СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ РАССТРОЙСТВ Российский патент 2015 года по МПК A61K38/10 A61P1/04 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения различных расстройств, включая желудочно-кишечные расстройства, ожирение, застойную сердечную недостаточность и доброкачественную гиперплазию предстательной железы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Синдром раздраженной толстой кишки (СРК (IBS)) представляет собой хроническое расстройство кишечника, которое поражает от 20 до 60 миллионов людей только в США (Lehman Brothers, Global Healthcare-Irritable bowel syndrome industry update, Сентябрь 1999). СРК является наиболее обычным расстройством, диагностируемым гастроэнтерологами (28% обследуемых пациентов), и является причиной 12% визитов к врачам общей практики (Camilleri 2001, Gastroenterology 120:652-668). В США экономический вклад СРК оценивается как $25 миллиардов ежегодно, посредством прямых затрат на нужды здравоохранения и непрямых затрат невыхода на работу (Talley 1995, Gastroenterology 109:1736-1741). Пациенты с СРК имеют в три раза больше невыходов на работу и сообщений о сниженном качестве жизни. Страдающие этим могут быть неспособны или не иметь желания посещать общественные мероприятия, сохранять работу или путешествовать даже на короткие расстояния (Drossman 1993, Dig Dis Sci 38:1569-1580). Существует огромная неудовлетворенная медицинская потребность у данной группы населения, так как для лечения СРК существует немного вариантов рецептур.

Пациенты с СРК страдают от боли в животе и нарушения работы кишечника. Определены три подгруппы пациентов с СРК на основании преобладающей особенности функционирования кишечника: с преобладанием запоров (з-СРК), с преобладанием диареи (д-СРК) или изменяющаяся между двумя (и-СРК). Оценка людей, которые страдают от з-СРК, варьируется от 20-50% пациентов с СРК, с часто упоминаемыми 30%. В противоположность другим двум подгруппам, которые имеют сходное соотношение по полу, з-СРК чаще встречается у женщин (соотношение 3:1) (Talley et al. 1995, Am J Epidemiol 142:76-83).

Определение и диагностические критерии для СРК официально приведены в "Rome Criteria" (Drossman et al. 1999, Gut 45:Suppl II: 1-81), который хорошо принят в клинической практике. Однако комплекс симптомов не объясняется анатомическими нарушениями или метаболическими изменениями. Это привело к классификации СРК как функционального ЖК расстройства, которое диагностируется на основании критериев Rome и ограниченного обследования для исключения органического заболевания (Ringel et al. 2001, Annu Rev Med 52: 319-338). СРК рассматривается как «биопсихосоциальное» расстройство, возникающее в результате комбинации трех взаимодействующих механизмов: измененная подвижность кишечника, повышенная чувствительность тонкой или толстой кишки к болевым стимулам (висцеральная чувствительность) и психосоциальные факторы (Camilleri 2001, Gastroenterology 120:652-668). В последнее время существуют увеличивающиеся доказательства роли воспаления в этиологии СРК. Сообщения показывают, что подгруппы пациентов с СРК имеют небольшое, но достоверное увеличение воспалительных и тучных клеток толстой кишки, увеличенные индуцибельный оксид азота (NO) и синтазу (iNOS) и измененную экспрессию воспалительных цитокинов (в обзоре Talley 2000, Medscape Coverage of DDW week).

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает композиции и связанные способы для лечения СРК и других желудочно-кишечных расстройств и состояний (например, расстройств желудочно-кишечной моторики, функциональных желудочно-кишечных расстройств, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ (GERD)), болезни Крона, язвенного колита, воспалительных заболеваний кишечника, функциональной изжоги, диспепсии (включая функциональную диспепсию или неязвенную диспепсию), гастропареза, хронической тонкокишечной псевдообструкции (или толстокишечной псевдообструкции) и расстройств и состояний, ассоциированных с запорами, например запоры, ассоциированные с использованием опиатных болеутоляющих средств, постхирургические запоры и запоры, ассоциированные с нейропатическими расстройствами, а также других состояний и расстройств. Композиции отличаются наличием пептидов, которые активируют рецептор гуанилатциклазы C (ГЦ-C).

Настоящее изобретение также касается композиций и связанных способов для лечения ожирения, застойной сердечной недостаточности и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГП (BPH)).

Без связи с какой-либо определенной теорией, в случае СРК и других желудочно-кишечных расстройств пептиды являются применимыми, так как они могут увеличивать желудочно-кишечную моторику.

Без связи с какой-либо определенной теорией, в случае СРК и других желудочно-кишечных расстройств пептиды являются применимыми отчасти, так как они могут уменьшать воспаление.

Без связи с какой-либо определенной теорией, в случае СРК и других желудочно-кишечных расстройств пептиды также являются применимыми, так как они могут уменьшать желудочно-кишечную или висцеральную боль.

Изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие определенные пептиды, которые способны активировать рецептор гуанилатциклазы С (ГЦ-C). Также в рамках изобретения находятся фармацевтические композиции, включающие пептид по изобретению, а также комбинированные композиции, включающие пептид по изобретению и второй терапевтический агент, например агент для лечения запора (например, SPI-0211; Sucampo Pharmaceuticals, Inc.; Bethesda, MD) или некоторых других желудочно-кишечных расстройств. Примеры второго терапевтического агента включают: агенты, понижающие кислотность, такие как ингибиторы протонового насоса и блокаторы Н2 рецепторов, прокинетические, такие как агонисты рецептора 5HT (например, Zelnorm®), противовоспалительные агенты, спазмолитические средства, антидепрессанты, обезболивающие агенты центрального действия, такие как агонисты опиоидных рецепторов, антагонисты опиоидных рецепторов, агенты для лечения воспалительных заболеваний кишечника, болезни Крона и язвенного колита (например, Traficet-EN^TM (ChemoCentryx, Inc.; San Carlos, CA), агенты, которые лечат желудочно-кишечную или висцеральную боль и ингибиторы цГМФ фосфодиэстеразы (мотапизон, запринаст и сульдинаксульфон). Таким образом, например, фармацевтические композиции могут включать обезболивающий агент, выбираемый из группы, состоящей из: блокаторов Ca каналов (например, зиконотида), антагонистов рецептора 5HT (например, антагонистов рецепторов 5HT3, 5HT4 и 5HT1), агонистов опиоидных рецепторов (например, лоперамид, федотозин и фентанил, налоксон, налтрексон, метилналозон, налмефен, ципридим, бета фуналтрексамин, налоксоназин, налтриндол и нор-биналторфимин, морфин, дифенилоксилат, пентапептид энкефалина и тримебутин), антагонистов рецептора NK1 (например, эзлопитант и SR-14033), агонистов рецептора CCK (например, локсиглумид), антагонистов рецептора NK1, антагонистов рецептора NK3 (например, талнетант, осанетант (SR-142801)), ингибиторов обратного захвата норадреналина-серотонина (NSRI; например, милнаципран), антагонистов ваниллоидных и каннабаноидных рецепторов (например, арванил), сиалорфина, сиалорфин-связанных пептидов, включающих последовательность аминокислот QHNPR (SEQ ID NO: ) например, VQHNPR (SEQ ID NO: ); VRQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGPQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGPRQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGPRRQHNPR (SEQ ID NO: ); и RQHNPR (SEQ ID NO: ), соединений или пептидов, которые являются ингибиторами неприлизина, фракефамид (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH₂; WO 01/019849 Al), лоперамид, Tyr-Arg (киоторфин), агонисты рецептора CCK (церулеин), конотоксиновые пептиды, пептидные аналоги тимулина, локсиглюмид, декслоксиглюмид (R-изомер локсиглюмида) (WO 88/05774) и другие обезболивающие пептиды или соединения, которые могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Изобретение включает способы для лечения различных желудочно-кишечных расстройств введением пептида, который действует как частичный или полный агонист рецептора ГЦ-C (GC-C). Пептид включает, по меньшей мере, шесть цистеинов, которые образуют три дисульфидные связи. В определенных вариантах воплощения изобретения дисульфидные связи замещены другими ковалентными сшивками и в некоторых случаях цистеины замещены другими остатками для обеспечения альтернативных ковалентных сшивок. Пептиды также могут включать, по меньшей мере, один участок расщепления трипсином или химотрипсином и/или карбоксиконцевой обезболивающий пептид или небольшую молекулу, например AspPhe или некоторые другие обезболивающие пептиды. При присутствии в пептиде обезболивающему пептиду или небольшой молекуле может предшествовать участок расщепления химотрипсином или трипсином, который позволяет высвобождать обезболивающий пептид или небольшую молекулу. Пептиды и способы по изобретению являются также применимыми для лечения боли и воспаления, ассоциированного с различными расстройствами, включая желудочно-кишечные расстройства. Определенные пептиды включают функциональные участки расщепления химотрипсином или трипсином, расположенные так, чтобы позволить инактивировать пептид при расщеплении. Определенные пептиды, имеющие функциональные участки расщепления, подвергаются гидролизу и поэтапной инактивации в пищеварительном тракте, и это является желательным в некоторых обстоятельствах. В определенных пептидах функциональный химотрипсиновый участок изменен, увеличивая стабильность пептида in vivo.

Изобретение включает способы для лечения других расстройств, таких как застойная сердечная недостаточность и доброкачественная гиперплазия предстательной железы, введением пептида или небольшой молекулы (парентерально или перорально), который действует как агонист рецептора ГЦ-C. Такие агенты могут быть использованы в комбинации с натрийуретическими пептидами (например, предсердным натрийуретическим пептидом, мозговым натрийуретическим пептидом или натрийуретическим пептидом С-типа), диуретиком или ингибитором ангиотензин-превращающего фермента.

Изобретение включает способы и композиции для увеличения кишечной моторики. Кишечная моторика включает спонтанные скоординированные расслабления и сокращения желудка, тонкой кишки, толстой кишки и прямой кишки для продвижения пищи через желудочно-кишечный тракт во время процесса пищеварения.

В определенных вариантах воплощения пептиды включают одну или две или более смежные отрицательно заряженные аминокислоты (например, Asp или Glu), или один или два или более смежных положительно заряженных остатков (например, Lys или Arg), или одну или две или более смежных положительно или отрицательно заряженных аминокислот на карбоксильном конце. В таких вариантах воплощения изобретения все боковые аминокислоты на карбоксильном конце являются или положительно или отрицательно заряженными. В других вариантах воплощения изобретения карбоксиконцевым заряженным аминокислотам предшествует Leu. Например, следующие последовательности аминокислот могут быть добавлены к карбоксильному концу пептида: Asp; Asp Lys; Lys Lys Lys Lys Lys Lys; Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys; Leu Lys Lys; и Leu Asp. Также возможно просто добавить Leu на карбоксильный конец.

В первом аспекте изобретение включает пептид, содержащий, состоящий из или состоящий преимущественно из последовательности аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ представляет собой Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует, или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует. В определенных вариантах воплощения изобретения Xaa₈, Xaa₉, Xaa₁₂, Xaa₁₃, Xaa₁₄, Xaa₁₇, и Xaa₁₉ могут быть любой аминокислотой. В определенных вариантах воплощения изобретения Xaa₅ представляет собой Asn, Trp, Tyr, Asp или Phe. В других вариантах воплощения изобретения Xaa₅ также может быть Thr или Ile. В других вариантах воплощения изобретения Xaa₅ представляет собой Tyr, Asp или Trp. В некоторых вариантах воплощения изобретения Xaa₈ представляет собой Glu, Asp, Gln, Gly или Pro. В других вариантах воплощения изобретения Xaa₈ представляет собой Glu; в некоторых вариантах воплощения изобретения Xaa₉ представляет собой Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe, в некоторых вариантах воплощения изобретения Xaa₉ представляет собой Leu, Ile, Val, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe.

В определенных вариантах воплощения изобретения аминокислота может быть замещена неприродной аминокислотой или природным или неприродным аналогом аминокислоты. Например, ароматическая аминокислота может быть замещена 3,4-дигидрокси-L-фенилаланином, 3-йод-L-тирозином, трийодтиронином, L-тироксином, фенилглицином (Phg) или нор-тирозином (norTyr). Phg и norTyr и другие аминокислоты, включающие Phe и Tyr, могут быть замещены, например, галогеном, -CH₃, -OH, -CH₂NH₃, -C(O)H, -CH₂CH₃, -CN, -CH₂CH₂CH₃, -SH, или другой группой.

В некоторых вариантах воплощения изобретения Xaa₁₂ представляет собой Asn, Tyr, Asp или Ala. В других вариантах воплощения изобретения Xaa₁₂ представляет собой Asn. В некоторых вариантах воплощения изобретения Xaa₁₃ представляет собой Ala, Pro или Gly, и в других вариантах воплощения изобретения она является Pro. В некоторых вариантах воплощения изобретения Xaa₁₄ представляет собой Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg, или Asp, и в других вариантах воплощения изобретения она является Ala или Gly, и в еще других вариантах воплощения изобретения она является Ala. В некоторых вариантах воплощения изобретения Xaa₁₆ представляет собой Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ представляет собой Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ выбирают из Trp, Tyr, Phe, Asn и Leu или Xaa₁₉ выбирают из Trp, Tyr, и Phe или Xaa₁₉ выбирают из Leu, Ile и Val; или Xaa₁₉ является His или Xaa₁₉ выбирают из Trp, Tyr, Phe, Asn, Ile, Val, His и Leu; и Xaa₂₀Xaa₂₁ представляет собой AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉Xaa₂₀Xaa₂₁ отсутствует. Изобретение также предусматривает способы лечения желудочно-кишечных расстройств (например, расстройства желудочно-кишечной моторики, функционального желудочно-кишечного расстройства, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, функциональной изжоги, диспепсии, неязвенной диспепсии, гастропареза, хронической тонкокишечной псевдообструкции, толстокишечной псевдообструкции), ожирения, застойной сердечной недостаточности, доброкачественной гиперплазии предстательной железы введением композиции, включающей вышеупомянутый пептид.

Когда Xaa₉ представляет собой Trp, Tyr или Phe или когда Xaa₁₆ является Trp, пептид имеет потенциальный функциональный участок расщепления химотрипсином, который расположен в положении, где расщепление инактивирует связывание рецептора ГЦ-C пептидом. Когда Xaa₉ представляет собой Lys или Arg или когда Xaa₁₆ представляет собой Lys или Arg, пептид имеет потенциально функциональный участок расщепления трипсином, который расположен в положении, где расщепление инактивирует связывание рецептора ГЦ-C пептидом.

