СПОСОБ ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для оценки риска развития хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у пациентов с хроническим бронхитом по составу и соотношению физиологически важных жирных кислот мембран эритроцитов.

Болезни органов дыхания относятся к наиболее распространенным заболеваниям человека в структуре общей заболеваемости. Они представляют значительную медико-социальную проблему, так как входят в число болезней, лидирующих по количеству дней нетрудоспособности, причинам инвалидности и занимают четвертое место среди причин смерти. Большое внимание среди хронических заболеваний бронхолегочной системы уделяется ХОБЛ и хроническому бронхиту (ХБ).

В мире ХОБЛ страдают от 4% до 15% взрослого населения. По данным, представленным в Глобальной стратегии диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких, пересмотр 2011 года (GOLD, 2011) распространенность ХБ в различных странах мира варьирует в широких пределах, в среднем от 10% до 47% [Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких (пересмотр 2011 года) / под. ред. А.С. Белевского. М.: Российское респираторное общество, 2012, 80 с.]. Взгляды исследователей на взаимоотношение ХБ и ХОБЛ менялись по мере расширения представлений о патогенезе этих заболеваний и в настоящее время остаются неоднозначными. Симптомы и морфологические изменения, характерные для ХБ, рассматривались ранее как стадия 0 или повышенный риск развития ХОБЛ [Fletcher С., Peto R. The natural history of chronic airflow obstruction // BMJ 1977; 1: 1645-8]. Позднее ХБ считали самостоятельной болезнью, которая не вызывает стойкого снижения дыхательной функции легких [Vestbo J., Prescott E., Lange P. Association between chronic mucus hypersecretion with FEV1 decline and COPD morbidity // Am J Respir Crit Care Med 1996; 153:1530-5]. В последние годы мнение исследователей сводится к тому, что ХБ может предшествовать развитию ХОБЛ [Guerra S., Sherrill D.L., Venker С., Ceccato C.M., Halonen M. Chronic bronchitis before age 50 years predicts incident airflow limitation and mortality risk // Thorax 2009; 64: 894-900]. Больные ХОБЛ, как правило, впервые обращаются за медицинской помощью на поздних стадиях заболевания, когда лечение не способно предупредить прогрессирование болезни и развитие осложнений. В связи с этим актуальной является проблема ранней доклинической диагностики заболевания, которая входит в ряд важнейших задач, представленных в Докладе рабочей группы GOLD [Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких (пересмотр 2011 года) / под. ред. А.С. Белевского. M: Российское респираторное общество. 2012. 80 с.].

Таким образом, распространенность, значительный экономический ущерб, обусловленный временной утратой трудоспособности, ранней инвалидизацией и высокой смертностью больных, обуславливают актуальность проблемы и необходимость разработки способа оценки риска развития и прогрессирования ХОБЛ с целью своевременного проведения профилактических мероприятий. Это позволит снизить заболеваемость и предупредить инвалидизацию лиц трудоспособного возраста. Учитывая возможность перехода хронического бронхита в более тяжелые нозологические формы заболеваний бронхолегочной системы, такие как ХОБЛ, крайне важным является раннее выявление риска развития хронической обструктивной болезни легких у данной категории пациентов.

В настоящее время согласно GOLD (2011) основным методом диагностики и оценки прогноза заболевания является интегральная оценка влияния ХОБЛ на состояние здоровья конкретного пациента. Она объединяет степень выраженности симптомов (используются опросники mMRC и CAT), данные спирометрии (спирометрические классы GOLD) и/или оценку риска обострений (используют спирометрические классы GOLD или определяют количество обострений за предшествующие 12 месяцев) [Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких (пересмотр 2011 года) / под. ред. А.С. Белевского. М.: Российское респираторное общество, 2012, 80 с.]. Учитывая, что между показателями спирометрии, симптомами и качеством жизни существует слабая корреляция [Jones P.W. Health status and spiral of declin // COPD 2009; 6:59-63] и для прогнозной оценки требуется мониторинг до 12 мес., снижается прогностическая значимость этого метода и эффективность проводимых лечебно-профилактических мероприятий. В связи с чем, крайне актуальным является поиск способов достоверной и своевременной оценки риска развития ХОБЛ у пациентов ХБ.

Известен способ прогнозирования риска развития хронической обструктивной болезни легких у длительно курящих лиц путем исследования биологических жидкостей пациента, согласно которому производят забор мокроты и определяют в ней уровень активности α₁-антитрипсина и уровень активности α₂-макроглобулина. При значениях α₁=341,17±41,77 мИЕ/мл и α₂=76,81±6,84 мИЕ/мл и выше прогнозируют риск развития ХОБЛ [Пат. РФ №2359618. Способ прогнозирования риска развития хронической обструктивной болезни легких у длительно курящих лиц / Черногорюк Г.Э., Смотрова А.А., Ямкина Н.С. и др. Опубл. 27.06.2009]. Однако этот способ применим только для курящих пациентов с ХОБЛ.

