Способ выращивания каллусных тканей Mertensia maritima (L.) S.F.Gray Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению и выращиванию каллусных культур лекарственных растений, и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения сырья, представляющего собой каллусную культуру растения Mertensia maritima (L.) S.F.Gray линия Mm-S1.с целью выделения комплекса биологически активных веществ, в частности, розмариновой кислоты.

Розмариновую кислоту содержат базилик, мелисса, розмарин, майоран, шалфей, тимьян, мята. Как следует из анализа литературных данных, розмариновая кислота относится к ценным биологически активным веществам, поскольку улучшает метаболизм жиров, способствует снижению массы тела, оказывает противотромбозное, противовоспалительное, антиоксидантное, иммуномодулирующее, антидепрессантное, противовирусное, дегликирующее и антибактериальное действие.

Традиционными источниками получения розмариновой кислоты и ее производных являются мелисса Melissa officinalis и розмарин Rosmarinus officinalis [Petersen M., Simmonds M.S.J. Rosmarinic acid // Phytochemistry. 2003. V.62, №2. P.121-125]. Учитывая высокую ценность розмариновой кислоты, усилия селекционеров, фармакологов и производителей пищевой продукции направлены на получение богатых розмариновой кислотой сортов растений и подбор оптимальных условий выращивания различных пищевых и лекарственных растений, а также способов выделения розмариновой кислоты из сырья.

Известные способы получения розмариновый кислоты из растительного сырья используют различные части растений, в частности из наземной части растений: мяты полевой, черноголовки обыкновенной, черноголовка крупноцветковой, чистеца болотного или их сочетания (п. РФ № 2541542, опубл. 10.12.2014, МПК C07C 67/5, C07C 67/56); из травы шалфея мутовчатого (п. РФ № 2402525, опубл. 27.10.2010. МПК C07C 67/32); из морской травы семейства Zosteraceae (П. РФ № 2401827, опубл. 20.10.2010, МПК C07C 69/732, C07C 69/56, C07C 67/52).

Все перечисленные выше решения направлены на получение розмариновой кислоты из растительного сырья, которые требуют значительных материальных и трудовых затрат на выращивание сырья, сбор, его подготовку для выделения розмариновой кислоты. Затем также для выделения целевого продукта из растительного сырья, в которых используют методы экстрагирования, фильтрования и концентрирования.

В настоящее время разработаны способы получения биологически активных веществ из каллусных культур, которые отличаются от вышеописанных способов меньшей трудоемкостью, более высоким качеством и быстротой процессов. К сожалению, заявителем в литературных источниках не найдено способов получения каллусной культуры мертензии приморской (Mertensia maritima (L.) S.F.Gray).

Известен способ получения культуры чая (Camellia sinensis L.), включающий выращивание каллусов на питательной среде, содержащей макро- и микросоли, витамины, аденин, дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), агар, при 26°С, перенос их в жидкую питательную среду того же состава и воздействие L-фенилаланина в концентрации 3 мМ, причем неизмельченный каллус помещают в жидкую питательную среду Хеллера, содержащую макро- и микросоли по Хеллеру, витамины по Уайту, мезоинозит - 20 мг/л, Са-пантотенат - 0,1 мг/л, аденин - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкозу - 25 г/л, выращивают при относительной влажности воздуха 70%, на качалке с частотой 90 об/мин в условиях темноты 14 дней, а в качестве растворителя для L-фенилаланина используют воду. Изобретение позволяет увеличить количество фенилпропаноидов в 4-5 раз по сравнению с контролем (п. РФ № 2709692, опубл. 19.12.2019, МПК A01H 4/00).

Известен способ получения каллусной культуры змееголовника дланевидного, который содержит более 20 биологически активных соединений, в частности, фенилпропаноиды, кумарины, флавоноиды и тритерпены), и может быть использован в качестве источника флавоноидов терапевтического действия. Способ получения каллусной культуры клеток дикорастущего растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян змееголовника раствором 3% перекиси водорода в течение 5 минут, 80% этиловым спиртом в течение 1 мин, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, мг/л: NH4NO3 - 33000, KNO3 - 38000, CaCl2×2H2O - 8800, MgSO4×7H2O - 7400, KH2PO4 - 3400, KI - 166, Н3ВО3 - 1240, MnSO4×4H2O - 4460, ZnSO4×7H2O - 1720, Na2MoO4×2H2O - 50, CuSO4×5H2O - 5, CoCl2×6H2O - 5, FeSO4×7H2O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000. Далее, полученные из проростков листовые экспланты помещают в питательнуюсреду следующего состава, мг/л: NH4NO3 - 33000, KNO3 - 38000, CaCl2×2H2O - 8800, MgSO4×7H2O - 7400, KH2PO4 - 3400, KI - 166, Н3ВО3 - 1240, MnSO4×4H2O - 4460, ZnSO4×7H2O - 1720, Na2MoO4×2H2O - 50, CuSO4×5H2O - 5, CoCl2×6H2O - 5, FeSO4×7H2O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100,пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 3000, гидролизат казеина - 500, кинетин - 1, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 1, вода - 1000 мл, агар - 12000. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют ¹/₄ каллусных биомасс, полученные каллусные культуры сохраняют пересадкой каждые 30 суток. (п. РФ № 2718253, опубл. 31.03.2020, МПК C12N 5/04).

