ИММУНОГЕННЫЙ ЭПИТОП ВИРУСА ГРИППА Российский патент 2015 года по МПК C12N15/44 C12N7/00 A61K39/145 A01H5/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к получению вирусоподобных частиц. В частности, настоящее изобретение направлено на получение вирусоподобных частиц, в состав которых входят антигены вируса гриппа, в особенности модифицированные антигены вируса гриппа, антитела к которым обладают широкой перекрестной реактивностью с другими штаммами вируса гриппа.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Грипп является основной причиной смерти людей от респираторных вирусных инфекций. К общим симптомам этого заболевания относятся лихорадка, боль в горле, одышка и слабость мышц, а также другие симптомы. Во время сезонных вспышек вирус гриппа поражает 10-20% населения мира и приводит к смерти 250-500 тыс. человек ежегодно.

Вирусы гриппа являются оболочечными вирусами, которые отпочковываются от плазматических мембран инфицированных клеток млекопитающих. В зависимости от вида антигенов матрикса и нуклеопротеинов выделяют вирусы гриппа: класса А, В и С. Вирусы гриппа типа А в зависимости от наличия различных поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) - также подразделяются на подтипы. НА обусловливают способность вируса связываться с клетками организма хозяина и проникать в них, NA отщепляет концевые остатки сиаловой кислоты от полисахаридных цепочек на клетке-хозяине и от поверхностных вирусных белков, что предотвращает агрегацию вирусных частиц и увеличивает их мобильность. В настоящее время ученым известно 16 подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9). На частицах вируса гриппа типа А присутствует один подтип гликопротеина НА и один подтип другого гликопротеина - NA. В целом, отдельные подтипы гликопротеинов характеризуются видоспецифичностью; например, все вирусы со всеми подтипами НА и NA инфицируют птиц, тогда как человека инфицируют только вирусы со следующими подтипами гликопротеинов: HI, Н2, Н3, Н5, Н7, Н9, Н10, N1, N2, N3 и N7 (Horimoto 2006; Suzuki 2005). Вирусы гриппа, в состав которых входят гликопротеины Н5, Н7 и Н9, считаются наиболее патогенными формами вируса гриппа А. Эти вирусы являются наиболее вероятными причинами пандемий в будущем.

Пандемии вируса гриппа, как правило, вызывают высоко контагиозные и высоко вирулентные вирусы гриппа. Эти вирусы могут привести к повышению заболеваемости и смертности в мировом масштабе. Возникновение новых подтипов вируса гриппа А привело к 4-м масштабным пандемиям в 20-м веке. Смертность от «испанки», вызванной вирусом H1N1 в 1918-1919 гг., составила более 50 миллионов человек во всем мире в период с 1917 по 1920 гг. И в настоящее время существует риск появления нового подтипа или передачи людям подтипа вируса, эндемичного для животных. Особую обеспокоенность вызывает высоковирулентная форма птичьего гриппа, вспышки которого уже были зарегистрированы в нескольких странах мира. Во многих случаях птичий грипп характеризовался смертностью, достигающей 100%, в течение первых 48-и часов заболевания. Предполагается, что распространение вируса птичьего гриппа (H5N1), впервые выявленного в Гонконге в 1997 г., в другие азиатские страны и в Европу было связано с миграцией диких птиц.

Современным методом борьбы с гриппом человека является ежегодная вакцинация. Вакцина - это, как правило, комбинация нескольких штаммов, которые по прогнозам будут преобладать в период следующей сезонной вспышке гриппа. Прогнозирование координируется Всемирной организацией здравоохранения. Как правило, число доз вакцины, которое выпускается ежегодно, недостаточно для вакцинации населения мира. Например, в Канаде и Соединенных Штатах число доз вакцины достаточно для иммунизации примерно одной трети населения, тогда как в Европе - лишь 17%. Очевидно, что количество произведенной во всем мире вакцины против гриппа будет недостаточным перед лицом всемирной пандемии гриппа. Даже если в каком-то году удастся каким-либо образом произвести достаточное число доз вакцины, то преобладающие штаммы в следующем году изменятся. Поэтому создание запасов в межсезонье не является выходом из сложившейся ситуации. В экономическом плане крупномасштабное производство эффективной вакцины против гриппа представляет собой значительный интерес для правительств и промышленности.

В настоящее время наиболее важные запасы вирусных частиц для производства вакцин получаются из оплодотворенных яиц. Вирусные частицы собираются и разрушаются с помощью детергента. Так получается инактивированная вирусная вакцина. Живые аттенуированные вакцины состоят из частиц вируса гриппа, адаптированных к росту при низкой температуре. При этом при нормальной температуре тела вакцина становится аттенуированной. Применение такой вакцины разрешено в США у детей и взрослых в возрасте от 5 до 49 лет. Инактивированные цельновирионные вакцины получаются путем инактивации вирусных частиц химическими агентами, что приводит к утрате патогенных свойств. Такие вакцины получаются из оплодотворенных яиц или клеточных линий млекопитающих. У вакцин различных типов есть свои преимущества и недостатки. Одним из преимуществ вакцин, полученных из цельных вирусных частиц, является тип иммунитета, вызванного такими вакцинами. В целом, расщепленные вакцины вызывают сильный ответ со стороны антител, тогда как вакцины, полученные из цельных вирусных частиц, индуцируют как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Функциональный ответ со стороны антител является критерием для выдачи разрешения на применение вакцины. Этот показатель коррелирует со степенью защиты, предоставляемой вакциной. Тем не менее, получены доказательства, что ответ со стороны Т-лимфоцитов также важен для реализации иммунитета против гриппа; клеточный иммунитет может предоставлять более качественную защиту от гриппа у пожилых людей.

Для индукции клеточного иммунитета против гриппа были разработаны цельновирионные вакцины. Вследствие высокой патогенности штаммов вируса гриппа (например, подтипа H5N1), эти вакцины производятся в лабораториях класса биологической безопасности 3+ (BL3+). Для производства высокопатогенных штаммов вируса гриппа, таких как H5N1, некоторые производители модифицировали последовательность гена гемагглютинина, что позволило снизить патогенность штамма вируса гриппа, сделать его авирулентным и относительно легко воспроизводимым в оплодотворенных яйцах или клеточных культурах млекопитающих. Другие производители используют реассортантные штаммы вируса гриппа, в которых генетические последовательности белков гемагглютинина и нейраминидазы клонируются в высокопродуктивных и низкопатогенных донорских штаммах вируса гриппа (A/PR/8/34; Quan F-S с соавт., 2007 г.). Безусловно, эти методы могут использоваться для получения вакцин с полезными свойствами. Однако они не решают проблемы крупномасштабного, экономичного и быстрого производства вакцин в количестве, необходимом для удовлетворения глобальных потребностей в обычный год, и тем более во время пандемии.

Используя такую технологию обратной генетики, можно также ввести мутацию в последовательность гена НА с целью создания авирулентного вируса. Производство цельновирионных вакцин высокопатогенных штаммов вируса гриппа требует применения специальных мер изоляции; в иных случаях генетическая последовательность готовой вакцины не будет четко соответствовать последовательности циркулирующего вируса. В случае живых аттенуированных вакцин существует определенный риск того, что введенная вакцина может рекомбинировать с вирусом гриппа в организме хозяина, что приведет к образованию новой разновидности вируса гриппа.

Этот метод предполагает сохранение антигенного эпитопа и посттрансляционных модификаций, поэтому для него характерны определенные ограничения и недостатки, к которым относится риск контаминации вследствие использования цельных вирусных частиц и различная степень выхода, зависящая от штамма вируса. Генетическая гетерогенность вируса вследствие инфицирования им яиц может привести к развитию субоптимальной защиты от инфекции. К другим недостаткам относится экстенсивное планирование для получения инфицированных яиц, риск контаминации вследствие использующихся при очитке химических веществ, а также длительность процедуры. Кроме того, введение такой вакцины может быть противопоказано лицам, гиперчувствительным к белку куриных яиц.

В случае пандемии производство расщепленной вакцины будет занимать большее время, вследствие необходимости адаптации штамма к росту на яйцах и неравномерного выхода продукции. И хотя эта технология в течение многих лет использовалась для производства сезонных вакцин, она вряд ли будет соответствовать приемлемым временным рамкам при пандемии, поскольку всемирная производственная мощность ограниченна.

Недавняя вспышка вируса гриппа А подтипа H1N1 в Мексике также выявила острую необходимость в разработке методики быстрого производства вакцины вновь возникающих штаммов.

Использование куриных яиц для производства вакцин не является обязательным. Вирусы гриппа также получаются в культурах клеток млекопитающих, например, в клеточных линиях MDCK или PERC.6, а также других клеточных линиях. Можно также использовать методы обратной генетики, когда вирусные частицы образуются вследствие трансформации клетки вирусными генами. Тем не менее, эти методы также требуют использования цельных вирусных частиц, трудоемких методов и специфических культурных сред.

Было разработано несколько рекомбинантных препаратов, таких как рекомбинантные вакцины-кандидаты против гриппа. В этих случаях ученые сосредоточились на экспрессии, производстве и очистке белков НА и NA вируса гриппа типа А, в том числе на экспрессии этих белков с использованием клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом (Crawford с соавт., 1999; Johansson, 1999), вирусных векторов и вакцинных конструкций на основе ДНК (Olsen с соавт., 1997).

Особенности инфекции, вызванной вирусом гриппа, хорошо известны. Вкратце перечислим их. Инфекционный цикл начинается с прикрепления поверхностного вирусного белка НА к клеточному рецептору, содержащему остатки сиаловой кислоты (гликопротеины и гликолипиды). Белок NA опосредует процессинг рецептора, содержащего остатки сиаловой кислоты, а проникновение вируса в клетку зависит от НА-зависимого рецептор-опосредованного эндоцитоза. В кислотной среде сформированный при захвате клеткой частиц вируса гриппа эндосом белок НА претерпевает конформационные изменения, которые ведут к слиянию вирусных и клеточных мембран и декапсидации вируса. При этом происходит М2-опосредованное высвобождение белков M1 из нуклеокапсид-ассоциированных рибонуклеопротеинов (РНП), которые мигрируют в ядро клетки для синтеза вирусной РНК. Антитела к белкам НА предотвращают инфицирование клетки вирусом путем нейтрализации инвазионной способности вируса. Антитела к белкам NA реализуют свое противовирусное действие на ранних этапах репликации вируса.

Crawford с соавт. (1999) описали экспрессию белков НА вируса гриппа в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом. Экспрессируемые белки обладали способностью предотвращать смертельные случаи гриппа, вызванные птичьими подтипами вируса гриппа Н5 и Н7. Johansson с соавт. (1999) указали, что белки вируса гриппа НА и NA, экспрессируемые бакуловирусом, вызывают иммунный ответ у животных, который по интенсивности превышает иммунный ответ на традиционные вакцины. Иммуногенность и эффективность гемагглютинина лошадиного вируса гриппа, экспрессируемого бакуловирусом, была сравнимой с иммуногенностью гомологичной ДНК-вакцины-кандидата (Olsen с соавт., 1997). Все эти данные указывают на то, что рекомбинантные белки НА и NA могут создать высокоэффективную защиту против вируса гриппа. Это подтверждено с помощью различных экспериментальных подходов для различных животных моделей.

Упомянутые выше исследования показали, что поверхностные вирусные гликопротеины НА и NA являются основной мишенью для создания защитного иммунитета против вируса гриппа, а белки M1 могут служить мишенью для создания клеточного иммунитета. Поэтому новые вакцины-кандидаты могут включать все эти вирусные антигены, т.е. иметь вид макромолекулярной белковой частицы, например, вирусоподобной частицы (ВПЧ). Использование ВПЧ для создания вакцинных препаратов имеет некоторые преимущества. Так, ВПЧ более иммуногены по сравнению с субъединичными или рекомбинантными антигенами и могут стимулировать образование как гуморального, так и клеточного иммунного ответа (Grgacic и Anderson, 2006). Кроме того, частицы с антигенами вируса гриппа могут презентовать конформационные эпитопы, которые вызывают образование нейтрализующих антител к вирусам гриппа различных штаммов.

Получение неинфекционных штаммов вируса гриппа для создания вакцины является одним из способов предотвращения непреднамеренного инфицирования. С другой стороны, вирусоподобные частицы (ВПЧ) исследовались как заменители культивированных вирусов. ВПЧ имитируют структуру вирусного капсида, но не обладают геномом. Поэтому они не могут реплицироваться или приводить к развитию вторичной инфекции.

Ряд исследований показали, что рекомбинантные белки вируса гриппа самостоятельно формируют ВПЧ в клеточных культурах с плазмидами экспрессии млекопитающих или векторами бакуловируса (Gomez-Puertas с соавт., 1999; Neumann с соавт.2000; Latham и Galarza, 2001). Gomez-Puertas с соавт.(1999) показали, что эффективное формирование ВПЧ вируса гриппа зависит от уровня экспрессии некоторых вирусных белков. Neumann с соавт. (2000) создали систему с плазмидами экспрессии млекопитающих, предназначенную для получения инфекционных вирусоподобных частиц на основе клонированных кДНК (комплементарных ДНК). Latham и Galarza (2001) сообщили о формировании ВПЧ вируса гриппа в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, коэкспрессирующим гены НА, NA, M1 и М2. Эти исследования показали, что белки вириона гриппа могут самостоятельно формировать частицы при одновременной экспрессии соответствующих генов в эукариотических клетках.

Gomez-Puertas с соавт.(2000) указали, что для построения ВПЧ в клетках насекомых большое значение имеют как гемагглютинин (НА), так и матриксный белок M1. В то же время Chen с соавт.(2007) доказали, что для формирования ВПЧ белок M1 не обязателен. Указанные авторы обнаружили, что эффективное высвобождение M1 и ВПЧ требовало наличия НА и активности сиалидазы, которая обеспечивалась NA. NA отщепляет остатки сиаловой кислоты от гликопротеинов на поверхности клеток, что приводит к образованию ВПЧ и высвобождению ВПЧ в окружающую среду.