Известно, что в патогенезе ХБ и ХОБЛ значительную роль играет системная воспалительная реакция, которая значительно утяжеляет течение и прогноз заболевания [Авдеев С.Н. Хроническая обструктивная болезнь легких как системное заболевание // Пульмонология. 2007; 2: 104-115]. В развитии воспаления при этих патологиях участвуют провоспалительные медиаторы (цитокины, гистамин, нейтральные протеазы, эйкозаноиды). Особое внимание уделяется медиаторам липидной природы - эйкозаноидам (простагландины, лейкотриены, тромбоксаны), которые являются конечными продуктами метаболизма полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) [Schwartz J. Role of polyunsaturated fatty acids in lung disease // Am J Clin Nutr. 2000; 71 (1 Suppl):393S-6S]. Нарушение мембранного состава жирных кислот (ЖК), их метаболизма является важным фактором развития бронхолегочной патологии. Полиненасыщенные жирные кислоты, с одной стороны, являются структурными компонентами биологических мембран, с другой - субстратом для синтеза эйкозаноидов [Novgorodtseva Т.Р., Karaman Y.K., Zhukova N.V., Lobanova E.G., Antonyuk M.V., Kantur T.A. Composition of fatty acids in plasma and erythrocytes and eicosanoids level in patients with metabolic syndrome // Lipids in Health and Disease. 2011; 10: 82. doi:10.1186/1476-511Х-10-82 http://www.lipidworid.com/content/10/1/82]. Модификация профиля жирных кислот в липидах мембран может изменять включение, агрегацию, диффузионные перемещения мембранных компонентов, активность мембраносвязанных ферментов и экспрессию рецепторов, мембранную проницаемость и транспортные свойства. Многие функции иммунокомпетентных клеток, например секреция, хемотаксис, чувствительность к микроорганизмам, также зависят от жидкостности мембраны [Gangopadhyay S., Vijayan V.K., Bansal S.K. Lipids of erythrocyte membranes of COPD patients: a quantitative and qualitative study // COPD. 2012; 9(4): 322-331].

Клиническая значимость различий индивидуальных уровней жирных кислот установлена при многих неинфекционных заболеваниях. Предлагают использовать показатели ЖК в скрининге атопических болезней [Businco L. et al., 1993], при мониторинге острой и хронической алкогольной интоксикации [Folsom A.R., 1996], как диагностические маркеры заболеваний сердечно-сосудистой системы [Эндакова Э.А., Новгородцева Т.П., Светашев В.И. Модификация состава жирных кислот крови при сердечно-сосудистых заболеваниях. Владивосток, Дальнаука, 2002, 196 с.].

Однако отсутствуют данные о возможности использования жирных кислот в качестве критерия оценки риска развития хронических бронхолегочных заболеваний.

Известен способ прогнозирования развития сердечно-сосудистой патологии у потомков больных ишемической болезнью сердца (ИБС), основанный на исследовании закономерностей нарушения липидного обмена по показателям липидов и аполипопротеидов сыворотки крови, фосфолипидов и ЖК эритроцитов [ПАТ. 2214597 RU. Способ прогнозирования развития сердечно-сосудистой патологии у потомков больных ишемической болезнью сердца / Т.П. Новгородцева, Н.С. Журавская, Л.В. Сорокина. Опубл. 20.10.2003. Бюл. №29]. При определении указанных параметров у пробандов больных ИБС определяют семейный тип нарушения липидного обмена у прямых потомков и в соответствии с установленным типом прогнозируют развитие заболевания у потомков больного. Однако разработанные авторами изобретения критерии можно использовать только для прогнозирования развития сердечно-сосудистой патологии.

Известен способ диагностики ИБС, позволяющий на основании анализа жирнокислотного спектра эритроцитарных мембран и определении прогностического показателя по соотношению ЖК, выявлять тенденцию к прогрессированию патологического процесса в сердце [Пат. 1760453 RU. Способ диагностики ишемической болезни сердца / Т.П. Новгородцева, Э.А. Эндакова, В.Е. Васьковский. Опубл. 07.09.92. Бюл. №33]. Данный способ нельзя экстраполировать на пациентов с заболеваниями органов дыхания.

Известен способ диагностики некоронарогенного повреждения миокарда у больных туберкулезом легких, основанный на определении в сыворотке крови концентрации сердечного белка, связывающего жирные кислоты (сБСЖК) (Патент РФ №2475746). Способ диагностики некоронарогенного повреждения миокарда у больных туберкулезом легких / Пермякова И.Н., Бакумцева Л.С. Опубликовано: 20.02.2013. Бюл. №5). При увеличении концентрации сБСЖК диагностируют некоронарогенное повреждение миокарда. Изобретение обеспечивает раннюю доклиническую диагностику некоронарогенного повреждения миокарда у указанной группы больных, что ограничивает его использование в диагностике заболеваний сердца и легких неинфекционной этиологии.