Когда Xaa₁₉ представляет собой Trp, Tyr или Phe, пептид имеет участок расщепления химотрипсином, который расположен в положении, где расщепление освободит часть пептидного карбоксильного конца до Xaa₁₉. Когда Xaa₁₉ является Leu, Ile или Val, пептид может иметь участок расщепления химотрипсином, который расположен в положении, где расщепление освободит аминоконцевую часть пептида до Xaa₁₉. При относительно высоком рН такой же эффект наблюдают, когда Xaa₁₉ является His. Когда Xaa₁₉ представляет собой Lys или Arg, пептид имеет участок расщепления трипсином, который расположен в положении, где расщепление освободит карбоксиконцевую часть пептида до Xaa₁₉. Следовательно, если пептид включает обезболивающий пептидный карбоксиконец до Xaa₁₉, пептид освободится в пищеварительном тракте при воздействии соответствующей протеазы. Среди обезболивающих пептидов, которые могут быть включены в пептид, находятся: AspPhe (как Xaa₂₀Xaa₂₁), эндоморфин-1, эндоморфин-2, ноцистатин, даларгин, люпрон, и субстанция P и другие обезболивающие пептиды, описанные в данном описании. Такие пептиды могут, например, использоваться для замещения Xaa₂₀Xaa₂₁.

Когда Xaa₁ или аминоконцевая аминокислота пептида по изобретению (например, Xaa₂ или Xaa₃) представляет собой Trp, Tyr или Phe, пептид имеет участок расщепления химотрипсином, который расположен в положении, где расщепление освободит аминоконцевую часть пептида, до Xaa₁ (или Xaa₂ или Xaa₃) вместе с Xaa₁, Xaa₂ или Xaa₃. Когда Xaa₁ или аминоконцевая аминокислота пептида по изобретению (например, Xaa₂ или Xaa₃) представляет собой Lys или Arg, пептид имеет участок расщепления трипсином, который расположен в положении, где расщепление освободит аминоконцевую часть пептида, до Xaa₁ вместе с Xaa₁, Xaa₂ или Xaa₃). Когда Xaa₁ или аминоконцевая аминокислота пептида по изобретению представляет собой Leu, Ile или Val, пептид может иметь участок расщепления химотрипсином, который расположен в положении, где расщепление освободит аминоконцевую часть пептида, до Xaa₁. При относительно высоком рН такой же эффект наблюдают, когда Xaa₁ является His. Следовательно, например, если пептид включает обезболивающий пептид, аминоконцевой к Xaa₁, пептид будет освобождаться в пищеварительном тракте при воздействии соответствующей протеазы. Среди обезболивающих пептидов, которые могут быть включены в пептид, находятся: AspPhe, эндоморфин-1, эндоморфин-2, ноцистатин, даларгин, люпрон и субстанция p и другие обезболивающие пептиды, описанные в настоящем описании.

При полной складчатости дисульфидные связи присутствуют между: Cys₆ и Cys₁₁; Cys₇ и Cys₁₅; и Cys₁₀ и Cys₁₈. Пептиды по изобретению имеют некоторое сходство последовательности с пептидами ST. Однако они включают аминокислотные изменения и/или добавления, которые улучшают функциональность. Такие изменения могут, например, увеличивать или уменьшать активность (например, увеличивать или уменьшать способность пептида стимулировать моторику кишечника), изменять способность правильно складываться, стабильность пептида, способность пептида связываться с рецептором ГЦ-C и/или уменьшать токсичность. В некоторых случаях пептиды могут функционировать более приемлемо, чем ST пептиды дикого типа. Например, они могут ограничивать нежелательные побочные эффекты, такие как диарея и обезвоживание.

В некоторых вариантах воплощения изобретения один или оба члена одной или более пар остатков Cys, которые в норме образуют дисульфидную связь, могут быть замещены гомоцистеином, 3-меркаптопролином (Kolodziej et al. 1996 Int J Pept Protein Res 48:274); β,β-диметилцистеином (Hunt et al. 1993 Int J Pept Protein Res 42:249) или диаминопропионовой кислотой (Smith et al. 1978 J Med Chem 21:117) с образованием альтернативных внутренних сшивок в положениях нормальных дисульфидных связей.

Кроме того, одна или более дисульфидных связей могут быть замещены альтернативными ковалентными связями, например амидной связью, сложноэфирным звеном, алкильным звеном, тиосложноэфирным звеном, лактамовым мостиком, карбамоиловым мостиком, мочевинным звеном, тиомочевинным звеном, звеном фосфонатного сложного эфира, алкильным звеном и алкенильным звеном, эфиром, тиоэфирным звеном или аминозвеном. Например, Ledu et al. (Proceedings Nat'l Acad. Sci. 100:11263-78, 2003) описывает способы получения лактамных и амидных сшивок. Schafmeister et al. (J. Am. Chem. Soc. 122:5891,2000) описывает стабильные, полностью углеродные сшивки. В некоторых случаях образование таких альтернативных сшивок требует замещения остатков Cys другими остатками, такими как Lys или Glu или неприродными аминокислотами.

В случае пептида, включающего последовательность (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствуют и/или последовательность Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует, пептид может все еще содержать дополнительные карбоксиконцевые или аминоконцевые аминокислоты или и те, и другие. Например, пептид может включать аминоконцевую последовательность, которая способствует рекомбинантной продукции пептида и отщепляется перед введением пептида пациенту. Пептид также может включать другие аминоконцевые или карбоксиконцевые аминокислоты. В некоторых случаях дополнительные аминокислоты защищают пептид, стабилизируют пептид или изменяют активность пептида. В некоторых случаях некоторые или все из этих дополнительных аминокислот удаляются перед введением пептида пациенту. Пептид может включать 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более аминокислот на своем аминоконце или карбоксиконце или на обоих. Количество боковых аминокислот не должно быть одинаковым. Например, может быть 10 дополнительных аминокислот на аминоконце пептида и ни одной на карбоксиконце.

В одном варианте воплощения изобретения пептид включает аминокислотную последовательность (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; и Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует. Когда Xaa₂₀Xaa₂₁ и/или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствуют, могут быть дополнительные боковые аминокислоты в некоторых вариантах воплощения изобретения.

Во втором аспекте изобретение также предусматривает терапевтический или профилактический способ, включающий введение пептида, включающего последовательность аминокислот (I): Хаа₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Хаа₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr или Phe; Xaa₈ является Glu, Asp, Gln, Gly или Pro; Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn, Tyr, Asp или Ala; Xaa₁₃ является Pro или Gly; Xaa₁₄ является Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg и Asp; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu; и Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует.

В определенных вариантах воплощения терапевтических или профилактических способов: пептид включает последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr, или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp, или Xaa₁₆ является любой аминокислотой, или Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp, или Xaa₁₆ является любой неароматической аминокислотой; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; и Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует.

В определенных вариантах воплощения изобретение обеспечивает очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот (II):

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Asn₁₂ Pro₁₃ Ala₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Gly₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn;

Xaa₈ является Glu или Asp;

Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Trp, Tyr или Phe;

Xaa₁₆ является Thr, Ala, Trp;

Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu или отсутствует; и Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe.

В различных предпочтительных вариантах воплощения изобретение предусматривает очищенный полипептид, содержащий последовательность аминокислот (II): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Asn₁₂ Pro₁₃ Ala₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Gly₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где Xaa₉ является Leu, Ile или Val и Xaa₁₆ является Trp, Tyr или Phe; Xaa₉ является Trp, Tyr или Phe, и Xaa₁₆ является Thr или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe и Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe; и Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn; пептид включает менее чем 50, 40, 30 или 25 аминокислот; менее чем пять аминокислот предшествует Cys₆.

Пептиды могут вводиться совместно с или связанными, например, ковалентно связанными с любым из множества других пептидов, включая обезболивающие пептиды или обезболивающие соединения. Например, терапевтический пептид по изобретению может быть связан с обезболивающим агентом, выбираемым из группы, состоящей из: блокаторов Ca каналов (например, зиконотида), полных или частичных антагонистов рецепторов 5HT (например, антагонистов рецепторов 5HT3, 5HT4 и 5HT1), полных или частичных агонистов рецепторов 5HT, включая агонисты рецепторов 5HT3, 5HT4 (например, тегасерод, мозаприд и рензаприд) и 5HT1, агонистов рецептора CRF (NBI-34041), агонистов адренорецептора β-3, агонистов опиоидных рецепторов (например, лоперамид, федотозин и фентанил, налоксон, налтрексон, метилналозон, налмефен, ципридим, бета фуналтрексамин, налоксоназин, налтриндол и норбиналторфимин, морфин, дифенилоксилат, пентапептид энкефалина, азимадолин и тримебутин), антагонистов рецепторов NK1 (например, эзлопитант и SR-14033), агонистов рецепторов CCK (например, локсиглюмид), антагонистов рецепторов NK1, антагонистов рецепторов NK3 (например, талнетант, озанетант (SR-142801)), ингибиторов обратного захвата норадреналина-серотонина (NSRI; например, милнаципран), агонисты ваниллоидных и каннабаноидных рецепторов (например, арванил), сиалорфина, сиалорфин-связанных пептидов, включающих последовательность аминокислот QHNPR (SEQ ID NO: ) например, VQHNPR (SEQ ID NO: ); VRQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGPQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGPRQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGPRRQHNPR (SEQ ID NO: ); и RQHNPR (SEQ ID NO: ), соединений и пептидов, которые являются ингибиторами нерилизина, фракефамида (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH₂; WO 01/019849 Al), лоперамида, Tyr-Arg (киоторфина), агонистов рецепторов CCK (церулеин), конотоксиновых пептидов, пептидных аналогов тимулина, локсиглюмида, декслоксиглюмида (R-изомер локсиглюмида) (WO 88/05774), и другие обезболивающие пептиды или соединения могут быть использованы вместе с или связанными с пептидами по изобретению.

Аминокислотные, неаминокислотные, пептидные и непептидные промежуточные вставки могут быть вставлены между пептидом, который является агонистом рецептора ГЦ-C, и пептидом, который имеет какую-либо другую биологическую функцию, например обезболивающим пептидом или пептидом, используемым для лечения ожирения. Связующим звеном может быть таковое, которое отщепляется от боковых пептидов in vivo или таковое, которое остается связанным с боковыми пептидами in vivo. Например, глицин, бета-аланин, глицил-глицин, глицил-бета-аланин, гамма-аминомасляная кислота, 6-аминокапроновая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан и глицил-L-валил-L-фенилаланин могут быть использованы в качестве промежуточного звена (Chaltin et al. 2003 Helvetica Chimica Acta 86:533-547; Caliceti et al. 1993 FARMCO 48:919-32), также могут полиэтиленгликоли (Butterworth et al. 1987 J. Med. Chem 30:1295-302) и производные малеинимида (King et al. 2002 Tetrahedron Lett. 43:1987-1990). Различные другие связующие звенья описаны в литературе (Nestler 1996 Molecular Diversity 2:35-42; Finn et al. 1984 Biochemistry 23:2554-8; Cook et al. 1994 Tetrahedron Lett. 35:6777-80; Brokx et al. 2002 Journal of Controlled Release 78:115-123; Griffin et al. 2003 J. Am. Chem. Soc. 125:6517-6531; Robinson et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5929-5934.

Пептиды могут включать последовательность аминокислот пептида, который существует в природе у видов позвоночных (например, млекопитающих) или у видов бактерий. Кроме того, пептиды могут быть частично или полностью неприродными пептидами. Также в рамках изобретения находятся пептидомиметики, соответствующие пептидам по изобретению. В различных вариантах воплощения изобретения пациент страдает от желудочно-кишечного расстройства; пациент страдает от расстройства, выбираемого из группы, состоящей из: расстройств желудочно-кишечной моторики, синдрома раздраженной толстой кишки, хронических запоров, функциональных желудочно-кишечных расстройств, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, функциональной изжоги, диспепсии, функциональной диспепсии, неязвенной диспепсии, гастропареза, хронической тонкокишечной псевдообструкции, болезни Крона, язвенного колита, синдрома раздраженной толстой кишки, толстокишечной псевдообструкции, ожирения, застойной сердечной недостаточности или доброкачественной гиперплазии предстательной железы; композицию вводят перорально; пептид включает 30 или менее аминокислот, пептид включает 20 или менее аминокислот, и пептид включает не более чем 5 аминокислот перед Cys₆; пептид включает 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, или 30, или менее аминокислот. В других вариантах воплощения изобретения пептид включает 20 или менее аминокислот. В других вариантах воплощения изобретения пептид включает не более чем 20, 15, 10 или 5 пептидов, последующих за Cys₁₈. В определенных вариантах воплощения изобретения Xaa₁₉ является участком расщепления химотрипсином или трипсином и обезболивающий пептид присутствует непосредственно после Xaa₁₉.

В третьем аспекте изобретение обеспечивает способ для лечения пациента, страдающего от запоров. Клинически принятые критерии, которые определяют запор, варьируются от частоты дефекации, консистенции фекалий и простоты дефекации. Одним обычным определением запора является менее чем три испражнения в неделю. Другие определения включают ненормально трудные испражнения или дефекацию, которая требует избыточного напряжения (Schiller 2001, Aliment Pharmacol Ther 15:749-763). Запоры могут быть идиопатическими (функциональные запоры или запоры медленного прохождения) или вторичными из-за других причин, включая неврологические, метаболические или эндокринные расстройства. Такие расстройства включают сахарный диабет, гипотиреоз, гипертиреоз, гипокальциемию, рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, повреждения спинного мозга, нейрофиброматоз, автономную нейропатию, болезнь Шагаса, болезнь Гирсшпрунга и муковисцидоз. Запоры также могут быть результатом хирургического вмешательства (послеоперационная непроходимость кишечника) или применения лекарственных средств, таких как обезболивающие средства (как опиоиды), гипотензивные средства, противосудорожные средства, антидепрессанты, спазмолитические средства и антипсихотические средства.

Способ включает введение композиции, включающей очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, или Phe; Xaa₈ является Glu, Asp, Gln, Gly или Pro; Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn, Tyr, Asp или Ala; Xaa₁₃ является Pro или Gly; Xaa₁₄ является Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg, и Asp; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует.

В одном варианте воплощения способа пептид включает последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует.