Quan с соавт. (2007) установили, что вакцина на основе ВПЧ, сформированных с помощью системы экспрессии на основе бакуловируса (в клетках насекомых), приводит к образованию защитного иммунитета против некоторых штаммов вируса гриппа (A/PR8/34 (H1N1)). ВПЧ, изученные Quan, отпочковывались от плазматической мембраны и характеризовались адекватными размерами и морфологией, соответствующими размерам и морфологии ВПЧ, полученных с помощью систем на основе клеток млекопитающих (клеток MDCK).

Оболочечные вирусы могут приобретать липидный капсид при отпочковывании от инфицированной клетки и мембрану, построенную из элементов плазматической мембраны или внутренних органелл клетки. Частицы вируса гриппа и ВПЧ отпочковываются от плазматической мембраны клетки-хозяина. Например, в клеточных системах на основе клеток млекопитающих или на основе бакуловируса частицы вируса гриппа отпочковываются от плазматической мембраны (Quan с соавт., 2007).

Инфицирование растений свойственно лишь некоторым оболочечным вирусам (например, представителям топовирусов и рабдовирусов). Эти вирусы отпочковываются от внутренних мембран клетки-хозяина, а не от плазматической мембраны. В растительных клетках-хозяевах было получено лишь небольшое число рекомбинантных ВПЧ, однако ни одна из них не происходила из плазматической мембраны. В настоящее время технология получения ВПЧ вируса гриппа основывается на коэкспрессии различных вирусных белков, и эта зависимость является ограничением такой технологии, поскольку в случае пандемий или ранних эпидемий для эффективной вакцинации критичным становится время, необходимое для создания вакцины. Для ускорения разработки вакцины несомненными преимуществами будет обладать более простая система производства ВПЧ, основывающаяся на экспрессии только одного вирусного белка.

Производство ВПЧ на основе НА вируса гриппа в растительных системах было описано в заявке на патент WO 2009/009876. В этой заявке было показано, что белок НА вируса гриппа может самостоятельно собираться в растительных клетках-хозяевах с формированием ВПЧ, которые отпочковываться от плазматической мембраны.

Для защиты мировой популяции от гриппа и предотвращения будущих пандемий производителям вакцин необходимо разработать эффективные и быстрые методы производства большого количества доз вакцины. Применяющаяся в настоящее время технология производства вакцины на основе оплодотворенных яиц не пригодна для производства достаточного числа доз вакцины и предполагает большие временные затраты. Используемые белки НА являются специфичными для каждого штамма и не вызывают образования антител с перекрестной реактивностью к другим штаммам, что исключает создание вакцин широкого спектра. Поэтому необходимым условием становится постоянное производство вакцины или быстрое реагирование при идентификации нового штамма.

Возможно введение определенных мутаций и (или) модификаций в нативный белок НА, использующийся для создания ВПЧ. Эти модификации приведут к получению белка гемагглютинина, обладающего более широким спектром и индуцирующего образование нейтрализующих антител к нескольким штаммам вируса гриппа даже после однократного введения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является создание усовершенствованной вакцины против гриппа.

Дополнительной целью настоящего изобретения является создание новых вирусоподобных частиц гриппа.

Дополнительной целью настоящего изобретения является создание белка гемагглютинина, модифицированного для образования антител более широкого спектра.

Настоящее изобретение предполагает создание полипептида с последовательностью аминокислотных остатков, идентичной таковой для N-связанного гликопротеина нуклеокапсида вируса, но частично или полностью свободного от N-связанных углеводов (т.е. содержащего один или несколько незамещенных сайтов гликозилирования по сравнению с последовательностью оригинального нативного белка НА), а также включает методы производства и использования этого полипептида.

Дополнительной целью настоящего изобретения является создание белка НА, в котором один или несколько N-связанных сайтов гликозилирования из домена НА1 были модифицированы (депонированы, мутированы, удалены, освобождены) от заместителя, что позволит создать ВПЧ гриппа для приготовления вакцины против гриппа широкого спектра.

В частности, домен НА1 включает аминокислоты, занимающие позиции 1-331 (нумерация в соответствии с последовательностью штамма А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO. 34). В частности, домен НА1 включает глобулярную головку и домен F'2 белка, что соответствует аминокислотам, занимающим позиции 39-331 (нумерация в соответствии с последовательностью штамма А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO. 34). В частности, сайт гликозилирования, лишенный заместителя, расположен в глобулярной головке белка, в частности, в районе аминокислот, занимающих позиции 39-273 последовательности SEQ ID No.34. В частности, сайт гликозилирования, лишенный заместителя, расположен в домене F′2 белка, в частности, в районе аминокислот, занимающих позиции 274-331 последовательности SEQ ID No.34.

В настоящем изобретении представлены замещения аминокислот в молекуле гемагглютинина вируса гриппа А, которые могут изменить антигенные и иммуногенные свойства НА. Эти замещения могут изменять антигенные сайты путем изменения специфичности рецептора и (или) связывания антитела с антигеном. Во всем разнообразии вариантов осуществления настоящего изобретения повышение антигенности вследствие замещений может оказаться полезным для производства вакцин против гриппа с более широкой перекрестной реактивностью. В частности, замещение аминокислот приводит к образованию молекул с иммуногенными характеристиками белка НА с аминокислотным замещением неаспарагиновых остатков, расположенных в сайте связывания с рецептором, т.е. в позициях 154 и (или) 165 и (или) 286 (нумерация в соответствии с последовательностью штамма А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO. 34). В отдельных вариантах осуществления изобретения аминокислотное замещение предполагает удаление (делецию) сайта гликозилирования или отщепление от него заместителя.

Молекула НА вируса гриппа с повышенной антигенностью может включать одну или несколько негликозилированных аминокислот, соответствующих позициям 154 и (или) 165 и (или) 286 в Н5 НА; при этом удаление одного из этих сайтов гликозилирования приводит к повышению реакционной способности вируса с антисыворотками, полученными от животных, подвергавшихся воздействию вируса гриппа с молекулой НА дикого типа.

Для разрушения сайта гликозилирования триадный сигнал N-X-S/T (где N - это аспарагин (Asn), X - любая аминокислота, за исключением пролина (Pro), a S/T может быть как серотонином (Ser), так и треонином (Thr)) может быть модифицирован с помощью методов белковой инженерии. Первый подход может заключаться в замещении Asn любой другой аминокислотой. Второй подход - это замещение аминокислоты S/T в позиции n+2 относительно гликозилируемого аспарагина любым другим аминокислотным остатком. Подходящей аминокислотой для замещения аспарагина, серина или треонина является аланин, однако может использоваться любая другая аминокислота. Например, Asn может замещаться Leu (лейцином). Не (изолейцином), Val (валином), Thr (треонином), Ser (серином) или Аlа (аланином). Ser или Thr могут замещаться Аlа, Val, Не или Leu.

В частности, молекула НА вируса гриппа с повышенной антигенностью может включать неаспарагиновые аминокислоты в позициях 154 и (или) 165 и (или) 286 в Н5 НА.

Молекула НА вируса гриппа с повышенной антигенностью может включать белок НА, в котором головка лишена N-связанных сайтов гликозилирования, т.е. от заместителей освобождены все три сайта гликозилирования.

В молекуле НА вируса гриппа с повышенной антигенностью может отсутствовать один или несколько сайтов гликозилирования, выбранных из следующей группы: N-154, N-165 и N-286 (нумерация в соответствии с последовательностью штамма А/Вьетнам/1194/04).

В настоящем изобретении представлен модифицированный гемагглютинин (ГА) от различных штаммов вируса гриппа.

В настоящем изобретении также представлен способ получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) гриппа в несиалирующих клетках организма хозяина, включающий:

а) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген НА (гемагглютинин) вируса гриппа, как указано выше, оперативно связанной с регуляторной областью, обладающей активностью в несиалирующих клетках организма хозяина или его части;

б) инкубация организма хозяина или его части в условиях, которые позволяют реализоваться экспрессии нуклеиновой кислоты, следовательно, образованию ВПЧ.

Настоящее изобретение включает указанный способ, в котором на этапе введения (этапе (а)) нуклеиновая кислота может экспрессироваться в клетке-хозяине временно или постоянно. Кроме того, ВПЧ могут очищаться с помощью, например, эксклюзионной хроматографии.

В дополнение к этому, настоящее изобретение относится к несиалирующим клеткам организма хозяина, который используется для образования вирусоподобных частиц (ВПЧ), в состав которых входит белок НА вируса гриппа. В частности, подходящим хозяином для образования ВПЧ, например, является растение или его часть, растительная клетка, насекомое или его часть, клетка насекомого, дрожжевой грибок или его часть, дрожжевая клетка.

Настоящее изобретение включает описание нуклеиновой кислоты, в состав которой входит последовательность нуклеотидов, кодирующая модифицированный белок НА вируса гриппа, как указано выше, оперативно связанная с регуляторной областью, обладающей активностью в несиалирующих клетках организма хозяина. Антигеном может являться гемагглютинин вируса гриппа (НА), лишенный одного или нескольких N-связанных сайтов гликозилирования на головке молекулы (антигенных сайтов, которые в норме присутствуют в нативной последовательности).

В настоящем изобретении также представлены вирусоподобные частицы (ВПЧ), включающие белок НА вируса гриппа, как указано в этом документе, а также один или несколько липидов хозяина. Если хозяином является насекомое, то вирусоподобные частицы (ВПЧ) могут включать белок НА вируса гриппа и один или несколько липидов насекомого; если хозяином является дрожжевой грибок, то вирусоподобные частицы (ВПЧ) могут включать белок НА вируса гриппа и один или несколько дрожжевых липидов; если хозяином является растение, то вирусоподобные частицы (ВПЧ) могут включать белок НА вируса гриппа и один или несколько растительных липидов.

В данном изобретении также представлены ВПЧ, образующиеся в клетках растений и, следовательно, содержащие один или несколько липидов растительного происхождения (называемых общим термином «растительные липиды»).

Также в изобретении представлены ВПЧ, которые образуются в клетках насекомых и включают липиды плазматической мембраны клеток насекомых (называемых общим термином «липиды насекомых»),

Также в изобретении представлены ВПЧ, которые образуются в дрожжевых клетках и включают липиды плазматической мембраны дрожжевых клеток (называемых общим термином «дрожжевые липиды»).

Также в настоящем изобретении представлены композиции, в которые входит эффективная доза ВПЧ, включающих белок НА вируса гриппа, один или несколько липидов из несиалирующей клетки хозяина, в которой образуются ВПЧ, а также фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может быть предназначен для перорального, внутрикожного, интраназального, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного или подкожного введения.

Кроме того, в настоящее изобретение включена композиция вакцины, в которую входит иммунологически эффективная доза ВПЧ, как указано выше, а также фармацевтически приемлемый носитель с адъювантом или без него. Вакцина может применяться перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно. В частности, вакцина может применяться без адъюванта.

В настоящем изобретении также представлен способ индукции иммунитета против вируса гриппа у определенного субъекта - способ, предполагающий введение субъекту вирусоподобных частиц, в состав которых входит белок НА вируса гриппа, один или несколько липидов хозяина и фармацевтически приемлемый носитель. Эти вирусоподобные частицы могут вводиться субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

Настоящее изобретение относится к способу индукции иммунитета к вирусу гриппа у определенного субъекта, который предполагает введение субъекту эффективной дозы вакцины, в состав которой входит одна или несколько ВПЧ, как указано выше.

Субъектом, в отношении которого применяются способы лечения, описанные выше, может являться человек, примат, лошадь, свинья, птица, водоплавающая птица, перелетная птица, перепел, утка, гусь, домашняя птица, курица, верблюд, представитель семейства псовых, собака, кошка, тигр, леопард, циветта, куница, каменная куница, хорек, домашнее животное, крупный рогатый скот, мышь, крыса, тюлень, кит или другое животное. В частности, субъектом может являться человек (пациент) или птица (включая водоплавающих птиц, перелетных птиц, домашних птиц, например, перепелок, уток, гусей, индюков, куриц), в частности, перелетных или домашних птиц, употребляемых в пищу (перепелки, утки, гуси, индюки, курицы).

Настоящее изобретение также содержит описание контейнера, такого как шприц, а также набора, включающего такой контейнер с вакцинной композицией, указанной выше.

Данное краткое описание изобретения может не охватывать всех аспектов настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Более полное представление об этих и других особенностях изобретения можно получить из приведенного ниже подробного описания. В данном описании встречаются ссылки на прилагаемые фигуры. Ниже представлено их краткое описание.

На Фигуре 1А показано расположение сайтов гликозилирования белка НА Н5 вируса гриппа А/Индонезия/5/05. Аминокислоты, их позиция и расположение указаны по аналогии со структурой последовательности вируса гриппа А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO. (идентификационный номер последовательности) 34 (Файл PDB: 2IBX). Путем разрушения сайтов гликозилирования N154, N165 и N286, расположенных на глобулярной голове, была получена молекула с тремя мутациями. Для локализации потенциальных антигенных сайтов применялось исследование Bright с соавт.(2003). Тип гликозилирования определялся на основании литературных данных о белках НА H1, Н3 и Н7 (Abe Y. С соавт.(2004); Vigerust DJ с соавт.(2007) и Kuroda с соавт.(1990);

На Фигуре 1В представлено изображение субдоменов мономера НА: субдоменов F′1 (1-38 согласно нумерации последовательности А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO.34), F′2 (274-331) и F. Сайт связывания с рецептором и субдомен эстеразы вместе формируют глобулярную головку (39-273). Пептид слияния представлен в виде белого прямоугольника. В структурах НА не представлены TmD и цитоплазматический хвост, поскольку в кристаллическом виде удалось выделить лишь растворимые продукты реакции с бромелаином, структура которых и определялась.

На Фигуре 2 представлены структуры мономеров НА различных подтипов вируса гриппа А. Также представлен двойной липидный слой с его алифатической составляющей и полярными головками. Структурные изображения взяты из статьи На с соавт. (На Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002) (птичий Н5);

На Фигуре 3 представлена последовательность кассеты экспрессии на основе пласто цианина люцерны, которая использовалась для экспрессии H1 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения (идентификационный номер последовательности: 8), Подчеркнут сигнальный пептид протеин-дисульфидизомеразы. Сайты рестрикции Bglll (AGATCT) и Sad (GAGCTC), которые использовались для клонирования, выделены полужирным шрифтом.

