и алифатический спирт, используемые в получении (a) наночастиц оксида железа, могут включать C10-C22-жирную кислоту, C10-C22-алифатический спирт и/или C10-C22-алифатический амин. Примеры жирной кислоты могут включать: стеариновую кислоту; олеиновую кислоту; линолевую кислоту; пальмитиновую кислоту; пальмитолеиновую кислоту; миристиновую кислоту; лауриновую кислоту; арахидоновую кислоту; рицинолеиновую кислоту; бегеновую кислоту или т.п. Примеры алифатического спирта могут включать: стеариловый спирт (октадеканол); олеиловый спирт; линолеиловый спирт; гескадеканол; пальмитолеиловый спирт; тетрадеканол; додеканол; арахидиловый спирт; эйкозанол; докозанол; гексадекандиол или т.п. Кроме того, примеры алифатического амина могут включать: стеариламин (октадециламин); олеиламин; гексадециламин; пальмитиламин; тетрадециламин; додециламин; арахидиламин или т.п.

Более предпочтительно, жирная кислота и алифатический спирт, используемые в настоящем описании, являются олеиновой кислотой и олеиловым спиртом соответственно. Аналогично, алифатический амин, используемый в настоящем описании, является олеиламином.

Что касается практических условий обработки, получение наночастиц оксида железа можно осуществлять нагреванием реакционных материалов, т.е. комплекса железа, жирной кислоты и алифатического спирта (или алифатического амина), в смешанном состоянии от комнатной температуры до 200-310°C со скоростью повышения температуры 5°C/мин или более, позволяя реакции протекать при температуре от 200 до 310°C в течение периода от 5 до 60 минут.

Наночастицы оксида железа, получаемые в настоящем изобретении, могут иметь размер 4 нм или менее. Характеристики наночастиц оксида железа, получаемых способом получения по настоящему изобретению, описаны ниже.

На фиг.1 (a) и (b) представлены полученные с помощью TEM изображения наночастиц оксида железа размером 3 нм. На фигурах можно видеть, что наночастицы крайне малы и одинаковы. На фиг.1 (b) представлена обширная область изображения для демонстрации того, что небольшие частицы не агрегируют, а однородно распределяются на всем протяжении обширной области без примеси больших частиц. По сравнению с наночастицами металлов, оксид с низкой электронной плотностью и, таким образом, крайне малые частицы оксида не наблюдают при TEM четко. Таким образом, как показано на фиг.1 (c), структуру решетки нечетко определяют при HR-TEM из-за энергии электронного пучка при TEM. Но на фиг.1 (d) показаны пики (311, 400) типичной структуры магнетита или маггемита на электронограмме (ED).

Фиг.2 представляет собой спектр XRD наночастиц размером 3 нм. На фигуре можно видеть, что наночастицы размером 3 нм имеют структуру магнетита или маггемита, хотя они демонстрируют относительно широкие пики (311, 400, 440) благодаря своему малому размеру. Четко различать магнетит и маггемит очень трудно, т.к. дифракционные рентгенограммы этих двух структур очень схожи. Согласно вычислению по уравнению Дебая-Шеррера наночастицы имеют размер 3 нм, являющийся тем же размером, что и на полученных с помощью TEM изображениях (фиг.1), таким образом, демонстрируя превосходную кристалличность.

Размер наночастиц оксида железа, получаемых по настоящему изобретению, можно контролировать, регулируя молярное отношение реагирующих материалов, таких как C4-C25-жирная кислота или C4-C25-алифатический спирт (или алифатический амин), вводимых при получении.

По настоящему изобретению размер наночастиц оксида железа можно снижать, снижая концентрацию предшественника железа, таким образом, контролируя размер наночастиц оксида железа.

Когда повышают количество алифатического спирта (или алифатического амина), как одного из реакционных материалов, можно синтезировать наночастицы со сниженным размером. Однако контроль размера может зависеть от типов реакционных материалов и/или условий реакции.

Например, в случае когда в качестве предшественника железа используют олеат железа, можно получать наночастицы с меньшим размером, снижая концентрацию реакционного материала, т.е. олеата железа. Т.е. наночастицы размером 3 нм, синтезированные с исходной концентрацией предшественника 0,2M; и наночастицы размером 2,3 нм, синтезированные с исходной концентрацией предшественника 0,1M. В результате, следует понимать, что размер наночастиц оксида железа можно контролировать через количество предшественника железа.

Что касается контроля размера на основе отношения между алифатическим спиртом (или алифатическим амином) и жирной кислотой, указанное выше отношение не рассматривают как существенно влияющее на размер наночастиц. Однако размер наночастиц снижают, повышая количество алифатического спирта, такого как олеиловый спирт.

Даже если алифатический спирт, используемый в настоящем описании, заменять алифатическим амином в качестве слабого восстановителя, можно получать наночастицы оксида железа. Используемым в настоящем описании алифатическим амином может являться C4-C25-алифатический амин и, предпочтительно, олеиламин.

Даже при использовании алкандиола вместо алифатического спирта можно получать наночастицы оксида железа. Однако в этом случае нельзя получать наночастицы оксида железа размером 4 нм или менее.

Учитывая размер и однородность наночастиц оксида железа, повышение температуры может являться относительно быстрым. Скорость повышения температуры может составлять 5°C/мин или выше и, более предпочтительно, 10°C/мин или выше.

Причиной упомянутого выше факта можно считать взрывную нуклеацию, происходящую соответствующим образом при быстром повышении температуры, и такая реакция является благоприятной для синтеза наночастиц оксида железа крайне малого и одинакового размера. Как описано выше, размер и однородность наночастиц оксида железа можно контролировать, регулируя скорость повышения температуры. Более конкретно, можно получать меньшие и более однородные наночастицы оксида железа, повышая скорость повышения температуры. В связи с этим скорость повышения температуры может составлять 200°C/мин или менее.

Например, в связи с корреляцией между размером наночастиц оксида железа и скоростью повышения температуры, если используют олеиновую кислоту и олеиловый спирт, со скоростью повышения температуры 3,3°C/мин, 5°C/мин синтезируют частицы неодинакового размера, включающие относительно большие наночастицы размером приблизительно от 4 нм до 6 нм. С другой стороны, со скоростью повышения температуры 10°C /мин и 20°C/мин синтезируют одинаковые частицы размером 3 нм и 2,7 нм соответственно.

Наночастицы оксида железа, получаемые по настоящему изобретению, становятся (псевдо) парамагнитными по причине своего сниженного размера, чтобы, таким образом, минимизировать помехи при T1-релаксации, вызываемые повышением T2-релаксации, что, в свою очередь, подходит для использования в качестве контрастного вещества для T1-режима МРТ. Таким образом, наночастицы оксида железа по настоящему изобретению можно применять в контрастных веществах для МРТ.

Наночастицы оксида железа, получаемые по настоящему изобретению, являются менее токсичными, чем другие оксиды металлов, таким образом, являясь биосовместимыми. Наночастицы оксида железа можно использовать в качестве контрастного вещества для T1-режима МРТ посредством модификации их поверхности фосфолипид-PEG, PEG-фосфатом (PO-PEG), моносахарид-фосфатами, производными моносахарид-фосфатов, бетаинами или лимонной кислотой. Более предпочтительно, поверхность оксида железа можно модифицировать с использованием PO-PEG, глюкозо-6-фосфата, глюкозо-6-фосфат-этаноламина, глюкозо-6-фосфат-PEG или лимонной кислоты. Покрывающие наночастицу материалы сильно действуют на гидродинамический размер, стабильность в воде и токсичность. Даже если размер ядра оксида железа крайне мал, гидрофильная композиция после лигандного обмена может являться достаточно большой для повышения T2-эффектов. Таким образом, гидрофильный слой является ключевым в контрастном веществе для T1-режима МРТ.