Известен способ получения каллусной культуры Hedysarum alpinum L., перспективной в качестве сырья для выделения биологически активных веществ и создания на их основе лекарственных средств. В данном способе получения культуры клеток 3-х недельные стерильные проростки, рассеченные на экспланты, помещают на агаризованную питательную среду МС с добавлением 1 мг/л 2-4 D и 0,1 мг/л 6-БАП для каллусообразования и дальнейшего культивирования полученного каллуса на агаризованной питательной среде МС с добавлением 2 мг/л α-НУК и 0,5 мг/л 6-БАП при отсутствии света, температуре 26±1°С и 70% влажности. Способ позволяет получить каллусную культуру Hedysarum alpinum L., характеризующуюся значимым приростом биомассы и высокой удельной скоростью роста (п. РФ № 2787746, опубл. 12.01.2023, МПК C12N 5/04).

Недостатком всех вышеприведенных способах наработки клеточных (каллусных) культур является невозможность их использования для других видов растений, например, для M. Maritima (Мертензия приморская), так как известно, что каждое растение требует своих индивидуально подобранных стерилизаторов, времени воздействия и концентрации и определенного состава питательных сред и регуляторов роста для выращивания растений регенерантов и калллусных тканей.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения каллусной культуры M. maritima перспективной в качестве сырья для получения розмариновой кислоты.

Техническая задача - разработка способа получения субстанций на основе каллусной культуры M. maritima, содержащей повышенное содержание розмариновой кислоты.

Технический результат заключается в получении субстанции методом культивирования каллусной культуры M. maritima (L.), обогащенной розмариновой кислотой, причем процесс культивирования каллусной культуры осуществляется в условиях, несвязанных с выращиванием и сбором растений в поле.

Поставленная задача решается тем, в способе культивирования каллусной культуры недифференцированные клетки M. maritima, помещают в культуральные сосуды, содержащие агаризованную питательную среды WB/А и культивируют в течение 7 суток в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 60±10%, после чего следующие 21 сутки образовавшиеся каллусы культивируют облучая их красным светом с длиной волны 660 +/- 20 нм или зеленым светом с длиной волны 520 +/- 10 нм и плотностью потока фотосинтетических фотонов 100+/-10 мкмоль/ (кв.м*с) при фотопериоде 16 часов «день», 8 часов «ночь» каждые сутки.

Признаки, относящиеся к основному процессу культивирования каллусной культуры и включенные в формулу изобретения, обеспечивают решение следующих проблем: позволяют решить поставленную задачу и обеспечить заявленный технический результат - получить субстанцию методом культивирования растительных клеток M. maritima в условиях, несвязанных с выращиванием и сбором растений в поле и содержащей повышенное содержание розмариновой кислоты.

Кроме того, проведение дополнительное в течение 21 суток культивирование при облучении красным светом с длиной волны 660 +/- 20 нм или зеленым светом с длиной волны 520 +/- 10 нм. и плотностью потока фотосинтетических фотонов 100+/-10 мкмоль/ (кв.м*с) при фотопериоде 16 часов «день», 8 часов «ночь» каждые сутки», также способствует достижению заявленного технического результата, поскольку способствует интенсивной выработки розмариновой кислоты в каллусах M. maritima за счет активации внутренних биохимических процессов в каллусной культуре.

Изобретение иллюстрируется таблицами:

в табл. 1 - приведено содержание розмариновой кислоты, % от сухого веса;

в табл. 2 - показана продуктивность (мг/л) каллусной культуры М. maritima при различном освещении.