На Фигуре 4 представлена плазмида 660, использующаяся для экспрессии НА дикого типа подтипа Н5 вируса гриппа А/Индонезия/5/05;

На Фигуре 5 представлена плазмида 680, использующаяся для негликозилированного мутированного НА подтипа Н5 вируса гриппа А/Индонезия/5/05;

На Фигуре 6 представлен титр антител против цельновирионной инактивированной вакцины после введения первой и второй дозы. Реактивность сывороток крыс, иммунизированных ВПЧ дикого типа или ВПЧ с тройной мутацией (негликозилированными ВПЧ), оценивалась нами после первой (14 дней) и второй иммунизации (35 дней). Иммунореактивность оценивалась по отношению к нескольким вирусам H5N1.

На Фигуре 7 представлены титры антител, ингибирующих гемагглютинин, после введения первой и второй дозы. Титры HI-антител у крыс, иммунизированных ВПЧ дикого типа или ВПЧ с тройной мутацией (негликозилированными ВПЧ), оценивалась нами через 14 дней после первой иммунизации (14-й день) и второй иммунизации (35-й день). Иммунореактивность оценивалась по отношению к нескольким вирусам H5N1 и одному вирусу H1N1.

На Фигуре 8 представлена последовательность НА0 вируса гриппа;

На Фигуре 9 представлена последовательность белка НА подтипа Н2 вируса гриппа;

На Фигуре 10 представлена последовательность белка НА подтипа Н3 вируса гриппа;

На Фигуре 11 представлена последовательность белка НА подтипа Н4 вируса гриппа;

На Фигуре 12 представлена последовательность белка НА подтипа Н5 вируса гриппа;

На Фигуре 13 представлена последовательность белка НА подтипа Н6 вируса гриппа;

На Фигуре 14 представлена последовательность белка НА подтипа Н7 вируса гриппа;

На Фигуре 15 представлена последовательность белка НА подтипа Н8 вируса гриппа;

На Фигуре 16 представлена последовательность белка НА подтипа Н9 вируса гриппа;

На Фигуре 17 представлена последовательность белка НА подтипа Н10 вируса гриппа;

На Фигуре 18 представлена последовательность белка НА подтипа Н11 вируса гриппа;

На Фигуре 19 представлена последовательность белка НА подтипа H12 вируса гриппа;

На Фигуре 20 представлена последовательность белка НА подтипа Н13 вируса гриппа;

На Фигуре 21 представлена последовательность белка НА подтипа H14 вируса гриппа;

На Фигуре 22 представлена последовательность белка НА подтипа H15 вируса гриппа;

На Фигуре 23 представлена последовательность белка НА подтипа H16 вируса гриппа;

На Фигуре 24 представлена последовательность вектора экспрессии 660 pCAMBIA, содержащего полную последовательность Н5 дикого типа;

На Фигурах 25 A-J представлены последовательности праймеров, использованных для ПЦР-амплификации;

На Фигуре 26 представлена последовательность полученного фрагмента, содержащего всю кодирующую область белка Н5, в том числе нативный сигнальный пептид, фланкированный сайтом Hind III по направлению против хода транскрипции по отношению к начальному кодону ATG, и сайтом Sacl, расположенным по ходу транскрипции по отношению к терминальному кодону ТАА;

На Фигуре 27 представлена последовательность полученного фрагмента, содержащего всю кодирующую область белка Н5, модифицированного таким образом, что в молекуле все три сайта гликозилирования будут отсутствовать, в том числе нативный сигнальный пептид, фланкированный сайтом Hind III по направлению против хода транскрипции по отношению к начальному кодону ATG, и сайтом Sacl, расположенным по ходу транскрипции по отношению к терминальному кодону ТАА;

На Фигурах 28 A-D представлены последовательности праймеров, использованных для ПЦР-амплификации;

На Фигуре 29 представлена аминокислотная последовательность зрелого белка Н5 вируса гриппа штамма А/Вьетнам/1194/04;

На Фигурах 30 А-В представлены последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот зрелого белка НА и соответствующего гена вируса гриппа штамма В/Флорида/4/2006.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на получению вирусоподобных частиц (ВПЧ). В частности, настоящее изобретение посвящено получению вирусоподобных частиц, содержащих антигены вируса гриппа.

Ниже представлено описание отдельных вариантов осуществления изобретения.

1 - белок НА

Использующийся в настоящем описании термин «белок» означает последовательность аминокислот, связанных между собой пептидной связью, которая может формировать вторичную, третичную или четвертичную структуру и приобретать определенную морфологию. С другой стороны, в аналогичном контексте могут использоваться термины «полипептид», «пептид» или «фрагменты пептида».

Термин «домен гемагглютинина» означает пептид, включающий полипептид-предшественник НА0 или домены НА1 и НА2. Домен гемагглютинина не включает сигнальный пептид, трансмембранный домен или цитоплазматический хвост, которые входят в состав природного пептида.

В отношении вируса гриппа термин «гемагглютинин», или «НА», используемый в этом документе, означает гликопротеин, располагающийся на поверхности вирусных частиц. НА - это гомотримерный мембранный гликопротеин I типа, как правило, включающий в свою структуру сигнальный пептид, домен НА1 и домен НА2, состоящий из мембранного якорного сайта на С-конце и небольшого цитоплазматического хвоста (Фигура 1 В). Последовательность нуклеотидов, кодирующая НА, хорошо известна и открыта для общего доступа (например, см. базу данных BioDefence (вирус гриппа; см. URL: biohealthbase.org) или базу данных Национального центра информации в сфере биотехнологии (см. URL: ncbi.nlm.nih. gov); ссылки на обе базы данных включены в данный документ.

Информация о структуре белков НА вируса гриппа

В мономере НА можно выделить 2 функциональных домена: глобулярную головку и стволовой домен. Соответствующие этим структурным доменам участки первичной последовательности показаны на Фигурах 1В и 2. Стволовой домен обусловливает инвазионную способность и патогенность вируса, что связано с необычными конформационными изменениями, которые происходят с этим доменом в кислых условиях. Кроме того, описано еще 4 субдомена: пептид слияния (гидрофобный участок из 26-и аминокислот, который отвечает за слияние с мембраной хозяина в конформационном состоянии, характерном для низких значений рН; сам стволовой домен (который может приобретать 2 совершенно различные конформации);

трансмембранный домен (TmD) (который определяет аффинность НА к липидным плотам); цитоплазматический хвост (Ctail), который участвует в секреции НА. В глобулярной головке выделяют 2 субдомена: рецептор-связывающий домен (RB) и рудиментарный домен эстеразы (Е). Субдомен эстеразы большей частью не выступает над поверхностью белка, поэтому большинство антител против белка НА связывается с рецептор-связывающим доменом, который представляет собой наиболее выступающую часть глобулярной головки (см. Фигуру 2).

Термины «гомотример» и «гомотримерный» означают олигомер, сформированный тремя молекулами белка НА. Белок НА синтезируется из мономерного белка-предшественника НА0 с молекулярной массой 75 кДа. Эти молекулы на поверхности вирусной частицы формируют вытянутый тримерный белок. У высокопатогенных птичьих штаммов белок-предшественник претерпевает внутриклеточное расщепление в консервативном сайте расщепления (также называемом пептидом слияния) с получением двух полипептидных цепочек: НА1 (328 аминокислот) и НА2 (221 аминокислота; включает трансмембранную область), связанных между собой дисульфидной связью. Это превращение имеет большое значение для инвазионной способности вируса, но не играет роли для тримеризации белка. У непатогенных птичьих штаммов и штаммов млекопитающих предшественник НА0 расщепляется вне клетки протеазами клеток дыхательных путей организма хозяина или коинфицирующих бактерий или микоплазм. Трансляцию белка в клетке-хозяине сопровождают такие процессы, как включение НА в мембрану эндоплазматической сети (ЭПС), отщепление сигнального пептида и гликозилирование белка. Образование третичной структуры (фолдинг) НА возможно только после гликозилирования белка и формирования 6-и внутрицепочечных дисульфидных мостиков. Тримеры НА формируются в цис- и транс-сети комплекса Гольджи. В процессе тримеризации ключевую роль играет трансмембранный домен. Структура кристаллической формы белка НА, связанного с бромелаином, лишенного трансмембранного домена, у различных штаммов вируса гриппа весьма консервативна. Также было установлено, что НА претерпевает значительные конформационные изменения во время инфекционного процесса. Для этого необходимо расщепление предшественника НА0 на 2 полипептидные цепочки: НА1 и НА2. Белок НА может иметь измененную структуру (т.е. состоять из доменов НА1 и НА2) или неизмененную структуру (т.е. состоять из домена НА0).

Настоящее изобретение относится к использованию белка НА, включающего трансмембранный домен, а также домены НА1 и НА2 (например, белком НА может являться НА0), или измененного белка НА, состоящего из НА1 и НА2.

Белок НА в настоящем изобретении может принадлежать к любому из подтипов. Например, белок НА может являться белком HI, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, H11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16.

В настоящем изобретении представлены ВПЧ, в состав которых входит белок НА с модифицированными N-гликанами. Рекомбинантный белок НА в рамках настоящего изобретения может также включать последовательность аминокислот, основанную на последовательности любого известного специалистам в данной области гемагглютинина (например, см. базу данных BioDefence (вирус гриппа; см. URL:biohealthbase.org) или базу данных Национального центра информации в сфере биотехнологий (см. URL:ncbi.nlm.nih.gov), в которой нативные N-связанные сайты гликозилирования были удалены (мутированы, делецированы, модифицированы) для удаления остатков сахаров, которые маскируют пептидные антигенные сайты.

Кроме того, структура НА может основываться на последовательности гемагглютинина, изолированного от одного или нескольких вновь идентифицированных и появляющихся штаммов вируса гриппа.

Кроме того, могут быть получены ВПЧ, которые включают комбинацию различных подтипов НА. Например, ВПЧ могут включать один или несколько белков НА подтипов HI, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, H11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16. Выбор комбинации НА может определяться предназначением вакцины, приготовленной на основе ВПЧ. Например, вакцина для птиц может включать комбинацию НА любых подтипов, тогда как ВПЧ для вакцинации людей могут включать НА одного или нескольких следующих подтипов: H1, Н2, Н3 и Н5. Как бы то ни было, в зависимости от предназначения ВПЧ можно получить и другие комбинации различных подтипов НА.

При получении ВПЧ, включающих НА различных подтипов, соответствующие подтипы НА могут коэкспрессироваться в одной и той же клетке, например, в растительной клетке.

В частности, ВПЧ, полученные в соответствии с описанным в данном изобретении способом, могут не включать в свой состав нейраминидазы (NA). Тем не менее, если предполагается получение ВПЧ, включающих NA и НА, то NA может коэкспрессироваться с НА.

2 - Подтипы гриппа

Настоящее изобретение включает все типы вируса гриппа человека, например, подтипы преобладающего вируса гриппа А, а также реже встречающихся вирусов гриппа В и С, а также НА от других подтипов вируса гриппа.

Настоящее изобретение также включает ВПЧ, в состав которых входят НА, полученные от вирусов гриппа одного или нескольких подтипов. Например, ВПЧ могут включать один или несколько НА подтипа H1 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO); 1), Н2 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 2), Н3 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 3), Н4 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 4), Н5 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 5), Н6 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO); 6), Н7 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 7), Н8 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 8), Н9 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 9), Н10 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 10), Н11 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID.NO): 11), Н12 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 12), H13 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 13), Н14 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 14), H15 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 15), H16 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 16) или их комбинацию. Один или несколько НА от вируса гриппа одного или нескольких подтипов могут одновременно экспрессироваться в клетках растений или насекомых. Это приведет к тому, что синтез одного или нескольких НА приведет к формированию ВПЧ, включающих в свой состав комбинацию НА, полученных от вируса гриппа одного или нескольких подтипов. Выбор комбинации НА может определяться предназначением вакцины, приготовленной на основе ВПЧ. Например, вакцина для человека может включать комбинацию НА любых подтипов, в частности, одного или нескольких следующих подтипов: Н1, Н2, Н3, Н5, Н7, Н9, Н10, N1, N2, N3 и N7, в частности, H1, Н2, Н3, Н5.

Тем не менее, могут быть получены и другие комбинации различных подтипов НА, что будет зависеть от предназначения вакцины.

3 - Способ получения

В настоящем изобретении также представлен способ получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) гриппа в клетках организма хозяина. Таким образом, в изобретении представлены ВПЧ и способ получения ВПЧ в системе экспрессии хозяина, в том числе экспрессии одного оболочечного белка. Этот способ предполагает введение кодирующей антиген нуклеиновой кислоты, оперативно связанной с активной регуляторной областью, в организм хозяина или его часть, и инкубация хозяина или его части в условиях, в которых была бы возможна экспрессия нуклеиновой кислоты, а значит, образование ВПЧ.

Регуляторные элементы, описанные в настоящем изобретении, также могут сочетаться с целевой кодирующей областью, что приведет к ее экспрессии в организмах различных хозяев, у которых возможна трансформация или временная экспрессия, в частности, в растениях, насекомых и дрожжах.

Такими организмами, в частности, являются растения, как однодольные, так и двудольные, например, зерновые, злаковые, пшеница, ячмень, овес, Nicotiana spp, Brassica spp, соя, боб, горох, люцерна, картофель, помидор, женьшень и Arabidopsis.

Методы стабильной трансформации и регенерации этих организмов известны специалистам. Методы получения трансформированных и регенерированных растений также хорошо известны.

Термин «трансформация» означает стабильный межвидовой перенос генетической информации (последовательности нуклеотидов), который проявляется генотипически и (или) фенотипически. Межвидовой перенос генетической информации от химерной конструкции к хозяину может быть наследуемым; в этом случае перенос генетической информации будет считаться стабильным; перенос также может оказаться ненаследуемым; в это случае он будет считаться временным.