В различных предпочтительных вариантах воплощения изобретения запор ассоциирован с применением терапевтического агента; запор ассоциирован с нейропатическим расстройством; запор переставляет собой постхирургический запор (послеоперационная непроходимость кишечника); и запор ассоциирован с желудочно-кишечным расстройством; запор является идиопатическим (функциональный запор или запор медленного прохождения); запор ассоциирован с нейропатическим, метаболическим или эндокринным расстройством (например, сахарный диабет, гипотиреоз, гипертиреоз, гипокальциемия, рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, повреждения спинного мозга, нейрофиброматоз, автономная нейропатия, болезнь Шагаса, болезнь Гиршспрунга или муковисцидоз). Запор также может быть результатом хирургического вмешательства (послеоперационная непроходимость кишечника) или применения лекарственных средства, таких как обезболивающие средства (например, опиоиды), гипотензивных средств, противосудорожных средств, антидепрессантов, спазмолитических средств и антипсихотических средств.

В четвертом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения пациента, страдающего от желудочно-кишечного расстройства, способ включает введение пациенту композиции, включающей очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn, Tip, Tyr, Asp, Ile, Thr или Phe; Xaa₈ является Glu, Asp, Gln, Gly или Pro; Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn, Tyr, Asp или Ala; Xaa₁₃ является Pro или Gly; Xaa₁₄ является Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg и Asp; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉Xaa₂₀Xaa₂₁ отсутствует.

В одном варианте воплощения способа пептид включает последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует.

В различных вариантах воплощения изобретения пациент страдает от желудочно-кишечного расстройства; пациент страдает от расстройства, выбираемого из группы, состоящей из: расстройства желудочно-кишечной моторики, синдрома раздраженной толстой кишки, хронических запоров, функционального желудочно-кишечного расстройства, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, функциональной изжоги, диспепсии, функциональной диспепсии, неязвенной диспепсии, гастропареза, хронической тонкокишечной псевдообструкции, болезни Крона, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, толстокишечной псевдообструкции, ожирения, застойной сердечной недостаточности или доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

В предпочтительных вариантах воплощения изобретения Xaa₉ является Leu, Ile или Val и Xaa₁₆ является Trp, Tyr или Phe; Xaa₉ является Trp, Tyr или Phe и Xaa₁₆ является Thr или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe; Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn.

В пятом аспекте изобретение предусматривает способ увеличения желудочно-кишечной моторики у пациента; данный способ включает: введение пациенту композиции, включающей очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr или Phe; Xaa₈ является Glu, Asp, Gln, Gly или Pro; Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn, Tyr, Asp или Ala; Xaa₁₃ является Pro или Gly; Xaa₁₄ является Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg, и Asp; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉Xaa₂₀Xaa₂₁ отсутствует.

В одном варианте воплощения изобретения пептид включает последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует.

В шестом аспекте изобретение предусматривает способ для увеличения активности рецептора кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C) у пациента; данный способ включает: введение пациенту композиции, включающей очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr или Phe; Xaa₈ является Glu, Asp, Gln, Gly или Pro; Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn, Tyr, Asp или Ala; Xaa₁₃ является Pro или Gly; Xaa₁₄ является Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg и Asp; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует.

В одном варианте воплощения изобретения пептид включает последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует.

В седьмом аспекте изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, включающий последовательность аминокислот: (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr или Phe; Xaa₈ является Glu, Asp, Gln, Gly или Pro; Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn, Tyr, Asp или Ala; Xaa₁₃ является Pro или Gly; Xaa₁₄ является Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg и Asp; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует.

В одном варианте воплощения изобретения пептид включает последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Хаа₃ Хаа₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Хаа₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует.

В восьмом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения запоров, способ включает введение агониста рецептора кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C). В различных вариантах воплощения изобретения: агонист представляет собой пептид, пептид включает четыре Cys, которые образуют две дисульфидные связи и пептид включает шесть Cys, которые образуют три дисульфидные связи.

В девятом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения желудочно-кишечного расстройства, расстройства желудочно-кишечной моторики, синдрома раздраженной толстой кишки, хронических запоров, функционального желудочно-кишечного расстройства, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, функциональной изжоги, диспепсии, функциональной диспепсии, неязвенной диспепсии, гастропареза, хронической тонкокишечной псевдообструкции, толстокишечной псевдообструкции, болезни Крона, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, ожирения, застойной сердечной недостаточности или доброкачественной гиперплазии предстательной железы, способ включает введение агониста рецептора кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C) перорально, посредством ректальных суппозиториев или парентерально. В различных вариантах воплощения изобретения: агонист представляет собой пептид, пептид включает четыре Cys, которые образуют две дисульфидные связи и пептид включает шесть Cys, которые образуют три дисульфидные связи.

В десятом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения желудочно-кишечного расстройства, выбираемого из группы, состоящей из: расстройства желудочно-кишечной моторики, синдрома раздраженной толстой кишки, хронических запоров, функционального желудочно-кишечного расстройства, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, функциональной изжоги, диспепсии, функциональной диспепсии, неязвенной диспепсии, гастропареза, хронической тонкокишечной псевдообструкции, толстокишечной псевдообструкции, болезни Крона, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, способ включает введение агониста рецептора кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C). В различных вариантах воплощения изобретения композицию вводят перорально; пептид включает 30 или менее аминокислот, пептид включает 20 или менее аинокислот и пептид включает не более чем 5 аминокислот перед Cys₅.

В различных вариантах воплощения изобретения: агонист представляет собой пептид, пептид включает четыре Cys, которые образуют две дисульфидные связи и пептид включает шесть Cys, которые образуют три дисульфидных связи.

В одиннадцатом аспекте изобретение обеспечивает способ для лечения ожирения, способ включает введение агониста рецептора кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C). В различных вариантах воплощения изобретения: агонист представляет собой пептид, пептид включает четыре Cys, которые образуют две дисульфидные связи, и пептид включает шесть Cys, которые образуют три дисульфидные связи.

В двенадцатом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения ожирения; данный способ включает введение полипептида, включающего последовательность аминокислот: (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr или Phe; Xaa₈ является Glu, Asp, Gln, Gly или Pro; Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn, Tyr, Asp или Ala; Xaa₁₃ является Pro или Gly; Xaa₁₄ является Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg и Asp; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu; и Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует. Пептид может вводиться отдельно или в комбинации с другим агентом для лечения ожирения, например сибутрамином или другим агентом, например агентом, описанным в настоящем описании.

В одном варианте воплощения изобретения пептид включает последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Хаа₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Хаа₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; и Xaa₂₀Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует.

В тринадцатом аспекте изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, включающую полипептид, описанный в настоящем описании.

В четырнадцатом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения застойной сердечной недостаточности; данный способ включает: введение пациенту композиции, включающей очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr или Phe; Xaa₈ является Glu, Asp, Gln, Gly или Pro; Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn, Tyr, Asp или Ala; Xaa₁₃ является Pro или Gly; Xaa₁₄ является Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg и Asp; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu; и Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует. Пептид может вводиться в комбинации с другим агентом для лечения застойной сердечной недостаточности, например натрийуретическим пептидом, таким как предсердный натрийуретический пептид, мозговой натрийуретический пептид или натрийуретический пептид C-типа), диуретиком или ингибитором ангиотензинпревращающего фермента.

В одном варианте воплощения изобретения пептид включает последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует.

В пятнадцатом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы, способ включает: введение пациенту композиции, включающей очищенный полипептид, включающего последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr или отсутствует или Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ отсутствует и Xaa₅ является Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, или Phe; Xaa₈ является Glu, Asp, Gln, Gly или Pro; Xaa₉ является Leu, Ile, Val, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn, Tyr, Asp или Ala; Xaa₁₃ является Pro или Gly; Xaa₁₄ является Ala, Leu, Ser, Gly, Val, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys, Arg, и Asp; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Asn, Lys Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly, Pro или Ala; Xaa₁₉ является Trp, Tyr, Phe или Leu; Xaa₁₉ является Lys или Arg; Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует.

Пептид может быть введен в комбинации с другим агентом для лечения ДГП, например ингибитором 5-альфа редуктазы (например, финастерид) или альфа адренергическим ингибитором (например, доксазозин).

В одном варианте воплощения изобретения пептид включает последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует; Xaa₈ является Glu; Xaa₉ является Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr или Phe; Xaa₁₂ является Asn; Xaa₁₃ является Pro; Xaa₁₄ является Ala; Xaa₁₆ является Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa₁₇ является Gly; Xaa₁₉ является Tyr или Leu; и Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует.

В шестнадцатом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения или уменьшения боли, включая висцеральную боль, боль, ассоциированную с желудочно-кишечным расстройством, или боль, ассоциированную с каким-либо другим расстройством, способ включает: введение пациенту композиции, включающей очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, например очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот, описанную в настоящем описании.

В семнадцатом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения воспаления, включая воспаление желудочно-кишечного тракта, например воспаление, ассоциированное с желудочно-кишечным расстройством, или инфекцией, или каким-либо другим расстройством, способ включает: введение пациенту композиции, включающей очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, например очищенный полипептид, включающий последовательность аминокислот, описанную в настоящем описании.

В определенных вариантах воплощения изобретения пептид включает пептид, включающий или состоящий из последовательности аминокислот Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys Cys Glu Xaa₉ Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Xaa₂₀ Xaa₂₁ (II) (SEQ ID NO:____), где Xaa₉ является любой аминокислотой, где Xaa₉ является любой аминокислотой, иной, чем Leu, где Xaa₉ выбирают из Phe, Trp и Tyr; где Xaa₉ выбирают из любой другой природной или неприродной аминокислоты, где Xaa₉ является Tyr; где Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ является Asn Ser Ser Asn Tyr; где Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ и Xaa₅ отсутствуют; где Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ и Xaa₄ отсутствуют; где Xaa₁ Xaa₂ и Xaa₃ отсутствуют; где Xaa₁ и Xaa₂ отсутствуют; где Xaa₁ отсутствует; где Xaa₂₀ Xaa₂₁ является AspPhe или отсутствует, или Xaa₂₀ является Asn или Glu и Xaa₂₁ отсутствует, или Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует. В случае пептида, включающего последовательность (I): Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys₆ Cys₇ Xaa₈ Xaa₉ Cys₁₀ Cys₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Cys₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Cys₁₈ Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁, где: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ отсутствует и/или последовательность Xaa₁₉ Xaa₂₀ Xaa₂₁ отсутствует, пептид может еще содержать карбоксиконцевые или аминоконцевые аминокислоты или и те, и другие.

Среди применимых пептидов находятся пептиды, состоящие из или включающие преимущественно последовательность аминокислот Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Cys Cys Glu Xaa₉ Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Xaa₂₀ Xaa₂₁ (II) (SEQ ID NO:---) являются следующие пептиды:

Gln Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Thr Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Leu Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Ile Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Gln Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Gln Ser Ser Gln Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Ser Ser Gln Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ala Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Asn Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Asp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Cys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Gln Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Glu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Gly Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu His Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Met Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Pro Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ser Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Thr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Val Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Ala Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Asn Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Asp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Cys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Gln Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Glu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Gly Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu His Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Met Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Pro Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Ser Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Thr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ED NO: )

Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

Cys Cys Glu Val Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: )

В восемнадцатом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения застойной сердечной недостаточности, способ включает введение полного или частичного агониста рецептора кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C). Агонист можно вводить в комбинации с другим агентом для лечения застойной сердечной недостаточности, например натрийуретическим пептидом, таким как предсердный натрийуретический пептид, мозговой натрийуретический пептид или натрийуретический пептид С-типа, диуретик или ингибитор ангиотензин-превращающего фермента.

В девятнадцатом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения ДГП; данный способ включает введение полного или частичного агониста рецептора кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C). Агонист можно вводить в комбинации с другим агентом для лечения ДГП, например ингибитором 5-альфа редуктазы (например, финастерид) или альфа адренергическим ингибитором (например, доксазозин).

В двадцатом аспекте изобретение предусматривает способ для лечения ожирения; данный способ включает введение полного или частичного агониста рецептора кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C). Агонист можно вводить в комбинации с другим агентом для лечения ожирения, например, фрагментом гастроинтестинального гормона пептидом YY_3-36 (PYY_3-36 ) (N. Engl. J. Med. 349:941, 2003; ikpeapge daspeelnry yaslrhylnl vtrqry) glp-1 (глюкагоноподобный пептид-1), экзендином-4 (ингибитор glp-1), сибутрамином, фентермином, фендиметразином, гидрохлоридом бензфетамина (Дидрекс), орлистатом (Ксеникал), гидрохлоридом диэтилпропиона (Тенуат), флуоксетином (Прозак), бупропионом, эфедрой, хромом, гарцинией камбоджийской, бензокаином, бурыми водорослями (focus vesiculosus), хитозаном, травой сенны, галеги (козья рута, французская сирень), конъюгированной линоленовой кислотой, L-карнитином, волокнами (волокна песочника, подорожника, гуаровые), кофеином, дегидроэпиандростероном, дубровником (teucrium chamaedrys), B-гидрокси-β-метилбутиратом и пируватом. Пептид, применимый для лечения ожирения, может вводиться в качестве совместной терапии с пептидом по изобретению как в виде отдельной молекулы, так и в виде сшитого белка с пептидом по изобретению. Следовательно, например, PYY_3-36 может быть сшит с карбокси или аминоконцом пептида по изобретению. Такой сшитый белок может включать участки расщепления химотрипсином или трипсином, которые могут позволять расщеплением разделять два пептида.

Пептиды и агонист рецептора кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C) могут быть использованы для лечения запоров или сниженной кишечной моторики, медленного пищеварения или медленного опустошения желудка. Пептиды могут быть использованы для облегчения одного или более симптомов СРК (вздутие, боль, запор), ГЭРБ (рефлюкс кислоты в пищевод), функциональной диспепсии или гастропареза (тошнота, рвота, вздутие, замедленное опорожнение желудка) и других расстройств, описанных в настоящем описании.

Детали одного или более вариантов воплощения изобретения установлены в сопутствующем описании. Все публикации, патенты и патентные заявки, таким образом, включены в виде ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1a изображает ЖХМС анализа рекомбинантного пептида MM-416776 и пептида MD-915.

Фиг. 1b и c изображает результаты ЖХМС анализа синтетического пептида MD-1100 и контроля.

Фиг. 2 изображает результаты анализа рецепторной активности кишечной ГЦ-C синтетического пептида MM-416776, пептида MD-915 и двух различных пептидов MD-1100.

Фиг. 3a изображает эффект рекомбинантного пептида MM-416776 и Zelnorm® в мышиной модели желудочно-кишечного транзита.

Фиг. 3b изображает эффект синтетического пептида MD-1100 и Zelnorm® в мышиной модели острого желудочно-кишечного транзита.

Фиг. 3b изображает эффект синтетического пептида MD-1100 и Zelnorm® в мышиной модели хронического желудочно-кишечного транзита.