Что касается получения наночастиц оксида железа, наночастицы оксида железа можно синтезировать термическим разложением олеата железа, как описано в Nat. Mater. 2004, 4, 891. Однако, т.к. в способе, описываемом в указанном выше документе, используют только олеиновую кислоту, присоединенную к комплексу железа, в качестве поверхностно-активного вещества для синтеза наночастиц, качества олеиновой кислоты недостаточно для получения наночастиц оксида железа размером 4 нм или менее. Напротив, авторы настоящего изобретения успешно синтезировали наночастицы оксида железа размером 4 нм или менее, варьируя условия получения наночастиц с различными условиями повышения температуры из запатентованного в данной области способа. Для контроля условий получения наночастиц адаптировали два различных способа.

Первым способом является получение в ходе реакции ряда центров кристаллизации, как описано в примерах 6 и 7, где наночастицы малого размера синтезируют для снижения количества атомов железа, прикрепленных к каждой частице, в течение роста частицы. В этом способе можно контролировать образование центров кристаллизации, регулируя температуру реакции. Однако по сравнению с предпочтительным способом получения по настоящему изобретению, включающим: проведение реакции комплекса железа, образованного железом в качестве центрального атома и C4-C25-карбоксилатной группой, связанной с ним в форме лиганда; C4-C25-жирной кислоты; и C4-C25-алифатического спирта или C4-C25-алифатического амина при температуре от 150 до 350°C для получения наночастицы оксида железа, указанный выше способ нуклеации через контроль температуры влечет за собой трудности контроля температуры и, таким образом, плохую воспроизводимость.

Вторым способом является синтез наночастиц малого размера посредством контроля скорости роста наночастиц, как описано в примере 8. В частности, в этом способе задерживают рост частиц для проведения промежуточной стадии реакции при росте частиц. Т.е. во втором способе также можно осуществлять контроль температуры. Напротив, по сравнению с предпочтительным способом получения по настоящему изобретению, включающим: проведение реакции комплекса железа, образованного железом в качестве центрального атома и связанной с ним C4-C25-карбоксилатной группой в форме лиганда; C4-C25-жирной кислотой; и C4-C25-алифатическим спиртом или C4-C25-алифатическим амином при температуре от 150 до 350°C для получения наночастиц оксида железа, указанный выше способ обладает тем недостатком, что трудно точно контролировать температуру реакции, и, таким образом, период роста частицы не является постоянным в течение реакции, что, в свою очередь, вызывает проблемы, такие как меньший выход и меньшая воспроизводимость.

Следующие примеры осуществляли с использованием олеата натрия, олеилового спирта и дифенилового эфира, приобретенных в TCI; гексагидрата хлорида железа (3), олеиновой кислоты (90%), 1-октадецена (90%) и 1,2-гексадекандиола, приобретенных в Aldrich; и олеиламина, приобретенного в Acros. Кроме того, для использования в Sam-Chun Chemical приобретали этанол и гексан.

Для TEM используют JEOL-2010, XRD измеряют с помощью Rigaku Ka, в качестве VSM (магнитометра с вибрирующим образцом) используют VSM-PPMS, и отношение M-T измеряют посредством VSM, одновременно повышая температуру на 5 K/мин.

Комплекс олеата железа ("олеат железа"), используемый в настоящем описании, является комплексом, получаемым проведением реакции олеата натрия с FeCl₃ способом, описываемым в J. Park et al., Nat. Mater. 2004, 4, 891. Более конкретно, 10,8 г гексагидрата хлорида железа и 36,5 г олеата натрия смешивают в 60 мл воды, 80 мл этанола и 140 мл гексана с последующей реакцией в смеси при 60°C в течение 4 часов при интенсивном перемешивании. Из продукта реакции с двумя отдельными фазами удаляли прозрачную нижнюю фазу с использованием делительной воронки. Оставшуюся коричневую органическую фазу смешивают с водой и затем снова удаляют нижнюю водную фазу. С помощью промывания удаляют водорастворимую соль в органической фазе. Указанное выше промывание повторяют три раза. Органический раствор подвергают выпариванию гексана, получая комплекс олеата железа.

Что касается анализа продуктов в следующих примерах и сравнительных примерах, то сопутствующие чертежи являются следующими.

На фиг.1 представлены изображения наночастиц оксида железа размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом, полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM), более конкретно: (a) полученное с помощью TEM изображение; (b) полученное с помощью TEM изображение в широком диапазоне; (c) полученное с помощью трансмиссионной электронной микроскопии изображение высоко разрешения (HR-TEM); и (d) микродифракционная электронограмма (SAED) выбранной области. На фиг.2 представлен спектр дифракция рентгеновских лучей (XRD) наночастиц размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом. На фиг.3 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 2 способом. На фиг.4 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 1,8 нм, синтезированных описываемым в примере 3 способом. На фиг.5 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 3,3 нм, синтезированных описываемым в примере 4 способом. На фиг.6 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 3,5 нм, синтезированных описываемым в примере 5 способом. На фиг.7 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 1,6 нм, синтезированных описываемым в примере 6 способом. На фиг.8 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 2,4 нм, синтезированных описываемым в примере 7 способом. На фиг.9 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 3,5 нм, синтезированных описываемым в примере 8 способом. На фиг.10 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 9 способом. На фиг.11: (a) представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 2,7 нм, синтезированных описываемым в примере 10 способом; (b) представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа, синтезированных описываемым в сравнительном примере 1 способом; и (c) представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа, синтезированных описываемым в сравнительном примере 2 способом. На фиг.12: (a) представлены M-H-графики при 5 K и 300 K соответственно для наночастиц размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом; (b) представлены изменения M-H-графика при 300 K для наночастиц с изменением размера частиц; (c) представлены M-T-графики при охлаждении в нулевом магнитном поле и охлаждении в магнитном поле для наночастиц размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 2 способом, соответственно; (d) представлен M-T-график для наночастиц размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом; (e) представлен M-T-график для наночастиц размером 12 нм, синтезированных описываемым в сравнительном примере 3 способом; (f) представлены M-H-графики при 5 K и 300 K соответственно для наночастиц размером 1,6 нм, синтезированных описываемым в примере 6 способом; (g) представлен M-T-график для наночастиц из примера 6; и (h) представлены M-H-графики при 5 K и 300 K соответственно для наночастиц размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 9 способом. На фиг.13 показано распределение среднечисловых гидродинамических размеров (среднее число 11,8 нм) наночастиц размером 3 нм, диспергированных в воде с использованием PEG-фосфата (PO-PEG) описываемым в примере 13 способом. На фиг.14 представлены ложные изображения при T1-режиме МРТ дисперсий, полученных сначала модификацией поверхности наночастиц оксида железа PEG-фосфатом (PO-PEG) и фосфолипид-PEG соответственно с размером частиц, и затем вторичным диспергированием наночастиц с модифицированной поверхностью в воде; в частности, в случае когда PO-PEG используют для обработки наночастиц размером 2,3 нм, 3 нм, 4 нм и 7 нм, каждый из них обозначают как 2,3 P, 3 P и 4 P соответственно; аналогично, в случае когда фосфолипид-PEG используют для обработки указанных выше наночастиц, каждую из них обозначают как 2,3 L, 3 L, 4 L и 7 L. На фиг.15 представлены результаты ложных МРТ-изображений клеток для наночастиц размером 3 нм и наночастиц размером 12 нм соответственно; в частности, на (a) представлено ложное МРТ-изображение клеток для наночастиц размером 3 нм; и на (b) представлено ложное МРТ-изображение клеток для наночастиц размером 12 нм. На фиг.16 представлены четкие контрастные изображения яремных вен, сонных артерий и дуги аорты, полученные с использованием наночастиц по настоящему изобретению, по сравнению с комплексом гадолиния Gadovist® (Bayer Schering Co.); в частности, на (a) представлено контрастное МРТ-изображение сосудов in vivo, полученное с использованием наночастиц размером 3 нм, и на (b) представлено контрастное МРТ-изображение сосудов in vivo, полученное с использованием Gadovist®. На фиг.17 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 4 нм, синтезированных описываемым в примере 20 способом. На фиг.18 представлены результаты анализа MTT для MCF-7 клеток с использованием гидрофильно-модифицированных наночастиц оксида железа по примеру 21. На фиг.19 представлены результаты анализа молекулярной массы наночастиц оксида железа посредством MALDI-TOF в примере 22, на фиг.20 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 12 нм, синтезированных описываемым в сравнительном примере 3 способом, на фиг.21 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 12 нм, синтезированных описываемым в сравнительном примере 4 способом, на фиг.22 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 7 нм, синтезированных описываемым в сравнительном примере 5 способом, на фиг.23 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 4 нм, инкапсулированных в форме агрегата с последующим негативным окрашиванием, описываемым в сравнительном примере 6 способом, и на фиг.24 представлено полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 6 нм, синтезированных по сравнительному примеру 7, и на фиг.25 представлены усиленные контрастные МРТ-изображения сосудов, полученные с использованием наночастиц размером 3 нм, покрытых глюкозо-6-фосфатом, описываемых в примере 17.