Методы временной экспрессии могут использоваться для экспрессии конструкций в рамках настоящего изобретения (см. статью Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348; ссылка на которую содержится в документе). Кроме того, возможно использование вакуумного метода временной экспрессии, описанного Kapila с соавт.(1997) (ссылка на статью содержится в настоящем документе). Эти методы могут включать, например, метод агроинокуляции или агроинфильтрации;

кроме того, возможно применение других методов временной экспрессии. При агроинокуляции или агроинфильтрации смесь агробактерий, включающих целевую нуклеиновую кислоту, вводятся во внутриклеточное пространство тканей растения, например, в листья, надземную часть растения (к которым относятся стебель, листья и цветки), в другую часть растения (стебель, корень, цветок) или в целое растение. После прохождения эпидермиса агробактерий инфицируют клетки растения и переносят копии тДНК в клетки. Затем происходит эписомальная транскрипция тДНК и трансляция мРНК, что приводит к образованию целевого белка в инфицированных клетках. Тем не менее, перенос тДНК внутрь ядра остается временным.

4 - Организм хозяина

ВПЧ, представленные в настоящем изобретении, могут образовываться в клетках-хозяевах, которые характеризуются недостаточностью сиалирования белков, например, недостаточностью сиалидазы, таких как растительные клетки, клетки насекомых, грибов и других организмов, в том числе губок, кишечнополостных, кольчатых червей, членистоногих, моллюсков, круглых червей, плоских червей, щетинкочелюстных, хламидий, спирохет, грамположительных бактерий, сине-зеленых водорослей, архебактерий, как указано на сайте «Glycoforum» (см., например, ссылку: glycoforum.gr.ip/science/word/evolution/ES-A03E.html).

В частности, ВПЧ, полученные в соответствии с описанным в данном изобретении способом, как правило, не включают в свой состав нейраминидазу (NA). Тем не менее, если предполагается получение ВПЧ, включающих NA и НА, то NA может коэкспрессироваться с НА.

В частности, ВПЧ, представленные в настоящем изобретении, могут образовываться в растительных клетках, в растениях или их частях, таких как листья, семена, или в другом растительном материале.

Под термином «растительный материал» подразумевается любой материал растительного происхождения. Растительным материалом может являться целое растение, ткань, клетка или их части. Кроме того, растительным материалом могут являться внутриклеточные и внеклеточные компоненты растительного происхождения, жидкие или твердые экстракты растений или их комбинации. Кроме того, растительным материалом может являться растение, растительная клетка, ткань, жидкий экстракт или их комбинация, причем эти материалы могут быть получены из листьев, стеблей, цветков, плодов, корней растений или их комбинаций. Растительным материалом может являться растение или его часть, не подвергнутые дальнейшей обработке. Предполагается, что растительный материал может подвергаться минимальной обработке, как это указано ниже, или более значительной обработке, в том числе частичной или существенной очистке белка с использованием известных методик; к таким методикам могут относиться хроматография, электрофорез и другие способы очистки.

Под термином «минимальная обработка» подразумевается, что растительный материал, например, растение или его часть, содержащий целевой белок, частично очищен с получением растительного экстракта, гомогената, фракции растительного гомогената и т.д. (т.е. минимально обработанных продуктов). Частичная очистка может включать разрушение структур растения с получением композиции, включающей растворимые компоненты растения и нерастворимые компоненты растения, которые можно разделить с помощью, например, центрифугирования, фильтрования, комбинации этих методов и других методов. В этом случае белки, секретированные во внеклеточное пространство листьев или других тканей, могут быть собраны с помощью вакуумной или центробежной экстракции; кроме того, ткани могут быть экстрагированы под давлением путем прохождения через роллеры, перемалывания или другой обработки, позволяющей отжать материал или высвободить белок из внеклеточного пространства. Минимальная обработка также может включать приготовление неочищенных экстрактов растворимых белков, поскольку эти препараты будут характеризоваться незначительным загрязнением вторичными растительными продуктами. Кроме того, минимальная обработка может включать водное экстрагирование растворимых белков из листьев с последующим осаждением любой подходящей для этого солью. Другие методы могут включать крупномасштабное вымачивание и экстракцию сока, что позволит непосредственно использовать сам экстракт.

Растительный материал в форме материала растительного происхождения или растительной ткани может приниматься субъектом перорально. Растительный материал может назначаться как добавка к питанию, вместе с другой пищей или в капсулированном виде. Можно менять концентрацию растительного материала или тканей для улучшения или усиления вкусовых качеств, или использоваться его с другими необходимыми материалами, ингредиентами, фармацевтическими вспомогательными веществами.

Кроме того, частью настоящего изобретения являются трансгенные растения, растительные клетки или семена, содержащие химерические генные конструкции, представленные в настоящем изобретении. Методы регенерации растений или растительных клеток также известны специалистам. Трансформированные растительные клетки выращиваются на соответствующей среде, которая может содержать селекционные агенты, такие как антибиотики; при этом для облегчения идентификации трансформированных растительных клеток используются селектируемые маркеры. После формирования ростка развитие побега может стимулироваться использованием соответствующих растительных гормонов в соответствии с известными методами; побеги переносятся на корнеобразующую среду для окончательной регенерации растения. Растения затем могут использоваться для образования повторяющихся поколений; для чего могут использоваться семена или способы вегетативного размножения. Кроме того, трансгенные растения можно получить без использования тканевых культур.

Частью настоящего изобретения также являются трансгенные растения, деревья, дрожжи, бактерии, грибы, насекомые и животные клетки, содержащие химерную генную конструкцию, в состав которой входит нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный НА0 для образования ВПЧ, в соответствии с настоящим изобретением.

Предполагается, что растение, включающее целевой белок или экспрессирующее ВПЧ, содержащие целевой белок, можно назначать субъекту или целевому организму различными путями в зависимости от необходимости и сложившейся ситуации. Например, целевой белок, полученный из растения, может перед применением экстрагироваться с получением неочищенной, частично очищенной или полностью очищенной формы. Если белок следует очищать, то его можно образовывать как в съедобных, так и в несъедобных растениях. Более того, если белок назначается перорально, то растительную ткань можно собирать и непосредственно добавлять в пищу субъекта либо высушивать ее перед употреблением; кроме того, животное может пастись в месте произрастания этих растений, при этом сбор растения не требуется. Также в рамках настоящего изобретения находится использование собранных растений в качестве пищевой добавки в рацион животных. Если растительная ткань употребляется в пищу животным без дальнейшей обработки или с минимальной обработкой, то предпочтительно, чтобы эта растительная ткань была съедобной.

Для ограничения экспрессии трансгенов в растениях может иметь значение посттранскрипционный сайленсинг генов, и для борьбы со специфическим разрушением трансгенных мРНК может применяться коэкспрессия супрессора сайленсинга от картофельного вируса Y (HcPro) (Brigneti с соавт., 1998), Альтернативные супрессоры сайленсинга хорошо известны специалистам и могут использоваться в соответствии с приведенным в данном документе описанием (Chiba с соавт., 2006, Virology 346:7-14; ссылка на статью содержится в данном документе), например, это TEV -p1/HC-Pro (p1/HC-Pro вируса гравировки табака), BYV -р21, р 19 вируса кустиковой карликовости томата (TBSV р 19), капсидный белок вируса морщинистости томата (TCV -СР), 2b мозаичного вируса огурца; CMV-2b), p25 картофельного вируса Х (PVX-p25), р 11 картофельного вируса М (PVM-p11), р11 картофельного вируса S (PVS-p11), р16 вируса ожога листьев черники (BScV -р16), р23 вируса тристезы лимона (CTV-p23), p24 вируса сворачивания листьев винограда-2, (GLRaV-2 p24), р 10 вируса винограда A, (GVA-p10), p14 вируса винограда В (GVB-p14), p10 латентного вируса борщевика (HLV-p10) или р16 обычного латентного вируса чеснока (GCLV-pl6). Следовательно, супрессор сайленсинга, например, HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p 19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16, GVA-p10 или другой супрессор может коэкспрессироваться вместе с нуклеиновой кислотой, кодирующей целевой белок, что обеспечит высокоэффективное образование белка в растении.

ВПЧ оболочечных вирусов, как правило, формируют свою оболочку из мембраны, от которой они отпочковываются. Плазматические мембраны растений включают фитостериновый комплемент, который может обладать иммуностимулирующим эффектом. Для исследования этой возможности ВПЧ на основе Н5 растительного происхождения назначались животным вместе с адъювантом; после этого определялась выраженность ответа со стороны гемагглютинин-ингибирующих антител (HAI) (Фигура 7).

Образование ВПЧ в растениях характеризуется определенными преимуществами над получением этих частиц в клеточных линиях насекомых. Растительные липиды могут стимулировать специфические иммунные клетки и усиливать вызываемый иммунный ответ. Растительные мембраны состоят из липидов, фосфатидилхолина (PC) и фосфатидилэтаноламина (РЕ), а также содержат гликосфинголипиды, характерные только для растений, некоторых бактерий и простейших. Сфинголипиды - это необычные соединения: они не являются эфирами глицерина, как PC или РЕ, а состоят из длинноцепочечного аминоспирта, который образует амидную связь с жирной кислотой, цепочка которой включает более 18-и атомов углерода. PC и РЕ, как и гликосфинголипиды, могут связываться с молекулами CD1, экспрессируемыми иммунными клетками млекопитающих, такими как антиген-презентирующие клетки (АРС), например, дендритными клетками, макрофагами и другими клетками, в том числе В- и Т-лимфоцитами тимуса и печени (Tsuji M,. 2006). Кроме того, в дополнение к возможному адъювантному эффекту, связанному с присутствием растительных липидов, преимуществом получения ВПЧ в растениях может являться способность растительных N-гликанов способствовать захвату гликопротеиновых антигенов антиген-презентирующими клетками (Saint- Jore-Dupas, 2007).

Что касается практического применения этих тезисов, то ожидается, что ВПЧ растительного происхождения будут вызывать более сильный иммунный ответ, чем ВПЧ, полученные с помощью других систем, и что иммунная реакция, вызываемая этими ВПЧ растительного происхождения, будет сильнее, чем иммунная реакция, вызываемая живыми или аттенуированными цельновирионными вакцинами.

В отличие от цельновирионных вакцин ВПЧ обладают рядом преимуществ: они не неинфекционны, поэтому строгие биологические ограничения, необходимые при работе с цельным инфекционным вирусом, при производстве таких вакцин не требуются. ВПЧ растительного происхождения обладают дополнительными преимуществами;

система экспрессии может выращиваться в теплицах или на открытом грунте, что значительно более экономично и лучше подходит для крупномасштабного производства.

Кроме того, растения не содержат ферментов, участвующих в синтезе сиаловой кислоты и добавления ее остатков к белкам. ВПЧ могут формироваться без участия нейраминидазы (NA), поэтому необходимость коэкспрессии NA или обработки клеток, в которых образуются ВПЧ, или их экстракта сиалидазой (нейраминидазой) для обеспечения образования ВПЧ отсутствует.

В частности, ВПЧ, полученные в соответствии со способом, представленным в настоящем изобретении, не включают белок M1, который, как известно, связывает РНК. РНК является веществом, загрязняющим препарат ВПЧ; ее присутствие нежелательно для получения разрешения уполномоченного органа на использование ВПЧ в качестве вакцины для человека.

5 - нуклеиновая кислота

В настоящем изобретении представлена нуклеиновая кислота, в состав которой входит последовательность нуклеотидов, кодирующая антиген гемагглютинин (НА) вируса гриппа, оперативно связанная с регуляторной областью, обладающей активностью в несиалирующих клетках организма хозяина.

В настоящем изобретении описывается клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей НА, например, НА вируса гриппа А человека, в вектор экспрессии хозяина и образование ВПЧ гриппа в клетках-хозяевах, пригодных для получения вакцины. ВПЧ также могут использоваться для получения реагентов, представленных рекомбинантными структурными белками вируса гриппа, которые самостоятельно собираются в функциональные и иммуногенные гомотипические макромолекулярные белковые структуры, включающие субвирусные частицы и ВПЧ гриппа, в трансформированных клетках-хозяевах, например, в клетках растений или насекомых.

Настоящее изобретение также включает последовательности нуклеотидов H1 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 1), Н2 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 2), Н3 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 3), Н4 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 4), Н5 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 5), Н6 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 6), Н7 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 7), Н8 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 8), Н9 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 9), Н10 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 10), Н11 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 11), Н12 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 12), Н13 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 13), Н14 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 14), H15 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 15) и H16 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 16).

В частности, настоящее изобретение включает последовательности нуклеотидов с идентификационными номерами SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7, которые кодируют НА подтипов H1, Н5 и Н7, соответственно; последовательности нуклеотидов с идентификационными номерами SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7, которые гибридизуются в жестких условиях гибридизации с нуклеиновыми кислотами, кодирующими НА подтипов H1, Н5 и Н7, соответственно; или последовательности нуклеотидов с идентификационными номерами SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7, которые гибридизуются в жестких условиях гибридизации с комплементарными молекулами нуклеиновых кислот, которые кодируют НА подтипов H1, Н5 и Н7, соответственно; при этом последовательность нуклеотидов кодирует белок гемагглютинин, который образует ВПЧ, индуцирующие образование антител. Например, экспрессия последовательности нуклеотидов в клетках-хозяевах приводит к образованию ВПЧ, и ВПЧ могут использоваться для индукции образования антител, способных связывать НА, в том числе зрелый НА, НА0, НА1 или НА2. ВПЧ при введении определенному субъекту вызывают иммунный ответ.

Гибридизация в жестких условиях - метод, известный специалистам (например, см. «Current Protocols in Molecular Biology» под ред. Ausubel с соавт., 1995, и приложения; Maniatis с соавт., в «Molecular Cloning (A Laboratory Manual)», Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook и Russell, в «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 3-е издание, 2001; ссылки на все эти источники содержатся в настоящем документе). Пример жестких условий гибридизации: гибридизация в течение 16-20 часов в 4 Х СЦН (четырехкратном стандартном цитрате натрия) при 65°С с последующим промыванием 0,1 Х СЦН при 65°С в течение одного часа или двукратным промыванием 0,1 Х СЦН при 65°С в течение 20 или 30 минут на каждое промывание. Другим примером жестких условий гибридизации могут служить следующие условия: гибридизация в течение ночи (16-20 часов) в 50% формамиде, 4 Х СЦН при 42°С с последующим промыванием 0,1 Х СЦН при 65°С в течение часа, или двукратным промыванием 0,1 Х СЦН при 65°С в течение 20 или 30 минут на каждое промывание, или в течение ночи (16-20 часов), или гибридизация в водном фосфатном буфере Church (7% ДСП (додецилсульфата натрия; 0,5М буфера NaPO₄ с рН 7,2; 10 ммоль/л ЭДТУК) при 65°С с двумя промываниями при 50°С в 0,1 Х СЦН, 0,1% ДСН в течение 20 или 30 минут на каждое промывание или двумя промываниями при 65°С в 2 Х СЦН, 0,1% ДСН в течение 20 или 30 минут на каждое промывание.