Фиг. 4a и 4b изображают эффект пептидов MD-915, MD-1100 и MM-416776 в мышиной модели острого желудочно-кишечного транзита.

Фиг. 4c изображает эффект пептида MD-1100 в мышиной модели хронического желудочно-кишечного транзита.

Фиг. 5a изображает эффект пептида MM-416776 и Zelnorm® в модели кишечной секреции сосущих мышей.

Фиг. 5b изображает эффекты MD-1100 и Zelnorm® в мышиной модели кишечной секреции.

Фиг. 6a и 6b изображают эффекты пептидов MM 416776, MD-1100 и MD-915 в мышиной модели кишечной секреции.

Фиг. 7 показывает результаты эксперимента, в котором активность MD-1100 анализировали в модели растяжения толстой кишки TNBS.

Фиг. 8a и 8b показывают эффекты различных доз MD-915 и MD-1100 в анализе болевых корчей PBQ.

Фиг. 9 показывает результаты анализа определения Kd с использованием MD-1100 в анализе конкурентного связывания радиоактивного лиганда.

Фиг. 10a и 10b показывают данные биодоступности для в/в и перорально вводимого MD-1100, как определяли анализом ELISA и ЖХМС.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пептиды по изобретению связываются с рецептором кишечной гуанилатциклазы (ГЦ-C), ключевого регулятора баланса жидкости и электролитов в кишечнике. При стимуляции этот рецептор, который расположен на апикальной мембране кишечной эпителиальной поверхности, вызывает повышение кишечного эпителиального циклического ГМФ (цГМФ). Считают, что такое повышение цГМФ вызывает уменьшение поглощения воды и натрия и увеличение секреции ионов хлорида и калия, приводя к изменениям в кишечном транспорте жидкости и электролитов и повышению кишечной моторики. Рецептор кишечной ГЦ-C обладает внеклеточным участком связывания лиганда, трансмембранным участком, внутриклеточным участком, подобным протеинкиназе и циклазным каталитическим доменом. Предложенными функциями для рецептора ГЦ-C являются гомеостаз жидкости и электролитов, регуляция пролиферации эпителиальных клеток и индукция апоптоза (Shalubhai 2002 Curr Opin Drug Dis Devel 5:261-268).

В добавление к экспрессии в кишечнике желудочно-кишечными эпителиальными клетками, ГЦ-C экспрессируется во внекишечных тканях, включая почки, легкие, поджелудочную железу, гипофиз, надпочечники, развивающуюся печень (описано в Vaandrager 2002, Mol Cell Biochem 230:73-83), и мужских и женских репродуктивных тканях (описано в Vaandrager 2002 Mol Cell Biochem 230:73-83)). Это предполагает, что агонисты рецептора ГЦ-C могут быть использованы в лечении расстройств вне ЖК тракта, например застойной сердечной недостаточности и доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

Грелин, пептидный гормон, секретируемый желудком, является ключевым регулятором аппетита у людей. Уровень экспрессии грелина регулируется голоданием и опустошением желудка (Kim et al., 2003, Neuroreprt 14:1317-20; Gualillo et al., 2003, FEBS Letts 552: 105-9). Следовательно, путем увеличения желудочно-кишечной моторики, агонисты рецептора ГЦ-C могут также быть использованы для регуляции ожирения.

У людей рецептор ГЦ-С активируется гуанилином (Gn) (патент США 596097), урогуанилином (Ugn) (патент США 5140102) и лимфогуанилином (Forte et al., 1999, Endocrinology 140:1800-1806). Интересно, что такие агенты являются в 10-100 раз менее сильными, чем класс пептидов, полученных из бактерий, называемых ST (описаны в Gianella 1995 J Lab Clin Med 125:173-181). ST пептиды рассматриваются как суперагонисты ГЦ-С и являются очень устойчивыми к протеолитическому расщеплению.

ST пептид способен стимулировать кишечную нервную систему (Rolfe et al., 1994, J Physiolo 475: 531-537; Rolfe et al., 1999, Gut 44: 615-619; Nzegwu et al., 1996, Exp Physiol 81: 313-315). Также сообщали, что цГМФ имеет антиноцицептивные эффекты во множественных моделях боли на животных (Lazaro Ibanez et al., 2001, Eur J Pharmacol 426: 39-44; Soares et al., 2001, British J Pharmacol 134: 127-131; Jain et al., 2001, Brain Res 909:170-178; Amarante et al., 2002, Eur J Pharmacol 454:19-23). Следовательно, агонисты ГЦ-С могут иметь и обезболивающий и противовоспалительный эффект.

У бактерий ST пептиды получают из препробелка, который обычно имеет, по меньшей мере, 70 аминокислот. Пре- и про-участки отщепляются как часть процесса секреции и полученный зрелый белок, который обычно включает менее чем 20 аминокислот, является биологически активным.

Среди известных бактериальных ST пептидов находятся: ST Ib E. coli (Moseley et al. (1983) Infect. Immun. 39:1167), имеющий зрелую последовательность аминокислот Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:__); ST Ia E. coli (So и McCarthy (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4011), имеющий зрелую последовательность аминокислот Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:_); ST I* E. coli (Chan и Giannella (1981) J. Biol. Chem. 256:7744), имеющий зрелую последовательность аминокислот Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn (SEQ ID NO:___); ST пептид C.freundii (Guarino et al. (1989) Infect. Immun. 57:649), имеющий зрелую последовательность аминокислот Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:__), ST пептиды Y. enterocolitica, Y-ST(Y-STa), Y-STb и Y-STc (описанные в Huang et al. (1997) Microb. Pathog. 22:89), имеющие следующую последовательность аминокислот про-формы: Gln Ala Cys Asp Pro Pro Ser Pro Pro Ala Glu Val Ser Ser Asp Trp Asp Cys Cys Asp Val Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys (SEQ ID NO:___) (а также Ser-7 на Leu-7 вариант Y-STa (SEQ ID NO:___), (Takao et al. (1985) Eur. J. Biochem. 152:199)); Lys Ala Cys Asp Thr Gln Thr Pro Ser Pro Ser Glu Glu Asn Asp Asp Trp Cys Cys Glu Val Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys (SEQ ID NO:___); Gln Glu Thr Ala Ser Gly Gln Val Gly Asp Val Ser Ser Ser Thr Ile Ala Thr Glu Val Ser Glu Ala Glu Cys Gly Thr Gln Ser Ala Thr Thr Gln Gly Glu Asn Asp Trp Asp Trp Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys (SEQ ED NO:___), соответственно; ST пептид Y. kristensenii, имеющий зрелую последовательность аминокислот Ser Asp Trp Cys Cys Glu Val Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys (SEQ ED NO:___); не-01 ST пептид V. cholerae (Takao et al. (1985) FEBS lett. 193:250) имеющий зрелую последовательность аминокислот Ile Asp Cys Cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys Leu Asn (SEQ ED NO:__); и ST пептид V. mimicus (Arita (1991) et al. FEMS Microbiol. Lett. 79:105), имеющий зрелую последовательность аминокислот Ile Asp Cys Cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys Leu Asn (SEQ ID NO:__). Таблица ниже обеспечивает последовательности всех или части ряда зрелых ST пептидов.

GenBank® каталог GenBank® GI Последовательность QHECIB 69638 NSSNYCCELCCNPACTGCY(SEQ ID NO:_) P01559 123711 NTFYCCELCCNPACAGCY(SEQ ID NO:_) AAA24653 147878 NTFYCCELCCNPACAPCY(SEQ ED NO:_) P01560 123707 NTFYCCELCCYPACAGCN(SEQ ED NO:_) AAA27561 295439 IDCCEICCNPACFGCLN(SEQ ID NO:_) P04429 123712 IDCCEICCNPACFGCLN(SEQ ID NO:_) S34671 421286 IDCCEICCNPACF(SEQ ID NO:_) CAA52209 395161 IDCCEICCNPACFG(SEQ ID NO:_) A54534 628844 IDCCEICCNPACFGCLN(SEQ ID NO:_) AAL02159 15592919 IDRCEICCNPACFGCLN(SEQ ID NO:_) AAA18472 487395 DWDCCDVCCNPACAGC(SEQ ID NO:_) S25659 282047 DWDCCDVCCNPACAGC(SEQ ED NO:_) P74977 3913874 NDDWCCEVCCNPACAGC(SEQ ID NO:__) BAA23656 2662339 WDWCCELCCNPACFGC(SEQ ID NO:_) P31518 399947 SDWCCEVCCNPACAGC(SEQ ID NO:_)

Незрелая (включая пре- и про-участки) форма белка ST-1A (ST-P) E. coli имеет последовательность mkkmalaifisvlsfpsfsqstesldsskekitletkkcdvvknnseldcsenmrintfyccelccnpacagcy (SEQ ID NO:___; см. GenBank® каталожный No. P01559 (gi:123711). Пре-последовательность простирается от ак 1-19. Про-последовательность простирается от ак 20-54. Зрелый белок простирается от 55-72. Незрелая (включая пре- и про-участки) форма белка ST-1B (ST-H) E. coli имеет последовательность: mkksilfiflsvlsfspfaqdakpvesskekitleskkcniakksnksgpesmnssnyccelccnpactgcy (SEQ ID NO:___; см. GenBank® каталожный No. P07965 (gi:3915589). Незрелая (включая пре и про участки) форма ST белка Y. enterocolitica имеет последовательность: mkkivfvlvlmlssfgafgqetvsgqfsdalstpitaevykqacdpplppaevssdwdccdvccnpacagc (SEQ ID NO:___; см. GenBank® каталожный No. S25659 (gi:282047).

Пептиды по изобретению, как бактериальные ST пептиды, имеют шесть остатков Cys. Эти шесть остатков Cys образуют три дисульфидные связи в зрелой и активной форме пептида. Если идентифицируют шесть остатков Cys от амино до карбоксиконца пептида, как A, B, C, D, E и F, тогда дисульфидные связи образуются, как указано ниже: A-D, B-E и C-F. Считают, что образование этих связей является важным для связывания рецептора ГЦ-С. Определенные пептиды по изобретению включают потенциально функциональные участки расщепления химотрипсином, например Trp, Tyr или Phe, расположенные между или Cys B и Cys D или между Cys E и Cys F. Расщепление в любом участке расщепления химотрипсином уменьшает или устраняет способность пептида связываться с рецептором ГЦ-С.

В человеческом организме, неактивная форма химотрипсина, химотрипсиноген, образуется в поджелудочной железе. Когда этот неактивный фермент достигает тонкого кишечника, он преобразуется в активный химотрипсин вырезанием двух ди-пептидов. Активный химотрипсин может потенциально расщеплять пептиды по пептидной связи на карбоксиконцевой стороне Trp, Tyr или Phe. Присутствие активного химотрипсина в кишечном тракте может потенциально приводить к расщеплению определенных пептидов по изобретению, имеющих определенным образом расположенные функциональные участки расщепления химотрипсином. Ожидают, что расщепление химотрипсином будет регулировать действие пептида по изобретению, имеющего определенным образом расположенный участок расщепления химотрипсином, когда пептид проходит через кишечный тракт.

Трипсиноген, как химотрипсин, является сериновой протеазой, которая производится в поджелудочной железе и присутствует в пищеварительном тракте. Активная форма, трипсин, будет расщеплять пептиды, имеющие Lys или Arg. Присутствие активного трипсина в кишечном тракте может приводить к расщеплению определенных пептидов по изобретению, имеющих соответствующим образом расположенный функциональный участок расщепления трипсином. Ожидают, что расщепление химотрипсином будет регулировать действие пептида по изобретению, имеющего соответствующим образом расположенный участок расщепления трипсином, когда пептид проходит через кишечный тракт.

Многие желудочно-кишечные расстройства, включая СРК, ассоциированы с абдоминальной или висцеральной болью. Некоторые из пептидов по изобретению включают обезболивающие или антиноцицептивные концы, такие как карбоксиконцевая последовательность AspPhe непосредственно после Trp, Tyr или Phe, что создает функциональный участок расщепления химотрипсином, или после Lys или Arg, что создает функциональный участок расщепления трипсином. Химотрипсин в кишечном тракте может потенциально расщеплять такие пептиды непосредственно карбокситерминально по отношению к остатку Trp, Phe или Tyr, высвобождая дипептид, AspPhe. Было показано, что такой дипептид имеет обезболивающую активность в моделях на животных (Abdikkahi et al. 2001, Fundam Clin Pharmacol 15:117-23; Nikfar et al. 1997, 29:583-6; Edmundson et al. 1998, Clin Pharmacol Ther 63:580-93). Таким образом, такие пептиды могут лечить и боль и воспаление. Другие обезболивающие пептиды могут присутствовать на карбоксиконце пептида (следуя за функциональным участком расщепления), включая: эндоморфин-1, эндоморфин-2, ноцистатин, даларгин, люпрон, и субстанцию P. Ряд применимых пептидов основан на стержневой последовательности: Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr. Для создания варианта, имеющего потенциальный функциональный участок расщепления химотрипсином, способный инактивировать пептид, или Leu (подчеркнуто) или Thr (подчеркнуто) может быть заменен Trp, Phe или Tyr или оба Leu и Thr могут быть замещены (независимо) Trp, Phe или Tyr. Для создания варианта, имеющего обезболивающий ди-пептид, за стержневой последовательностью следует Asp Phe. Карбоксиконцевой Tyr в стержневой последовательности может позволить дипептиду Asp Phe быть высвобожденным химотрипсином в пищеварительном тракте. Стержневой последовательности необязательно может предшествовать Asn Ser Ser Asn Tyr или Asn.

Следовательно, применимые варианты, основанные на стержневой последовательности, включают:

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---; MM-416776)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---; MD-915)

Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---; MM416774)

Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---; MD-1100)

Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr (SEQ ED NO:---)

Asn Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:-)

Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

Asn Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:---)

В некоторых случаях пептиды по изобретению производятся в виде препробелков, которые включают аминоконцевую ведущую последовательность:

mkksilfiflsvlsfspfaqdakpvesskekitleskkcniakksnksgpesmn. Когда пептид производится бактериальной клеткой, например E. coli, вышеупомянутая ведущая последовательность отщепляется и зрелый пептид эффективно секретируется из бактериальной клетки. Патент США № 5395490 описывает векторы, системы экспрессии и способы для эффективной продукции ST пептидов в бактериальных клетках и способы достижения эффективной секреции зрелых ST пептидов. Векторы, системы экспрессии и способы, описанные в патенте США № 5395490, могут быть использованы для получения ST пептидов и альтернативных ST пептидов по настоящему изобретению.

