СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОЗМАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2015 года по МПК C07C67/52 C07C67/56 

Описание патента на изобретение RU2541542C2

Изобретение относится к фармацевтическому производству и касается способа получения розмариновой кислоты.

Розмариновая кислота - ([[3-(3,4-дигидрофосфат)-1-косо-2E-пропенил]коси]-3,4-пропионовая кислота) широко используется в фармакологии, парафармацевтической промышленности для производства лекарственных средств и биологически активных добавок к пище. Она имеет низкую токсичность, быстро выводится из кровотока [Petersen M., Simmonds M.S.J. Rosmarinic acid // Phytochemistry, 2003, V.62, №2, P.121-125]. Розмариновая кислота обладает высокой противовоспалительной [Al-Sereiti M.R., Abu-Amer K.M., Sen P. Pharmacology of rosemary (Rosmarinus officinalis Linn. ) and its therapeutic potentials // Indian J. Exper. Biol. 1999. №37. P.124-130], антимутагенной [Santamaria L., Tateo F., Bianchi A., Bianchi L. Rosmarinus officinalis extract inhibits as antioxidant mutagenesis by 8-methoxypsoralen (8-MOP) and benzo[a]pyrene (BP) in Salmonella typhimurium // Med. Biol. Environ. 1987. №15. P.97-101], противоопухолевой, антипролиферативной [Makino T., Ono T., Muso E., Yoshida H., Honda G., Sasayama S. Inhibitory effects of rosmarin ic acid on the proliferation of cultured murine mesangial cells // Nephrol Dial Transplant. 2000. №15. P.1140-1145] и антициклооксигеназной [Patrick P., Kalidas S. Inhibitory effects of rosmarinic acid extracts on porcine pancreatic amylase in vitro // Asia Pacific J. Clin. Nutr. 2004. V.13. №1. P.101-106], антиаллергенной [Ito H., Miyazaki T., Ono M., Sakurai H. Antiallergic activities of rabdosiin and its related compounds: chemical and biochemical evaluations // Bioorganic and Medicinal Chemistry. 1998. V.6. №7. P.1051-1056], антидепрессантной [Takeda H., Tsuji M., Matsumiya T., Kubo M. Identification of rosmarinic acid as a novel antidepressive substance in the leaves of Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo (Perillae Herba) // Jpn. J. Neuropsychopharmacol. 2002. №22. P.15-22], антивирусной [Dimitrova Z., Dimov B., Manolova N., Pancheva S., Ilieva D., Shishkov S. Antiherpes effect of Melissa officinalis L. extracts // Acta Microbiol Bulg. 1993. V.29. P.65-72] активностью, в том числе против вируса иммунодефицита человека [Mazumder A., Neamati N., Sunder S., Schulz J., Pertz H., Eich E., Pommier V. Curcumin analogues with altered potencies against hiv-1 integrase as probes for biochemical mechanisms of drug action // J. Med. Chem. 1997. V.40. P.3057-3063]. Розмариновая кислота является одним из эффективных натуральных антиоксидантов [Malencic D.J., Gasic O., Popovic M., Boza P. Screening for antioxidant properties of Salvia reflexa Hornem // Phytother. Res. 2000. V.14. P.546-548] и может защищать от свободнорадикальных патологий, таких как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, онкологические заболевания, лучевая болезнь [Lu Y., Foo L.Y. Polyphenolics of Salvia - a review // Phytochemistry. 2002. V.75. P.197-202]. Розмариновая кислота входит в состав композиций, используемых для лечения сердечно-сосудистых заболеваний [RU 2328300 C2, 2008.07.10], кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваниий [RU 2006136529, 2008.04.27]. Розмариновая кислота применяется в косметическом производстве [Petersen M., Simmonds M.S.J. Rosmarinic acid // Phytochemistry. 2003. V.62, №2. P.121-125].

Традиционными источниками получения розмариновой кислоты и ее производных являются мелисса Melissa officinalis и розмарин Rosmarinus officinalis [Petersen M., Simmonds M.S.J. Rosmarinic acid // Phytochemistry. 2003. V.62, №2. P.121-125].