Кроме того, настоящее изобретение включает последовательности нуклеотидов которые характеризуется полной или частичной идентичностью (на 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любой другой идентичностью в пределах от 70 до 100%), или сходством, с последовательностью нуклеотида, кодирующего НА подтипа H1 (идентификационный номер последовательности SEQ ID NO:1), Н5 (идентификационный номер последовательности SEQ ID NO:5) или Н7 (идентификационный номер последовательности SEQ ID NO:7); при этом последовательность нуклеотидов кодирует белок гемагглютинин, который, образует ВПЧ, а ВПЧ вызывают образование антител. Например, экспрессия последовательности нуклеотидов в растительных клетках приводит к образованию ВПЧ, и ВПЧ могут использоваться для индукции образования антител, способных связывать НА, в том числе зрелый НА, НА0, НА1 или НА2. ВПЧ при введении определенному субъекту вызывают иммунный ответ.

Идентичность или сходство последовательности может определяться с помощью программы сравнения последовательностей нуклеотидов, такой как программа, предоставляемая в пакете DNASIS (например, использующая следующие параметры:

штраф за пропуск в последовательности - 5, число верхних диагоналей - 5, фиксированный штраф за пропуск в последовательности - 10, к-фрагмент - 2, перемещаемый пропуск - 10, размер окна - 5, а также другие параметры). Как бы то ни было, специалистам хорошо известны и другие методы сравнения последовательностей; примерами могут служить алгоритмы Smith и Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443,1970), Pearson и Lipman (1988, Proc. Nat′l. Acad. Sci. USA 85:2444), компьютеризованные варианты этих алгоритмов (например, GAP, BESTFIT, FASTA и BLAST), а также простое сравнение последовательностей и визуальное наблюдение.

Следовательно, настоящее изобретение также включает подходящий вектор, в состав которого входит химерическая конструкция, который можно применять в стабильных или временных системах экспрессии. Генетическая информация может содержаться в одной или нескольких конструкциях. Например, последовательность нуклеотидов, кодирующая целевой белок, может вводиться в одну конструкцию, а вторая последовательность нуклеотидов, кодирующая белок, модифицирующий гликозилирование целевого белка, может вводиться в другую конструкцию. Эти последовательности нуклеотидов затем могут коэкспрессироваться в клетке-хозяине. Также может использоваться конструкция, в состав которой входит последовательность нуклеотидов, кодирующая как целевой белок, так и белок, который модифицирует профиль гликозилирования целевого белка. В этом случае последовательность нуклеотидов будет включать первую последовательность, в состав которой входит последовательность первой нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой белок, оперативно связанная с промотором или регуляторной областью, и вторую последовательность, в состав которой входит вторая нуклеиновая кислота, кодирующая белок, модифицирующий профиль гликозилирования целевого белка, оперативно связанная с промотором или регуляторной областью.

Термин «коэкспрессия» означает, что две или большее число нуклеотидных последовательностей экспрессируются примерно в одно и то же время в организме хозяина и в пределах одной ткани организма хозяина. С другой стороны, последовательности нуклеотидов могут не экспрессироваться абсолютно одновременно. Чаще всего две или большее число последовательностей нуклеотидов экспрессируются таким образом, что соответствующие продукты экспрессии могут взаимодействовать друг с другом. Например, белок, модифицирующий гликозилирование целевого белка, может экспрессироваться до периода экспрессии целевого белка или в течение этого периода, что сделает возможным модификацию гликозилирования целевого белка. Две или большее число последовательностей нуклеотидов могут коэкспрессироваться во временной системе экспрессии, в которую введено две или большее число последовательностей, в организме хозяина примерно одновременно при условиях, в которых возможна экспрессия обеих последовательностей. С другой стороны, основной хозяин, включающий одну последовательность нуклеотидов, например, последовательность, кодирующую белок, модифицирующий профиль гликозилирования целевого белка, может подвергаться трансформации, как временной, так и постоянной (стабильной), в результате которой в клетку-хозяин будет вводиться последовательность, кодирующая целевой белок. В этом случае, последовательность, кодирующая белок, модифицирующий профиль гликозилирования целевого белка, может экспрессироваться в определенной ткани, в течение определенного этапа развития, или ее экспрессия может индуцироваться с помощью промотора, а дополнительная последовательность, кодирующая целевой белок, может экспрессироваться при тех же условиях и в той же ткани, что обеспечит коэкспрессию последовательностей нуклеотидов.

Конструкции, представленные в настоящем изобретении, могут вводиться в растительные клетки с помощью Ti-плазмид, Ri-плазмид, растительных вирусных векторов, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропортации и т.д. Обзор этих методик представлен в следующих источниках: Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp.421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebvre, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp.561-579 (1997). Другие методы включают прямой захват ДНК, использование липосом, электропортацию, например, с помощью протопластов, микроинъекцию, бомбардировку частицами, содержащими ДНК, и вакуумную фильтрацию. См., например, Bilang с соавт.(Gene 100: 247-250 (1991), Scheld с соавт.(Моl. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche с соавт.(Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause с соавт.(Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein с соавт., Nature 327: 70-73 (1987); Howell с соавт.(Science 208: 1265, 1980), Horsch с соавт.(Science 227; 1229-1231, 1985), DeBlock с соавт., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.. Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J.Virol Meth, 105:343-348, 2002,), Пат.США №№4,945,050; 5,036,006; 5,100,792, заявка на патент США, серийный №08/438,666, поданная 10 мая 1995 г., заявка на патент США, серийный №07/951,715, поданная 25 сентября 1992 г.(ссылки на все источники содержатся в настоящем описании).

Термины «регуляторная область», «регуляторный элемент», «промотор» означают (фрагмент нуклеиновой кислоты, как правило, но не всегда расположенный против хода транскрипции по отношению к кодирующей области гена, представленной ДНК или РНК, а также ДНК и РНК. Когда регуляторная область активна и оперативно связана с целевым геном, то это может привести к экспрессии целевого гена. Регуляторный элемент может опосредовать органную специфичность, контролировать временную активацию гена или активацию на определенной стадии развития. Термин «регуляторная область» включает элементы промотора, основные элементы промотора, проявляющие основную активность промотора, элементы, которые индуцируются в ответ на внешние стимулы, элементы, которые опосредуют активность промотора, например, элементы отрицательного контроля или усилители транскрипции. Термин «регуляторная область», использующийся в данном документе, также включает элементы, обладающие активностью после транскрипции, например, регуляторные элементы, которые модулируют экспрессию гена, такие как усилители трансляции и транскрипции, репрессоры трансляции и транскрипции, активирующие последовательности и детерминанты нестабильности мРНК. Некоторые из этих элементов могут располагаться проксимально по отношению к кодирующей области.

В контексте раскрытия сущности настоящего изобретения термин «регуляторный элемент» или «регуляторная область», как правило, относятся к последовательности ДНК, обычно, но не всегда, расположенной в направлении 5′ по отношению к кодирующей последовательности структурного гена; эти элементы контролируют экспрессию кодирующей области, обеспечивая распознавание ее РНК-полимеразой и (или) другими факторами, необходимыми для начала транскрипции с определенного сайта. Тем не менее, следует понимать, что другие последовательности нуклеотидов, расположенные в интронах, или в направлении 3' по отношению к последовательности, также могут участвовать в регуляции экспрессии целевой кодирующей области. Примером регуляторного элемента, который обеспечивает распознавание РНК-полимеразой или другими транскрипционными факторами определенного сайта, с которого следует начинать транскрипцию, является промотор. Большинство промоторов эукариотов содержат блок ТАТА - консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из четырех пар нуклеотидов, аденозина и тимидина, обычно расположенную примерно в 25-и парах оснований по направлению 5′ от сайта начала транскрипции. Элемент промотора включает основной элемент промотора, отвечающий за начало транскрипции, а также другие регуляторные элементы (указанные выше), которые модифицируют экспрессию гена.

К ним относится несколько типов регуляторных областей, в том числе и тех, активность которых зависит от стадии развития, индуцируется или проявляется конституционально. Регуляторная область, активность которой зависит от стадии развития, или которая контролирует дифференциальную экспрессию определенного гена, активируется в определенных органах или тканях в определенный период развития этого органа или ткани. Как бы то ни было, некоторые регуляторные области, которые активируются, на определенных стадиях развития, могут преимущественно активироваться в определенных органах и тканях на определенных этапах развития;

кроме того, они также могут быть активными на определенных стадиях развития или на базальном уровне в других органах и тканях в пределах растения. К примерам тканеспецифичных регуляторных областей, например, регуляторного региона, специфичного для семян, относятся промотор напина и промотор круциферина (Rask с соавт., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau с соавт., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Примером промотора, специфичного для листьев, является промотор пластоцианина (Фигура 3; патент США 7,125,978, ссылка на который содержится в настоящем документе).

Индуцируемая регуляторная область - это область, которая способна прямо или опосредованно активировать транскрипцию одной или нескольких последовательностей ДНК или одного или нескольких генов в ответ на действие индуктора. В отсутствие индуктора последовательность ДНК или ген транскрибироваться не будут.Как правило, белковый фактор, который специфично связывается с индуцируемой регуляторной областью, что приводит к активации транскрипции, может существовать в неактивной форме; превращение в активную форму происходит прямо или опосредованно с помощью индуктора. Как бы то ни было, индукция может осуществляться и без белкового фактора. Индуктор может являться химическим агентом, например, белком, метаболитом, фактором роста, гербицидом или фенольным соединением, а также физиологическим стрессом, непосредственно вызванным теплом, холодом, солью или токсичными элементами, или опосредованно вызванным действием патогена или болезнетворного агента, такого как вирус. Растительная клетка, содержащая индуцируемую регуляторную область, может подвергаться наружному действию индуктора путем нанесения индуктора на клетку или растение путем распыления, поливки, нагревания и др. Индуцируемые регуляторные элементы могут происходить из растительных и нерастительных генов (см., например, Gatz, С.and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; ссылка на статью содержится в настоящем документе). К примерам возможных индуцируемых промоторов относятся промоторы, индуцируемые тетрациклином (Gatz, С.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; ссылка на статью содержится в настоящем документе), промоторы, индуцируемые стероидами (Aoyama, Т. and Chua, N.H., 1997, Plant J. 2, 397-404; ссылка на статью содержится в настоящем документе), промоторы, индуцируемые этанолом (Salter, M.G., с соавт., 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., с соавт., 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, ссылки на статьи содержится в настоящем документе), гены IВ6 и CK11, индуцируемые цитокинином (Brandstatter, I. and Kieber, J.J., 1998, Plant Cell 10,1009-1019; Kakimoto, Т., 1996, Science 274, 982-985; ссылки на статьи содержится в настоящем документе) и элемент DR5, индуцируемый ауксином (Ulmasov, Т. с соавт., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; ссылка на статью содержится в настоящем документе).

Конституциональная регуляторная область обеспечивает экспрессию гена во всех частях растения и в течение всего времени развития растения. К примерам известных конституциональных регуляторных элементов относятся промоторы, связанные с транскриптом CaMV 35S (Odell с соавт., 1985, Nature, 313: 810-812), генами актина-1 риса (Zhang с соавт., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), актина-2 (An с соавт., 1996, Plant J., 10: 107-121), tms-2 (Патент США 5,428,147, ссылка на который содержится в настоящем документе) и триосефосфатизомеразы-1 (Xu с соавт., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), геном убихитина-1 кукурузы (Cornejo с соавт., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), генами убихитина-1 и -6 арабидопсиса (Holtorf с соавт., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646) и геном трансляционного фактора инициации 4А табака (Mandel с соавт., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004). Термин «конституциональный», используемый в данном документе, не обязательно указывает на то, что контролируемый конституциональной регуляторной областью ген экспрессируется во всех типах клеток на одинаковом уровне. Этот термин означает, что ген экспрессируется в клетках различных типов; при этом зачастую может наблюдаться различие в уровне его экспрессии.

Термин «оперативно связанный» означает, что определенные последовательности, например, регуляторный элемент и целевая кодирующая область, вступают в прямое или опосредованное взаимодействие для осуществления их функции, например, участия в экспрессии гена или ее модуляции. Взаимодействие оперативно связанных последовательностей может, например, опосредоваться белками, которые взаимодействуют с оперативно связанными последовательностями.

Одна или несколько нуклеотидных последовательностей, представленных в настоящем изобретении, могут экспрессироваться в любом подходящем для этого растении-хозяине, трансформированном нуклеотидной последовательностью, конструкцией или вектором, представленными в настоящем изобретении. К примерам подходящих растений-хозяев относятся, например, зерновые сельскохозяйственные культуры, к которым относятся люцерна, канала, Brassica spp., кукуруза, Nicotiana spp., люцерна, картофель, женьшень, горох, овес, рис, соя, пшеница, ячмень, подсолнечник, хлопок и т.д.

Одна или несколько химерических генных конструкций, представленных в настоящем изобретении, могут также включать 3′-нетранслируемую область генома. 3′-нетранслируемая область генома - это часть гена, включающая сегмент ДНК, содержащий сигнал полиаденилирования и любые другие регуляторные сигналы, которые могут воздействовать на процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования обычно характеризуется воздействием на добавление полиадениловой кислоты к 3′-концу предшественника мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно определяются по наличию гомологии к канонической форме 5′-ААТААА-3′, хотя вариации также встречаются нередко. Одна или несколько химерических генных конструкций, представленных в настоящем изобретении, также могут включать усилители трансляции или транскрипции, наличие которых может потребоваться. Области этих усилителей (энхансеров) хорошо известны специалистам и могут включать стартовый кодон ATG и соседние с ним последовательности. Стартовый кодон должен находиться в фазе с рамкой считывания кодирующей последовательности, что обеспечит трансляцию всей последовательности.