Альтернативные пептиды

Изобретение включает альтернативные пептиды, которые могут включать одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять (в некоторых вариантах воплощения изобретения менее чем 5, или менее чем 3, или 2, или менее) замещений аминокислот по сравнению с SEQ ID NO:____до___. Замещение(я) может быть консервативным или неконсервативным. Природные аминокислоты могут быть замещены D-изомерами любой аминокислоты, неприродными аминокислотами и другими группами. Консервативное замещение аминокислоты приводит к изменению аминокислоты на аминокислоту для подобного действия или аминокислоту подобного заряда, полярности или гидрофобности. В некоторых положениях даже консервативные замещения аминокислот могут уменьшать активность пептида. Среди замещений природных аминокислот обычно расцениваемыми как консервативные являются:

Для аминокислоты Код Замещение любой из Аланин Ala Gly, Cys, Ser Аргинин Arg Lys, His Аспарагин Asn Asp, Glu, Gln, Аспартовая кислота Asp Asn, Glu, Gln Цистеин Cys Met, Thr, Ser Глютамин Gln Asn, Glu, Asp Глютамовая кислота Glu Asp, Asn, Gln Глицин Gly Ala Гистидин His Lys, Arg Изолейцин Ile Val, Leu, Met Лейцин Leu Val, Ile, Met Лизин Lys Arg, His Метионин Met Ile, Leu, Val Фенилаланин Phe Tyr, His, Trp Пролин Pro   Серин Ser Thr, Cys, Ala Треонин Thr Ser, Met, Val Триптофан Trp Phe, Tyr Тирозин Tyr Phe, His Валин Val Leu, Ile, Met

В некоторых обстоятельствах может быть желательным лечить пациентов вариантным пептидом, который связывается с и активирует рецептор кишечной ГЦ-С, но является менее активным, чем невариантная форма пептида. Такая сниженная активность может происходить из сниженной аффинности к рецептору или сниженной способности активировать рецептор при связывании или сниженной стабильности пептида.

В некоторых пептидах пары остатков Cys, которые обычно образуют дисульфидную связь, один или оба члена пары могут быть замещены гомоцистеином, 3-меркаптопролином (Kolodziej et al. 1996 Int J Pept Protein Res 48:274); β,β-диметилцистеином (Hunt et al. 1993 Int J Pept Protein Res 42:249) или диаминопропионовой кислотой (Smith et al. 1978 J Med Chem 21:117) с образованием альтернативных внутренних связей в положениях нормальных дисульфидных связей.

Продукция пептидов

Применимые пептиды могут быть получены как в бактериях, включая, без ограничения, E. coli, так и в других существующих системах для получения пептида или белка (например, Bacillus subtilis, система экспрессии бакуловируса с использованием клеток Drosophila Sf9, системы экспрессии дрожжей или нитеобразных грибов, системы экспрессии клеток млекопитающих), или они могут быть химически синтезированы.

Если пептид или вариантный пептид должен быть получен в бактерии, например E. coli, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид, предпочтительно также кодирует ведущую последовательность, которая дает возможность секреции зрелого пептида из клетки. Следовательно, последовательность, кодирующая пептид, может включать пре-последовательность и про-последовательность, например, природного бактериального ST пептида. Секретированный, зрелый пептид может быть очищен из культуральной среды.

Последовательность, кодирующую пептид по изобретению предпочтительно вставляют в вектор, способный доставлять и сохранять молекулу нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке. Молекула ДНК может быть вставлена в автономно реплицирующийся вектор (подходящие векторы включают, например, pGEM3Z и pcDNA3 и их производные). Нуклеиновой кислотой вектора может быть ДНК бактерии или бактериофага, такого как бактериофаг ламбда или M13 и их производные. За созданием вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем описании, может следовать трансформация клетки-хозяина, такой как бактерия. Подходящие бактериальные хозяева включают, но не ограничиваются, E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Salmonella. Генетическая конструкция также включает, в добавление к кодирующей молекуле нуклеиновой кислоты, элементы, которые делают возможной экспрессию, такие как промоторная и регуляторная последовательности. Векторы экспрессии могут содержать транскрипционные регулирующие последовательности, которые регулируют инициацию транскрипции, такие как последовательности промотора, энхансера, оператора и репрессора. Множество транскрипционных регулирующих последовательностей хорошо известны специалистам в области техники. Вектор экспрессии также может включать регуляторную последовательность трансляции (например, нетранслируемая 5' последовательность, нетранслируемая 3' последовательность или внутренний входной участок рибосомы). Вектор может быть способен к автономной репликации или может интегрировать в ДНК клетки-хозяина для обеспечения стабильности во время продукции белка.

Последовательность, кодирующая белок, которая включает пептид по изобретению, также может быть пришита к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептидный афинный конец, например глютатион S-трансферазу (GST), белок, связывающий мальтозу Е, белок A, FLAG конец, гекса-гистидин, myc конец или конец HA гриппа, с целью облегчить очистку. Афинный конец или сплав репортера объединяет рамку считывания интересующего пептида с рамкой считывания гена, кодирующего аффинный конец, так что образуется трансляционная сшивка.

Экспрессия сшитого гена приводит к трансляции одного полипептида, который включает интересующий пептид и аффинный конец. В некоторых случаях, когда используются аффинные концы, последовательность ДНК, кодирующая участок распознавания протеазы, сшита между рамками считывания с аффинным концом и интересующим пептидом.

Генетические конструкции и способы, подходящие для получения незрелых и зрелых форм пептидов и вариантов по изобретению в системе экспрессии белка, иной, чем бактерии, и хорошо известные специалисту в области техники, также могут быть использованы для получения пептидов в биологической системе.

Зрелые пептиды и их варианты могут быть синтезированы твердофазным методом с использованием автоматического пептидного синтезатора. Например, пептид может быть синтезирован на Cyc(4-CH₂Bxl)-OCH₂-4-(оксиметил)-фенилацетамидометиловой смоле с использованием программы двойного связывания. Защитные группы должны использоваться соответственно для создания правильной системы дисульфидных связей. Например, следующие защитные группы могут быть использованы: т-бутилоксикарбонил (альфа-аминогруппы); ацетамидометил (тиоловые группы остатков Cys B и E); 4-метилбенил (тиоловые группы остатков Cys C и F); бензил (y-карбоксил глютамовой кислоты и гидроксильная группа треонина, если присутствует); и бромбензил (фенольная группа тирозина, если присутствует). Связывание производится с симметричным ангидридом т-бутоксилкарбониламинокислот или гидроксибензотриазоловых сложных эфиров (для остатков аспарагина или глютамина), и пептид депротектируется и отщепляется от твердой основы в фторводороде, диметилсульфиде, анизоле и п-тиокрезоле с использованием соотношения 8/1/1/0,5 (об./об./об./мас.) при 0°C в течение 60 мин. После удаления фторводорода и диметилсульфида пониженным давлением и анизола и п-тиокрезола экстракцией этиловым эфиром и этилацетатом последовательно сырые пептиды экстрагировали смесью 0,5 M натрий-фосфатного буфера, pH 8,0 и N,N-диметилформамида с использованием соотношения 1/1, об./об. Дисульфидную связь для остатков Cys B и E образовывали с использованием диметилсульфоксида (Tam et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6657-62). Полученный пептид очищали хроматографией с обращенной фазой. Дисульфидную связь между остатками Cys C и F образовывали сперва растворением пептида в 50% уксусной кислоте в воде. Добавляли насыщенный раствор йода в ледяной уксусной кислоте (1 мл раствора йода на 100 мл раствора). После инкубации при комнатной температуре в течение 2 дней в закрытом стеклянном контейнере раствор разводили в пять раз деионизированной водой и экстрагировали этиловым эфиром четыре раза для удаления непрореагировавшего йода. После удаления остаточного количества этилового эфира ротационным выпариванием раствор сырого продукта лиофилизировали и очищали последующей хроматографией с обращенной фазой.

Анализ связывания рецептора кишечной ГЦ-С

Способность пептидов и других агентов связываться с рецептором кишечной ГЦ-С может быть исследована следующим образом. Клетки клеточной линии человеческой карциномы толстой кишки T84 (American Type Culture Collection (Bethesda, Md.) выращивали до слияния в 24-луночных культуральных планшетах со смесью 1:1 среды Ham's F12 и модифицированной Dulbecco среды Eagle's (DMEM), снабженной 5% эмбриональной сыворотки телят. Клетки, используемые в анализе, обычно находились между пассажами 54-60. Коротко, монослои клеток T84 в 24-луночных планшетах промывали дважды 1 мл связывающего буфера (DMEM, содержащая 0,05% бычьего альбумина сыворотки и 25 mM HEPES, pH 7,2), затем инкубировали в течение 30 мин при 37°C в присутствии зрелого, меченного радиоактивной меткой ST пептида E. coli и тестируемого вещества в различных концентрациях. Затем клетки промывали четыре раза 1 мл DMEM и растворяли с помощью 0,5 мл/ячейку 1 N NaOH. Уровень радиоактивности в растворенном веществе затем определяли с использованием стандартных методов.

Пример 1: Получение вариантных ST пептидов и ST пептида дикого типа

1a: Получение рекомбинантных вариантных ST пептидов и ST пептида дикого типа

Вариантный ST пептид, обозначаемый как MD-915, воспроизводили рекомбинантно и исследовали в модели на животных. MD-915 имеет последовательность: Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: ). Также создавали пептид, имеющий последовательность ST пептида дикого типа (MM-416776).

Пептиды MD-915 и MM-416776 получали в виде препробелков, используя векторы, полученные, как указано далее. Последовательность, кодирующую пре-про-последовательность термостойкого энтеротоксина, амплифицировали из pGK51/pGSK51 (ATCC 67728) с использованием олигонуклеотида MO3514 (5' CACACCATATGAAGAAATCAATATTATTTATTTTTCTTTCTG 3' (SEG ID NO: )) и олигонуклеотида MO3515 (5' CACACCTCGAGTTAGGTCTCCATGCTTTCAGGACCACTTTTATTAC 3' (SEQ ID NO:__)). Фрагмент амплификационного продукта поглощали с помощью NdeI/XhoI и связывали с вектором экспрессии T7, pET26b(+) (Novagen) поглощали с помощью NdeI/XhoI, таким образом создавая плазмиду MB3976. Участок, кодирующий пре-про-белок, секвенировали и обнаруживали, что он кодирует последовательность аминокислот:

mkksilfiflsvlsfspfaqdakpagsskekitleskkcnivkk s n k s g pesm (SEQ ID NO:__), которая отличалась от последовательности аминокислот предшественника термостабильного энтеротоксина a2 (sta2; mkksilfiflsvlsfspfaqdakpagsskekitleskkcnivkknnesspesm (SEQ ID NO:___); GenBank® каталожный No. Q47185, GI: 3913876) в трех положениях (указанных подчеркнутым и жирным текстом) около C-конца. Для создания векторов экспрессии с пре-про-последовательностью комплементарные олигонуклеотиды, кодирующие каждый вариант ST пептида или ST пептид дикого типа, отжигали и клонировали в вектор экспрессии MB3976. Для создания MB3984 (кодирующей MM-416776 пептид полной длины ST пептид дикого типа в виде препробелка), содержащей последовательность аминокислот, NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO:___) сшивали ниже пре-про-последовательности, MB 3976 поглощали с помощью BsaI/XhoI и связывали с отожженными олигонуклеотидами MO3621 (5' GCATGAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGTAC CGGGTGCTATTAATAAC 3' (SEQ ED NO:_)) и MO3622 (5' TCGAGTTATTAATAGCACCCGGTACAAGCAGGATTACAACACAATTCACAGCAGTAATTGCTACTATTC 3'(SEQ ID NO:_)). Для создания MB3985 (кодирующего MD-915 в виде препробелка), содержащего следующую последовательность аминокислот, NSSNYCCEYCCNPACTGCY, сшитую ниже пре-про-последовательности, MB 3976 поглощали с помощью BsaI/XhoI и связывали с отожженными олигонуклеотидами MO3529 (5' GCATGAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAATATTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGGGTGCTATTAATAAC 3' (SEQ ID NO:_)) и MO3530 (5' TCGAGTTATTAATAGCACCCGGTACAAGCAGGATTACAACAATATTCACAGCAGTAATTGCTACTATTC 3'(SEQ ID NO:_)).

Пептид MD-915 и пептид MM-416776 получали, как указано ниже. Векторы экспрессии трансформировали в бактериальную клетку хозяина E. coli BL21 γ DE3 (Invitrogen). Одну колонию инокулировали и выращивали при встряхивании в течение ночи при 30ºC в питательной среде L + 25 мг/л канамицина. Ночную культуру добавляли к 3,2 л партии среды (глюкоза 25 г/л, казаминовые кислоты 5 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, KH₂PO₄ 13,3 г/л, (NH₄)₂HPO₄ 4 г/л, MgSO₄-7H₂O 1,2 г/л, лимонная кислота 1,7 г/л, ЭДТА 8,4 мг/л, CoCl₂-6H₂O 2,5 мг/л, MnCl₂-4H₂O 15 мг/л, CuCl₂-4H₂O 1,5 мг/л, H₃BO₃ 3 мг/л, Na₂MoO₄-2H₂O 2,5 мг/л, ацетат Zn -2H₂O 13 мг/л, лимоннокислое железо 100 мг/л, канамицин 25 мг/л, пеногаситель DF₂O₄ 1 мл/л) и ферментировали с использованием следующих параметров процесса: pH 6,7 - контроль только с основанием (28% NH₄OH), 30°C, оксигенация: 5 литров в минуту. После исходного потребления партии глюкозы (на основании мониторинга уровня растворенного кислорода (DO)) добавляли 1,5 л питательной среды (глюкоза 700 г/л, казаминовые кислоты 10 г/л, экстракт дрожжей 10 г/л, MgSO₄-7H₂O 4 г/л, ЭДТА 13 мг/л, CoCl₂-6H₂O 4 мг/л, MnCl₂-4H₂O 23,5 мг/л, CuCl₂-4H₂O 2,5 мг/л, H₃BO₃ 5 мг/л, Na₂MoO₄-2H₂O 4 мг/л, ацетат Zn-2H₂O 16 мг/л, лимоннокислое железо 40 мг/л, пеногаситель DF₂O₄ 1 мл/л) со скоростью питания, регулируя для поддержания 20% DO. Добавляли IPTG до 0,2 мМ через 2 часа после начала питания. Общее время работы составило приблизительно 40-45 часов (до израсходования питания).