Несмотря на проведенные патентные исследования прямой прототип из уровня техники не выявлен.

Как уже упоминалось выше, важным фактором развития бронхолегочной патологии является нарушение состава жирных кислот (ЖК) клеточной мембраны, детерминирующее дисбаланс синтеза про- и противовоспалительных эйкозаноидов и развитие хронического воспалительного процесса. Воспаление, в свою очередь, обуславливает развитие и утяжеление заболеваний органов дыхания. Следовательно, идентификация нарушения состава жирных кислот клеточных мембран может стать диагностическим критерием развития ХОБЛ.

Эйкозаноиды или оксилипины - это большая группа молекулярных медиаторов, синтезирующихся из арахидоновой (С_20:4n-6) и эйкозапентаеновой (С_20:5n-3) полиненасыщенных жирных кислот. Метаболиты арахидоновой кислоты характеризуются ярко выраженными провоспалительными, бронхоконстрикторными свойствами. Тогда как из эйкозапентаеновой кислоты синтезируются эйкозаноиды противовоспалительного и бронходилатационного действия. Нарушение синтеза и дисбаланс эйкозаноидов в организме может стать причиной развития хронического воспаления (Караман Ю.К., Лобанова Е.Г., Юбицкая Н.С. Нарушение синтеза эйкозаноидов у больных с метаболическим синдромом // Клиническая медицина, 2010, №3. С.46-49). Определение содержания С_20:4n-6 и С_20:5n-3, а также их соотношения может указывать на нарушение в эйкозаноидном цикле и, соответственно, на риск развития воспалительного процесса. Эти исследования стали предпосылкой к созданию нового надежного способа оценки риска развития хронической обструктивной болезни легких.

Задача изобретения состоит в том, чтобы создать новый надежный достоверный способ оценки риска развития хронической обструктивной болезни легких для раннего выявления риска развития ХОБЛ у пациентов, страдающих хроническим бронхитом, применение которого в медицинской практике позволит своевременно определить риск развития ХОБЛ и проводить лечебно-профилактические мероприятия, чтобы предупредить переход хронического бронхита в более тяжелые формы заболевания бронхолегочной системы и последующую инвалидизацию.

Для решения поставленной задачи согласно предлагаемому способу оценки риска развития хронической обструктивной болезни легких у пациента берут пробу венозной крови, выделяют мембраны эритроцитов, из которых экстрагируют липиды с последующим анализом состава жирных кислот, а в качестве оценочного коэффициента риска (R) используют отношение жирных кислот С_20:4n-6/С_20:5n-3, по величине которого судят о степени риска развития ХОБЛ,

при значении R до 10,40-10,64 степень риска развития ХОБЛ оценивают как низкую,

при значении R от 10,65 до 14,71-17,31 - степень риска развития ХОБЛ оценивают как среднюю,

при значении R в диапазоне от 17,32 до 29,80-35,4 диагностируют наличие ХОБЛ легкой степени.

Высокое значение соотношения жирных кислот С_20:4n-6/С_20:5n-3, т.е. превышающее 35,4, свидетельствует о нарушении в эйкозаноидном цикле, преобладании синтеза провоспалительных и бронхоспастических эйкозаноидов. Арахидоновая кислота (С_20:4n-6) и ее метаболиты (С_22:4n-6) являются субстратами для биосинтеза эйкозаноидов, обладающими воспалительными, хемотаксическими, бронхоспастическими свойствами. Из эйкозапентаеновой кислоты (С_20:5n-3) и продуктов ее метаболизма (С_22:5n-3, С_22:6n-3) по циклооксигеназным и липоксигеназным реакциям образуются эйкозаноиды противовоспалительного, бронходилатационного действия. Следовательно, повышенное содержание ПНЖК семейства n6 обеспечивает воспалительный компонент, оказывает влияние на агрегационные свойства тромбоцитов, функционирование иммунной системы, бронхоспазм. Увеличение содержания С_20:4n-6 в мембране эритроцитов у лиц с хронической патологией бронхолегочной системы свидетельствует об увеличении субстрата для образования медиаторов воспаления (лейкотриен В4), бронхоспазма (простагландин D2). Тогда как эндогенный недостаток в клетках ПНЖК n3 приводит к дефициту эйкозаноидов с противовоспалительной и бронходилатационной активностью. Следовательно, повышение соотношения жирных кислот С_20:4n-6/С_20:5n-3 может являться специфическим маркером риска развития ХОБЛ. Раннее выявление нарушения состава жирных кислот у пациентов с хроническим бронхитом без ограничения скорости воздушного потока, коррекция этих нарушений может предупредить прогрессирование патологического процесса и развитие ХОБЛ.