Известны способы получения розмариновой кислоты из культуры клеток Coleus blumei и Salvia officinalis [Petersen M., Simmonds M.S.J. Rosmarinic acid // Phytochemistry, 2003. V.62. №2. P.121-125]. Однако все указанные виды произрастают за рубежом и в южных зонах европейской части России с небольшими ареалами произрастания. Актуальным является поиск растений с высоким содержанием розмариновой кислоты, произрастающих на территории России.

Известен способ получения розмариновой кислоты из растений экстракцией измельченного сырья спиртом, концентрирования экстракта, растворения остатка в воде, экстракции водной фазы толуолом при pH 4,5, затем метил-трет-бутил эфиром при pH 3,5-4 с добавлением соляной кислоты поэтапно, упаривания эфирного экстракта, растворения его в воде с активированным углем при нагревании, фильтрации, добавки кристаллов розмариновой кислоты в качестве затравки, охлаждения при 0-5°C в течение 6 ч, фильтрования и сушки в вакууме при 60°C в течение 24 ч. Выход целевого продукта 1,08% от веса сырья, чистота 90,6% от стандарта [WO 03/066568 A1, 2003.08.14].

К недостаткам данного способа относятся длительность и трудоемкость процесса выделения.

В качестве прототипа выбран способ получения розмариновой кислоты из растительного сырья, который включает экстракцию водой морской травы семейства Zosteraceae в течение 6-8 ч при комнатной температуре при добавлении пищевой кислоты до pH 2,5-3,0, последующую фильтрацию полученного раствора с отжимом, очистку экстракта на мембранном микрофильтре, затем на хроматографической колонке с полихромом-1 элюирование целевого продукта 5-7% водным раствором этилового спирта, концентрирование и лиофилизирование [RU 2401827, 20.10.2010].

К недостаткам известного способа относятся значительно меньшая растворимость розмариновой кислоты в воде, недостаточно высокий выход целевого продукта. Сырье Zostera asiatica, Zostera marina, Phyllospadix iwatensis имеет ограниченный ареал распространения.

Технический результат изобретения состоит в значительном расширении сырьевой базы и в упрощении способа получения розмариновой кислоты. Новый способ позволяет получить высокий выход и чистоту целевого продукта из надземной части растений, в которых розмариновая кислота является доминирующим компонентом среди фенолкарбоновых кислот.

Технический результат достигается тем, что способ получения розмариновой кислоты из растительного сырья, включающий экстрагирование, фильтрование, хроматографию, элюирование и концентрирование, согласно изобретению в качестве сырья используют наземную часть растений с высоким содержанием розмариновой кислоты в надземной части и доминирующим компонентом розмариновой кислоты среди фенолкарбоновых кислот, хроматографию проводят на колонке с полиамидом методом фронтальной хроматографии, элюирование осуществляют метанолом, после концентрирования проводят перекристаллизацию, при этом в качестве сырья используют растения: мята полевая, или черноголовка обыкновенная, или черноголовка крупноцветковая, или чистец болотный.

Изобретение поясняется следующими чертежами и таблицами:

в таблице 1 показана экстракция Stachys palustris различными экстрагентами;

в таблице 2 показаны данные по содержанию розмариновой кислоты в представителях семейства Lamiaceae;

на рис.1 показан график высокоэффективной жидкостной хроматографии экстракта листьев Stachys palustris. По оси абсцисс - время удерживания, пик 3 - розмариновая кислота;

на рис.2 показано изменение концентрации розмариновой кислоты в элюате при хроматографии экстракта листьев Stachys palustris 96% метанолом;

на рис.3 изображен график изменения концентрации розмариновой кислоты в элюате при хроматографии экстракта листьев Stachys palustris 50% метанолом. Сорбент - диасорб C16;

на рис.4 изображен график изменения концентрации фенолкарбоновых кислот в элюате при хроматографии экстракта листьев Stachys palustris 50% метанолом. Сорбент - полиамид;

на рис.5 - УФ-спектр розмариновой кислоты. По оси абсцисс - длина волны, нм.

