СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ, ОБЛАДАЮЩЕЙ АНТИЛИПАЗНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, ИЗ ВЕГЕТАТИВНОЙ ЗЕЛЕНИ ОГУРЦА ПОСЕВНОГО Российский патент 2025 года по МПК A61K36/42 B01D11/02 A61P1/18 

Область техники, к которой относится изобретение: Фармацевтика

Уровень техники: Экстракты, субстанции и биологически активные вещества, получаемые из растительных видов, используются в качестве эффективных лекарственных средств, обладающих ингибирующим действием на панкреатическую липазу человека и используемых для профилактики и лечения ожирения и других видов нарушений обмена липидов [1]. Для получения средств из растений наиболее часто применяемыми являются дикорастущие или культивируемые лекарственные виды, для которых были разработаны способы получения растительных сборов, экстрактов и субстанций [1].

Например, известен способ получения ингибитора липазы из семян рапса посредством трехкратной экстракции хлороформом сырья при соотношении сырье: экстрагент 1:(2,0-3,0) в течение 25-35 мин, объединения экстрактов и упаривания под вакуумом [2]. Известен способ получения фармацевтической композиции для уменьшения поглощения жира из пищи, включающей 5-50 вес.ч. пектина, его аналогов или его производных, или его солей, 1 вес.ч. ингибитора желудочно-кишечной липазы, в качестве которого используют природный флавоноид гесперидин, и 10-80 вес.ч. вспомогательных компонентов [3]. Оба способа не могут считаться универсальными для любого вида сырья, так как хлороформные экстракты из растений не всегда обладают антилипазной активностью, а также не любое растение может считаться источником для получения гесперидина.

Основной сельскохозяйственной культурой тепличного севооборота является огурец посевной, особенностью которой является образование удлиненных побегов. Учитывая объемы производства побегов огурца, они являются перспективным сырьем для фармацевтической промышленности, в частности для создания средств для профилактики и лечения заболеваний липидного обмена, ввиду высокого содержания флавоноидов. Несмотря на доступность сырья, существует небольшое количество способов переработки данного сырья. Известен способ получения экстракта, включающий доставку, сушку, дезинтеграцию, измельчение, шлифовку сырья и СО₂ экстракцию при 30°С и 73,6 атм в СО₂ экстракторе [4]. Сведений о наличии биологической активности у данного экстракта нет, поэтому невозможно сделать вывод о его эффективности как биологически-активного средства.

Исследование отходов тепличного производства выявило наличие антилипазной активности у экстрактов и флавоноидов из листьев огурца посевного [5]. Известен способ получения флавоноидов из листьев огурца, зараженных мучнистой росой, включающий замораживание жидким азотом, экстракцию метанолом, концентрирование экстрактов, сорбцию на поливинилпирролидоне, элюцию этанолом и смесью дихлорэтан-этанол-метилэтилкетон-ацетон, очистку методом жидкостной хроматографии и колоночной хроматографии на Сефадексе LH-20 [6]. Известен способ получения флавоноидов из листьев огурца, зараженных мучнистой росой, включающий экстракцию метанолом, концентрирование экстрактов, жидкофазную экстракцию диэтиловым эфиром, гидролиз 4 М соляной кислотой, жидкофазную экстракцию диэтиловым эфиром и этилацетатом, обессоливание на патронах Sep-Pak C18, очистку методом жидкостной хроматографии [7]. Недостатком обоих способов является использование зараженного растительного материала, который не может считаться общедоступным, применение длительной схемы разделения, а также токсичных растворителей.

Наиболее близкими к заявляемому можно считать способы получения флавоноидов из листьев огурца, включающие экстракцию этанолом или изопропанолом, концентрирование экстрактов, сорбцию на полиамиде, элюцию водой и этанолом, очистку методом жидкостной хроматографии и колоночной хроматографии на Сефадексе LH-20 и силикагеле [5, 8]. Недостатком обоих способов является использование лишь листьев огурца, при том, что остальные части растения остаются неиспользуемыми, применение длительной схемы разделения и токсичных растворителей, а также низкий выход целевых продуктов (<0,1% от массы сырья).