К примерам подходящих 3′-областей относятся 3′-транскрибируемые нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования плазмидных генов Agrobacterium, индуцирующих опухоль (Ti), таких как гены нопалин-синтазы (ген Nos), и растительных генов, таких как гены запасного белка сои, ген малой единицы рибулозы-1, ген 5-бифосфаткарбоксилазы (RuBisCO; Патент США 4,962,028; ссылка содержится в документе), промотор, использующийся для регулирования экспрессии пластоцианина (Pwee and Gray 1993; ссылка на статью содержится в настоящем документе). Пример промотора пластоцианина описан в Патенте США 7,125,978, ссылка на который содержится в настоящем документе.

Как указано в данном документе, промоторы, включающие последовательности усилителя (энхансера) с доказанной эффективностью для экспрессии в листьях, оказались эффективными и для временной экспрессии. Не вдаваясь в теоретические подробности, 5′-прикрепление регуляторных элементов генов фотосинтеза путем прикрепления к матриксу ядра может опосредовать высокий уровень экспрессии. Например, фрагмент гена пластоцианина гороха, опосредующий выраженную экспрессию гена-репортера, может использоваться до уровня -784 от участка начала трансляции.

В соответствии с настоящем изобретением, возможно использование регуляторной области фотосинтетического гена, например, регуляторной области пластоцианина (Патент США 7,125,978; ссылка на который содержится в настоящем описании), или регуляторной области, полученной от гена рибулоза-1,5-бифосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO; Патент США 4,962,028; ссылка на который содержится в настоящем описании), а/b-связывающего хлорофилл белка (CAB; Leutwiler с соавт.; 1986; ссылка на статью содержится в настоящем описании), ST-LS1 (связанного с комплексом фотосистемы II, выделяющим кислород, Stockhaus с соавт; 1989; ссылка на статью содержится в настоящем описании).

Для идентификации трансформированных растительных клеток конструкции, представленные в настоящем изобретении, могут претерпевать дальнейшую обработку и включать селектируемые маркеры. К подходящим селектируемым маркерам относятся ферменты, которые обеспечивают устойчивость к химическим веществам, таким как антибиотики, например, гентамицин, гигромицин, канамицин, или гербицидам, таким как фосфинотрицин, глифосфат, хлорсульфурон и др. Аналогично, могут использоваться ферменты, которые приводят к образованию соединения, определяемого по изменению цвета, такого как GUS (бета-глюкуронидаза), или по люминесценции, такого как люцифераза или зеленый флуоресцентный белок (GFP).

кДНК-копии этих генов могут клонироваться в подходящий вектор экспрессии, в зависимости от требований со стороны системы экспрессии хозяина. Примеры подходящих векторов экспрессии для растений описаны ниже. Кроме того, могут использоваться вектор экспрессии на основе бакуловируса, например, pFastBacl (In Vitrogen); в этом случае с помощью известных методов и согласно информации, приведенной в руководстве производителя, получаются плазмиды на основе pFastBacl.

В настоящем изобретении также представлены генные конструкции, в состав которых входит нуклеиновая кислота, кодирующая НА, как описано выше, оперативно связанная с регуляторным элементом, обладающим активностью в клетках растений. К примерам регуляторных элементов, обладающих активностью в клетках растений, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, относятся, например, регуляторная область пластоцианина (Патент США 7,125,978; ссылка содержится в настоящем описании), регуляторная область, полученная из гена рибулоза-1,5-бифосфат-карбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO; Патент США 4,962,028; ссылка содержится в настоящем описании), гена а/b-связывающего хлорофилл белка (CAB; Leutwiler с соавт.; 1986; ссылка содержится в настоящем описании), ST-LS1 (связанного с комплексом фотосистемы II, выделяющим кислород, Stockhaus с соавт.1989; ссылка содержится в настоящем описании). Если конструкция экспрессируется в клетке насекомого, то к примерам регуляторных элементов, обладающих активностью в клетках насекомых, относятся промотор полигедрона, промотор гена gp64 и другие элементы.

В настоящем изобретении также представлено клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей НА, например, НА вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (H5N1), в вектор экспрессии для растений, дрожжей или насекомых (например, вектор экспрессии на основе бакуловируса), и получение вакцины-кандидата против гриппа или реагентов, включающих рекомбинантные структурные белки вируса гриппа, которые самостоятельно собираются в функциональные и иммуногенные гомотипические макромолекулярные белковые структуры, в том числе субвирусные частицы и ВПЧ гриппа, в трансформированных растительных клетках или трансформированных клетках насекомых.

Нуклеиновая кислота, кодирующая НА, например, НА вируса гриппа человека А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), или НА вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05, может экспрессироваться, например, с помощью системы экспрессии на основе бакуловируса, в соответствующей клеточной линии, например, в клетках Spodoptera frugiperda (например, в клеточной линии Sf-9; ATCC РТА-4047). Также могут быть использованы и другие линии клеток насекомых.

Нуклеиновая кислота, кодирующая НА, кроме того, может экспрессироваться в растительной клетке или в растении. Нуклеиновая кислота, кодирующая НА, может синтезироваться путем обратной транскрипции или полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе РНК НА. Например, РНК может быть изолирована из вируса гриппа человека А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), или из вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (H5N1), или из клеток, инфицированных вирусом гриппа. Для обратной транскрипции и ПЦР могут использоваться олигонуклеотидные праймеры, специфичные для РНК НА, например, НА вируса гриппа человека А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) или НА вируса гриппа человека А Индонезия/5/05 (H5N1). Кроме того, нуклеиновая кислота, кодирующая НА, может синтезироваться химическим путем с помощью методов, известных специалистам.

6 - Белки

Настоящее изобретение также включает один или несколько белков НА, которые кодируются нуклеотидными последовательностями с идентификационными номерами SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7, кодирующими НА подтипов H1, Н5 и Н7, соответственно), нуклеотидными последовательностями с идентификационными номерами SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеиновыми кислотами, которые кодируют НА подтипов Н1, Н5 и Н7, соответственно, или нуклеотидными последовательностями с идентификационными номерами SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7, которые гибридизуются в жестких условиях с комплементами нуклеиновых кислот, кодирующих НА подтипов Н1, Н5 и Н7, соответственно, где нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинина, который формирует ВПЧ, а ВПЧ вызывают образование антител.

Аналогично, настоящее изобретение включает НА следующих подтипов: H1 (идентификационный номер соответствующей нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO): 1), Н2 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 2), Н3 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 3), Н4 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 4), Н5 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 5), Н6 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 6), Н7 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 7), Н8 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 8), Н9 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 9), Н10 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 10), Н11 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 11), H12 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 12), Н13 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 13), Н14 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 14), H15 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 15), H16 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 16); и последовательности нуклеотидов, которые характеризуются идентичностью различной степени с последовательностями HI (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 1), Н2 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 2), НЗ (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 3), Н4 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 4), Н5 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 5), Н6 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 6), Н7 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 7), Н8 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 8), Н9 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 9), Н10 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 10), Н11 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 11), Н12 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 12), Н13 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 13), Н14 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 14), H15 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 15), H16 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 16): от 60 до 100%, в частности, от 70 до 100%, от 80 до 100%, от 90 до 100% или от 95% до 100%; при этом нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинина, который образует ВПЧ, вызывающие образование антител. Например, экспрессия последовательности нуклеотидов в растительных клетках-хозяевах приводит к образованию ВПЧ, и ВПЧ могут использоваться для индукции образования антител, способных связывать НА, в том числе зрелый НА, НА0, НА1 или НА2. ВПЧ при введении определенному субъекту вызывают иммунный ответ.

7 - ВПЧ

В настоящем изобретении представлены ВПЧ, включающие НА одного или нескольких типов и подтипов.

Термины «вирусоподобная частица», «вирусоподобные частицы» (ВПЧ) означают структуры, которые формируются самостоятельно и состоят из структурных белков, таких как белок НА вируса гриппа. ВПЧ, как правило, по своим морфологическим и антигенным свойствам идентичны вирионам, образующимся при инфекции, но не содержат генетической информации, необходимой для репликации, и поэтому не являются инфекционными частицами. В некоторых случаях ВПЧ могут включать в свой состав один вид белков или несколько видов белков. ВПЧ, состоящие из белков более чем одного вида, могут включать белки от одного вида вирусов или белки различных видов вирусов, различных родов вирусов, различных подсемейств или семейств вирусов (обозначаемых по номенклатуре ICTV). В других случаях один или несколько видов белков, входящих в состав ВПЧ, могут характеризоваться модифицированной по сравнению с природной последовательностью аминокислот.ВПЧ могут образовываться в подходящих для этого клетках-хозяевах, в том числе клетках растений и насекомых. После экстракции из клетки-хозяина, изоляции и последующей очистки в соответствующих условиях ВПЧ могут очищаться как цельные структуры.

Настоящее изобретение также включает, например, ВПЧ на основе вируса гриппа, которые приобретают липидный нуклеокапсид из плазматической мембраны клетки, в которой экспрессируются белки ВПЧ. Например, если ВПЧ экспрессируется в растительной системе, то ВПЧ может приобретать липидный нуклеокапсид из плазматической мембраны клетки.

В целом, термин «липид» означает жирорастворимую (липофильную) молекулу, которая встречается в природе. Термин также употребляется в более узком смысле и относится к жирным кислотам и их производным (в том числе три-, ди- и моноглицериды и фосфолипиды), а также другим жирорастворимым стеринсодержащим метаболитам или стеринам. Фосфолипиды - это основной компонент биологических мембран, в состав которых также входят гликолипиды, стерины и белки. К примерам фосфолипидов относятся фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и др. К примерам стеринов относятся зоостерины (например, холестерин) и фитостерины. Из различных видов растений было выделено более 200 фитостеринов. К наиболее распространенным относятся кампестерин, стигмастерин, эргостерин, брассикастерин, дельта-7-стигмастерин, Бельта-7-авенастерин, дауностерин, ситостерин, 24-метилхолестерин, холестерин и бета-ситостерин. Специалистам очевидно, что липидная композиция плазматической мембраны клетки может варьироваться в зависимости от условий среды и условий роста клетки или организма, из которого получена эта клетка.

Клеточные мембраны, как правило, состоят из двух слоев липидов, а также белков, которые выполняют различные функции. В двойном слое липидов могут обнаруживаться локализованные сосредоточения определенных липидов, называемые «липидными плотами». Не вдаваясь в теоретические подробности, липидные плоты могут играть важную роль в эндо- и экзоцитозе, попадании и выделении вирусов или других инфекционных агентов, передаче сигналов между клетками, взаимодействии с другими структурными компонентами клетки или организма, такими как внутриклеточный и внеклеточный матрикс.

ВПЧ, образованные белками вируса гриппа в соответствии с настоящим изобретением, не содержат белка M1. Белок M1, как известно, связывает РНК (Wakefield and Brownlee, 1989), которая является загрязнителем препарата ВПЧ. Присутствие РНК является нежелательным для получения разрешения уполномоченного органа на применение препарата ВПЧ, поэтому получение препарата ВПЧ, в котором нет РНК, может обладать преимуществами.

ВПЧ, сформированные в растениях, в соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, могут образовывать комплексы с липидами растительного происхождения. ВПЧ могут включать в свой состав пептиды НА0, НА1, НА2 или их комбинации. Липиды растительного происхождения могут существовать в виде липидного двойного соля и могут образовывать оболочку, окружающую ВПЧ. Липидами растительного происхождения могут являться липидные компоненты плазматической мембраны растения, в котором образуются ВПЧ, в том числе один или несколько липидов растительного происхождения, например, фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (РЕ), гликосфинголипиды, фитостерины или их комбинации. Липиды растительного происхождения также могут называться «растительными липидами».

ВПЧ отпочковываются от плазматической мембраны клеток растений, поэтому липидная композиция ВПЧ отражает их происхождение. ВПЧ, полученные в соответствии с настоящим изобретением, включают в свой состав НА, который образует комплекс с липидами растительного происхождения. Растительные липиды могут стимулировать специфические иммунные клетки и усиливать вызываемый иммунный ответ.Растительные мембраны состоят из липидов, фосфатидилхолина (PC) и фосфатидилэтаноламина (РЕ), а также содержат гликосфинголипиды, сапонины и фитостерины. Кроме того, в плазматической мембране также выявляются липидные плоты - эти микродомены обогащены сфинголипидами и стеринами. В растениях, как известно, содержатся совершенно различные фитостерины, к которым относятся стигмастерин, ситостерин, 24-метилхолестерин и холестерин (Mongrand с соавт., 2004), PC и РЕ, как и гликосфинголипиды, могут связываться с молекулами CD1, экспрессируемыми иммунными клетками млекопитающих, такими как антиген-презентирующие клетки (АРС), например, дендритными клетками, макрофагами и другими клетками, в том числе В- и Т-лимфоцитами тимуса и печени (Tsuji M,. 2006). Молекулы CD1 структурно похожи на молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I; их роль заключается в презентации гликолипидных антигенов NKT-клеткам (естественным Т-киллерам). После активации NKT-клетки активируют клетки врожденной иммунной системы, такие как NK-клетки и дендритные клетки, а также клетки адаптивной иммунной системы, такие как В-клетки, выделяющие антитела, и Т-клетки.

В состав плазматической мембраны входят различные фитостерины; их специфический набор может варьировать в широких пределах в зависимости от вида, условий роста, питательных ресурсов и состояния патогена, а также от других факторов. В целом, самым распространенным фитостерином является бета-ситостерин.

Фитостерины присутствуют в составе ВПЧ гриппа в комплексе с двойным липидным слоем, таким как капсид, построенный из элементов плазматической мембраны, что может представлять собой определенные преимущества данной композиции вакцины. Не вдаваясь в теоретические подробности, ВПЧ растительного происхождения, в состав которых входит двойной липидный слой, такой как капсид, построенный из элементов плазматической мембраны, могут индуцировать более сильную иммунную реакцию, чем ВПЧ, полученные с помощью другой системы экспрессии, и могут вызывать иммунную реакцию, аналогичную таковой для живой или аттенуированной цельновирионной вакцины.