Технический результат заключается в создании способа оценки риска развития хронической обструктивной болезни легких, позволяющего на ранних стадиях выявлять и оценивать с высокой точностью риск развития ХОБЛ на основе оценки изменений соотношения ключевых жирных кислот С_20:4n-6 и С_20:5n-3 в мембранах эритроцитов. Изобретение помогает вовремя оценить течение заболевания бронхолегочной системы и своевременно проводить лечение.

Решению поставленной задачи - разработке нового способа предшествовали глубокие клинические исследования, проводившиеся на базе клиники Владивостокского филиала ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН-НИИ МКВЛ.

В исследовании приняли участие 45 человек на условиях добровольного информированного согласия. Из них 35 пациентов с заболеваниями бронхолегочной системы (22 муж. и 13 жен.) в возрасте 23-57 лет (37,4±2,36 лет), в том числе 20 больных хроническим катаральным необструктивным бронхитом (ХБ) и 15 больных ХОБЛ легкой степени стабильного течения.

Заболевания диагностировали на основании анамнестических данных, объективного осмотра, лабораторных исследований, спирографии с выполнением бронхолитического теста. Диагноз ХОБЛ выставляли согласно Глобальной стратегии: диагностика, лечение и профилактика ХОБЛ (GOLD 2011) [Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких (пересмотр 2011 года) / под. ред. А.С. Белевского. М.: Российское респираторное общество, 2012, 80 с.]. В контрольную группу вошли 10 здоровых добровольцев в возрасте 23-55 лет (32,2±8,2 лет), не курящих и никогда не куривших. Критериями исключения являлись наличие профессиональных заболеваний бронхолегочной системы, сердечно-сосудистых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь) и их осложнений, сахарного диабета, заболеваний щитовидной железы, острых патологических состояний и обострений хронических болезней.

У каждого пациента определяли бронхиальную проходимость для постановки диагноза, оценивали активность воспалительного процесса по показателям неспецифического звена иммунитета и уровню цитокинов в крови, анализировали качественный и количественный состав жирных кислот мембран эритроцитов, рассчитывали соотношение жирных кислот С_20:4n-6/С_20:5n-3 (коэффициент риска (R)).

Предлагаемый способ основан на функциональной роли полиненасыщенных жирных кислот - жирных кислот С_20:4n-6 и С_20:5n-3 в развитии воспалительного процесса и детерминации бронхолегочных осложнений.

Состав жирных кислот мембран эритроцитов определяли методом газожидкостной хроматографии.

Биоматериал: кровь с антикоагулянтом (200 мкл 20% р-ра гепарина на 5 мл крови либо ЭДТА 0,1М 0,02 мл/мл крови) 8-12 мл. Время от забора крови до момента выделения клеток составляло не более 1 часа.

Бронхиальная проходимость оценивалась по показателям объема форсированного выдоха за 1-ю секунду (ОФВ₁) и форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ), индекса ОФВ₁/ФЖЕЛ. За бронхиальную обструкцию принимали показатель ОФВ₁/ФЖЕЛ<0,70.

При обследовании с помощью спирометрии у больных хроническим бронхитом отсутствовали признаки ограничения скорости воздушного потока. Пациенты ХОБЛ имели легкую степень тяжести - ОФВ1 (82,6±2,1%) и ОФВ1/ФЖЕЛ (68,6±1,5%), средняя длительность заболевания составляла 8,4±1,6 года, средний возраст (48,8±2,2 лет).

Активность воспалительного процесса оценивали по состоянию неспецифического звена иммунитета, цитокинового статуса. Исследовали фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН) по Маянскому [Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций. / Под ред. Маянского А.Н. Горький: Изд-во Горьк. Мед. институт, 1989, 242 с.]. Изучали содержание в сыворотке крови фактора некроза опухоли (TNFα), рецептора к TNFαI (s-TNFα RI (р55)), интерлейкина-8 (IL-8), интерлейкина-10 (IL-10), основного фактора роста фибробластов (bFGF), трансформирующего фактора роста β1 (TFGβ1). Уровень цитокинов определяли иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы «Genzyme diagnostics». Измерения проводили в плоскодонных 96-луночных планшетах на спектрофотометре Bio-tek Power Wave (США).

Для исследования жирнокислотного состава эритроцитарных мембран у пациентов отбирали кровь из локтевой вены в стерильные силиконизированные пробирки с антикоагулянтом (200 мкл 20% р-ра гепарина на 5 мл крови либо ЭДТА 0,1М 0,02 мл/мл крови). Перед проведением анализа пробирку с кровью помещали в ротамикс и аккуратно перемешивали в течение 5 мин.