Клетки собирали центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут. Осадок клеток отбрасывали и надосадочную жидкость пропускали через 50 Кд секцию для ультрафильтрации. 50 Кд фильтрат (0,6 литра) загружали на 110 мл колонку быстрого тока Q-сефарозы (Amersham Pharmacia, уравновешенную 20 мМ Tris-HCl pH 7,5) со скоростью тока 400 мл/час. Колонку промывали шестью объемами 20 мМ Tris-HCl pH 7,5 и белки элюировали 50 мМ уксусной кислоты, собирая фракции 50 мл. Фракции, содержащие вариантный ST пептид или ST пептид дикого типа, собирали и растворитель удаляли ротационным выпариванием. Сухие белки ресуспендировали в 10 мл 8% уксусной кислоты, 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) и нагружали на колонку Varian Polaris C18-A (250×21,2 мм 10 мкм, уравновешенную в том же буфере) со скоростью тока 20 мл/мин. Колонку промывали 100 мл 8% метанола, 0,1% ТФУ и обрабатывали с градиентом (300 мл) 24 до 48% метанола, 0,1% ТФУ, собирая фракции 5-мл. Фракции, содержащие пептид, собирали и растворитель удаляли ротационным выпариванием. Пептиды растворяли в 0,1% ТФУ и лиофилизировали.

Фракции пептида MD-915 и пептида MM-416776 анализировали стандартными ЖХМС и ВЭЖХ. ЖХМС анализ выявил, что MD-915 является более однородным, чем MM-416776 (см. Фиг. 1а; обратить внимание, что пептид MD-915 проявляет меньше пиков (панель B), чем MM-416776 (панель A)).

1b: Получение синтетически вариантных ST пептидов и ST пептида дикого типа

Пептиды химически синтезировали коммерческой компанией пептидного синтеза. Меняющиеся выходы пептидов получали в зависимости от эффективности химического синтеза. Следовательно, четырьмя пептидами, в уменьшающемся порядке выхода, были: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:---; MD-1100), 10-20% выход; Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:-; MM416774); Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:-; MD-915); Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:-MM-416776), <5% выход.

Таким образом специфические изменения аминокислот, вводимых в пептиды, могут создавать улучшенные производительные свойства.

Фиг. 1b показывает общий профиль ионной хроматографии синтетически полученного MD-1100. Фиг. 1c показывает общий профиль ионной хроматографии контрольного чистого образца. Существует один основной пик, присутствующий в образце MD-1100, который также не присутствовал в контрольном образце. Количественным анализом установлено, что MD-1100 является >98% чистым.

Пример 2: Активация рецептора кишечной ГЦ-С вариантным ST пептидом и ST пептидом

Способность MD-915, MM-416776 и MD-1100 активировать рецептор кишечной ГЦ-С оценивали в анализе, используя клеточную линию человеческой карциномы толстой кишки T84 (Американская коллекция типовых культур (Bethesda, Md.). Для анализа клетки выращивали до слияния в 24-луночных планшетах со смесью 1:1 среды Ham's F12 и модифицированной Dulbecco среды Eagle's (DMEM), снабженной 5% эмбриональной сыворотки телят, и использовали между пассажами 54 и 60.

Коротко, монослои клеток T84 в 24-луночных планшетах промывали дважды мл/ячейку DMEM, затем инкубировали при 37ºC в течение 10 мин с 0,45 мл DMEM, содержащей 1 мМ изобутилметилксантина (IBMX), ингибитора циклической нуклеотидфосфодиэстеразы. Тестируемые пептиды (50 мкл) затем добавляли и инкубировали в течение 30 минут при 37ºC. Среду аспирировали и реакцию затем терминировали добавлением ледяных 0,5 мл 0,1 Н HCl. Образцы держали на льду в течение 20 минут и затем выпаривали досуха с использованием струйного сушильного аппарата или вакуумного центрифугирования. Сухие образцы ресуспендировали в 0,5 мл фосфатного буфера, представленного в наборе Cayman Chemical Cyclic GMP EIA (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Циклический ГМФ измеряли посредством EIA в соответствии с методикой, описанной в наборе Cayman Chemical Cyclic GMP EIA.

Фиг. 2 показывает активность химически синтезированных вариантов пептида в таком анализе активности рецептора ГЦ-С. В таком анализе MM-416776 и два различных пептида MD-1100 (MD-1100(a) и MD-1100(b), синтезированные двумя различными методами) имели активность, сравнимую с MM-416776. Пептиды MD-915 и MM-416776 были химически синтезированы образом, идентичным таковому MD-1100(b).

Пример 3: MD-915 и MM-416776 увеличивают кишечный транзит у мышей

С целью определить, увеличивают ли пептиды скорость желудочно-кишечного транзита, пептиды и контроль исследовали с использованием анализа мышиного желудочно-кишечного транзита (GIT) (Moon et al. Infection и Immunity 25:127, 1979). В этом анализе, активированный уголь, который легко визуализируется в желудочно-кишечном тракте, вводят мыши после введения тестируемого соединения. Расстояние, проходимое активированным углем, измеряли и выражали в процентном отношении к общей длине толстой кишки.

Мыши голодали со свободным доступом к воде в течение 12-16 часов перед лечением пептидом или контрольным буфером. Пептиды вводили перорально в дозе 1 мкг/кг -1 мг/кг пептида в буфере (20 мМ Tris pH 7,5) за 7 минут до получения пероральной дозы 5% активированного угля (Aldrich 242276-250G). Контрольным мышам вводили только буфер перед получением дозы активированного угля. Через 15 минут мышей умерщвляли и затем иссекали тонкие кишки от желудка до слепой кишки. Общую длину тонкой кишки, а также расстояние, проходимое от желудка до передней линии активированного угля, измеряли для каждого животного и результаты выражали как процент от общей длины тонкого кишечника, пройденной передней линией активированного угля. Все результаты представляли как среднее 10 мышей±стандартное отклонение. Сравнение расстояния, пройденного активированным углем между мышами, получившими пептид по сравнению с мышами, получившими только растворитель, проводили с использованием t-критерия Стьюдента и статистически значимой разницу расценивали для P<0,05. P-значения рассчитывали с использованием двухстороннего T-критерия, допуская неравноценные дисперсии.

Как может быть видно на фиг. 3a, b, ST пептид дикого типа (MM-416776, (Sigma-Aldrich, St Louis, MO; 0,1 мг/кг), синтетически полученный MD-1100 и Zelnorm® (0,1 мг/кг), лекарственное средство, утвержденное для СРК, которое является агонистом рецептора серотонина 5HT4, увеличивали скорость желудочно-кишечного транзита в этой модели. Фиг. 4a показывает результат исследования, демонстрирующий, что скорость кишечного транзита увеличивается с увеличением дозировки и рекомбинантно синтезированных MM-416776 или MD-915. Фиг. 4b показывает результаты исследования, демонстрирующие оба химически синтезированных пептида MM-416776 или MD-1100 пептид увеличивают скорость кишечного транзита более, чем как буфер Tris отдельно, так и эквивалентная доза Zelnorm®.

Сходный эксперимент проводили для определения, является ли MD-1100 эффективным при хроническом режиме приема. Коротко, 8-недельным самкам мышей CD1 давали перорально один раз в день в течение 5 дней MD-1100 (0,06 мг/кг или 0,25 мг/кг в 20 мМ Tris pH 7,5) или один растворитель (20 мМ Tris pH 7,5). На 5-й день проводили GIT анализ, подобный таковому выше, кроме того, что вводили 200 мкл 10% раствора активированного угля. Фиг. 4c показывает результаты исследования, демонстрирующие, что оба химически синтезированный MD-1100 или Zelnorm® были эффективными в анализе мышиной желудочно-кишечной моторики при хроническом введении (ежедневно в течение 5 дней). Результаты показаны рядом с острым дозированием (1 день).

Пример 4: Пептид MD-915 и пептид MM-416776 увеличивают кишечную секрецию у сосущих мышей (анализ SuMi)

Пептид MM-416776 и пептид MD-915 тестировали в отношении их способности увеличивать кишечную секрецию с использованием модели кишечной секреции сосущих мышей. В этой модели тестируемое соединение вводили сосущим мышам, которые были в возрасте между 7 и 9 днями. После умерщвления мышей желудочно-кишечный тракт от желудка до слепой кишки иссекали ("пищеварительные каналы"). Оставшееся ("тело"), а также пищеварительные каналы взвешивали и рассчитывали соотношение пищеварительного канала к телу. Если соотношение было выше 0,09, заключали, что тестируемое соединение увеличивает кишечную секрецию. Фиг. 5a показывает кривую зависимости доза-эффект для ST пептида дикого типа (MM-416776) в этой модели. Фиг. 5b показывает кривую зависимости доза-эффект для пептида MD-1100 пептид в этой модели. Эти данные показывают, что ST пептид дикого типа (приобретенный у TDT, Inc. West Chester, PA) и пептид MD-1100 увеличивают кишечную секрецию. Эффект Zelnorm® также исследовали. Как может быть видно из фиг. 5, Zelnorm® в дозе 0,2 мг/кг не увеличивал кишечную секрецию в этой модели. Фиг. 6a показывает кривую зависимости доза-эффект для рекомбинантного пептида MM-416776, описанного выше, и рекомбинантного пептида MD-915, описанного выше. Как может быть видно из фиг. 6a, оба пептида увеличивали кишечную секрецию в этой модели. Подобным образом фиг. 6b показывает кривую зависимости доза-эффект для химически синтезированных MD-915, MD-1100 и MM-416776, а также ST пептида дикого типа (приобретенного от Sigma-Aldrich, St Louis, MO).

Модели на животных гипералгезии толстой кишки

Повышенная чувствительность к растяжению колоректальной области является обычной у пациентов с СРК и может быть ответственной за основной симптом боли. Были разработаны как воспалительные, так и невоспалительные модели на животных висцеральной гипералгезии на растяжение для изучения эффекта соединений на висцеральную боль при СРК.

I. Модель индуцированной тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS) ректальной аллодинии

Самцам крыс Wistar (220-250 г) проводили премедикацию 0,5 мг/кг ацепромазина, вводимого внутрибрюшинно (ВБ), и анестезировали внутримышечным введением 100 мг/кг кетамина. Пары электродов из нихромовой проволоки (60 см в длину и 80 мкм в диаметре) имплантировали в поперечно-полосатую мышцу живота, на 2 см латеральнее белой линии. Свободные концы электродов выводили на задней стороне шеи и защищали пластиковой трубкой, прикрепленной к коже. Электромиографические записи (EMG) начинали через 5 дней после хирургического вмешательства. Электрическую активность поперечно-полосатой мышцы живота записывали с помощью аппарата электроэнцефалографии (Mini VIII, Alvar, Paris, France) с использованием постоянного короткого промежутка времени (0,03 сек) для удаления низкочастотных сигналов (<3 Гц).

Через десять дней после хирургической имплантации вводили тринитробензолсульфоновую кислоту (TNBS) для индукции воспаления прямой кишки. TNBS (80 мг кг^-1 в 0,3 мл 50% этанола) вводили интраректально посредством катетера из силиконового каучука, проведенного на 3 см от ануса под легкой диэтил-эфирной анестезией, как описано (Morteau et al. 1994 Dig Dis Sci 39:1239). После введения TNBS крыс помещали в пластиковые каналы, где они были несколько ограничены в подвижности в течение нескольких дней перед растяжением колоректальной зоны (CRD). Экспериментальное соединение вводили за один час до CRD, что проводили вставлением в прямую кишку на 1 см от ануса, баллона длиной 4 см, сделанного из латексного презерватива (Gue et al., 1997 Neurogastroenterol. Motil. 9:271). Баллон фиксировали на жестком катетере, полученном из зонда для эмболэктомии (Fogarty). Баллон, прикрепленный к катетеру, фиксировали у основания хвоста. Баллон, присоединенный к баростату, поступательно надували с шагом 15 мм рт.ст., от 0 до 60 мм рт.ст., каждая стадия надувания продолжалась 5 мин. Исследование ректальной чувствительности, как измеряли EMG, проводили перед (1-2 дня) и через 3 дня после ректальной инстилляции TNBS.

Число импульсов потенциалов действия, которые соответствовали сокращениям живота, определяли в 5 мин периоды. Статистический анализ количества сокращений живота и оценку взаимоотношений доза-эффект проводили односторонним анализом дисперсий (ANOVA) с последующими попарными сравнениями (критерии Стьюдента или Даннета) и регрессионным анализом для ЭД50, если необходимо.

Фиг. 7 показывает результаты эксперимента, в котором активность MD-1100 анализировали в колоректальной модели TNBS. Достоверное снижение абдоминального ответа наблюдали при 0,3 мкг/кг и 3 мкг/кг MD-1100. Полученные результаты демонстрируют, что MD-1100 уменьшает боль, связанную с растяжением колоректальной области в этой модели на животных.

II. Модель гипералгезии, индуцированной стрессом

Самцам крыс Wistar (200-250 г) хирургически имплантировали электроды из нихромовой проволоки, как в модели TNBS. Через десять дней после хирургической имплантации проводили стресс частичного защемления (PRS), как описано Williams et al., в течение двух часов (Williams et al. 1988 Gastroenterology 64:611). Коротко, под легкой анестезией этиловым эфиром носовые скулы, верхние конечности и грудную клетку заворачивали в ограничивающие ремни из бумажной ленты для ограничения, но не предотвращения движений тела. Контрольных симулированных стрессом животных анестезировали, но не заворачивали. За тридцать минут до конца сеанса PRS животным вводили тестируемое соединение или растворитель. Через тридцать минут-один час после завершения PRS проводили методику растяжения CRD, как описано выше для модели TNBS с баростатом при давлении 15, 30, 45 и 60 мм рт.ст. Статистический анализ количества всплесков определяли и анализировали, как в модели TNBS выше.

Модель болевых корчей, индуцированных фенилбензохиноном

Модель болевых корчей, индуцированных PBQ, может быть использована для оценки активности регуляции боли пептидами и агонистами рецептора ГЦ-С по изобретению. Такая модель описана Siegmund et al. (1957 Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 95:729-731). Коротко, через один час после перорального введения тестируемого соединения, например пептида, морфина или растворителя, 0,02% раствор фенилбензохинона (PBQ) (12,5 мл/кг) вводили мыши внутрибрюшинным путем. Количество вытягиваний и корчей записывали с 5-й до 10-й минуты после инъекции PBQ, и также можно сосчитать между 35-й и 40-й минутой и между 60-й и 65-й минутой для получения динамической оценки. Результаты выражены как количество растяжений и корчей (среднее ±SEM) и процент вариации ноцицептивного порога, рассчитанный из среднего значения группы, леченной растворителем. Статистическую достоверность любого различия между леченными группами и контрольной группой определяли критерием Данетта с использованием остаточной дисперсии после одностороннего анализа дисперсий (P<0,05) с использованием программного обеспечения SigmaStat.