ПРИМЕР 1

Синтез наночастиц оксида железа размером 3 нм

1,8 г (2 ммоль) олеата железа, 0,57 г (2 ммоль) олеиновой кислоты и 1,61 г (6 ммоль) олеинового спирта смешивали с 10 г дифенилового эфира и помещали в круглодонную колбу. Пары удаляли из колбы вакуумированием при 80°C в течение 1 часа, затем в колбу подавали газ аргон для получении инертной атмосферы. После проведения реакции в колбе при повышении температуры до 250°C со скоростью 10°C/мин реакционный материал в ходе реакции становился черным. После повышения температуры до 250°C реакцию продолжали в течение 30 минут, получая наночастицы размером 3 нм (фиг.1 и 2). После проведения реакции продукт быстро охлаждали и затем промывали избытком ацетона. После промывания полученный преципитат диспергировали в органическом растворителе, таком как хлороформ или гексан.

ПРИМЕР 2

Синтез наночастиц оксида железа размером 2,3 нм

Синтез наночастиц размером 2,3 нм осуществляли термическим разложением в тех же условиях, как описано в примере 1, после смешивания 0,9 г (1 ммоль) олеата железа и 3,22 г (12 ммоль) олеинового спирта с 10 г дифенилового эфира без добавления олеиновой кислоты.

ПРИМЕР 3

Синтез наночастиц оксида железа размером 1,8 нм

Наночастицы размером 1,8 нм синтезировали смешиванием 0,9 г (1 ммоль) олеата железа и 3,22 г (12 ммоль) олеинового спирта с 10 г дифенилового эфира без добавления олеиновой кислоты с последующим повышением температуры до 200°C со скоростью повышения температуры 20°C/мин и проведением реакции при 200°C в течение 30 минут. Другие условия, по существу, являлись теми же, что и в примере 1.

ПРИМЕР 4

Синтез наночастиц размером 3,3 нм с использованием 1-октадецена

Наночастицы синтезировали смешиванием 1,8 г олеата железа, 0,57 г олеиновой кислоты и 1,6 г олеинового спирта с 10 г 1-октадецена с последующим повышением температуры до 250°C со скоростью повышения температуры 10°C/мин и ростом частиц при 250°C в течение 30 минут. Другие условия, по существу, являлись теми же, что и в примере 1.

ПРИМЕР 5

Синтез наночастиц размером 3,5 нм с использованием олеиламина

Наночастицы синтезировали смешиванием 1,8 г олеата железа, 0,57 г олеиновой кислоты и 1,6 г олеиламина с 10 г дифенилового эфира с последующим повышением температуры до 250°C со скоростью повышения температуры 10°C/мин и ростом частиц при 250°C в течение 30 минут. Другие условия, по существу, являлись теми же, что и в примере 1.

ПРИМЕР 6

Получение наночастиц оксида железа размером 1,6 нм

Очень малые наночастицы оксида железа синтезировали согласно известному способу синтеза (Nature Mater. 3(2004), 891), замедляя скорость роста частиц. Синтезированные частицы центрифугировали для получения очень малых наночастиц оксида железа. Для синтеза наночастиц посредством термического разложения олеата железа температура синтеза, как правило, составляет 320°C, и при этой температуре частицы быстро растут. С другой стороны, при 300°C обеспечение энергией для роста частиц является недостаточным, таким образом, скорость роста (т.е. рост частиц) снижается. Таким образом, можно получать наночастицы очень малого размера, получаемые в течение роста при 300°C, хотя их нельзя получать в ходе реакции при 320°C.

После смешивания 1,8 г (2 ммоль) олеата железа (Fe-олеата) и 0,57 г (2 ммоль) олеиновой кислоты с 10 г 1-октадецена смесь помещали в круглодонную колбу и удаляли из нее пары вакуумированием при 80°C в течение 1 часа. Затем в колбу подавали газ аргон для получения инертной атмосферы. Затем после повышения температуры до 300°C со скоростью 3,3°C/мин реакцию проводили при 300°C в течение 30 минут с последующим быстрым охлаждением продукта реакции до комнатной температуры. После этого охлажденный продукт подвергали осаждению добавлением к нему этанола при комнатной температуре, получая наночастицы оксида железа размером 1,6 нм.

ПРИМЕР 7

Получение наночастиц оксида железа размером 2,4 нм

Синтезировали наночастицы оксида железа размером 2,4 нм, замедляя скорость роста наночастиц, как описано в примере 6.

Более конкретно, после смешивания 1,8 г (2 ммоль) олеата железа (Fe-олеата) и 0,57 г (2 ммоль) олеиновой кислоты с 10 г 1-октадецена смесь помещали в круглодонную колбу и удаляли из нее пары вакуумированием при 80°C в течение 1 часа. Затем в колбу подавали газ аргон для получения инертной атмосферы. Затем после повышения температуры до 300°C со скоростью 3,3°C/мин реакцию проводили при 300°C в течение 35 минут с последующим быстрым охлаждением продукта реакции до комнатной температуры. После этого охлажденный продукт подвергали осаждению добавлением к нему этанола при комнатной температуре, получая наночастицы оксида железа размером 2,4 нм.

ПРИМЕР 8

Получение наночастиц оксида железа размером 3,5 нм

Наночастицы оксида железа малого размера синтезировали согласно известному способу синтеза (Nature Mater. 3(2004), 891) посредством снижения температуры для получения большего количества центров кристаллизации. Т.к. температура нуклеации при термическом разложении Fe-олеата составляла приблизительно 270°C, реакционные материалы дольше оставляли при указанной выше температуре 270°C, чтобы, таким образом, облегчать образование центров кристаллизации в большом количестве. Причиной этого является то, что, если образуются многочисленные центры кристаллизации, можно снижать количество атомов железа, прикрепленных к каждой частице, таким образом, можно снижать размер каждой частицы.