Затем кровь центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. В результате получали разделение крови на 3 слоя: эритроциты, лейкоцитарная пленка и плазма. Эритроциты располагались в нижнем слое пробирки. Осторожно пипеткой эритроциты отбирали в пробирку с физиологическим раствором и центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин. Процедуру повторяли еще 2-3 раза. Из полученной эритроцитарной массы выделяли мембраны эритроцитов. Мембраны эритроцитов получали путем гемолиза клеток дистиллированной водой и центрифугированием 15 мин при 14000 об/мин в растворе PBS с трехкратным промыванием. Выделение липидов из мембран эритроцитов крови осуществляли, используя систему растворителей хлороформ - метанол в соотношении 1:2, затем добавляли по 1 объему хлороформа, метанола и 0,9% раствора хлористого натрия до полного расслоения фаз [Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 1959; 37: 911-917]. Анализ состава жирных кислот (ЖК) проводили методом газожидкостной хроматографии после их метилирования [Carreau J.P., Duback J.P. Adaptation of a macroscale method to the microscale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extract // J. Chromatogr. 1978; 151(3): 384-390; Christie W.W. Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas-chromatography - a reappraisal // J. Chromatogr. 1978; 447(2): 305-314]. Метиловые эфиры ЖК получали с помощью транс-метилирования липидов 1% раствором натрия в метаноле и затем 5% HCl в метаноле. Метиловые эфиры экстрагировали гексаном. Гексановый раствор метиловых эфиров ЖК очищали с помощью микротонкослойной хроматографии в бензоле. Зону метиловых эфиров на силикагеле определяли по стандарту или с помощью паров йода. Эфиры элюировали хлороформом, раствор упаривали в вакууме на роторном испарителе (Венгрия). Перерастворенные в гексане метиловые эфиры анализировали на газожидкостном хроматографе Shimadzu GC-2010 (Япония), снабженном пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонкой (0,25 мм × 30 м) с привитой фазой Supelcowax 10. Температура колонки и детектора 210°C, температура испарителя 240°C. Газ-носитель - гелий. Расчет площади хроматографических пиков и обработку результатов проводили на станции Z-Chrom. Идентифицировали метиловые эфиры ЖК по времени удерживания с использованием стандартов и по значениям «углеродных чисел» [Stransky К., Jursik Т., Vitek A., Skorepa J. An improved method of characterizing fatty acids by equivalent chain length values // J. High. Res. Chromatogr. 1992; 15: 730-740]. Результаты выражали в относительных % от общей суммы ЖК.

Для статистического анализа полученных данных использовалась прикладная программа «Statistica», версия 6,1 (серия 1203С для Windows). Статистическую значимость различий средних величин определяли по непараметрическим критериям Вилкоксона, Уайта.

В результате анализа лабораторных показателей у обследованных пациентов с ХБ и ХОБЛ определен иммунный статус (табл.1), состав жирных кислот мембран эритроцитов (табл.2). Исследование иммунного статуса у больных ХБ и ХОБЛ выявило наличие воспалительного процесса (табл.1). Установлено падение ФАН, что указывает на угнетение неспецифических факторов иммунной защиты. У пациентов с ХБ и ХОБЛ зарегистрированы высокие значения TNF-α, s-TNFα-RI (p55) по сравнению с группой контроля (р<0,001 для всех показателей). У пациентов ХБ гиперпродукция медиаторов воспаления компенсировалась увеличением IL-8 (р<0,001), обладающего иммуносупрессорной активностью. У больных ХОБЛ уровень IL-8 не отличался от показателя контрольной группы. У больных ХБ отмечалось снижение TGF-β (p<0,01). Тогда как у пациентов с ХОБЛ содержание TGF-β значительно увеличивалось (р<0,001).

Таблица 1 Показатели иммунного статуса у пациентов с хроническими заболеваниями бронхолегочной системы (М±m) Показатели Контрольная группа (здоровые), n=10 Больные с ХБ, n=20 Больные с ХОБЛ, n=15 ФАН, % 64,52±0,68 59,90±0,88* 57,52±1,96* TNFα, пг/мл 2,60±0,03 7,89±1,47*** 4,3±0,3*** sTNF-RI, пг/мл 789,1±7,10 1595,58±141,53*** 1523,4±11,0*** bFGF, пг/мл 38,3±0,8 38,93±1,54 53,9±0,3*** TGF-β, пг/мл 1865,4±11,3 1479,17±19,60** 48145,0±20,6*** ИЛ-8, пг/мл 11,5±1,9 17,40±1,20*** 13,4±1,6 Примечание: (*) - статистическая значимость различий относительно контрольной группы: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001

Полученные результаты исследования свидетельствуют о развитии воспалительной реакции и нарушении цитокиновой регуляции иммунного ответа у больных хроническими заболеваниями бронхолегочной системы. При этом дисбаланс между про- и противовоспалительными процессами при ХОБЛ был более выражен в сравнении с ХБ, что свидетельствует о формировании хронического воспаления.