Широкое применение розмариновой кислоты лимитировано недостаточным ее выпуском в связи с ограниченностью сырьевой базы и сложностью технологических процессов ее производства. В основном выпуск лекарственных средств на ее основе ограничен галеновыми препаратами. В этой связи возникла необходимость в поиске распространенного, постоянно возобновляемого источника сырья и простого, воспроизводимого технологического способа получения розмариновой кислоты.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве растительного сырья для получения розмариновой кислоты используют наземную часть растений: Mentha arvensis L (мята полевая), Prunella vulgaris L. (черноголовка обыкновенная), Prunella grandiflora L. (черноголовка крупноцветковая), Stachys palustris L. (чистец болотный). Их использование обеспечивает более высокий выход и чистоту целевого продукта за счет высокого содержания розмариновой кислоты в надземной части растений. Кроме того, розмариновая кислота является доминирующим компонентом среди фенолкарбоновых кислот указанных растений.

Надземную часть растений высушивали при комнатной температуре и измельчали, экстрагировали 50% метанолом в течение 24 ч при комнатной температуре. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр. Хроматографию осуществляют на колонке с полиамидом (Ferak Berlin). Полиамид в качестве адсорбента широко применяется для разделения и очистки органических соединений за счет хорошей стабильности физико-химических свойств, избирательности адсорбции, легкой десорбции, длительного срока службы, легкого образования замкнутой цепи и экономии средств. Экстракт наносят на колонку до окончания процесса хроматографии (метод фронтальной хроматографии). Розмариновую кислоту элюируют с колонки 60% водным раствором метанола. Элюат концентрируют в вакууме. Для получения розмариновой кислоты с более высокой степенью чистоты полученный порошок перекристаллизовывают, растворив в минимальном количестве дистиллированной воды, фильтруют и кристаллизуют при температуре 4°C. Образовавшиеся кристаллы розмариновой кислоты отфильтровывают и высушивают.

Пример 1

Растения Stachys palustris 0,1 г экстрагировали 10 мл экстрагента при комнатной температуре 24 ч. В качестве экстрагента для извлечения розмариновой кислоты использовали различные концентрации этанола и метанола в воде, ацетонитрил, бутанол, этилацетат, также 1:1 подкисленные соляной кислотой (0,05%) ранее указанные экстрагенты (табл.1, рис.1). После окончания процесса экстракции полученный раствор отфильтровывали. Определение розмариновой кислоты в экстрактах осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на оборудовании производства «Knauer»: насос Smartline 1000, детектор UV-VIS Smartline 2500, λ=330 нм с использованием колонки Диасорб-130-C18, 7 мкм (250×4 мм) («БиоХимМак», Россия), элюента вода - ацетонитрил - фосфорная кислота (80:20:0.05, по объему) при скорости элюирования 0,7 мл/мин, сравнивая времена удерживания со стандартным образцом розмариновой кислоты.

Пример 2

В растениях семейства Lamiaceae: мята полевая, черноголовка обыкновенная, черноголовка крупноцветковая, чистец болотный, обнаружено высокое содержание розмариновой кислоты, и она является доминирующим компонентом среди фенолкарбоновых кислот (табл.2). Растения 0,1 г экстрагировали 10 мл 98% метанола при комнатной температуре 24 ч. Определение розмариновой кислоты в экстрактах осуществляли методом ВЭЖХ, как это было описано в примере 1. Наибольшее содержание розмариновой кислоты обнаружено в надземной части Черноголовка крупноцветковая - 5,24% от сухого веса сырья (табл. 2).

Пример 3

Чистец болотный 1 г экстрагировали 100 мл 96% метанола. Согласно примеру 1 экстракция 96% метанолом дает наибольшее содержание розмариновой кислоты. Экстракт наносили на колонку с полиамидом (Ferak Berlin) или диасорбом-100-C16 (БиоХимМак СТ) (масса сорбента 10 г, колонка 120×21 мм) со скоростью 1 мл/мин. Отбирали фракции по 10 мл. По розмариновой кислоте сорбционная емкость выше для полиамида, чем для диасорба. Недостатком хроматографии на сорбентах полиамид и диасорб экстракта растений 98% метанолом является одновременное элюирование с розмариновой кислотой ксантонов (желтая зона) и флавоноидов (темно-желтая зона в УФ-свете), (рис.2).