После смешивания 1,8 г (2 ммоль) олеата железа (Fe-олеата) и 0,57 г (2 ммоль) олеиновой кислоты с 10 г 1-октадецена смесь помещали в трехгорлую круглодонную колбу, нагревали до 270°C в инертной атмосфере и оставляли в ней в течение 20 минут для осуществления синтеза при той же температуре. После нуклеации температуру повышали до 318°C, температуры роста частиц, для ингибирования дальнейшей реакции и затем оставляли при той же температуре, т.е. 318°C, в течение 10 минут для осуществления синтеза, таким образом, получая наночастицы размером 3,5 нм.

ПРИМЕР 9

Синтез наночастиц оксида железа размером 2,3 нм

Раствор, содержащий 0,64 г олеиновой кислоты, 0,59 г 1,2-гексадекандиола и 15,81 г дифенилового эфира, очищали удалением примесей после его вакуумирования приблизительно при 70°C в течение 1 часа. Затем подавали газ аргон до образования инертной атмосферы и затем останавливали. Туда вводили 0,3 мл пентакарбонилжелеза. Посредством повышения температуры до 250°C со скоростью повышения температуры 3,3°C/мин и проведения реакции при 250°C в течение 30 минут получали наночастицы размером 2,3 нм. Другие условия, по существу, являлись теми же, что и в примере 1.

ПРИМЕР 10

Размер частиц и распределение в зависимости от скорости повышения температуры

После смешивания 1,8 г олеата железа, 0,57 г олеиновой кислоты и 1,6 г олеинового спирта с 10 г дифенилового эфира температуру повышали до 250°C со скоростью повышения температуры 20°C/мин, в смеси проводили реакцию и синтезировали наночастицы при 250°C в течение 30 минут. В результате синтезировали однородные наночастицы размером 2,7 нм. Другие условия, по существу, являлись теми же, что и в примере 1.

ПРИМЕР 11

Физико-химические свойства полученных наночастиц оксида железа

С использованием магнитометра с вибрирующим образцом (VSM) измеряли магнитные свойства наночастиц. На фиг.12 представлены графики зависимости намагниченности от величины напряженности внешнего магнитного поля (M-H) для наночастиц разных размеров 1,6, 2,3, 3 и 12 нм, синтезированных в приведенных выше примерах. Более конкретно, на фиг.12 (a) представлены M-H-графики при 5 K и 300 K соответственно, для наночастиц размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом; на (b) представлены изменения M-H-графика при 300 K для наночастиц с изменением размера частиц; на (c) представлены M-T-графики при охлаждении в нулевом магнитном поле и охлаждении в магнитном поле для наночастиц размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 2 способом, соответственно; на (d) представлен M-T-график для наночастиц размером 3 нм, синтезированных описываемым в примере 1 способом; на (e) представлен M-T-график для наночастиц размером 12 нм, синтезированных описываемым в сравнительном примере 3 способом; на (f) представлены M-H-графики при 5 K и 300 K соответственно, для наночастиц размером 1,6 нм, синтезированных описываемым в примере 6 способом; на (g) представлен M-T-график для наночастиц размером 1,6 нм, синтезированных описываемым в примере 6 способом; и (h) представлены M-H-графики при 5 K и 300 K соответственно, для наночастиц размером 2,3 нм, синтезированных описываемым в примере 9 способом.

Согласно фиг.12, наночастицы оксида железа размером 12 нм при 5 K являлись ферримагнитными, проявляя коэрцитивность и остаточную намагниченность. Наночастицы оксида железа размером 3 нм также являлись ферримагнитными, проявляя небольшую коэрцитивность, а также остаточную намагниченность. Однако наночастицы размером 2,3 нм не демонстрировали ни остаточную намагниченность, ни коэрцитивность при этой температуре. Т.е. эти наночастицы оставались в парамагнитном состоянии до температуры 5 K. Это неожиданный случай для магнитных наночастиц с суперпарамагнитными свойствами. Указанные выше условия можно четко определять из графика зависимости намагниченности от температуры (M-T) и, например, можно видеть, что температура слипания составляет 200 K для наночастиц размером 12 нм и 10 K для наночастиц размером 3 нм, однако температуру слипания наночастиц размером 2,5 нм не определяли даже при 5 K. Температура слипания означает температуру перехода, при которой физические свойства, такие как суперпарамагнитные, ферромагнитные и/или ферримагнитные свойства, изменяются, и она может являться пропорциональной объему частиц. Таким образом, при снижении размера частиц температура слипания также может снижаться. Например, если размер частиц снижается до 3 нм или менее, температуру слипания не обнаруживают даже при 5 K. В результате можно видеть, что частица размером 3 нм является парамагнитной или имеет подобные парамагнитным физические свойства. Это свойство впервые обнаружили на наночастицах оксида железа, имеющих структуру феррита, и, т.к. оно схоже с парамагнитным свойством, его обозначают как "псевдопарамагнитное свойство", отличающееся от суперпарамагнитного свойства. Т.к. наночастицы оксида железа малого размера 3 нм или менее в большинстве своем являются суперпарамагнитными наночастицами и/или имеют неупорядоченные спины на своей поверхности, эти частицы могут быть похожи на парамагнитные. Более конкретно, хотя указанные выше наночастицы не являются парамагнитными, они демонстрируют свойства, подобные парамагнитным, таким образом, являясь псевдопарамагнитными.

Для анализа накладывали M-H-графики при комнатной температуре (фиг.12b). Можно видеть, что намагниченность снижается со снижением размера частиц. Причиной этого можно считать то, что когда частица меньше, анизотропная энергия снижается, что, в свою очередь, делает возможным частое возникновение так называемой релаксации Неэля, и, в общем, частицы имеют низкую намагниченность для снижения энергии Зеемана, таким образом, повышая тепловую флуктуацию. Однако неожиданно обнаруживали, что различие в магнитных свойствах значительно выше между частицей размером 3 нм и частицей размером 2,3 нм несмотря на малое изменение размера. Указанный выше результат можно интерпретировать с помощью эффекта переворачивания спина (spin-canting effect) (J.M.D. Coey, Phys. Rev. Lett. 1971, 27, 1140). Например, магнитные наночастицы, как правило, имеют меньшую намагниченность, чем частицы в глубине. Причиной этого является то, что: поверхностные атомы находятся в ином окружении, чем атомы в глубине, таким образом, направление спина поверхностных атомов имеет иной угол, чем у атомов в глубине, что, в свою очередь, снижает общий угол спина и, таким образом, снижает намагниченность. Это относится к описываемому выше эффекту переворачивания спина. Альтернативно, Linderoth оценил толщину поверхности, где действует эффект переворачиваемости спина, приблизительно как 0,9 нм (S. Linderoth et al., J. Apl. Phys. 1994, 75, 6583). Согласно указанному выше наночастица размером 2,3 нм может включать приблизительно 1,0% ядерной части относительно общего объема частицы, на что не влияет эффект переворачивания спина.

С другой стороны, наночастица размером 3 нм может включать приблизительно 6,4% ядерной части в частице. Таким образом, можно считать, что различие в намагниченности является относительно большим.

Согласно вычислениям Linderoth, наночастица размером 1,6 нм, на которую, почти на всю, влияет spin-canting surface, проявляет типичные парамагнитные свойства, где зависимость M-T является линейной при комнатной температуре (фиг.12f). Кроме того, можно видеть, что насыщение крупномасштабного магнитного поля не проходит вплоть до значений крупномасштабного магнитного поля в 5 K.