Фиг. 8a и 8b показывают эффект различных доз MD-915 и MD-1100 в исследовании корчей PBQ. Индометацин, НПВС (нестероидное противовоспалительное средство) с известной активностью регулирования боли использовали в качестве положительного контроля в анализе. Достоверное уменьшение корчей наблюдали для MD-915 (доза 1 мг/кг) и MD-1100 (доза 2,5 мг/кг) по сравнению с контрольным растворителем. Потерю эффективности в самой высокой тестируемой дозе также наблюдали для множества других соединений (таких, как антагонисты 5HT-3), тестируемых в подобных анализах. Результаты настоящего исследования предполагают, что оба из MD-915 и MD-1100 имеют антиноцицептивные эффекты в этой модели висцеральной боли, сравнимые с промежуточными дозами индометацина.

Пример 5: Определение Кд MD-1100

Для определения аффинности MD-1100 к рецепторам ГЦ-С, обнаруженным в слизистой оболочке кишечника крыс, проводили анализ конкурентного связывания с использованием кишечных эпителиальных клеток крыс. Эпителиальные клетки из тонкой кишки крыс получали, как описано Kessler et al. (J. Biol. Chem. 245: 5281-5288 (1970)). Коротко, животных умерщвляли и открывали их брюшные полости. Тонкую кишку промывали 300 мл ледяного солевого раствора или PBS. 10 см тонкой кишки, отмеренной на 10 см от привратника, удаляли и нарезали на сегменты по 1 дюйму. Слизистую оболочку кишки выдавливали из кишечника аккуратным давлением между кусочком парафильма и наконечником пипетки P-1000. Кишечные эпителиальные клетки помещали в 2 мл PBS и переливали вверх и вниз с помощью 5 мл пипетки для получения суспензии клеток. Концентрацию белка в суспензии измеряли, используя метод Bradford (Anal. Biochem. 72: 248-254(1976)).

Анализ конкурентного связывания проводили на основании метода Giannella et al. (Am. J. Physiol. 245: G492-G498) между [¹²⁵I] меченными MM-416776 и MD-1100. Анализируемая смесь содержала: 0,5 мл DME с 20 мМ HEPES-KOH pH 7,0, 0,9 мг суспензии клеток, указанной выше, 21,4 фмоль [¹²⁵I]-MM-416776 (42,8 пМ), и различные концентрации конкурента MD-1100 (от 0,01 до 1000 нМ). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа и реакцию останавливали нанесением смеси на фильтры из стекловолокна GF/B (Whatman). Фильтры промывали 5 мл ледяного PBS и измеряли радиоактивность. Фиг. 9 показывает, что Кд для MD-1100 в этом анализе составила 4,5 нм. %B/Bo представляет собой процентное соотношение радиоактивности, поглощенной в каждом образце (B), по сравнению с радиоактивностью, удержанной в контрольном образце без холодного конкурента (Bo). Giannella et al. (Am. J. Physiol.245: G492-G498) наблюдали, что Кд для ST пептида дикого типа в таком же анализе была ~13 нм.

Пример 6: Фармакокинетические свойства MD-1100

Для исследования фармакокинетики MD-1100 проводили исследования поглощающей способности у мышей введением MD-1100 внутривенно посредством инъекции в хвостовую вену или перорально посредством зонда 8-недельным мышам CD1. Сыворотку получали от животных в различные временные точки и исследовали на присутствие MD-1100 с использованием конкурентного ферментного иммунопоглощающего анализа (Oxoid, набор ST EIA, Cat#TD0700). В анализе использовали моноклональные антитела к ST пептиду (антитела представлены в наборе Oxoid) и синтетически полученный MD-1100. Фиг. 10a показывает данные поглощения для вводимого внутривенно и перорально MD-1100, как определяли анализом ELISA. Видимо MD-1100 минимально системно поглощается и является <2,2% биодоступным.

Проводили подобное исследование биодоступности, в котором использовали ЖХМС вместо ELISA для определения MD-1100. Исходно, образцы сыворотки экстрагировали из цельной крови подвергшихся воздействию и контрольных мышей, затем вводили непосредственно (10 мл) на встроенную колонку твердофазной экстракции (SPE) (Waters Oasis HLB колонка 25 мм, 2,0×15 мм прямая связь) без последующей обработки. Образец на колонке SPE промывали 5% метанолом, 95% раствором dH₂O (2,1 мл/мин, 1,0 минута), затем загружали на аналитическую колонку с использованием клапанного переключателя, который помещает колонку SPE в перевернутый путь тока на аналитической колонке (Waters Xterra MS C8 колонка 5 мм IS, 2,1×20 мм). Образец элюировали из аналитической колонки градиентом с обращенной фазой (подвижная фаза A: 10 мМ гидроксида аммония в dH₂O, подвижная фаза B: 10 мМ гидроксида аммония в 80% ацетонитриле и 20% метаноле; 20% B для первых 3 минут, затем переход до 95% B в течение 4 мин и удержание в течение 2 мин, все при скорости тока 0,4 мл/мин). На 9,1 минутах градиент возвращается к исходным условиям 20%B в течение 1 мин. MD-1100 элюировали из аналитической колонки на 1,45 минутах и определяли тройной-четверной масс-спектрометрией (MRM, 764 (+2 состояние заряда)>182 (+1 состояние заряда) Да; потенциал воронки=30 В; столкновение=20 ЭВ; исходное разрешение=2 Да на основном пике; дочернее разрешение=2 Да на основном пике). Инструментальный ответ преобразовывали в единицы концентрации сравнением со стандартной кривой с использованием известных количеств химически синтезированного MD-1100, полученного и введенного в сыворотку мыши с использованием такой же методики.

Фиг.10b показывает данные поглощения для вводимого в/в и перорально MD-1100, как определяли ЖХМС. В таком анализе MD-1100 проявляется подобным образом минимально системно поглощаемым и является <0,11% биодоступным.

Введение пептидов и агонистов рецептора ГЦ-С

Для лечения желудочно-кишечных расстройств пептиды и агонисты по изобретению предпочтительно вводят перорально, например в виде таблетки, геля, пасты, суспензии, жидкости, порошка или в некоторых других формах. Перорально вводимые композиции могут включать вяжущие вещества, ароматизирующие агенты и смачивающие средства. Пептиды и агонисты могут быть совместно вводимыми с другими агентами, применяемыми для лечения желудочно-кишечных расстройств, включая, но не ограничиваясь, агентами, подавляющими кислотность, такими как агонисты рецепторов гистамина-2 (H2A) и ингибиторы протонового насоса (PPI). Пептиды и агонисты могут также вводиться ректальными суппозиториями. Для лечения расстройств вне желудочно-кишечного тракта, таких как застойная сердечная недостаточность и доброкачественная гиперплазия предстательной железы, пептиды и агонисты предпочтительно вводят парентерально или перорально.

Пептиды, описанные в настоящем описании, могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими агентами. Например, пептиды могут вводиться вместе с обезболивающим пептидов или соединением. Обезболивающий пептид или соединение могут быть ковалентно прикреплены к пептиду, описанному в данном описании, или могут быть отдельным агентом, который вводят вместе с или последовательно с пептидом, описанным в настоящем описании в комбинированной терапии.

Комбинированная терапия может быть достигнута введением двух или более агентов, например пептида, описанного в данном описании, и обезболивающего пептида или соединения, каждый из которых рецептирован и вводится отдельно или введением двух или более агентов в одной композиции. Другие комбинации также заключены в комбинированной терапии. Например, два агента могут быть рецептированы вместе и вводиться в сочетании с отдельной композицией, содержащей третий агент. Тогда как два или более агентов в комбинированной терапии могут вводиться одновременно, они не должны. Например, введение первого агента (или комбинации агентов) может предшествовать введению второго агента (или комбинации агентов) на минуты, часы, дни или недели. Следовательно, два или более агента могут вводиться в пределах минут друг от друга или в пределах 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18 или 24 часов друг от друга или в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 дней друг от друга или в пределах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель друг от друга. В некоторых случаях возможны даже более длинные интервалы. Тогда как во многих случаях желательно, чтобы два или более агента, используемые в комбинированной терапии, присутствовали в организме пациента в одно и то же время, это не должно быть так.

Комбинированная терапия может также включать два или более введений одного или более агентов, используемых в комбинации. Например, если агент X и агент Y используют в комбинации, их можно вводить последовательно в любой комбинации один или более раз, например в порядке X-Y-X, X-X-Y, Y-X-Y, Y-Y-X, X-X-Y-Y и др.

Агенты, отдельно или в комбинации, могут быть смешаны с любым фармацевтически приемлемым носителем или средой. Следовательно, они могут быть комбинированы с веществами, которые не дают неблагоприятных, аллергических или других нежелательных реакций при введении пациенту. Используемые носители или среды могут включать растворители, диспергирующие агенты, оболочки, агенты, усиливающие поглощение, агенты регулируемого высвобождения и др.

Агенты как в виде их свободной формы, так и в виде соли могут быть смешаны с полимером, таким как полимолочная-гликолевая кислота (PLGA), поли-(I)-молочная-гликолевая-виннокаменная кислота (P(I)LGT) (WO 01/12233), полигликолевая кислота (патент США 3773919), полимолочная кислота (патент США 4767628); поли(ε-капролактон) для создания композиции продолжительного высвобождения. Такие композиции могут быть использованы в имплантатах, которые высвобождают пептид или другой агент в течение периода в несколько дней, нескольких недель или нескольких месяцев в зависимости от полимера, размера частиц полимера и размера имплантата (см., например, патент США 6620422). Другие композиции продолжительного высвобождения описаны в EP 0467389 A2, WO 93/241150, патенте США 5612052; WO 97/40085, WO 94/155587, патенте США 5672659, патенте США 5893985, патенте США 5134122, патенте США 5192741, патенте США 5192741 и патенте США 5445832. В таких композициях продолжительного высвобождения микрочастицы пептида смешивают с микрочастицами полимера. Один или более имплантатов с продолжительным высвобождением могут быть помещены в толстую кишку, тонкую кишку или в обе.

Агенты могут вводиться, например, внутривенной инъекцией, внутримышечной инъекцией, подкожной инъекцией или другими путями. Агенты могут вводиться перорально, например в виде таблетки, геля, пасты, суспензии, жидкости, порошка или в какой-либо другой форме. Перорально вводимые композиции могут содержать вяжущие вещества, ароматизирующие агенты и смачивающие агенты. Агенты могут быть включены в зубные пасты или полоскания для полости рта. Следовательно, пероральные композиции могут включать абразивы и пенящиеся агенты. Агенты также могут вводиться трансдермально или в форме суппозитория.

Агенты могут быть свободной кислотой, или основанием, или их фармакологически приемлемой солью. Твердые вещества могут быть растворены или диспергированы непосредственно перед введением или ранее. В некоторых обстоятельствах препараты включают консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Фармацевтические формы, подходящие для инъекции, могут включать стерильные водные или органические растворы или дисперсии, которые включают, например, воду, спирт, органический растворитель, масло или другой растворитель или диспергирующее вещество (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и растительные масла). Фармацевтические агенты могут быть стерилизованы фильтрационной стерилизацией или другими подходящими средствами.

Подходящие фармацевтические композиции в соответствии с изобретением обычно включают количество активного соединения(й) с приемлемым фармацевтическим разбавителем или вспомогательным веществом, такими как стерильный водный раствор, для получения диапазона окончательных концентраций, в зависимости от предназначенного использования. Методики получения обычно хорошо известны в области техники, как проиллюстрировано Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, Mack Publishing Company, 1995).

Агенты, описанные в настоящем описании, и агенты комбинированной терапии могут быть упакованы в виде набора, который включает одну или много доз двух или более агентов, каждый упакован или рецептирован отдельно, или одну или много доз двух или более агентов, упакованные или рецептированные в комбинации. Следовательно, один или более агентов могут присутствовать в первом контейнере, и набор может необязательно включать один или более агентов во втором контейнере. Контейнер или контейнеры помещают в упаковку, и упаковка может необязательно включать инструкции по введению или дозированию. Набор может включать дополнительные компоненты, такие как шприцы или другие средства для введения агентов, а также разбавители или другие средства для рецептирования.

Обезболивающие агенты

Пептиды, описанные в данном описании, могут быть использованы в комбинированной терапии с обезболивающим агентом, например обезболивающим соединением или обезболивающим пептидом. Обезболивающий агент может необязательно быть ковалентно прикреплен к пептиду, описанному в настоящем описании. Среди применимых обезболивающих агентов находятся: блокаторы Ca каналов, антагонисты рецептора 5HT(например, антагонисты рецепторов 5HT3, 5HT4 и 5HT1), агонисты опиоидных рецепторов (лоперамид, федотозин и фентанил), антагонисты рецептора NK1, агонисты рецептора CCK (например, локсиглюмид), антагонисты рецептора NK1, антагонисты рецептора NK3, ингибиторы обратного захвата норадреналина-серотонина (NSRI), агонисты ваниллоидных и каннабаноидных рецепторов и сиалорфин. Обезболивающие агенты в различных классах описаны в литературе.

Среди применимых обезболивающих пептидов находятся сиалорфин-связанные пептиды, включая таковые, включающие последовательность аминокислот QHNPR (SEQ ID NO: ), включая: VQHNPR (SEQ ID NO: ); VRQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGPQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGPRQHNPR (SEQ ID NO: ); VRGPRRQHNPR(SEQ ID NO: ); и RQHNPR (SEQ ID NO: ). Сиалорфин-связанные пептиды связываются с неприлизином и ингибируют опосредованные неприлизином распад субстанции P и Met-энкефалина. Следовательно, соединения или пептиды, которые являются ингибиторами неприлизина, являются применимыми обезболивающими агентами, которые могут вводиться с пептидами по изобретению в совместной терапии или связанными с пептидами по изобретению, например, посредством ковалентной связи. Сиалорфин и связанные пептиды описаны в патенте США 6589750; патенте США 20030078200 A1 и WO 02/051435 A2.