Следовательно, у пациентов с ХБ отсутствуют ярко выраженные клинические симптомы заболевания (нет ограничения скорости воздушного потока и воспаления).

Однако анализ состава жирных кислот мембран эритроцитов и расчет соотношения С_20:4n-6/С_20:5n-3 позволил выявить нарушения в липидной составляющей клеточной мембраны у больных ХБ и ХОБЛ (табл.2).

В составе липидов мембран эритроцитов обследованных групп выделено 37 индивидуальных жирных кислот - насыщенных, моноеновых и полиненасыщенных, нормального и изостроения с длиной цепи от С₁₂ до С₂₄, как с четным, так и нечетным числом углеродных атомов (табл.2).

При ХБ происходит накопление некоторых насыщенных жирных кислот, таких как C_12:0 (р<0,01), С_14:0 (р<0,01), C_15:0 (p<0,05) относительно группы контроля (табл.2). У больных ХБ в мембране эритроцитов происходит увеличение относительной доли C_16:1n-7 (p<0,05). Относительное содержание С_20:4n-6 увеличивалось на 13% (p<0,05) по сравнению с группой здоровых лиц. Уровень С_20:5n-3 снижался на 32% (p<0,05) относительно контрольной группы. Падение уровня С_20:5n-3 в мембране эритроцитов привело к уменьшению содержания ее метаболита - С_20:5n-3 на 6% (p<0,05). Изменение в содержании С_20:4n-6 и С_20:5n-3 привело к увеличению соотношения С_20:4n-6/С_20:5n-3 в 1,5 раза (p<0,001).

При ХОБЛ выявлено увеличение доли C_15:0 (p<0,001), C_18:0 (p<0,05), С_20:0 (p<0,001) по сравнению с группой здоровых лиц. Показано снижение относительного содержания эссенциальной линолевой кислоты (C_18:2n-6, р<0,01). В мембранах эритроцитов происходило увеличение С_20:4n-6 на 41% (р<0,001) по сравнению с группой контроля. Относительное содержание С_20:5n-3 (р<0,001) и ее метаболита докозапентаеновой кислоты (С_22:5n-3, р<0,05) в мембране эритроцита снижалось в два раза и на 9% соответственно у больных ХОБЛ.

Таблица 2 Состав жирных кислот мембран эритроцитов у пациентов с хроническими заболеваниями бронхолегочной системы Жирные кислоты, % Контрольная группа (здоровые), n-10 Больные с ХБ, n-15 Больные с ХОБЛ, n-15 12:0 0,18±0,01 0,35±0,07**   14:0 0,39±0,03 0,65±0,12** 0,34±0,01 15:0 0,17±0,01 0,24±0,04* 1,08±0,01*** 16:0 23,98±1,28 22,32±1,47 23,16±0,28 16:1n-9 0,21±0,05 0,27±0,03 0,21±0,05 16:1n-7 0,39±0,03 0,51±0,05* 0,53±0,05 17:0 0,35±0,02 0,27±0,03 0,25±0,03 18:0 13,40±0,75 15,27±0,52 16,78±0,40* 18:1n-9 14,84±0,84 14,86±0,45 15,49±0,73 18:1n-7 1,53±0,08 1,33±0,12 1,76±0,05 18:1n5 0,32±0,02 0,33±0,08 0,36±0,14 18:2n6 15,75±0,28 15,00±0,16 12,21±0,61** 18:3n3 0,15±0,02 0,22±0,09 0,13±0,03 20:0 0,150±0,035 0,13±0,04 0,46±0,04*** 20:1 0,34±0,07 0,27±0,07 0,23±0,03 20:2n-6 0,250±0,005 0,29±0,03 0,26±0,02 20:3n-6 1,59±0,51 1,45±0,17 1,70±0,20 20:4n-6 12,95±1,65 14,89±0,79* 18,26±0,50*** 20:5n-3 1,23±0,04 0,93±0,09* 0,56±0,06*** 22:4n-6 2,37±0,29 2,38±0,22 3,18±0,31** 22:5n-6 0,37±0,01 0,31±0,04 0,46±0,07 22:5n-3 1,99±0,02 1,88±0,03* 1,82±0,05* 22:6n-3 4,67±0,85 6,09±0,60 5,87±0,39 Сумма n-6 32,91±0,10 34,32±0,70* 36,07±0,55** Сумма n-3 8,04±0,12 9,12±0,89 8,32±0,42 20:4n-6/20:5n-3 10,52±0,12 16,01±1,3*** 32,60±2,8*** Примечание: (*) - статистическая значимость различий относительно контрольной группы: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001. В таблицу не внесены отдельные представители ЖК, содержание которых не превышает 0,1%. В основном это насыщенные ЖК нормального строения (10:0, 19:0, 22:0), некоторые моноеновые (14:1, 22:1), диеновые (18:2n-5/9) и триеновые (20:3n-3) ЖК.