Следовательно, в некоторых вариантах реализации изобретения в нем представлены ВПЧ, в состав которых входит двойной липидный слой растительного происхождения. В некоторых вариантах реализации изобретения липидный двойной слой растительного происхождения может образовывать оболочку (капсид) ВПЧ.

8 - Композиция

В настоящем изобретении представлены композиции, в состав которых входит эффективная доза ВПЧ, включающих белок НА вируса гриппа, один или несколько растительных липидов и фармацевтически приемлемый носитель. Белок НА вируса гриппа может быть представлен белком Н5 Индонезия. Также в изобретении представлен метод индукции иммунитета против вируса гриппа у определенного субъекта. Этот метод предполагает назначение вирусоподобных частиц, в состав которых входит белок НА вируса гриппа, один или несколько растительных липидов и фармацевтически приемлемый носитель. Вирусоподобные частицы могут вводиться субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

9 - Способ лечения

В настоящем изобретении представлен способ индукции иммунитета, или «провокации иммунного ответа» против вируса гриппа у определенного субъекта, заключающийся в назначении субъекту композиции, описанной в этом изобретении.

«Иммунный ответ», как правило, означает ответ со стороны адаптивной иммунной системы. Ответ со стороны адаптивной иммунной системы включает гуморальный ответ и клеточный ответ. Гуморальный ответ - это разновидность иммунного ответа, опосредованная секретируемыми антителами, которые образуются в В-лимфоцитах (В-клетках). Секретируемые антитела связываются с антигенами на поверхности проникших в организм микробов (таких как вирусы и бактерии), что является сигналом к их разрушению. Гуморальный иммунный ответ, как правило, заключается в образовании антител и в сопровождающих процессах, а также в реализации эффекторных функций антител, в том числе в активации Т-хелперов-2 и образовании цитокинов, клеток памяти, стимуляции фагоцитоза опсонинами, уничтожении патогенна и других процессах.

Клеточный иммунный ответ - это иммунный ответ, развивающийся без участия антител. Клеточный иммунитет предполагает активацию макрофагов, естественных киллеров (NK-клеток), антиген-специфичных цитотоксичных Т-лимфоцитов, а также высвобождение различных цитокинов в ответ на антиген. Клеточный иммунитет, как правило, означает активацию Т-хелперов, Т-киллеров и реализацию ответа, опосредованного Т-лимфоцитами. Клеточный иммунитет имеет большое значение для борьбы с вирусной инфекцией.

ВПЧ с рекомбинантным НА, представленные в настоящем изобретении, могут использоваться в сочетании с существующими вакцинами против гриппа, дополнять вакцины, делая их более эффективными и снижая их дозы. Как известно специалистам, вакцины могут быть направлены против одного или нескольких видов вируса гриппа. К примерам подходящих вакцин относятся, например, вакцины, имеющиеся в продаже, производимые Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, Medlmmune, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi-Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals и другими компаниями.

При желании к ВПЧ, представленным в настоящем изобретении, могут быть добавлены известные специалистам подходящие адъюванты. Более того, ВПЧ могут использоваться в составе вакцины, включающей эффективную дозу ВПЧ, достаточную для развития иммунитета у целевого организма, как это указано выше. Более того, ВПЧ, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут сочетаться с ВПЧ, полученными с использованием различных белков вируса гриппа, например, нейраминидазы (NA).

Следовательно, настоящее изобретение имеет отношение к методу индукции иммунитета к вирусу гриппа у животного или целевого организма, который предполагает введение эффективной дозы вакцины, в состав которой входит один или несколько видов ВПЧ. Вакцина может применяться перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

Как показано на Фигурах 6 и 7, анализ in vitro показывает наличие перекрестной реактивности антител к мутированным ВПЧ гриппа А/Индонезия/5/05 (Н5) и другим штаммам вируса гриппа, таким как А/Вьетнам/1203/04; А/Аньхой/1/05 и А/Турция/582/06 (все - штаммы H5N1), тогда как активность гемагглютинации единственного исследованного H1N1 оказалась ниже (Фигура 7).

Важно, что антитела, образованные после однократного введения мутированного H5N1 (негликозилированный белок Н5) вызывали более выраженный ответ на все штаммы Н5, исследованные через 14 дней, чем антитела против Н5 дикого типа. Это указывает на то, что негликозилированный иммуноген может обеспечивать более быстрый ответ, чем антиген дикого типа.

Эти данные, следовательно, указывают на то, что ВПЧ гриппа растительного происхождения, включающие в свой состав мутированный вирусный белок гемагглютинин Н5, лишенный N-связанных углеводов, индуцирует иммунный ответ, специфичный для патогенных штаммов вируса гриппа, и что этот ответ является перекрестным для других штаммов и может развиваться быстро после однократного введения ВПЧ.

10 - Субъект

К примерам субъектов или целевых организмов, которым могут быть назначены ВПЧ, представленные в настоящем изобретении, относятся люди, приматы, птицы, водоплавающие птицы, перелетные птицы, перепелки, утки, гуси, домашние птицы, куры, индейки, свиньи, овцы, лошадиные, лошади, верблюды, псовые, собаки, кошки, тигры, леопарды, циветты, куницы, каменные куницы, хорьки, домашние животные, крупный рогатый скот, мыши, крысы, гвинейские свиньи или другие грызуны, тюлени, киты или другие животные. Эти целевые организмы приведены в качестве примеров, и область применения и использования настоящего изобретения ими не ограничивается.

Настоящее изобретение также относится к вирусам гриппа, которые инфицируют других млекопитающих или животных-хозяев, например, людей, приматов, лошадей, свиней, птиц, водоплавающих птиц, перелетных птиц, перепелок, уток, гусей, домашних птиц, куриц, индюков, верблюдов, псовых, собак, кошек, тигров, леопардов, циветт, куниц, каменных куниц, хорьков, домашних животных, крупный рогатый скот, мышей, крыс, тюленей, китов или других животных.

В частности, субъектом, в отношении которого применяются методы, описанные выше, может являться человек, примат, лошадь, свинья, птица, водоплавающая птица, перелетная птица, перепел, утка, гусь, курица, собака, кошка, хорек, домашнее животное или другое животное. В частности, субъектом может являться человек (пациент) или птица (включая водоплавающую птицу, перелетную птицу, домашнюю птицу, например, перепелку, утку, гуся, индюка, курицу), в частности, перелетная птица или домашняя птица, которая употребляется в пищу (перепелка, утка, гусь, индюк, курица). В частности, субъектом является человек.

11 - Контейнеры, шприцы, наборы и т.д.

Настоящее изобретение также включает описание контейнеров для заявленной в данном описании композиции. Контейнер содержит лекарственную форму с одной или несколькими дозами и консервантом. В частности, контейнер - это шприц, готовый к применению, заполненный композицией или вакциной, как это указано в данном описании.

В частности, в изобретении представлен набор, в состав которого входит контейнер, включающий вакцину или композицию, соответствующую приведенному в этом описании описанию, а также инструкции по применению указанной композиции (вакцины).

Далее изобретение будет подробно описано с помощью ссылок на следующие неограничивающие примеры.

Пример 1

Материалы и методы

1. Мутация Н5 дикого типа штамма А/Индонезия/5/05 (Идентификационный номер последовательности SEQ ID NO.17) с получением негликозилированного Н5.

Тройной мутант получался путем удаления сайтов гликозилирования N154, N165 и N286, расположенных на глобулярной головке На дикого типа, а именно путем замещения Thr или Ser, включенных в паттерн последовательности гликозилирования N-X-T/S, на остаток Аlа. Таким образом, тройной мутант содержал три замещенных аминокислоты: Т156А, Т167А и S288A (нумерация проведена в соответствии с исходной последовательностью SEQ ID NO.17). Замещения трех аминокислот были проведены с помощью метода сшивания на основе ПЦР, представленного Darveau с соавт. (1995), с использованием вектора экспрессии НА дикого типа (конструкция 660, Фигура 4) в качестве матрицы.

Опишем вкратце этот метод. Параллельно было проведено три ПЦР-амплификации на векторе экспрессии 660 pCAMBIA в качестве матрицы с тремя различными парами праймеров:

1) Plato-443c (последовательность SEQ ID NO: 18) и НА5-Т156А.r (последовательность SEQ ID NO: 19);

2) HA5-T167A.C (последовательность SEQ ID NO:20) и HA5-S288A..r (последовательность SEQ ID NO: 21);

3) HA5-S288A.C (последовательность SEQ ID NO:22) и HA(Ind)-SacI.r (последовательность SEQ ID NO: 23).

Продукты амплификации, полученные в этих трех реакциях, смешивались; полученная смесь служила матрицей для четвертой реакции (составная реакция), для которой в качестве праймеров использовались Plato-443c (последовательность SEQ ID NO: 18) и HA(Ind)-Sac.r (последовательность SEQ ID NO: 23). Получившийся в результате участок ДНК фрагментировался BamHI (в промоторе пластоцианина) и Sacl (на 3'-конце фрагмента) и клонировался в pCAMBIAPlasto, предварительно фрагментированный этими же ферментами. Получившаяся в результате плазмида, названная 680, представлена на Фигуре 5 (идентификационный номер последовательности SEQ ID NO.29).

2. Сборка кассет экспрессии

Все манипуляции выполнялись согласно общим протоколам молекулярной биологии (Sambrook and Russell (2001); ссылка содержится в описании). Первый этап клонирования заключался в сборке рецепторной плазмиды, содержащей регуляторные элементы, расположенные в 5′- и 3′-направлениях от гена пластоцианина люцерны Промотор пластоцианина и 5′-нетранслируемая область амплифицировались из геномной ДНК люцерны с помощью олигонуклеотидных праймеров Xmal-pPlas.c (последовательность SEQ ID NO:24) и SacI-ATG-pPlas.r (последовательность SEQ ID NO: 25). Продукт амплификации фрагментировался Xmal и SacI, а затем сшивался с вектором рСАМВТА2300 (Gambia, Канберра, Австралия), предварительно фрагментированным этими же ферментами; в результате получался pCAMBIApromo Plasto. Аналогично, 3′-нетранслируемая область и терминатор гена пластоцианина амплифицировались из геномной ДНК люцерны с помощью следующих праймеров: SacI-PlasTer.c (последовательность SEQ ID NO: 26), EcoRI-PlasTer.r (последовательность SEQ ID NO: 27); продукт фрагментировался SacI и EcoRI, а затем полученный фрагмент вставлялся в соответствующий сайт pCAMBIApromoPlasto, что приводило к получению pCAMBIAPlasto.

3. Сборка кассет экспрессии Н5

Фрагмент, кодирующий гемагглютинин вируса гриппа штамма А/Индонезия/5/05 (H1N1; учетный номер LANE ISDN 125873) синтезировался Epoch Biolabs (Шугар-Ленд, Техас, США). На Фигуре 26 представлена последовательность полученного фрагмента, содержащего всю кодирующую область белка Н5 (SEQ ID NO. 17), в том числе нативный сигнальный пептид, фланкированный сайтом Hind III по направлению против хода транскрипции по отношению к начальному кодону ATG, и сайтом Sacl, расположенным по ходу транскрипции по отношению к терминальному кодону ТАА (идентификационный номер последовательности SEQ ID NO: 28; также приведена последовательность мутантного Н5: SEQ ID NO.29). Кодирующая область Н5 клонировалась в кассету экспрессии на основе пластоцианина по методу сшивания на основе ПЦР, представленному Darveau с соавт.(1995). Опишем вкратце этот метод. Первая ПЦР-амплификация проводилась с использованием праймеров Plato-443 с (идентификационный номер последовательности SEQ ID NO:30) и SpHA(Ind)-Plasto.r (последовательность SEQ ID NO:31), а также pCAMBIA promoPlasto в качестве матрицы. Вторая амплификация проводилась с праймерами Plasto-SpHA(Ind).c (последовательность SEQ ID NO: 6) и HA(Ind)-Sac.r (последовательность SEQ ID NO:32); в качестве матрицы использовался кодирующий фрагмент Н5. Продукты амплификации, полученные в двух реакциях, смешивались; полученная смесь использовалась в качестве матрицы для третьей реакции (составная реакция), для которой в качестве праймеров использовались Plato-443 с (последовательность SEQ ID NO: 4) и HA(Ind)-Sac.r (последовательность SEQ ID NO: 33). Получившийся в результате участок ДНК фрагментировался BamHI (в промоторе пластоцианина) и Sacl (на 3′-конце фрагмента) и клонировался в pCAMBIAPlasto, предварительно фрагментированный этими же ферментами. Получившаяся в результате плазмида, названная 660, представлена на Фигуре 5; плазмида, полученная при использовании «мутантного» белка Н5, названа 680.

В соответствии с описанием Hamilton с соавт.(2002), получалась конструкция НсРrо (35НсРrо). Для подтверждения чистоты конструкций определялась последовательность всех клонов. Плазмиды использовались для трансформации Agrobacterium tumefaciens (AGL1; АТСС, Манассас, Вирджиния 20108, США) с помощью электропортации (Mattanovich с соавт., 1989). Чистота всех штаммов А. tumefaciens подтверждалась рестрикционным картированием.