Пример 4

Чистец болотный 1 г экстрагировали 100 мл 50% метанола. Экстракт обрабатывали 100 мл гексана или хлороформа. Кроме гидрофобных соединений в гексан переходит 8,0% розмариновой кислоты, в хлороформ - 1,5% розмариновой кислоты. Таким образом, для устранения недостатка, описанного в примере 3, перед хроматографией осуществляется обработка хлороформом экстракта, позволяющая удалить гидрофобные окрашенные соединения.

Пример 5

Чистец болотный 1 г экстрагировали 100 мл 50% метанола. Розмариновую кислоту выделяли методом фронтального анализа. 170 мл экстракта с концентрацией розмариновой кислоты 0,148 мг/мл наносили на колонку с дисорбом C 16 (масса сорбента 10 г, колонка 120×21 мм) со скоростью 1 мл/мин. Отбирали фракции по 10 мл. Изменение концентрации розмариновой кислоты на выходе из сорбента показано на рис.3. На первом этапе при пропускании экстракта растений чистеца болотного в элюате розмариновая кислота не обнаруживается, поскольку происходит его сорбция в колонке, из колонки элюируются гидрофильные примеси и фенолкарбоновые кислоты (соединение 1 и 2, пики на рис.1). Достигнув предельной сорбционной емкости по розмариновой кислоте, происходит элюирование розмариновой кислоты. После начала элюирования концентрация в элюате розмариновой кислоты растет до 0,197 мг/мл, что существенно превышает значение на входе, а затем уменьшается.

Десорбцию розмариновой кислоты осуществляли 20 мл 60% раствором метанола. Содержание розмариновой кислоты в элюате составляет 0,934 мг/мл розмариновой кислоты. Элюат собирали, концентрировали и сушили. В результате десорбции 60% метанолом содержание примесей минимальное. Фронтальная хроматография позволяет получить 25 мг розмариновой кислоты, провести значительное концентрирование розмариновой кислоты, отделить некоторые гидрофильные и гидрофобные примеси.

Пример 6

Чистец болотный 1 г экстрагировали 100 мл 50% метанола. Розмариновую кислоту выделяли методом фронтального анализа, который предусматривает ввод в колонку раствора разделяемой смеси вплоть до окончания процесса (Микеш О. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. М., 1982. Т.1). 170 мл экстракта с концентрацией розмариновой кислоты 0,148 мг/мл наносили на колонку с полиамидом (масса сорбента 10 г, колонка 120×21 мм) со скоростью 1 мл/мин. Отбирали фракции по 10 мл. Изменение концентрации розмариновой кислоты в элюате показано на рис.4. На первом этапе при пропускании метанольного экстракта растений чистеца болотного в элюате розмариновая кислота не обнаруживается, поскольку происходит его сорбция колонке, из колонки элюируются гидрофильные примеси и фенолкарбоновые кислоты (соединение 1 и 2, пики на рис.1). Достигнув предельной сорбционной емкости по розмариновой кислоте, происходит элюирование розмариновой кислоты. После начала элюирования концентрация в элюате розмариновой кислоты растет до 0,340 мг/мл, что существенно превышает значение на входе, а затем уменьшается.

Десорбцию розмариновой кислоты осуществляли 20 мл 60% раствором метанола. Содержание розмариновой кислоты в элюате составляет 0,320 мг/мл розмариновой кислоты. Фракции, соответствующие 110-170 мл нанесенного экстракта и 20 мл элюата, собирали, концентрировали и сушили. В результате в собранных фракциях содержание примесей минимальное. Фронтальная хроматография позволила провести значительное концентрирование розмариновой кислоты, отделить гидрофильные и гидрофобные примеси. Фронтальная хроматография позволила получить 25 мг розмариновой кислоты.