Даже если наночастицы по настоящему изобретению, по существу, являются наночастицами оксида железа, имеющими структуру феррита (фиг.2), они обладают скорее парамагнитными или псевдопарамагнитными свойствами, чем суперпарамагнитными. Таким образом, указанные выше наночастицы можно применять для использования в качестве контрастного вещества для T1-режима МРТ.

ПРИМЕР 12

Гидрофильная модификация наночастиц оксида железа с использованием фосфолипид-PEG

10 мг наночастиц оксида железа размером 3 нм, полученных в примере 1, диспергировали в 10 мл хлороформа, а затем к дисперсии добавляли 10 мг фосфолипид-PEG {1,2-дистеарил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N[метокси(полиэтиленгликоль-2000)]}. После перемешивания медленно выпаривали хлороформ с последующим добавлением воды и в конечном итоге получали водный коллоидный раствор хорошо диспергированных наночастиц оксида железа. Гидродинамический размер гидрофильной наночастицы составлял 15 нм, как измеряли с помощью DLS (динамического рассеяния света).

ПРИМЕР 13

Гидрофильная модификация наночастиц оксида железа с использованием PEG-фосфата (PO-PEG)

0,15 г POCl₃ и 6 г метилового эфира полиэтиленгликоля (Mn:2000) добавляли к 7 мл раствора тетрагидрофурана (THF), перемешивая в течение 4 часов. PO-PEG получали после удаления из него THF. 10 мг наночастиц оксида железа размером 3 нм с олеатом на их поверхности, полученных в примере 1, и 100 мг PO-PEG смешивали с этанолом, плотно закрывали и перемешивали при 70°C в течение 4 часов, для обмена их лигандов. Полученный продукт три раза промывали N-гексаном и после выпаривания этанола добавляли воду к остатку для его диспергирования, таким образом, получая коллоидные растворы частиц с гидродинамическим размером 11,8 нм (фиг.13).

ПРИМЕР 14

МР-релаксация гидрофильно-модифицированных наночастиц оксида железа in vitro

Для определения МР-контрастирующей способности коллоидных гидрофильных наночастиц оксида железа гидрофильно-модифицированных способом, описываемым в примерах 13 и 17 и сравнительном примере 6 соответственно, получали несколько ложных изображений с использованием концентраций 0,5, 0,25, 0,13, 0,063, 0,031, 0,016, 0,0078 и 0,0039 мг/мл с использованием наночастиц оксида железа разных размеров: 1,6 нм (пример 6), 2,4 нм (пример 7), 3 нм (пример 1), 4 нм (пример 20) и 7 нм (сравнительный пример 5) соответственно. МР-изображение при 1,5 T получали с использованием МР-сканнера (GE Health Care, Signa Excite), оборудованного головной катушкой. Значение T1 получали с помощью режима IR-FSE со следующими параметрами: TR/TE/T1=4000 мс/8,4 мс/50-4000 мс. Значение T2 получали с помощью режима CPMG со следующими параметрами: TR/RE=5000 мс/16-200 мс.

В случае МР-изображения при 4,7 T использовали градиентную катушку BGA12 (Biospec 47/40, Bruker Biospin MRI GmbH) для анализа осуществления релаксации. Более конкретно, после анализа содержания железа в порошке нанокапсул оксида железа-PLGA посредством ICP-AES, этот порошок подвергали измерению при разных концентрациях 2,1, 0,5, 0,25 и 0,12 5 мг/л в 0,01M PBS (фосфатно-солевом буфере, pH 7,4). Время T2-релаксации измеряли с помощью многосрезового импульсного режима мультиэхо (MSME), где используемые в настоящем описании параметры могут являться следующими:

TR (время повторения) = 10000 мс; TEC (время задержки эхоимпульса) = от 8 до 2048 мс (256 раз с интервалами 8 мс); FOV = 60×40 мм; разрешение = 0,234×0,156 мм/пиксель; толщина среза = 1 мм; количество повторений = 1; размер матрицы = 128×128.

В следующей таблице 1 представлены r1, r2 и их отношение для наночастиц разных размеров при 1,5 T и 4,7 T. В таблице 1 представлены значения релаксации для ложных МРТ-изображений при 1,5 тесла в зависимости от размера наночастиц. Наибольшее значение r1 составляет около 7 нм, но различие между значениями r1 не столь велико. Напротив, если размер частиц снижается, значение r2 значительно снижается. В результате r2/r1 также может значительно снижаться. Например, наночастицы размером 1,6 нм могут иметь очень небольшое отношение r2/r1, т.е. приблизительно 1,47 в магнитном поле 1,5 T. Небольшое r2/r1 свидетельствует о том, что соответствующие наночастицы подходят для использования в качестве контрастного вещества для T1-режима МРТ. Кроме того, согласно сравнительному примеру 6, указанному в таблице 1, можно видеть, что, даже если размер каждой наночастицы оксида железа составляет 4 нм, r2/r1 чрезмерно возрастает, если агрегирует множество наночастиц (фиг.23), что нежелательно для контрастного вещества для T1-режима.

Таблица 1 Модификация поверхности Лиганд Средний размер частиц (способ получения) r1 r2 r2/r1 Магнитное поле (T) Пример 13 PO-PEG 1,6 нм
(Пример 5) 0,146 0,215 1,47 1,5 Пример 13 PO-PEG 2,4 нм
(Пример 7) 0,360 1,75 4,86 1,5 Пример 13 PO-PEG 3 нм
(Пример 1) 1,22 6,31 5,17 1,5 Пример 13 PO-PEG 4 нм
(Пример 20) 1,78 14,9 8,37 1,5 Пример 17 Глюкозо-6-фосфат 3 нм
(Пример 1) 3,5 14,8 4,2 4,7 Пример 13 PO-PEG 7 нм
(Сравнительный пример 5) 4,28 44,1 10,3 1,5 Пример 13 PO-PEG 12 нм
(Сравнительный пример 3) 1,63 70,9 43,5 1,5 Сравнительный пример 6 PLGft 4 нм
(гидродинамический диаметр: 117 нм)
(Пример 20) 0,095 99,4,5 1053,3 4,7

ПРИМЕР 15

МР-томография клеток

T1-взвешенные МР-изображения in vitro клеток MCF-7, инкубированных с различными концентрациями наночастиц (0,25, 100 мкг Fe/мл), получали на МР-сканнере при 1,5 T. Значительное усиление сигнала T1 наблюдали для клеток, меченных 25 и 100 мкг Fe/мл наночастиц размером 3 нм, покрытых PO-PEG, в то время как немеченые клетки не были яркими (фиг.15a). Хотя наноструктурные материалы, как правило, кластеризуются в эндосоме, наночастицы размером 3 нм обеспечивали T1-контрастный эффект не только в деионизированной воде, но также и в клеточном окружении в результате их низкой объемной анизотропии. Напротив, на ложном T1-взвешенном МР-изображении клеток клетки, меченные частицами размером 12 нм, демонстрировали гораздо меньшее усиление сигнала; при высокой концентрации они даже были затемнены (фиг.15b). Ослабленный T1-сигнал клеток, инкубированных с наночастицами оксида железа размером 12 нм, видимо, является следствием эффекта магнитной восприимчивости по причине сильного магнитного момента агрегатов магнитных наночастиц большого размера.