Для устранения недостатков способа-прототипа предложено использование всей вегетативной зелени огурца в качестве сырья, с целью полной утилизации тепличных отходов. В качестве начального экстрагента выбрана вода по причине низкой токсичности и высокой экстракционной силы по отношению к целевым метаболитам вегетативной зелени огурца. С целью интенсификации процесса экстракции предложено применение ультразвуковой ванны, сокращающей длительность процесса. Исключен этап хроматографического выделения индивидуальных флавоноидов из суммы с применением ВЭЖХ и Сефадекса LH-20, так как для суммарный препарат также обладает ингибиторным действием на панкреатическую липазу человека и может быть использован для практических целей без предварительного разделения.

Раскрытие сущности изобретения: Задачей изобретения является создание суммарного растительного препарата, содержащего флавоноиды, из отходов тепличного производства, уменьшение времени экстракции, устранение токсичных экстрагентов и растворителей, а также повышение антилипазного действия средства за счет высокого содержания действующих веществ. Техническим результатом изобретения является повышенное антилипазное действие средства из вегетативной зелени огурца, полученного заявленным способом.

Для достижения указанного технического результата измельченный растительный материал (вегетативная зелень огурца) экстрагируют водой очищенной в соотношении сырье : экстрагент 1:20 с ультразвуковой обработкой рабочей частотой 35 кГц и мощностью генератора 100 Вт при 90°С в течение 2 ч, после чего проводят экстракцию водой очищенной в тех же условиях еще раз. Водные экстракты концентрируют в вакууме до 1:30 от первоначального объема, смешивают жидкий концентрат с полиамидом для хроматографии в соотношении полиамид : растительный материал 1:1, досушивают до состояния порошка при 50°С в течение 6 ч, переносят порошок на колонку с чистым полиамидом для хроматографии в соотношении порошок : чистый полиамид для хроматографии 1:5, промывают колонку водой очищенной объемом, равным 10-ти объемам чистого полиамида, вымывают сумму флавоноидов 60% этанолом объемом, равным 5-ти объемам чистого полиамида для хроматографии, после чего этанольный раствор флавоноидов концентрируют в вакууме досуха, после чего досушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 55°С и давлении 0,1 атм в течение 6 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта (суммы флавоноидов) составляет 2-4% от массы растительного материала.

Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию “новизна”. Предложенный способ позволяет получить сумму флавоноидов в виде рассыпчатого негигроскопичного порошка ярко-желтого цвета без вкуса и запаха. Потеря массы при высушивании составляет 5,0±0,3%.

Осуществление изобретения: Пример 1. 10 кг измельченной до размера частиц 1 мм вегетативной зелени огурца сорта Gele Tros (Геле Трос или Большой голландский желтый) с влажностью 4% загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 200 л воды. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и проводят ультразвуковую обработку с рабочей частотой 35 кГц и мощностью генератора 100 Вт в импульсном режиме при температуре 90°С в течение 60 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют, смесь фильтруют через сукно в сборник, в результате чего получено 170 л водного экстракта 1. Остаток сырья после первой экстракции водой переносят в экстракционный аппарат, заливают 170 л воды, вносят стержневой ультразвуковой процессор и проводят ультразвуковую обработку с рабочей частотой 35 кГц и мощностью генератора 100 Вт в импульсном режиме при температуре 90°С в течение 60 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют, смесь фильтруют через сукно в сборник, в результате чего получено 160 л водного экстракта 2. Водные экстракты 1 и 2 объединяют и концентрируют в вакууме до получения жидкого концентрата объемом 11 л. Отгон воды объемом 315 л далее может быть повторно использован на стадии экстракции растительного сырья. Жидкий концентрат (11 л) смешивают с 10 кг полиамида для хроматографии и высушивают в вакууме до состояния порошка при 50°С в течение 6 ч. Полученный порошок переносят на колонку с 50 кг чистого полиамида для хроматографии и промывают колонку 500 л воды очищенной. Водный элюат далее не используют и направляют в отвал. После промывания водой колонку промывают 250 л 60% этанола, полученный элюат собирают, переносят в колбу и концентрируют в вакууме досуха. Отгон этанола объемом 240 л далее может быть повторно использован на стадии хроматографии на полиамиде. Колбу с сухим остатком досушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 55°С и давлении 0,1 атм в течение 6 часов и далее полученный продукт измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта (суммы флавоноидов) составил 400 г (4% от массы растительного материала). Сумма флавоноидов представляет собой рассыпчатый негигроскопичный порошок ярко-желтого цвета без вкуса и запаха. Потеря массы при высушивании составила 5,0%.