Для получения розмариновой кислоты с более высокой степенью чистоты полученный порошок перекристаллизовывают, растворив в минимальном количестве дистиллированной воды, фильтруют и кристаллизуют при температуре 4°C. Образовавшиеся кристаллы розмариновой кислоты отфильтровывают и высушивают. Чистота препарата 92-94% (по данным ВЭЖХ). УФ-спектр розмариновой кислоты показан на рис.5.

Таблица 1 № п/п Растворитель Содержание розмариновой кислоты, % от сухого веса Содержание от суммы фенолкарбоновых кислот, % 1 Вода 0,06±0,00 9,2 2 30% этанол 0,06±0,00 7,8 3 50% этанол 1,08±0,05 76,7 4 70% этанол 1,16±0,06 76,9 5 96% этанол 1,15±0,05 99,4 6 30% метанол 0,02±0,00 2,3 7 50% метанол 1,48±0,07 74,2 8 70% метанол 1,71±0,09 90,4 9 96% метанол 1,74±0,09 98,0 10 Ацетонитрил 0,01±0,00 29,3 11 Бутанол 0,03±0,00 12,3 12 Этилацетат 0,04±0,00 20,1 13 Вода подкисленная 0,58±0,03 53,9 14 96% этанол подкисленный 1,30±0,07 98,0 15 96% метанол подкисленный 0,79±0,03 77,7 16 Ацетонитрил подкисленный 0,31±0,01 40,8 17 Бутанол подкисленный 0,10±0,01 98,6 18 Этилацетат подкисленный 0,49±0,03 42,5

Таблица 2 Растения Места отбора образцов Содержание розмариновой кислоты, % от сухого веса Содержание от суммы фенолкарбоновых кислот, % Mentha arvensis L мята полевая Республика Коми, Княжпогостский район 1,16±0,06 81,4 Prunella grandiflora L. Черноголовка крупноцветковая Свердловская область, Красноуфимский район 5,24±0,10 78,8 Prunella vulgaris L. Черноголовка обыкновенная Свердловская область, Красноуфимский район 3,12±0,11 87,5 Stachys palustris L. чистец болотный Республика Коми, Княжпогостский район 1,74±0,09 98,0 Ajuga reptans L. живучка ползучая г.Сыктывкар 0,00 0,0 Dracocephalum ruyschiana L. змееголовник Рюйша Республика Коми, Усть-Цилемский р-н 0,13±0,00 18,2 Galeopsis bifida Boenn. пикульник двунадрезный г.Сыктывкар 0,02±0,00 7,4 Lamium amplexicaule L. яснотка стеблеобъемлющая Республика Коми, с.Выльгорт 0,06±0,00 17,7 Scutellaria galericulata L. шлемник обыкновенный г.Сыктывкар 0,07±0,00 67,3