Способ осуществляют следующим образом:

Для выращивания каллусов M. maritima используют известную агаризированную питательную среду WB/А, среда (Bulgakov, V.P., Tchernoded, G.K., Mischenko, N.P., Khodakovskaya, M.V., Glazunov, V. P., Radchenko, S.V., Zvereva, E.V., Fedoreyev, S.A., Zhuravlev, Y.N., 2002. Effect of salicylic acid, methyl jasmonate, ethephon and cantharidin on anthraquinone production by Rubia cordifolia callus cultures transformed with the rolB and rolC genes. J. Biotechnol. 97 (3), 213-221. https://doi.org/10.1016/s0168-1656(02) 00067-6) Следующего состава, мг/1 л воды:

NH₄NO₃ – 400;

KNO₃ – 1900;

K₂HPO₄ – 170;

CaCl₂×6H₂O – 440;

MgSO₄×7H₂O – 370;

H₃BO₄ - 6,2;

MnSO₄×4H₂O - 16,9;

CuSO₄×5H₂O - 0,025;

CoCl₂×2H₂O - 0,025;

ZnSO₄×7H₂O - 8,6;

Na₂MoO₄×2H2O - 0,25;

KJ - 0,83;

FeSO₄×7H₂O - 27,8;

Na₂EDTA×2H₂O - 37,3;

Мезоинозит – 100;

Тиамина гидрохлорид - 0,2;

Никотиновая кислота - 0,5;

Пиридоксина гидрохлорид - 0,5;

Казеина гидролизат – 100;

6-бензиламинопурин - 0,5;

α-нафтилуксусная кислота – 2;

Сахароза – 25000;

Агар – 7000;

Вода - до 1 л;

рН среды 5,6-5,8 до автоклавирования.

Количественное определение розмариновой кислоты определяют методом ВЭЖХ с использованием хроматографа 1260 Infinity Agilent Technologies (или аналогичного), оснащенного системой насосов высокого давления и спектрофотометрическим детектором с диодной матрицей. Разделение проводят на аналитической колонке Zorbax C18 (150мм, 2.1 мм, 3,5 мкм, Agilent, США) термостатированной при 40°С. Подвижная фаза состоит из раствора муравьиной кислоты (0,1 %) в деионизированной воде (раствор А) и ацетонитрила (раствор Б). Градиентное элюирование проводят со скоростью потока растворителей 0,2 мл/мин по следующей схеме: от 0 % до 40% раствора Б за 35 мин, затем до 98 % раствора Б до 40 мин и 98 % раствора Б до 55 мин; или аналогичной. Хроматографический сигнал при λ 325 нм записывают и используют для количественного определения розмариновой кислоты. Результаты анализов обрабатываются программой Agilent OpenLAB CDS software (v.01.06.111). Содержание розмариновой кислоты в образцах определяют методом абсолютной градуировки.

Пример 1.

Недифференцированные клетки Мертензии приморской (200 мг), полученные более 10 лет назад (Fedoreyev S.A., Inyushkina Y.V., Bulgakov V.P., Veselova M.V., Tchernoded G.K., Gerasimenko A.V., Zhuravlev Y.N. 2012. Production of allantoin, rabdosiin and rosmarinic acid in callus cultures of the seacoastal plant Mertensia maritima (Boraginaceae). // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Vol.110. N.1. P.183-188) и хранящиеся в коллекции культурь тканей ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН, помещают в культуральные сосуды, в частности, в колбы Эрленмейера объемом 200 мл, содержащие 100 мл агаризованной питательной среды следующего состава, и культивируют в течение 7 суток в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 60±10%. Следующие 21 сутки культуру освещают светодиодами зеленого света, с длиной волны 520 +/- 10 нм. и плотностью потока фотосинтетических фотонов 100+/-10 мкмоль/ (кв.м*с) при фотопериоде 16 часов «день», 8 часов «ночь» каждые сутки. Затем каллусы извлекают из культуральных сосудов и высушивают в токе горячего воздуха при температуре 50-55°С.

Образцы высушенной каллусной ткани для количественного определения розмариновой кислоты экстрагируют 80% метанолом с использованием ультразвуковой бани. Экстракт фильтруют и аликвоту 1-5 мкл используют для анализа. Стандартный образец розмариновой кислоты (≥98% (HPLC), EP Y0000786) растворяют в 80% метаноле (три или более разведений в пределах концентраций от 100мг/мл до 1000мг/мл), анализируют и используют для определения градуировочной характеристики.