Пример 2. Использована та же схема получения (пример 1) из 10 кг измельченной до размера частиц 1 мм вегетативной зелени огурца сорта Зозуля F1 с влажностью 4%. Выход готового продукта (суммы флавоноидов) составил 200 г (2% от массы растительного материала). Сумма флавоноидов представляет собой рассыпчатый негигроскопичный порошок желтого цвета без вкуса и запаха. Потеря массы при высушивании составила 5,3%.

Пример 3. Использована та же схема получения (пример 1) из 10 кг измельченной до размера частиц 1 мм вегетативной зелени огурца сорта Нежинский F1 с влажностью 4%. Выход готового продукта (суммы флавоноидов) составил 300 г (3% от массы растительного материала). Сумма флавоноидов представляет собой рассыпчатый негигроскопичный порошок желтого цвета без вкуса и запаха. Потеря массы при высушивании составила 4,7%.

Химический состав, количественный анализ и показатели качества суммы флавоноидов из вегетативной зелени огурца посевного. С применением метода ВЭЖХ [5] изучен химический состав разработанного средства, в котором установлено присутствие таких флавоноидов как изовитексин 4′,2′′-ди-О-глюкозид, изовитексин 2′′-О-глюкозид (мелозид A), изовитексин 4′-О-глюкозид-2′′-О-(6′′′′-О-п-кумароил)-глюкозид, изовитексин 4′-О-глюкозид-2′′-О-(6′′′′-О-ферулоил)-глюкозид, изовитексин 2′′-О-(6′′′-О-кофеил)-глюкозид, изовитексин 2′′-О-(6′′′-О-п-кумароил)-глюкозид и изовитексин 2′′-О-глюкозид-6′′-О-п-кумарат.

Для осуществления химической стандартизации средства разработана методика количественного анализа суммарного содержания флавоноидов методом спектрофотометрии в УФ-области.

Методика количественного анализа флавоноидов методом спектрофотометрии в УФ-области. Испытуемый раствор. 100 мг суммы флавоноидов помещают в пластиковую пробирку типа Эппендорф вместимостью 10 мл, прибавляют 8 мл 2 М соляной кислоты в 70% этаноле, закрывают крышкой и нагревают при 60°С в течение 60 мин. Полученный раствор центрифугируют, переносят супернатант в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70% этанолом (раствор А). 1 мл раствора А смешивают в 4 мл воды и полученный раствор наносят на полиамидный патрон (1 г), предварительно промытый 30 мл этанола и 30 мл воды. Элюирование патрона проводят 30 мл воды, отбрасывая водный элюат. Далее патрон промывают 70% этанолом, собирая элюат в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70% этанолом (раствор Б).

Стандартный раствор. 20 мг изовитексина переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл растворяют в 1 мл ДМСО и доводят объем раствора до метки 70% этанолом (раствор А1). 1 мл раствора А1 переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70% этанолом (раствор Б1).

Раствор сравнения. 70% этанол.

Условия спектрофотометрирования:

- кварцевая кювета с длиной оптического пути 1 дм;

- длина волны: 330 нм.

Расчет: содержание флавоноидов в процентах (X) вычисляют по формуле: X = [A / m] × [m1 / A1] × [(100 - W) / 100] × 100, где A - оптическая плотность исследуемого раствора; m - масса навески суммы флавоноидов, г; A1 - оптическая плотность стандартного раствора; m - масса навески изовитексина, г; W - влажность суммы флавоноидов, %.

