СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕФИЦИТОВ ИЗОТИПОВ С4А И С4В КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/68 G01N33/544 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения изотипического состава компонентов комплемента в cыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Синтез компонента С4 комплемента человека кодируется двумя независимыми генами С4А и С4В. Наличие дефицита по одному из генов приводит к обнаружению в сыворотке крови только одного из изотипов белка, тогда как в норме в крови имеются оба изотипа. Белки С4А и С4В (кодируемые генами С4А и С4В) являются носителями антигенов групповых веществ крови, соответственно, Rodgers и Chido и отличаются электрофоретической подвижностью. С4А быстрее движется к аноду при электрофорезе в агарозном геле, что и послужило основой наиболее распространенного метода типирования этих белков [1].

Наследственные дефициты какого-либо из изотипов С4 является причиной подверженности аутоиммунным заболеваниям, что и обусловило необходимость типирования. В мире имеется 12 референс-лабораторий, в которых проводится такое типирование с использованием в основном трех весьма сложных методов: электрофореза предварительно десиалированного белка, определения Rg/Ch-антигенов и исследования структуры α -цепей С4 [2]. Трудности типирования С4 приводят к весьма ограниченному его использованию в клинической практике. Кроме того, существенным для проявления функциональных свойств этого белка являются различия в строении изотипов, а не многочисленные аллотипические отличия.

Функциональные отличия изотипов C4A и C4B состоят в том, что оба они, будучи переведенными в короткоживущую активированную форму C4b, способны ковалентно связываться с мишенью-активатором, но изотоп C4A более эффективно реагирует с аминогруппами иммунных агрегатов, активирующих комплемент, а C4B - с гидроксильными группами полисахаридов клетки-мишени (3).

На сегодняшний день практически единственным методом определения функциональной активности C4 компонента комплемента является гемолитический метод [4], не отличающийся высокой степенью воспроизводимости и неохотно используемый клиницистами из-за трудностей, связанных с приготовлением гемолитической системы на основе эритроцитов барана. Кроме того в этом методе преимущественно определяется функциональная активность изотипа C4B, поскольку мишенью для его связывания являются эритроциты, богатые полисахаридами [3]. Метод определения функциональной активности C4, в котором бы преимущественно определялся изотип C4A, отсутствует.

Нами разработан способ, позволяющий определять функциональную активность компонента C4 системы комплемента человека преимущественно для C4A или C4B изотипа на основе иммуноферментного метода и по результатам определения судить о наличии или отсутствии соответствующих дефицитов.

Способ осуществляется следующим образом: в лунках микропанели последовательно сорбируют сначала либо иммуноглобулины классов G или М, нативные или агрегированные предварительным нагреванием (для преимущественного определения активности C4A - метод A), либо липополисахариды клеточной стенки грамотрицательных бактерий (для преимущественного определения активности C4B - метод B), затем определяемого C4 из растворов, его содержащих, в присутствии сыворотки морской свинки. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C4 фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного компонента C4 ковалентно связываться с активатором после активации классического пути комплемента агрегированным иммуноглобулином или липополисахаридом [5]. Вычисляют отношения активностей C4. определенных методами A и B, путем деления результата определения активности по методу В на результат определения активности по методу A, о наличии или отсутствии дефицитов изотипов компонентов C4A и C4B судят по значению отношения активностей: если это отношение превышает стандартное отношение, полученное таким же образом для пула из 10 сывороток здоровых доноров, в 2 и более раз - это означает наличие дефицита изотипа компонента C4A, если же это отношение ниже стандартного в 2 и более раз - это означает наличие дефицита изотипа компонента C4B (таблица).

Пример. Определение функциональной активности препарата C4 (метод A). Растворяют иммунохимически чистый IgG или IgM или их агрегаты, полученные предварительным нагреванием при 63^oC, в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS⁺⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего C4 в растворе VBS⁺⁺, в виде прогрессивных двукратных разведений. Во все лунки планшета вносят по 10 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг орто-фенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой.

Определение функциональной активности препарата C4 (метод В). Растворяют препарат липополисахарида в 0,05 М натрий- карбонатном буфере, pH 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS⁺⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего C4 в растворе VBS⁺⁺, в виде прогрессивных двукратных разведений. Во все лунки планшета вносят по 10 мкл сыворотки морской свинки, не содержащей активного компонента C4. После инкубации в термостате стате в течение 1 ч при 37^oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг орто-фенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой.