ПРИМЕР 16

МР-изображение in vivo наночастиц оксида железа размером 3 нм с PO-PEG на поверхности

Изображения при динамической МР-ангиографии с временным разрешением и 3D-FLASH-изображения на крысах получали с использованием катушки для запястья на МРТ-сканнере при 3 T до и после инъекции наночастиц оксида железа размером 3 нм, покрытых PO-PEG, полученных согласно примеру 13 (доза: 2,5 мг Fe/кг). Изображения перед введением контрастного вещества вычитали из изображений после введения контрастного вещества и полученные изображения реконструировали с использованием протокола проекции максимальной интенсивности (MIP) с помощью OsiriX (версия 3.8.1; 32bit; OsiriX foundation, Geneva). Динамическую МР-ангиографию с временным разрешением проводили с интерполяционным временным разрешением 1,25 секунд и следующими параметрами: угол поворотов спинов = 20, ETL=1, TR=3,1 мс, TE=1,13 мс, область сканирования FOV=75×140 мм², матрица = 256×106, толщина срезов/пропуск = 2,5 мм/0 мм, и NEX=1. Параметры 3D-FLASH-изображения являлись следующими: угол поворотов спинов = 25, ETL=1, TR=25 мс, TE=5,1 мс, область сканирования FOV=110×65 мм, матрица = 256×169, толщина среза/пропуск = 1,0 мм/0 мм, и NEX=2.

На фиг.16a на T1-взвешенных МР-изображениях кровеносные сосуды являлись яркими, свидетельствуя о том, что наночастицы размером 3 нм могут усиливать T1-релаксацию в кровотоке. Яркий сигнал кровеносного сосуда можно поддерживать в течение 1 часа при динамической МР-ангиографии с временным разрешением (не показано на фиг.16), это свидетельствует о том, что наночастицы размером 3 нм можно использовать в качестве контрастного вещества для контрастно-усиленной МРТ-визуализации кровотока в T1-режиме.

Визуализация кровотока важна в клинической МР-визуализации, т.к. с помощью нее можно определять инфаркт миокарда, почечную недостаточность, атеросклеротические бляшки, тромбоз и ангиогенез в опухолях. Длительная визуализация кровотока важна для визуализации в установившемся состоянии, являющейся критической для получения изображений с высоким разрешением. Например, изображение легочной артерии можно четко получать посредством визуализации в установившемся состоянии с использованием USP10 (ультрадисперсного суперпарамагнитного оксида железа). Наночастицы размером 3 нм могут являться хорошим контрастным веществом для T1-режима для визуализации в установившемся состоянии, т.к. благодаря оптимальному размеру частиц они имеют длительное время полужизни в кровотоке.

Частицы не должны являться столь большими, чтобы избегать захвата ретикулоэндотелиальной системой, и не должны быть столь маленькими, чтобы предотвращать экскрецию частиц почками. В отличие от наночастиц размером 3 нм комплекс гадолиния Gadovist (Bayer Schering Pharma), общеупотребительный в качестве контрастного вещества для T1-режима МРТ, имеет короткое время полужизни в кровотоке. Непосредственно после инъекции Gadovist МР-изображение in vivo демонстрировало высокий контрастный эффект по причине своей высокой релаксивности, но яркий сигнал быстро пропал через 2 минуты (фиг.16b).

ПРИМЕР 17

Гидрофильная модификация наночастиц оксида железа с использованием моносахарид-фосфата и МР-визуализация in vivo

Наночастицы оксида железа, покрытые олеиновой кислотой, получали описываемым в примере 1 способом.

100 мг 3 нм наночастиц оксида железа диспергировали в 8 мл THF (тетрагидрофурана) и смешивали с водным раствором 200 мг глюкозо-6-фосфата натрия в 2 мл воды. Раствор смеси перемешивали и проводили реакцию при 60°C в течение 4 часов. После охлаждения отделяли верхнюю фазу THF раствора смеси и к нижней фазе наночастиц оксида железа, покрытых глюкозо-6-фосфатом, добавляли воду для получения стабильного коллоидного раствора наночастиц оксида железа.

Гидродинамический размер наночастиц с глюкозо-6-фосфатом на поверхности составлял 3,8 нм, как измеряли способом динамического рассеяния света (Malvern Zetasizer Nano ZS).

МР-визуализация с использованием наночастиц размером 3 нм, покрытых глюкозо-6-фосфатом, осуществляли согласно примеру 16.

Как показано на фиг.25, кровеносные сосуды являлись яркими на T1-взвешенном МР-изображении. Яркий сигнал крови можно поддерживать в течение 2 часов, но после 24 часов яркий сигнал не наблюдали. Это означает, что композиция наночастиц размером 3 нм, покрытых глюкозо-6-фосфатом, может являться хорошим контрастным веществом для МРТ кровотока.

ПРИМЕР 18

Гидрофильная модификация наночастиц оксида железа с использованием лимонной кислоты

Наночастицы оксида железа, покрытые олеиновой кислотой, получали способом, описываемым в примере 1.

100 мг наночастиц оксида железа размером 3 нм диспергировали в 8 мл THF (тетрагидрофурана) и смешивали с водным раствором 400 мг цитрата натрия в 2 мл воды. Раствор смеси перемешивали и проводили реакцию при 60°C в течение 4 часов. После охлаждения отделяли верхнюю фазу THF раствора смеси и к нижней фазе наночастиц оксида железа, покрытых лимонной кислотой, добавляли воду для получения стабильного коллоидного раствора наночастиц оксида железа.

Гидродинамический размер наночастиц с лимонной кислотой на поверхности составлял 10 нм, как измеряли способом динамического рассеяния света (Malvern Zetasizer Nano ZS).

ПРИМЕР 19

Гидрофильная модификация наночастиц оксида железа с использованием бетаина

Наночастицы оксида железа, покрытые олеиновой кислотой, получали способом, описываемым в примере 1.

150 мг наночастиц оксида железа размером 3 нм диспергировали в 25 мл N-гексана и смешивали с 600 мг бетаина (2-(триметилазаниумил)ацетат гидрохлорид) в 25 мл этанола. Раствор смеси перемешивали и проводили реакцию при 50°C в течение 8 часов. После охлаждения обменявшиеся лигандами наночастицы отделяли от растворителя центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. К обменявшимся лигандами наночастицам, покрытым бетаином, добавляли воду для получения стабильного коллоидного раствора наночастиц оксида железа.

Гидродинамический размер наночастиц с бетаином на поверхности составлял 7 нм, как измеряли способом динамического рассеяния света (Malvern Zetasizer Nano ZS).

ПРИМЕР 20

Синтез наночастиц оксида железа размером 4 нм

Согласно способу, описываемому в примере 6, наночастицы оксида железа размером 4 нм синтезировали посредством контроля скорости роста частиц. Более конкретно, наночастицы размером 4 нм синтезировали следующим образом: после смешивания 1,8 г олеата железа и 0,57 г олеиновой кислоты с 10 г 1-октадецена температуру повышали до 318°C со скоростью повышения температуры 10°C/мин с последующим проведением реакции при 318°C в течение 30 минут и затем быстрым охлаждением продукта реакции до комнатной температуры. После этого охлажденный продукт подвергали осаждению добавлением к нему этанола при комнатной температуре, получая наночастицы оксида железа размером 4 нм.

ПРИМЕР 21

Анализ MTT гидрофильно-модифицированных наночастиц оксида железа

Во влажной атмосфере при 37°C с концентрацией CO₂ 5% выращивали клетки линии рака молочной железы человека, т.е. MCF-7, на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, Welgene), содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку (FBS) и 1% пенициллин/стрептомицин (100 ед./мл и 100 мкг/мл соответственно, Gibco).