Метрологический анализ разработанной методики показал, что относительная ошибка определения флавоноидов методом спектрофотометрии в УФ-области не превышает 2%. Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительных валидационных параметрах методик, что указывает на возможность их использования в практике фармакопейного анализа для определения показателей качества разработанного средства.

По данным проведенных исследований определены общие показатели качества средства, обобщенные ниже. Для стандартизации средства было предложено определение внешнего вида, подлинности, потери в массе при высушивании, золы сульфатной, тяжелых металлов, количественное определение флавоноидов и микробиологической чистоты.

Показатели качества суммы флавоноидов из вегетативной зелени огурца посевного:

- Описание, внешние признаки (визуальный, органолептический методы) - рассыпчатый негигроскопичный порошок, цвет от желтого до ярко-желтого, запах отсутствует, вкус 0.1% водного раствора отсутствует;

- Подлинность (определение изовитексина, ВЭЖХ) - на хроматограмме при длине волны 330 нм должен присутствовать пик, совпадающий по подвижности с таковой изовитексина;

- Потеря в массе при высушивании (гравиметрический метод) - не более 5%;

- Зола сульфатная (гравиметрический метод) - не более 0.1%;

- Тяжелые металлы (спектрофотометрический метод) - не более 0.01%;

- Количественное определение (флавоноиды, спектрофотометрический метод) - не менее 70%;

- Микробиологическая чистота (бактериологический метод) - категория 3Б;

- Хранение - в защищенном от света месте при температуре 12-15°С;

- Срок годности - 5 лет.

Предлагаемый способ, по сравнению с известным, позволяет получить препарат постоянного состава с более выраженной активностью за счет более высокого содержания действующих веществ (флавоноидов). Рассчитать экономическую целесообразность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и определяют перспективность внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.

Информация о результатах доклинических исследований лекарственных средств и клинических исследований лекарственных препаратов: Антилипазная активность суммы флавоноидов из вегетативной зелени огурца посевного. Анализ ингибирования липазы проводили согласно методу, описанному Zhang et al. (2011) [9]. Коммерческий ингибитор липазы URB602 измеряли в качестве положительного контроля. В качестве субстрата использовали п-нитрофенол пальмитат (pNPP), который гидролизовался липазой до п-нитрофенола (pNP). В центрифужную пробирку (объемом 1,5 мл) помещали 450 мкл 0,05 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,6), содержащего холат натрия (1,15 мг/мл) и гуммиарабик (0,55 мг/мл), смешивали с 50 мкл pNPP в изопропаноле (0,01 М) и 5 мкл раствора суммы флавоноидов в изопропаноле (1-100 мкг/мл). Добавляли 5 мкл раствора панкреатической липазы человека (50 мг/мл) и инкубировали при 37°C 5 мин. Отбирали порцию реакционной смеси объемом 200 мкл и добавляли в 96-луночный планшет. Поглощение измеряли при 410 нм. Ингибирующую активность липазы измеряли при пяти различных концентрациях и строили кривую логарифмической регрессии для расчета значений IC₅₀ (мг/мл).

Сумма флавоноидов из вегетативной зелени огурца посевного была эффективным ингибитором панкреатической липазы in vitro по сравнению с коммерческим ингибитором липазы поджелудочной железы (URB602). Сумма флавоноидов имела низкие значения IC₅₀ (15 мкг/мл), что значительно эффективнее, чем у коммерческого ингибитора (92 мкг/мл). Таким образом, средство оказывает выраженное антилипазное действие.

Источники информации:

Seyedan A., Alshawsh M.A., Alshagga M.A., Koosha S., Mohamed Z. Medicinal Plants and Their Inhibitory Activities against Pancreatic Lipase: A Review // Evid. Based Complement. Alternat. Med. - 2015. - Vol. 2015. - No 973143. DOI: 10.1155/2015/973143.

Патент РФ 1510148(13)A1. Корчагина Л.Н., Чернобай В.Т., Любецкая Ж.А., Потапова Н.В., Маслова Н.Ф. Способ получения ингибитора липазы. Заявка № 88 4370713, 26.01.1988.