Количественное содержание розмариновой кислоты в полученных экстрактах определяют методом ВЭЖХ с использованием хроматографа 1260 Infinity Agilent Technologies (или аналогичного), оснащенного системой насосов высокого давления и спектрофотометрическим детектором с диодной матрицей. Разделение проводят на аналитической колонке Zorbax C18 (150мм, 2.1 мм, 3,5 мкм, Agilent, США) термостатированной при 40°С. Подвижная фаза состоит из раствора муравьиной кислоты (0,1 %) в деионизированной воде (раствор А) и ацетонитрила (раствор Б). Градиентное элюирование проводят со скоростью потока растворителей 0,2 мл/мин по следующей схеме: от 0 % до 40% раствора Б за 35 мин, затем до 98 % раствора Б до 40 мин и 98 % раствора Б до 55 мин; или аналогичной. Хроматографический сигнал при λ 325 нм записывают и используют для количественного определения розмариновой кислоты. Результаты анализов обрабатываются программой Agilent OpenLAB CDS software (v.01.06.111).Содержание розмариновой кислоты в образцах определяют методом абсолютной градуировки. Содержание розмариновой кислоты в выращенном каллусе представлено в табл. 1.

Пример 2.

Способ осуществляется, как описано в примере 1, но 21 сутки культуру освещают светодиодами красного света, с длиной волны 660 +/- 20 нм. и плотностью потока фотосинтетических фотонов 100+/-10 мкмоль/ (кв.м*с) при фотопериоде 16 часов «день», 8 часов «ночь» каждые сутки.

Количественное содержание розмариновой кислоты в выращенной каллусной культуре приведено в табл. 1.

Пример 3.

Для доказательства технического результата количественное содержание розмариновой кислоты определили также в стеблях, корнях и листьях растения M. Maritima. Подготовку проб и анализ проводили согласно описанию, приведенному в Примере 1. Результаты приведены в табл. 2.

Как следует из табл. 1. Способ культивирования каллусной культуры растения M. maritima, позволяет повышать продуктивность, обеспечивает воспроизводимым биотехнологическим источником природной розмариновой кислоты. Заявляемым способом из каллусов растения M. maritima получают розмариновой кислоты в 3 раза больше, чем его содержится в природном растении,

Из табл. 2 наглядно видно, что облучение культуры каллусов растения M. maritima светодиодами красного или зеленого света, с длиной волны 660 +/- 20 нм. и плотностью потока фотосинтетических фотонов 100+/-10 мкмоль/ (кв.м*с) при фотопериоде 16 часов «день», 8 часов «ночь» каждые сутки не оказывает негативного влияния на ростовые характеристики культуры по сравнению с контрольными условиями (темнота), и обеспечивает не только повышение содержания розмариновой кислоты в клетках, но повышение продуктивности за счет стабильного роста культуры.

Полученные данные позволяют заключить, что удельное содержание розмариновой кислоты при выращивании каллусных тканей M. maritima в миллиграмм на 1 грамм сухого веса при освещении каллусов Мертензии приморской зеленым или красным светом больше, чем без освещения на 238%. и 203% соответственно.

Таким образом, заявленное техническое решение обеспечивает достижение заявленного технического результата - получить каллусную культуру M. maritima (L.), обогащенную розмариновой кислотой, причем процесс культивирования каллусной культуры осуществляется в условиях, несвязанных с выращиванием и сбором растений в поле.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению и выращиванию каллусных культур лекарственных растений, и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения сырья, представляющего собой каллусную культуру растения Mertensia maritima (L.) S.F.Gray линия Mm-S1 с целью выделения комплекса биологически активных веществ, в частности розмариновой кислоты. Способ заключается в следующем: недифференцированные клетки M. maritima помещают в культуральные сосуды, содержащие агаризованную питательную среду WB/А, и культивируют в течение 7 суток в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 60±10%, после чего следующие 21 сутки образовавшиеся каллусы культивируют, облучая их красным светом с длиной волны 660±20 нм или зеленым светом с длиной волны 520±10 нм и плотностью потока фотосинтетических фотонов 100±10 мкмоль/ (кв. м⋅с) при фотопериоде 16 ч «день», 8 ч «ночь» каждые сутки. Заявленное изобретение позволяет получить каллусную культуру M. maritima (L.), обогащенную розмариновой кислотой, причем процесс культивирования каллусной культуры осуществляется в условиях, не связанных с выращиванием и сбором растений в поле. 2 табл.

Способ выращивания каллусных тканей Mertensia maritima (L.) S.F.Gray, включающий помещение недифференцированных клеток в культуральные сосуды, содержащие агаризованную питательную среду WB/А, при этом недифференцированные клетки культивируют в течение 7 суток в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 60±10%, а затем 21 сутки культивируют, облучая выращиваемую культуру красным светом с длиной волны 660±20 нм или зеленым светом с длиной волны 520±10 нм и плотностью потока фотосинтетических фотонов 100±10% мкмоль/кв. м⋅с при фотопериоде 16 ч «день», 8 ч «ночь» каждые сутки.