Антагонисты и агонисты опиоидных рецепторов могут вводиться с пептидами по изобретению или в совместной терапии или связанными с пептидом по изобретению, например, ковалентной связью. Например, антагонисты опиоидных рецепторов, такие как налоксон, налтрексон, метилналозон, налмефен, ципридим, бета фуналтрексамин, налоксоназин, налтриндол и нор-биналторфимин, считаются полезными в лечении СРК. Может быть применимым рецептировать опиоидные антагонисты такого типа в композиции с отложенным или продолжительным высвобождением, так что исходное высвобождение антагониста происходит в середине до дистального отдела тонкой кишки и/или восходящей ободочной кишки. Такие антагонисты описаны в WO 01/32180 A2. Пентапептид энкефалин (HOE825; Tyr-D-Lys-Gly-Phe-L-гомосерин) является агонистом мю и дельта опиодных рецепторов и считается применимым для увеличения кишечной моторики (Eur. J. Pharm. 219:445,1992), и этот пептид может быть использован в связи с пептидами по изобретению. Также применимым является тримебутин, который считается, что связывается с мю/дельта/каппа опиоидными рецепторами и активирует высвобождение мотилина и регулирует высвобождение гастрина, вазоактивного интестинального пептида, гастрина и глюкагонов. Агонисты опиоидных рецепторов каппа, такие как федотозин, кетоциклазоцин и соединения, описанные в WO 03/097051 A2, могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению. Кроме того, агонисты опиоидных рецепторов мю, такие как морфин, дифенилоксилат, фракефамид (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH₂; WO 01/019849 A1) и лоперамид, могут быть использованы.

Tyr-Arg (киоторфин) представляет собой дипептид, который действует стимуляцией высвобождения мет-энкефалинов для извлечения обезболивающего эффекта (J. Biol. Chem 262:8165, 1987). Киоторфин может быть использован с или связанным с пептидами по изобретению.

Агонисты рецептора CCK, такие как церулеин от амфибий и другие виды, являются применимыми обезболивающими агентами, которые могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Конотоксиновые пептиды представляют собой большой класс обезболивающих пептидов, которые действуют на потенциал-зависимые Ca каналы, рецепторы NMDA или никотиновые рецепторы. Такие пептиды могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Пептидные аналоги тимулина (Французская заявка 2830451) могут иметь обезболивающую активность и могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Антагонисты рецепторов CCK (CCKa или CCKb), включая локсиглюмид и декслоксиглюмид (R-изомер локсиглюмида) (WO 88/05774) могут иметь обезболивающую активность и могут использоваться с или связанными с пептидами по изобретению.

Другие применимые обезболивающие агенты включают агонисты 5-HT4, такие как тегасерод/зелнорм и лирексаприд. Такие агонисты описаны в: EP1321142 A1, WO 03/053432A1, EP 505322 A1, EP 505322 B1, US 5510353, EP 507672 A1, EP 507672 B1 и US 5273983.

Блокаторы кальциевых каналов, такие как зинокотид и связанные соединения, описаны в, например, EP625162B1, US 5364842, US 5587454, US 5824645, US 5859186, US 5994305, US 6087091, US 6136786, WO 93/13128 A1, EP 1336409 A1, EP 835126 A1, EP 835126 B1, US 5795864, US 5891849, US 6054429, WO 97/01351 A1, могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Различные антагонисты рецепторов NK-1, NK-2, и NK-3 (для обзора см. Giardina et al. 2003 Drugs 6:758) могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Антагонисты рецептора NK1, такие как: апрепитант (Merck & Co Inc), вофопитант, эзлопитант (Pfizer, Inc.), R-673 (Hoffmann-La Roche Ltd), SR-14033 и связанные соединения описанные в, например, EP 873753 A1, US 20010006972 A1, US 20030109417 A1, WO 01/52844 A1, могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Антагонисты рецептора NK-2, такие как непадутант (Menarini Ricerche SpA), саредутант (Sanofi-Synthelabo), SR-144190 (Sanofi-Synthelabo) и UK-290795 (Pfizer Inc) могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Антагонисты рецептора NK3, такие как осанетант (Sanofi-Synthelabo), талнетант и связанные соединения, описанные в, например, WO 02/094187 A2, EP 876347 A1, WO 97/21680 A1, US 6277862, WO 98/11090, WO 95/28418, WO 97/19927 и Boden et al. (J Med Chem. 39:1664-75, 1996), могут быть использованы или связаны с пептидами по изобретению.

Ингибиторы обратного захвата норадреналина-серотонина, такие как милнаципран и связанные соединения, описанные в WO 03/077897 A1, могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Антагонисты ваниллоидных рецепторов, такие как арванил и связанные соединения, описанные в WO 01/64212 A1, могут быть использованы с или связанными с пептидами по изобретению.

Когда обезболивающим средством является пептид и он ковалентно связан с пептидом, описанным в настоящем описании, полученный пептид может также включать, по меньшей мере, один участок расщепления трипсином или химотрипсином. Когда присутствует в пептиде, обезболивающему пептиду может предшествовать (если он находится на карбоксиконце) или следовать за ним (если он находится на аминоконце) участок расщепления химотрипсином или трипсином, который позволяет высвобождать обезболивающий пептид.

В добавление к сиалорфин-связанным пептидам, обезболивающие пептиды включают: AspPhe, эндоморфин-1, эндоморфин-2, ноцистатин, даларгин, люпрон, зикнотид и субстанцию P.

Способы лечения

Пептиды по изобретению могут быть использованы для лечения или предотвращения рака, предраковых опухолей или метастатических опухолей. Например, они могут быть использованы для предотвращения или лечения: колоректального/местного метастазирующего колоректального рака, рака желудочно-кишечного тракта, рака легких, рака или предраковых опухолей или метастатических опухолей эпителиальных клеток, полипов, карцином молочной железы, колоректальной, легких, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, почек, желудка, мочевого пузыря, печени, пищевода и яичка, карциномы (например, базальноклеточной, базосквамозной, Брауна-Пирса, карциномы протоков, опухоли Эрлиха, Кребса, клеток Меркеля, мелко- или немелкоклеточной легких, овсяновидных клеток, папиллярной, бронхиолярной, сквамозных клеток, промежуточных клеток Уолкера), лейкоза (например, B-клеточного, T-клеточного, HTLV, острого или хронического или лимфоцитарного, тучных клеток, миелоидного), гистиоцитомы, гистиоцитоза, болезни Ходжкина, не-Ходжкинской лимфомы, плазмацитомы, ретикулоэндотелиоза, аденомы, аденокарциномы, аденофибромы, аденолимфомы, амелобластомы, ангиокератомы, ангиолимфоидной гиперплазии с эозинофилией, склерозирующей ангиомы, ангиоматоза, апудомы, бранхиомы, злокачественного карциноидного синдрома, карциноидной болизни сердца, карциносаркомы, цементомы, холангиомы, холестеатомы, хондросаркомы, хондробластомы, хондросаркомы, хордомы, хористомы, краниофарингиомы, хондромы, цилиндромы, цистаденокарциномы, цистаденомы, цистосарконии филлодия, дисгерминомы, эпендимомы, саркомы Эвинга, фибромы, фибросаркомы, гиганто-клеточной опухоли, ганглионевромы, глиобластомы, гломангиомы, гранулезо-клеточной опухоли, гинандробластомы, гамартомы, гемангиоэндотелиомы, гемангиомы, гемангио-перицитомы, гемангиосаркомы, гепатомы, островково-клеточной опухоли, саркомы Капоши, лейомиомы, лейомиосаркомы, лейкосаркомы, опухоли из клеток Лейдига, липомы, липосаркомы, лимфангиомы, лимфангиомиомы, лимфангиосаркомы, медуллобластомы, менингиомы, мезенхимомы, мезонефромы, мезотелиомы, миобластомы, миомы, миосаркомы, миксомы, миксосаркомы, невриномы, невромы, нейробластомы, нейроэпителиомы, нейрофибромы, нейрофиброматоза, одонтомы, остеомы, остеосаркомы, папилломы, параганглиомы, нехромаффинной параганглионии, пинеаломы, рабдомиомы, рабдомиосаркомы, опухоли из клеток Сертоли, тератомы, тека-клеточной опухоли и других заболеваний, в которых клетки становятся диспластическими, бессмертными или трансформированными.

Пептиды по изобретению могут быть использованы для лечения или предотвращения: Семейного Аденоматозного Полипоза (FAP) (аутосомно-доминатного синдрома), который предшествует раку толстой кишки, наследственного неполипозного колоректального рака (HNPCC) и наследственного аутосомно-доминатного синдрома.

Для лечения или предотвращения рака, предраковых опухолей и метастатических опухолей пептиды могут быть использованы в комбинированной терапии с облучением или химиотерапевтическими агентами, ингибитором цГМФ-зависимой фосфодиэстеразы или селективным ингибитором цклооксигеназы-2 (ряд селективных ингибиторов циклооксигеназы-2 описаны в WO02062369, таким образом включенным в виде ссылки).

Пептиды могут быть для лечения или предотвращения воспаления. Следовательно, они могут быть использованы отдельно или в комбинации с ингибитором цГМФ-зависимой фосфодиэстеразы или селективного ингибитор циклооксигеназы-2 для лечения: органного воспаления, ИЗК (например, болезни Крона, язвенного колита), астмы, нефрита, гепатита, панкреатита, бронхита, муковисцидоза, ишемических заболеваний кишечника, кишечного воспаления/аллергии, брюшной болезни, проктита, эозинофильного гастроэнтерита, мастоцитоза и других воспалительных расстройств.

Пептиды могут также быть использованы для лечения или предотвращения инсулин-связанных расстройств, например: сахарного диабета II, гипергликемии, ожирения, расстройств, ассоциированных с нарушениями в транспорте глюкозы и электролитов и секреции инсулина в клетках или эндокринных расстройств. Они могут быть также использованы в лечении инсулинорезистентности и постхиругического и не постхирургического снижения чувствительности к инсулину.

Пептиды могут быть использованы для предотвращения или лечения респираторных расстройств, включая расстройства вдыхания, вентиляции и секреции слизи, легочную гипертензию, хроническую обструкцию сосудов и дыхательных путей и необратимые обструкции сосудов и бронхов.

Пептиды могут быть использованы в комбинированной терапии с ингибитором фосфодиэстеразы (примеры таких ингибиторов могут быть обнаружены в патенте США № 6333354, таким образом включенным в виде ссылки).

Пептиды могут также быть использованы для предотвращения или лечения: ретинопатии, нефропатии, диабетической ангиопатии и образования отека.

Пептиды могут также быть использованы для предотвращения или лечения неврологических расстройств, например головной боли, тревоги, расстройств движения, агрессии, психоза, эпилептических припадков, панических атак, истерии, расстройств сна, депрессии, шизоаффективных расстройств, апноэ во сне, синдромов дефицита внимания, потери памяти и нарколепсии. Они могут также быть использованы как седативные средства.

Пептиды и обнаружимо меченные пептиды могут быть использованы в качестве маркеров для распознавания, определения, стадирования или диагностики заболеваний и состояний тонкой кишки, включая: болезнь Крона, колит, воспалительные заболевания кишечника, опухоли, доброкачественные опухоли, такие как доброкачественные стромальные опухоли, аденома, ангиома, аденоматозные (на ножке и без ножки) полипы, злокачественные, карциноидные опухоли, опухоли эндокринных клеток, лимфома, аденокарцинома, карцинома верхнего, среднего и нижнего отделов желудочно-кишечного тракта, желудочно-кишечные стромальные опухоли (GIST), такие как лейомиома, клеточная лейомиома, лейомиобластома и лейомиосаркома, опухоли желудочно-кишечных автономных нервов, синдромы мальабсорбции, глютеновая болезнь, дивертикулез, дивертикул Меккеля, дивертикулы толстой кишки, мегаколон, болезнь Гирсшпрунга, синдром раздраженной толстой кишки, мезентериальная ишемия, ишемический колит, колоректальный рак, полипоз толстой кишки, синдром полипов, кишечная аденокарцинома, синдром Лиддла, миопатия Броди, младенческие судороги и хориоатетоз.

Пептиды могут быть соединенены с другой молекулой (например, диагностической или терапевтической молекулой) для нацеливания на клетки, несущие рецептор ГЦС, например муковисцидозные поражения и специфические клетки, выстилающие кишечный тракт. Следовательно, они могут быть использованы для нацеливания радиоактивных компонентов или терапевтических компонентов в кишечнике для помощи в визуализации и диагностике или лечении колоректального/метастазирующего или местного колоректального рака и для доставки нормальных копий гена опухолевого супрессора p53 в кишечный тракт.

Пептиды могут быть использованы отдельно или в комбинированной терапии для лечения эректильной дисфункции.

Пептиды могут быть использованы отдельно или в комбинированной терапии для лечения заболеваний внутреннего уха, например для лечения болезни Меньера, включая симптомы заболевания, такие как головокружение, потеря слуха, шум в ушах, ощущение полноты в ухе и для поддержания гомеостаза жидкости во внутреннем ухе.

Пептиды могут быть использованы отдельно или в комбинированной терапии для лечения расстройств, связанных с задержкой жидкости и натрия, например, болезней транспортных систем электролитов-воды/электролитов в почках, кишечнике и урогенитальной системе, застойной сердечной недостаточности, гипертонии, гипотонии, цирроза печени и нефротического синдрома. Кроме того, они могут быть использованы для усиления диуреза или регуляции кишечной жидкости.

Пептиды могут быть использованы отдельно или в комбинированной терапии для лечения расстройств, связанных с секрецией бикарбоната, например муковисцидоза.

Пептиды могут быть использованы отдельно или в комбинированной терапии для лечения расстройств, ассоциированных с регенерацией клеток печени.

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается фармацевтической композиции для лечения желудочно-кишечных расстройств и состояний, содержащей: (а) пептид из 14 аминокислот, который активирует рецептор гуанилатциклазы С (ГЦ-С), (б) средство, выбранное из: ингибитора протонного насоса, агониста Н2 рецепторов, антагониста опиоидных рецепторов, агониста опиоидных рецепторов, и (с) фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение обеспечивает уменьшение воспаления, боли, увеличивает желудочно-кишечную моторику у пациента. 2 з.п. ф-лы, 6 пр., 10 ил.

1. Фармацевтическая композиция для лечения желудочно-кишечного расстройства, содержащая:
(a) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность:
Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
(b) средство, выбранное из:
(i) ингибитора протонного насоса;
(ii) агониста H2 рецепторов;
(iii) антагониста опиоидных рецепторов; и
(iv) агониста опиоидных рецепторов; и
(c) фармацевтически приемлемый носитель.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой агонист опиоидных рецепторов представляет собой фентанил или морфин.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой полипептид состоит из аминокислотной последовательности: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.