Патент РФ 2009118060(13)A. Тихонов В.П., Дергачева Л.И., Корденкова А.Ю., Шевченко Т.В., Офицеров Е.Н. Фармацевтическая композиция, биологически активная добавка и способ уменьшить поглощение жира из пищи. Заявка № 2009118060/15, 14.05.2009. Дата публикации заявки: 20.11.2010.

Патент РФ 2020140752(13)A. Пензина Т.А. Способ получения натурального экстракта огурца. Заявка: 2020140752, 10.12.2020. Дата подачи заявки: 10.12.2020.

Olennikov D.N., Kashchenko N.I. Acylated flavonoids from Cucumis sativus inhibit the activity of human pancreatic lipase // Appl. Biochem. Microbiol. - 2023. - Vol. 59. - P. 530-538. DOI: 10.1134/S0003683823040099.

Abou-Zaid M.M., Lombardo D.A., Kite G.C., Grayer R.J., Veitch,N.C. Acylated flavone C-glycosides from Cucumis sativus // Phytochemistry. - 2001. - Vol. 58. - P. 167-172. DOI: 10.1016/s0031-9422(01)00156-x.

McNally D.J., Wurms K.V., Labbé C., Quideau S., Bélanger R.R. Complex C-glycosyl flavonoid phytoalexins from Cucumis sativus // J. Nat. Prod. - 2003. - Vol. 66. - P. 1280-1283. DOI: 10.1021/np030150y.

Olennikov D.N., Kashchenko N.I. New flavonoids from Cucumis sativus // Chem. Nat. Compd. - 2023. - Vol. 58. - P. 651-654. DOI: 10.1007/s10600-023-04079-4.

Zhang L., Hogan S., Li J., Sun S., Canning C., Zheng S.J., Zhou K. Grape skin extract inhibits mammalian intestinal α-glucosidase activity and suppresses postprandial glycemic response in streptozocin-treated mice // Food Chem. - 2011. - Vol. 126. - P. 466-471. DOI: 10.1016/j.foodchem.2010.11.016.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства, обладающего антилипазным действием. Способ получения средства, обладающего антилипазным действием, из вегетативной зелени огурца посевного путем экстрагирования растительного материала, в котором измельченный растительный материал смешивают с водой в соотношении 1:20 и подвергают смесь ультразвуковой обработке рабочей частотой 35 кГц и мощностью генератора 100 Вт при 90°С в течение 60 мин дважды, смесь фильтруют, водные извлечения концентрируют в вакууме до 1:30 от первоначального объема, концентрат наносят на полиамид для хроматографии в соотношении 1:1, досушивают до состояния порошка при 50°С в течение 6 ч, переносят порошок на колонку с чистым полиамидом для хроматографии в соотношении 1:5, промывают колонку водой очищенной объемом, равным 10-ти объемам чистого полиамида, и 60% этанолом объемом, равным 5-ти объемам чистого полиамида, для хроматографии, после чего этанольный раствор концентрируют в вакууме досуха и измельчают. Вышеописанный способ позволяет получить средство из вегетативной зелени огурца с повышенным антилипазным действием. 3 пр.

Способ получения средства, обладающего антилипазным действием, из вегетативной зелени огурца посевного путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что измельченный растительный материал смешивают с водой в соотношении 1:20 и подвергают смесь ультразвуковой обработке рабочей частотой 35 кГц и мощностью генератора 100 Вт при 90°С в течение 60 мин дважды, смесь фильтруют, водные извлечения концентрируют в вакууме до 1:30 от первоначального объема, концентрат наносят на полиамид для хроматографии в соотношении 1:1, досушивают до состояния порошка при 50°С в течение 6 ч, переносят порошок на колонку с чистым полиамидом для хроматографии в соотношении 1:5, промывают колонку водой очищенной объемом, равным 10-ти объемам чистого полиамида, и 60% этанолом объемом, равным 5-ти объемам чистого полиамида, для хроматографии, после чего этанольный раствор концентрируют в вакууме досуха и измельчают.