Выявлено накопление С_22:4n-6 (р<0,001), увеличение суммы ПНЖК n6 на 10% (р<0,01) по сравнению с группой здоровых лиц. Соотношение С_20:4n-6/С_20:5n-3 у больных ХОБЛ повышалось в 3 раза (р<0,001) относительно группы контроля.

Из полученных результатов следует, что развитие хронических заболеваний органов дыхания сопровождается нарушением состава жирных кислот мембран эритроцитов, дисбалансом между субстратами синтеза про- и противовоспалительных эйкозаноидов. Модификация жирнокислотного состава цитомембран у больных хроническими заболеваниями бронхолегочной системы приводит не только к нарушению структуры клеточного каркаса, но и к патологии регуляции иммунного ответа через дисфункцию синтеза провоспалительных липидных медиаторов. Дезорганизация липидной компоненты клеточной мембраны обуславливает развитие воспалительного процесса, что является важным звеном патогенеза ХОБЛ. При отсутствии ярко выраженных клинических симптомов у больных ХБ развиваются метаболические нарушения, характеризующиеся увеличением доли арахидоновой кислоты при достоверном дефиците эйкозапентаеновой кислоты. Значимым фактором повышенного риска развития и отягощения бронхолегочной патологии является увеличение соотношения С_20:4n-6/С_20:5n-3, которое свидетельствует о нарушениях в эйкозаноидной цикле, преобладании синтеза провоспалительных медиаторов.

Таким образом, соотношение жирных кислот С_20:4n-6/С_20:5n-3 является специфическим маркером неблагоприятного течения бронхолегочной патологии и может служить достоверным критерием оценки развития заболевания, позволяя прогнозировать риск развития ХОБЛ.

Так, при значении С_20:4n-6/С_20:5n-3 до 10,40-10,64 степень риска развития ХОБЛ оценивают как низкую; при значении С_20:4n-6/С_20:5n-3 от 10,65 до 14,71-17,31 - степень риска развития ХОБЛ оценивают как среднюю; при С_20:4n-6/С_20:5n-3 в диапазоне от 17,32 до 29,80-35,4 диагностируют наличие ХОБЛ легкой степени.

Сопоставление результатов полностью подтвердило достоверность предложенного метода оценки риска развития ХОБЛ. Повышение соотношения С_20:4n-6/С_20:5n-3 у пациентов с патологией органов дыхания можно рассматривать как факторы риска развития ХОБЛ.

В течение года все обследуемые с ХБ и ХОБЛ находились под наблюдением. Полученные выводы были проверены в результате динамического наблюдения пациентов в течение года.

Изобретение позволяет в более ранние сроки от начала заболевания устанавливать возможность риска развития ХОБЛ, прогнозировать динамику развития заболевания и проводить лечение.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Как было подробно указано в клинически-лабораторной части настоящего описания, у пациента отбирается кровь из локтевой вены в стерильные силиконизированные пробирки с антикоагулянтом (200 мкл 20% р-ра гепарина на 5 мл крови либо ЭДТА 0,1М 0,02 мл/мл крови). Перед проведением анализа пробирку с кровью помещают в ротамикс и аккуратно перемешивается в течение 5 мин.

Затем кровь центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Эритроциты, находящиеся в нижнем слое пробирки, отбирают в пробирку с физиологическим раствором и центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. Процедуру повторяют 2-3 раза. Из полученной эритроцитарной массы известным методом выделяют мембраны эритроцитов с последующим экстрагированием липидов, которые подвергают обработке растворителями с последующим получением метиловых эфиров ЖК. Метиловые эфиры анализируют на газожидкостном хроматографе Shimadzu GC-2010 (Япония). Расчет площади хроматографических пиков и обработку результатов проводят на станции Z-Chrom. Идентифицируют метиловые эфиры ЖК по времени удерживания с использованием стандартов и по значениям «углеродных чисел». Результаты выражают в относительных % от общей суммы ЖК. Оценку риска (R) осуществляют по формуле:

R=A_C20:4n-6:В_С20:5n-3, где

R - коэффициент риска,

A_C20:4n-6 - содержание жирной кислоты С_20:4n-6,

B_C20:5n-3 - содержание жирной кислоты C_20:5n-3.