Для исследования внутриклеточного захвата клетки MCF-7 инкубировали на 8-луночном предметном стекле с последующим смешиванием культивируемых клеток с наночастицами оксида железа и размером 3 нм, и размером 12 нм с поверхностью, модифицированной PO-PEG. Через 24 часа клетки промывали PBS и затем фиксировали с использованием 4% пара-формальдегида. С помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (LSM 510, Carl Zeiss, Germany) получали флуоресцентные изображения.

Для анализа выживания и роста клеток в присутствии наночастиц осуществляли анализ с использованием 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида (MTT, Sigma). С этой целью клетки MCF-7 выращивали на 200 мкл среды в течение 1 дня. Выращенные клетки смешивали с наночастицами и размером 3 нм, и размером 12 нм, покрытых PO-PEG, в различных концентрациях (например, 0, 1,56, 3,13, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкг Fe/мл). После культивирования смеси в течение ночи культивируемый материал смешивали со средой, содержащей 0,1 мкг/мл MMT в течение 1 часа. После этого среду удаляли и осажденный формазан растворяли в ДМСО, для определения жизнеспособности клеток определяли поглощение при 540 нм с использованием микроспектрофотометра VerseMaxTM для чтения планшетов (Molecular Devices).

Согласно фиг.18 наночастицы размером и 4 нм, и 10 нм демонстрировали выживаемость приблизительно 100% клеток MCF-7 до концентрации 100 мкг Fe/мл. Это означает, что наночастицы обоих размеров, покрытые PO-PEG, не являлись токсичными для клеток в пределах указанной концентрации.

ПРИМЕР 22

MALDITOF-масс-спектрометрия

10 мг/мл наночастиц оксида железа и 10 мг/мл 9-нитроантрацена, используемого в качестве матрицы, растворяли в хлороформе. Наночастицы и 9-нитроантрацен смешивали в отношении 1:100 и только каплю смеси добавляли на субстрат LDI и затем испаряли в атмосферу. Субстрат помещали в MALDI-TOF-спектрометр (Voyager-DE^TM STR Biospectrometry Workstation, Applied Biosystems Inc.) с последующим облучением лазером для измерения массы наночастиц в диапазоне от 500 до 300000 Да в линейном режиме и модели детектирования катионов соответственно. На фиг.19 представлен результат анализа молекулярной массы наночастиц с помощью MALDI-TOF: (a) представляет собой полученное с помощью TEM изображение наночастиц оксида железа размером 1,6 нм; на (b) представлены результаты анализа наночастиц оксида железа размером 1,6 нм с помощью MALDI-TOF, где наночастицы имеют молекулярную массу 9000 Да; (c) представляет собой полученное с помощью TEM изображение наночастицы оксида железа размером 2,4 нм; на (d) представлены результаты анализа наночастиц оксида железа размером 2,4 нм с помощью MALDI-TOF, где наночастицы имеют молекулярную массу 65000 Да; и на (e) представлены результаты анализа массы ядерной части наночастиц оксида железа размером 1,6 нм с помощью термогравиметрического анализа (TGA), где масса ядра составляет 35,8%, и это означает, что каждая частица размером 1,6 нм имеет ядерную фракцию 35,8%, таким образом, молекулярная масса ядра составляет 3330 Да.

ПРИМЕР 23

Гидрофильная модификация наночастиц оксида железа с использованием глюкозо-6-фосфат-этаноламина

ПРИМЕР 23-1

Синтез глюкозо-6-фосфат-этаноламина

1 г глюкозо-6-фосфата натрия, 0,68 г EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорида) и 0,4 г NHS (N-гидроксисукцинимида) смешивали с 10 мл буферного раствора MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислотой). Раствор смеси перемешивали и проводили реакцию при 30°C в течение 30 минут. После проведения реакции 0,22 мл этаноламина (2-аминоэтанола) смешивали с раствором, затем проводили реакцию при 30°C в течение 12 часов. Глюкозо-6-фосфат-этаноламин получали после удаления буферного раствора MES.

ПРИМЕР 23-2

Гидрофильная модификация наночастиц оксида железа с использованием глюкозо-6-фосфатэтаноламина

Наночастицы оксида железа, покрытые олеиновой кислотой, получали способом, описываемым в примере 1.

100 мг наночастиц оксида железа размером 3 нм диспергировали в 10 мл THF (тетрагидрофурана) и смешивали с водным раствором 300 мг глюкозо-6-фосфат-этаноламина в 2 мл воды. Раствор смеси перемешивали и проводили реакцию при 60°C в течение 4 часов. После охлаждения отделяли верхнюю фазу THF раствора смеси и к нижней фазе наночастиц оксида железа, покрытых глюкозо-6-фосфат-этаноламином, добавляли воду для получения стабильного коллоидного раствора наночастиц оксида железа.

Гидродинамический размер определяли с использованием наночастиц размером 3 нм, покрытых глюкозо-6-фосфат-этаноламином, для получения стабильного коллоидного раствора наночастиц железа. Гидродинамический размер наночастиц с глюкозо-6-фосфат-этаноламином на поверхности составлял 8 нм, как измеряли способом динамического рассеяния света (Malvern Zetasizer Nano ZS).

ПРИМЕР 24

Гидрофильная модификация наночастиц оксида железа с использованием глюкозо-6-фосфат-PEG

ПРИМЕР 24-1

Синтез глюкозо-6-фосфат-PEG

1 г глюкозо-6-фосфата натрия, 0,68 г EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорида) и 0,4 г NHS (N-гидроксисукцинимида) смешивали с 10 мл буферного раствора MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислотой). Раствор смеси перемешивали и проводили реакцию при 30°C в течение 30 минут. После проведения реакции 0,23 мл диэтиламина смешивали с раствором, затем проводили реакцию при 30°C в течение 12 часов. После проведения реакции раствор смешивали с раствором EDC-активированного mPEG-COOH, полученного смешиванием 17,75 г mPEG-COOH (метокси-полиэтиленгликоль-карбоксила, Mn:5000), 1,361 г EDC и 0,817 г NHS с 40 мл буферного раствора MES. Раствор смеси перемешивали и проводили реакцию при 30°C в течение 24 часов. После удаления побочного продукта посредством диализа, после удаления DIW получали глюкозо-6-фосфат-PEG.

ПРИМЕР 24-2

Гидрофильная модификация наночастиц оксида железа с использованием глюкозо-6-фосфат-PEG

Наночастицы оксида железа, покрытые олеиновой кислотой, получали способом, описываемым в примере 1.

100 мг наночастиц оксида железа размером 3 нм диспергировали в 10 мл THF (тетрагидрофурана) и смешивали с водным раствором 1 г глюкозо-6-фосфат-PEG в 2 мл воды. Раствор смеси перемешивали и проводили реакцию при 60°C в течение 4 часов. После охлаждения отделяли верхнюю фазу THF раствора смеси и к нижней фазе наночастиц оксида железа, покрытых глюкозо-6-фосфат-PEG, добавляли воду для получения стабильного коллоидного раствора наночастиц оксида железа.

Гидродинамический размер определяли с использованием наночастиц размером 3 нм, покрытых глюкозо-6-фосфат-PEG, для получения стабильного коллоидного раствора наночастиц железа. Гидродинамический размер наночастиц с глюкозо-6-фосфат-PEG на поверхности составлял 14 нм, как измеряли способом динамического рассеяния света (Malvern Zetasizer Nano ZS).