Определение изотипов C4 компонента комплемента в сыворотках больных аутоиммунными заболеваниями (наиболее часто имеющими дефициты). После определения функциональной активности C4 методами A и B делят второе значение на первое (В/А) и вычисляют процент от стандартного соотношения, определенного на пуле сывороток 10 здоровых доноров, не содержащих дефицитов. Значения отношения активностей C4B к C4A в 2 и более раз выше или в 2 и более раз ниже стандарта, полученного для пула из 10 сывороток здоровых доноров, означают наличие соответственно дефицитов C4A или C4B (таблица). Как следует из данных таблицы, при отношении активностей компонента C4, определенных методами A и B, (В/А), составляющих менее 50% от стандартного, имеется дефицит изотипа C4B, а при отношении активностей в 200% и выше имеются дефициты C4A.

ЛИТЕРАТУРА
1. Awdeh Z.L., Alper C.A. Inherited structure polymorphism of the foutrh component of human complement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. N 6. P. 3576-3580.

2. Mauff G., Alper C.A., Awdeh Z. et al. Statement on the nomenclature of human C4 allotypes. Immunobiol. 1983. V. 164. N 12. P. 184-191.

3. Law S.K.A., Dobbs A.W., Porter R.R. A comparison of the properties of two classes, C4A and C4B, of human complement component C4. The EMBO Journal. 1984. V. 3. N 8. P. 1819-1823.

4. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, C4 и С5. Биоорганическая химия. 1982. Т. 8. N 5. С. 652-659.

5. Козлов Л. В., Зинченко А.А., Соляков Л.С., Сизой М.Н., Ищенко А.М., Мартюшин С.В., Андреев С.В. Механизм активации комплемента человека иммуностимуляторами из клеточных стенок бактерий. Биоорганическая химия. 1983. Т. 9. N 8. С. 1047-1055.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения изотипического состава компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. В лунках микропанели последовательно сорбируют сначала иммуноглобулины классов G или M, нативные или агрегированные предварительным нагреванием для преимущественного определения активности C4A - метод A. Либо сорбируют липополисахариды клеточной стенки грамотрицательных бактерий для преимущественного определения активности C4B - метод B. Затем вносят в лунки определяемый C4 из растворов, его содержащих, в присутствии сыворотки морской свинки. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C4 комплемента человека определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к компоненту C4 комплемента человека - фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом. Определяют отношение активностей, полученных методами A и B. Если эти отношения выше или ниже стандартного отношения, полученного для пула сывороток 10 здоровых доноров, в 2 раза или больше, то имеется соответственно дефицит C4A или C4B. Способ позволяет определить дефицит изотипов C4A и C4B компонента комплемента человека на основе иммуноферментного метода и может быть использован в клинической практике. 1 табл.

Способ определения дефицитов изотипов C4A и C4B компонента комплемента человека, отличающийся тем, что проводят определение активности компонента C4 комплемента человека по методу A, для чего сорбируют в лунках микропанели неспецифические иммуноглобулины G или M, в лунки микропанели вносят раствор, содержащий определяемый компонент C4, и сыворотку морской свинки, проводят инкубацию, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C4 человека и субстрат этого фермента и определяют активность компонента C4 по продукту ферментативной реакции, затем проводят определение активности компонента C4 комплемента человека по методу B, для чего сорбируют в лунках микропанели липополисахарид из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в лунки микропанели вносят раствор, содержащий определяемый компонент C4, и сыворотку морской свинки, проводят инкубацию, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C4 человека и субстрат этого фермента и определяют активность компонента C4 по продукту ферментативной реакции, после чего вычисляют отношения активности C4, определенных методами A и B, путем деления результата определения активности по методу B на результат определения активности по методу A, о наличии или отсутствии дефицитов изотипов компонентов C4A и C4B судят по значению отношения активности следующим образом, если это отношение превышает стандартное отношение, полученное таким же путем для пула из 10 сывороток здоровых доноров, в 2 и более раз, устанавливают наличие дефицита изотипа C4A компонента комплемента, если же это отношение ниже стандартного в 2 и более раз, устанавливают наличие дефицита изотипа C4B компонента комплемента.