Клинический пример. Пациентка В., 45 лет, поступила в клинику ПИИ МКВЛ СО РАМН с жалобами на продуктивный кашель с небольшим количеством слизистой мокроты, одышку при интенсивной физической нагрузке. Вышеуказанные жалобы беспокоят пациентку последние 5 лет с обострениями продолжительностью до 2 недель 1-2 раза в год, частые острые респираторные вирусные заболевания - 3-4 раза в год. При объективном осмотре: состояние удовлетворительное, кожные покровы обычной окраски, перкуторно над легкими - легочный звук, аускультативно - дыхание везикулярное с ЧД 18 в 1 мин, ЧСС 72 в 1 мин, АД 130/70 мм рт.ст. По остальным органам и системам без особенностей. При исследовании бронхиальной проводимости установлено форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ) - 88%, постбронходилятационный объем форсированного выдоха за 1-ю секунду (ОФВ₁) - 80%, индекс ОФВ₁/ФЖЕЛ - 0,89. Результаты оценки по тесту CAT составили 8 балов.

Пациентке проведено обследование по предлагаемому способу, а именно взято из локтевой вены 5 мл крови в стерильную силиконизированную пробирку с антикоагулянтом (200 мкл 20% р-ра гепарина). Затем в соответствии с вышеизложенной методикой выполнено выделение эритроцитарных мембран с последующим экстрагированием ЖК. В результате анализа метиловых эфиров жирных кислот методом газожидкостной хроматографии выявлено, что относительное содержание С_20:4n-6 составило 12,4%, доля С_20:5n-3 - 0,72% от общей суммы всех жирных кислот в мембране эритроцита. Далее проведена оценка риска развития ХОБЛ у данной пациентки. Рассчитали коэффициент риска (R) по формуле R=A_C20:4n-6/B_C20:5n-3, где A_C20:4n-6=12,4%, B_C20:5n-3=0,72%. Коэффициент риска (R) составил 17,2, что соответствует средней степени риска развития ХОБЛ.

При повторном обследовании через 6 мес. на фоне отсутствия выраженной симптоматики выявлены признаки нарушения бронхиальной проходимости, соответствующие классу GOLD 1: индекс ОФВ₁/ФЖЕЛ равен 0,68, постбронходилятационный ОФИ₁ - 82%. При этом оценка по тесту CAT составила 9 балов. При обследовании по предлагаемому способу уровень С_20:4n-6 составил 13,96% и количество С_20:5n-3 в мембране эритроцита равнялось 0,41% от общей суммы ЖК. По результатам исследования выявлено, что коэффициент риска (R), рассчитанный как соотношения С_20:4n-6/С_20:5n-3, составил 34,04. Это позволило сделать заключение о наличии у пациентки ХОБЛ легкой степени стабильного течения.

Пример наглядно демонстрирует, что оценка риска развития ХОБЛ через расчет коэффициента риска (R) как отношения С_20:4n-6/С_20:5n-3 является достоверно информативным и наиболее точным методом ранней диагностики, не имеющим противопоказаний, который позволяет прогнозировать развитие заболевания при минимальных клинических проявлениях патологического процесса.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для оценки риска развития хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у пациентов с хроническим бронхитом. Способ основан на идентификации и анализе состава жирных кислот мембран эритроцитов крови пациентов с последующим расчетом коэффициента риска (R) по соотношению жирных кислот С_20:4n-6 и С_20:5n-3. При значении R до 10,40-10,64 степень риска развития ХОБЛ оценивают как низкую; при значении R от 10,65 до 14,71-17,31 степень риска развития ХОБЛ оценивают как среднюю; при значении R в диапазоне от 17,32 до 29,80-35,4 диагностируют наличие ХОБЛ легкой степени. Использование способа позволяет в более ранние сроки от начала заболевания устанавливать возможность риска развития ХОБЛ, прогнозировать динамику развития болезни и проводить своевременное лечение. Предложенный способ является достоверно информативным и точным методом ранней диагностики ХОБЛ, не имеющим противопоказаний, который позволяет прогнозировать развитие заболевания при минимальных клинических проявлениях патологического процесса. 2 табл., 1 пр.

Способ оценки риска развития хронической обструктивной болезни легких, характеризующийся тем, что у пациента берут пробу венозной крови, выделяют мембраны эритроцитов, из которых экстрагируют липиды с последующим анализом состава жирных кислот, а в качестве оценочного критерия риска развития ХОБЛ используют коэффициент риска (R), рассчитанный как соотношение жирных кислот С_20:4n-6/С_20:5n-3, по величине R судят о степени риска развития ХОБЛ,
при значении R до 10,40-10,64 степень риска развития ХОБЛ оценивают как низкую,
при значении R от 10,65 до 14,71-17,31 степень риска развития ХОБЛ оценивают как среднюю,
при значении R в диапазоне от 17,32 до 29,80-35,4 диагностируют наличие ХОБЛ легкой степени.