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1

Размер частиц и распределение в зависимости от скорости повышения температуры

После смешивания 1,8 г олеата железа, 0,57 г олеиновой кислоты и 1,6 г олеинового спирта с 10 г дифенилового эфира температуру повышали до 250°C со скоростью повышения температуры 3,3°C/мин и в смеси проводили реакцию при 250°C в течение 30 минут. В результате синтезировали неоднородные наночастицы, включающие частицы размером почти 6 нм. Другие условия, по существу, являлись теми же, что и в примере 1.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 2

Размер частиц и распределение в зависимости от скорости повышения температуры

После смешивания 1,8 г олеата железа, 0,57 г олеиновой кислоты и 1,6 г олеинового спирта с 10 г дифенилового эфира температуру повышали до 250°C со скоростью повышения температуры 5°C/мин и в смеси проводили реакцию при 250°C в течение 30 минут. В результате синтезировали неоднородные наночастицы, включающие частицы размером почти 6 нм. Другие условия, по существу, являлись теми же, что и в примере 1.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 3

Синтез наночастиц размером 12 нм

Наночастицы размером 12 нм синтезировали тем же способом, как описано в J. Park et al., Nat. Mater. 2004, 4, 891. Более конкретно, после смешивания 1,8 г олеата железа и 0,28 г олеиновой кислоты с 10 г 1-октадецена повышали температуру до 318°C со скоростью повышения температуры 3,3°C/мин, проводили реакцию и синтезировали наночастицы при 318°C в течение 30 минут. На фиг.20 представлено полученное при исследовании с помощью TEM изображение синтезированных наночастиц.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 4

Синтез наночастиц оксида железа с использованием бегеновой кислоты

Чтобы ингибировать избыточный рост наночастиц стерическим торможением и попытаться получить частицы малого размера, вместо небольшой жирной кислоты использовали поверхностно-активное вещество с объемными группами. При синтезе добавляли бегеновую кислоту, имеющую более высокое стерическое торможение, чем олеиновая кислота, таким образом, пытаясь ингибировать избыточный рост наночастиц.

Что касается синтеза, 1,8 г олеата железа и 0,34 г бегеновой кислоты смешивали с 10 г 1-октадецена с последующим повышением температуры до 318°C со скоростью повышения температуры 3,3°C/мин и проведением реакции в смеси при 318°C в течение 30 минут. В результате получали наночастицы оксида железа размером 12 нм, и этот размер, по существу, равен размеру наночастиц, получаемых с использованием олеиновой кислоты с относительно небольшим стерическим торможением. В результате подтверждали, что размер наночастиц оксида железа не контролируют с использованием стерического торможения в случае использования термического разложения олеата железа. Фиг.21 представляет собой полученное при наблюдении с помощью TEM изображение синтезированных наночастиц.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 5

Синтез наночастицы размером 7 нм

Наночастицы размером 7 нм синтезировали смешиванием 1,8 г олеата железа и 0,57 г олеиновой кислоты с 10 г 1-октадецена с последующим повышением температуры до 318°C со скоростью повышения температуры 5°C/мин и проведением реакции в смеси при 318°C в течение 30 минут. На фиг.22 представлено полученное при наблюдении с помощью TEM изображение синтезированных наночастиц.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 6

Получение гидрофильно-модифицированных капсул, включающих агрегаты наночастиц оксида железа размером 4 нм

После диспергирования 40 мг наночастиц оксида железа размером 4 нм и 40 мг сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA) в растворе этилацетата дисперсию смешивали с 4 мл раствора Pluronic® F127 (BASF Corporation, бифункциональный блок-сополимер) и перемешивали, получая капсулы. В результате наблюдения с помощью TEM (фиг.23) обнаруживали, что некоторые агрегаты, состоящие из наночастиц, присутствуют в инкапсулированном состоянии. Согласно измерениям с использованием динамического рассеяния света (DLS) (производитель: Malven) наночастицы имеют гидродинамический размер (z-среднее) 117 нм.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 7

Синтез с использованием 1,2-гексадекандиола

1,8 г олеата железа, 0,57 г олеиновой кислоты и 1,55 г 1,2-гексадекандиола смешивали с 10 г дифенилового эфира с последующим повышением температуры до 250°C со скоростью повышения температуры 10°C/мин и проведением реакции в смеси при 250°C в течение 30 минут для синтеза наночастиц. Другие условия, по существу, являлись теми же, что и в примере 1. В результате наблюдения с помощью TEM обнаруживали, что синтезировали немного неоднородные наночастиц размером 6 нм. В случае когда синтез осуществляли заменой олеилового спирта 1,2-гексадекандиолом, имеющим две гидроксильные группы, не получали наночастицы малого размера приблизительно 4 нм, хотя термическое разложение можно проводить при низкой температуре (фиг.24).

Хотя настоящее изобретение описано в отношении вариантов осуществления, конкретных примеров и сопутствующих чертежей, они приведены только для общего понимания, и настоящее изобретение особым образом ими не ограничено. Таким образом, специалистам в этой области очевидно, что возможны модификации и варианты, отличающиеся от указанных выше.

Таким образом, сущность настоящего изобретения не ограничена указанными выше вариантами осуществления, в объем настоящего изобретения можно включать различные изменения и модификации, как определено в формуле изобретения и ее эквивалентах.

Изобретение относится к способу получения парамагнитных наночастиц оксида железа. Заявленный способ включает взаимодействие комплекса железа, содержащего железо в качестве центрального атома и карбоксилатную группу, имеющую от 10 до 22 атомов углерода, связанную с центральным атомом в форме лиганда; С10-С22-жирной кислоты и С10-С22-алифатического спирта или С10-С22-алифатического амина с получением наночастиц оксида железа. Получение наночастиц оксида железа выполняется путем повышения температуры от комнатной температуры до температуры от 200 до 250°C со скоростью повышения температуры 5°C/мин или более и проведением реакции при температуре от 200 до 250°C в течение периода времени от 5 до 60 минут. Изобретение обеспечивает получение наночастиц оксида железа с размерами 4 нм и менее, которые применимы в качестве контрастного вещества для Т1-режима МРТ. 6 з.п. ф-лы, 1 табл., 25 ил., 31 пр.

1. Способ получения наночастиц оксида железа, включающий: взаимодействие комплекса железа, содержащего железо в качестве центрального атома и карбоксилатную группу, имеющую от 10 до 22 атомов углерода (′′С10-С22′′), связанную с центральным атомом в форме лиганда; С10-С22-жирной кислоты и С10-С22-алифатического спирта или С10-С22-алифатического амина с получением наночастиц оксида железа, где получение наночастиц оксида железа выполняется путем повышения температуры от комнатной температуры до температуры от 200 до 250°C со скоростью повышения температуры 5°C/мин или более и проведением реакции при температуре от 200 до 250°C в течение периода времени от 5 до 60 минут.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий диспергирование преципитата в органическом растворителе, где преципитат получают охлаждением и промыванием описываемых выше наночастиц.

3. Способ по п.1, где размер наночастиц оксида железа составляет 4 нм или менее.

4. Способ по п.1, где комплекс железа является олеатом железа.

5. Способ по п.1, где жирная кислота и алифатический спирт являются олеиновой кислотой и олеиловым спиртом соответственно, в то время как алифатический амин является олеиламином.

6. Способ по п.1, где скорость повышения температуры составляет 10°C/мин или более.

7. Способ по п.1, где размер наночастиц оксида железа контролируют путем регулирования молярного отношения жирной кислоты и алифатического спирта или алифатического амина.