Похожие патенты RU2541542C2

название год авторы номер документа
ПРОТИВООЖОГОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ 2014
  • Болотник Елизавета Витальевна
  • Алексеева Людмила Ивановна
  • Ларионов Леонид Петрович
  • Гаврилов Андрей Станиславович
RU2552790C1
СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИЦИНА И ПСЕВДОГИПЕРИЦИНА 2015
  • Пунегов Василий Витальевич
  • Чуча Константин Витальевич
  • Эчишвили Эльмира Элизбаровна
RU2623084C2
Биологически активная добавка, обладающая актопротекторной активностью 2022
  • Бубенчикова Валентина Николаевна
  • Шамилов Арнольд Алексеевич
  • Поздняков Дмитрий Игоревич
  • Гарсия Екатерина Робертовна
RU2794752C1
Способ комплексной переработки морской травы семейства Zosteraceae 2022
  • Вахрушев Алексей Иванович
  • Купера Елена Владимировна
  • Руцкова Татьяна Анатольевна
  • Маханьков Вячеслав Валентинович
  • Подволоцкая Анна Борисовна
  • Текутьева Людмила Александровна
  • Козловская Эмма Павловна
RU2796368C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОЗМАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ 2009
  • Артюков Александр Алексеевич
  • Купера Елена Владимировна
  • Руцкова Татьяна Анатольевна
  • Маханьков Вячеслав Валентинович
  • Новиков Вячеслав Леонидович
  • Глазунов Валерий Петрович
  • Козловский Алексей Стефанович
  • Попов Александр Михайлович
  • Козловская Эмма Павловна
RU2401827C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 20-ГИДРОКСИЭКДИЗОНА И ЭКДИЗОНА ИЗ СМЕСИ ЭКДИСТЕРОИДОВ 1996
  • Алексеева Л.И.
  • Володин В.В.
  • Лукша В.Г.
RU2123855C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ РАСТЕНИЯ РОДА SERRATULA αЭКДИЗОНА, βЭКДИЗОНА И ИНОКОСТЕРОНА 1997
  • Пунегов В.В.
  • Мишуров В.П.
  • Никитина Е.Н.
RU2138509C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7,3'-ДИСУЛЬФАТА ЛЮТЕОЛИНА 2010
  • Артюков Александр Алексеевич
  • Кочергина Татьяна Юрьевна
  • Руцкова Татьяна Анатольевна
  • Купера Елена Владимировна
  • Новиков Вячеслав Леонидович
  • Глазунов Валерий Петрович
  • Маханьков Вячеслав Валентинович
  • Козловская Эмма Павловна
RU2432960C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОЗМАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ 2009
  • Бубенчикова Валентина Николаевна
  • Кондратова Юлия Александровна
RU2402525C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ ФЕНОЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ЧАГИ 2013
  • Сысоева Мария Александровна
  • Хабибрахманова Венера Равилевна
  • Кыямова Гульнара Илдусовна
RU2530637C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 541 542 C2

Реферат патента 2015 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОЗМАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к способу получения розмариновой кислоты и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Способ включает экстрагирование, фильтрование, хроматографию, элюирование и концентрирование, причем в качестве сырья используют наземную часть растений с высоким содержанием розмариновой кислоты в надземной части, в частности мята полевая, или черноголовка обыкновенная, или черноголовка крупноцветковая, или чистец болотный или их сочетание, и доминирующим компонентом розмариновой кислоты среди фенолкарбоновых кислот, растения экстрагируют, после экстракции полученный раствор фильтруют, хроматографию проводят на колонке с полиамидом методом фронтальной хроматографии, элюирование осуществляют 60% метанолом, после концентрирования проводят перекристаллизацию. Способ обеспечивает расширение сырьевой базы, обеспечивает получение розмариновой кислоты высокой чистоты с высоким выходом. 5 ил., 2 табл., 6 пр.

Формула изобретения RU 2 541 542 C2

Способ получения розмариновой кислоты из растительного сырья, включающий экстрагирование, фильтрование, хроматографию, элюирование и концентрирование, отличающийся тем, что в качестве сырья используют наземную часть растений с высоким содержанием розмариновой кислоты в надземной части, в частности мята полевая, или черноголовка обыкновенная, или черноголовка крупноцветковая, или чистец болотный или их сочетание, и доминирующим компонентом розмариновой кислоты среди фенолкарбоновых кислот, растения экстрагируют, после экстракции полученный раствор фильтруют, хроматографию проводят на колонке с полиамидом методом фронтальной хроматографии, элюирование осуществляют 60% метанолом, после концентрирования проводят перекристаллизацию.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2541542C2

CN1995007A, 11.07.2007
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОЗМАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ 2009
  • Бубенчикова Валентина Николаевна
  • Кондратова Юлия Александровна
RU2402525C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОЗМАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ 2009
  • Артюков Александр Алексеевич
  • Купера Елена Владимировна
  • Руцкова Татьяна Анатольевна
  • Маханьков Вячеслав Валентинович
  • Новиков Вячеслав Леонидович
  • Глазунов Валерий Петрович
  • Козловский Алексей Стефанович
  • Попов Александр Михайлович
  • Козловская Эмма Павловна
RU2401827C1
US 20030147974 A1, 07.08.2003

RU 2 541 542 C2

Авторы

Алексеева Людмила Ивановна

Даты

2015-02-20Публикация

2013-06-04Подача