4. Приготовление биомассы, заражение, агроинфильтрация и сбор

Растения Nicotiana benthamiana выращивались из семян в неглубоких емкостях, заполненных торфяным мохом. Растения выращивались в теплице при световом периоде 16/8 и следующем температурном режиме: днем 25°С/ночью 20°С. Через три недели после посева семян ростки извлекались изо мха, переносились в горшки и выращивались в теплице еще в течение трех недель при таких же условиях окружающей среды. Перед трансформацией в различные моменты времени удалялись верхушечные и осевые почки путем отщипывания почек от растения или путем химической обработки растений. Агорабактерии, трансфицированные плазмидами 660 и 680, выращивались на дрожжевом экстракте с добавлением 10 ммоль/л 2-[N-морфолино]этансульфоновой кислоты (МЭС), 20 мкмоль/л ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл карбенициллина (рН 5,6) до достижения OD600 (оптической плотности при 600 нм) между 0,6 и 1,6. Суспензии агробактерий перед применением центрифугировались и ресуспендировались в инфильтрационной среде (10 ммоль/л MgCl₂ и 10 ммоль/л МЭС, рН 5,6). Затем, согласно описанию Liu and Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348), проводилась шприцевая инфильтрация. Для вакуум-инфильтрации суспензии A. tumefaciens центрифугировались, ресуспендировались в инфильтрационной среде; полученная среда хранилась при 4°С в течение ночи. В день инфильтрации партии культур разбавлялись в 2,5 раза и согревались перед использованием. Цельные растения Nicotiana benthamiana помещались сверху донизу в бактериальную суспензию в герметичном контейнере из нержавеющей стали под вакуумом 20-40 Торр и выдерживались в течение 2-х минут. После шприцевой или вакуум-инфильтрации растения снова помещались в теплицу и инкубировались еще 4-5 дней, а затем собирались.

5. Сбор листьев и общая экстракция белка

После инкубации надземные части растений собирались, замораживались при -80°С и измельчались на кусочки. Общая фракция растворимых белков экстрагировалась путем гомогенизации (Polytron) каждого образца замороженного и измельченного растительного материала в 3-х объемах холодного трис-буфера (50 ммоль/л, рН 7,4, 0,15 моль/л NaCl и 1 ммоль/л фенилметансульфонилфторида). После гомогенизации суспензия центрифугировалась при 20000 g в течение 20-и минут при 4°С; осветленный неочищенный экстракт (супернатант) сохранялся для анализа. Общее содержание белка в осветленном неочищенном экстракте определялось с помощью анализа Bradford assay (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния) с помощью альбумина бычьей сыворотки в качестве стандартного образца.

6. Анализ белка и иммуноблоттинг

Концентрация белка определялась с помощью белкового анализа с бицинхониновой кислотой (Pierce Biochemicals, Рокпорт, Иллинойс). Белки разделялись с помощью SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) в восстанавливающих условиях и окрашивались кумасси голубым. Окрашенные гелевые пластины сканировались, проводился денситометрический анализ, для чего использовалось программное обеспечение ImageJ (NIH - Национальные институты здравоохранения).

Белки из фракции элюирования из эксклюзионного хроматографа осаждались ацетоном (Bollag с соавт., 1996), ресуспендировались в 1/5 объема в уравновешивающем/элюирующем буфере и разделялись с помощью SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) в восстанавливающих условиях и переносились на пластины с поливинилдифторидом (ПВДФ) (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, Индиана) для иммунодетекции. Перед проведением иммуноблоттинга пластины блокировались 5% снятым молоком и 0,1% Твин-20 в солевом растворе с трис-буфером в течение 16-18 часов при 4°С.Иммуноблотинг проводился путем инкубации со следующими антителами: для определения HI использовались мышиные моноклональные антитела против вируса гриппа A (Fitzgerald Industries International, Конкорд, Массачуссетс, США, номер по каталогу 10-150) (2 мкг/мл в 2% снятом молоке и солевом растворе твин-20 с добавлением трис-буфера (0,1%), а для определения Н5 - кроличьи антитела против Н5 (Вьетнам) (Immune Technology, Вудсайд, Нью-Йорк, США, номер по каталогу IT-003-005V), разбавленные 1/4000 в 2% снятом молоке и солевом растворе твин-20 с добавлением трис-буфера (0,1%). В качестве вторичных антител использовались козьи антимышиные антитела IgG (H+L), конъюгированные с пероксидазой (Jackson Immunoresearch Laboratories, Вест Грув, Пенсильвания, США, номер по каталогу 115-035-146) (разбавленные 1/12000 в 2% снятом молоке и солевом растворе твин-20 с добавлением трис-буфера (0,1%)). Иммунореактивные комплексы определялись с помощью хемилюминесценции с использованием люминола в качестве субстрата (Roche Diagnostics Corporation). Конъюгация человеческих антител IgG с ферментом с пероксидазой хрена проводилось с помощью набора конъюгации активированной пероксидазы EZ-Link Plus® (Pierce, Рокфолд, Иллинойс).

Анализ гемагглютинации на Н5 основывался на методе, описанном Nayak and Reichl (2004). Опишем вкратце его содержание. На микротитровальных пластинах с 96-ью лунками с V-образным дном готовились серийные двойные разведения исследуемого образца (100 мкл). Лунки содержали 100 мкл ФСБ, в каждую лунку вносилось по 100 мкл разведенного образца. В каждую лунку добавлялось 100 мкл 0,25% суспензии лошадиных эритроцитов (Bio Link Inc., Сиракузы, Нью-Йорк), и пластины инкубировались в течение 2 ч при комнатной температуре. Величина, обратная наибольшему разведению, которое давало полную агглютинацию, регистрировалась как активность НА. Параллельно в ФСБ разводился стандарт рекомбинатного Н5 (А/Вьетнам/1203/2004 H5N1); эти разведения исследовались на каждой пластине и использовались в качестве контроля.

7. Очистка ВПЧ Н5

Замороженные листья N. benthamiana, инфильтрированные 660 или 680, гомогенизировались в 1,5 объемах трис-буфера (50 ммоль/л, рН 8, 50 ммоль/л NaCl и 0,04 мета-бисульфида натрия) с помощью промышленного блендера. Получившийся экстракт дополнятся 1 ммоль/л фенилметансульфонилфторида, его рН доводился до 6 с помощью - молярной уксусной кислоты; затем экстракт нагревался до 42°С в течение 5-и минут. К экстракту добавлялась диатомовая земля, чтобы адсорбировать загрязняющие примеси, которые выпали в осадок после изменения рН и тепловой обработки. Суспензия отфильтровывалась через фильтр с ватманской бумагой. Полученный в результате осветленный экстракт центрифугировался при 10000 г в течение 10-и минут при комнатной температуре, чтобы удалить остатки диатомовой земли, пропускался через фильтры 0,8/0,2 мкм Acropack и загружался в аффинную колонку с фетуин-агарозой (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). После этапа промывания в NaCI (400 ммоль/л) с трис-буфером (25 ммоль/л) (рН 6) связанные белки элюировались раствором NaCl (1,5 моль/л), МЭС (50 мкмоль/л) (рН 6). К элюированным ВПЧ добавлялся твин-80 до конечной концентрации 0,0005% (по объему). ВПЧ концентрировались на фильтре MWCO Amicon (100 кДа), центрифугировались при 10000 g в течение 30-и минут при 4°С и ресуспендировались в ФСБ (рН 7,4) с 0,01% твин-80 и 0,01% тримеросала. Суспендированные ВПЧ перед использованием подергались стерилизации фильтрованием.

8. Исследования на животных

Изучение иммунного ответа на ВПЧ гриппа проводилось на самках крыс Уистара [Wistar] в возрасте 6-8 недель (Charles River Laboratories). Тринадцать крыс рандомизировались в три группы (три крысы в группу контроля и по 5 животных в группу вакцины на основе ВПЧ Н5 дикого типа растительного происхождения (660) и в группу мутантной вакцины (680). Для внутримышечной иммунизации использовалось 8 групп, для исследования интраназального пути введения использовалось 6 групп. Все группы иммунизировались двумя дозами вакцины; ревакцинация проводилась через 14 дней после первой иммунизации.

Внутримышечное введение выполнялось в заднюю конечность без анестезии. Крысы иммунизировались вакциной на основе ВПЧ Н5 растительного происхождения (15 мкг), вакциной на основе ВПЧ из мутантной формы Н5 растительного происхождения или ФСБ.

Все антигенные препараты смешивались с альгидрогелем до конечной концентрации 1% (квасцы; Accurate Chemical and Scientific Corporation, Уэсбери, Нью-Йорк, США) в соотношении 1:1 по объему перед иммунизацией.)

Забор крови и забор селезенки

Через 14 дней после первой иммунизации и через 14 дней после второй иммунизации под анестезией проводился забор крови из яремной вены. Сыворотка получалась путем центрифугирования при 8000 в течение 10-и минут.

Через три недели после второй иммунизации крысы анестезировались углекислым газом и убивались; забор крови осуществлялся путем пункции сердца сразу же после смерти. Производился забор селезенки. Забранные селезенки помещались в RPMI с добавлением гентамицина и раздавливались в конической пробирке на 50 мл с помощью поршня от шприца на 10 мл. Раздавленная масса дважды промывалась и центрифугировалась при 2000 об/мин в течение 5-ти минут, а затем ресуспендировалась в АСК лизирующем буфере в течение 5-и минут при комнатной температуре. Спленоциты промывались ФСБ-гентамицином, ресуспендировались в 5% среде RPMI и подсчитывались. Спленоциты использовались для пролиферативного анализа.

Титры антител:

А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1); А/Аньхой/1/05 (H5N1); А/Турция/1/05 (H5N1); А/Новая Каледония/20/99 (H1N2)

Титры антител против вируса гриппа в сыворотке измерялись через 14 дней после первой иммунизации, а также через 21 день после второй иммунизации (после убивания крысы). Титры определялись с помощью фермент-связанного иммуносорбентного анализа (EL1SA) с использованием инактивированного вируса гриппа А/Индонезия/5/05 в качестве покрывающего антигена. Определялось значение, обратное максимальному разведению, при котором значение OD было как минимум на 0,1 выше, чем для образца отрицательного контроля.

При определении классов антител (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM) оценивались их титры в образцах, забранных после смерти животных с помощью метода ELISA, как описано выше.

Титры антител, ингибирующих гемагглютинацию (HI)

Титры сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию (HI), определялись на 14-й и 35-й дни, как описано ранее (WHO 2002; Kendal 1982). Для исследования образов сыворотки крыс на активность HI использовались инактивированные вирусные препараты штаммов А/Индонезия/5/05 (H5N1); А/Турция/1/05 (H5N1) и А/Вьетнам/1203/2004. Сыворотка предварительно обрабатывалась рецептор-разрушающим ферментом II (RDE II) (Denka Seiken Co., Токио, Япония), приготовленным из Vibrio cholerae (Kendal 1982). Анализы на HI проводились с помощью 0,5% суспензии эритроцитов лошади. Титры антител, ингибирующих гемагглютинацию, определялись как величина, обратная наибольшему разведению, при котором наблюдалось полное подавление гем агглютинации.

Результаты

Реактивность сывороток крыс, иммунизированных ВПЧ дикого типа или мутантной ВПЧ, оценивалась через 14 дней после первой (14-й день) и второй иммунизации (35-й дней). Все крысы иммунизировались 15 мкг антигена в виде раствора в квасцах. Оценивалась иммунореактивность против вирусов H5N1 клада 1 (А/Вьетнам/1203/04), клада 2.1 (А/Индонезия/5/05), клада 2.2 (А/Турция/1/05) и клада 2.3 (А/Аньхой/1/05). После введения первой дозы мутантные ВПЧ вызывали более выраженную реакцию со стороны антител, чем ВПЧ дикого типа всех исследованных штаммов H5N1 (Фигура 6). Иммунореактивность против птичьего штамма А/Турция/1/05 была статистически значимой после введения первой дозы (р<0,05). Также определялась иммунореактивность против вирусов гриппа H1N1 (А/Новая Каледония/20/99); иммунореактивность проявлялась после ревакцинации. СГТ: среднегеометрический титр. Представленные значения - это СГТ (ln) величин, обратных конечным титрам для пяти крыс в группе. В скобках указаны средние отклонения. *р<0,05 по сравнению с ВПЧ дикого типа. Титры НI-антител у крыс, иммунизированных ВПЧ дикого типа или мутантной ВПЧ, оценивалась через 14 дней после первой иммунизации (14-й день) и после второй иммунизации (35-й день). Ответ со стороны антител, ингибирующих гемагглютинацию, определялся с помощью инактивированных цельных вирусов H5N1. После введения первой дозы мутантные ВПЧ вызывали более выраженную реакцию со стороны антител, ингибирующих гемагглютинацию, чем ВПЧ дикого типа против всех исследованных штаммов H5N1 (Фигура 7). Статистическая значимость достигалась для вируса гриппа штаммов А/Индонезия/5/05 и А/Турция 1/05. СГТ: среднегеометрический титр. Представленные значения - это СГТ (In) величин, обратных конечным титрам для пяти крыс в группе. В скобках указаны средние отклонения. *р<0,05 по сравнению с ВПЧ дикого типа.

Эти данные указывают на то, что «мутированный» негликозилированный белок Н5 представляет собой весьма интересную альтернативу нативному белку Н5 в отношении производства ВПЧ, которые можно использовать для получения быстродействующей вакцины против гриппа широкого спектра. Все цитаты включены в настоящий документ посредством ссылок.

В настоящем изобретении описано один или несколько частных вариантов его осуществления. Тем не менее, специалистам понятно, что в рамках данного изобретения возможны различные изменения и модификации, и что они не выходят за объем, определенный формулой изобретения.

Литература

- Abe Y. el al. Journal of virology. (2004) 78: 9605-9611.

- Bollag, D.M., Rozycki, M.D., and Edelstein, S.J. (1996) Protein methods (2nd edition). Wiley-Liss, New York, USA.

- Bligh, E.G., & Dyer, W.J. Can. J. Med. Sci. 37, 911-917 (1959).

- Bright et al. Virology. (2003) 308; 270-278.

- Chen, B.J., Leser, G.P., Morita, E., and Lamb R.A. (2007) Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles. J. Virol. 81, 7111-7123.

- Crawford, J., Wilkison, В., Vosnesensky. A., Smith, G., Garcia, M., Stone, H., and Perdue, M.L. (1999). Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes. Vaccine 17,2265-2274.

- Darveau, A., Pelletier, A. & Perreault, J. PCR-mediated synthesis of chimeric molecules. Methods Neurosc. 26, 77-85 (1995).

- Grgacic EVL, Anderson DA. Virus-like particles: passport to immune recognition. Methods 2006; 40: 60-65.

- Gillim-Ross, L., and Subbarao, K. (2006) Emerging respiratory viruses: challenges and vaccine strategics. Clin. Mocrobiol. Rev. 19, 614-636.

- Gomez-Puertas, P., Mena, I., Castillo, M., Vivo, A., Perez-Pastrana, E. and Portela, A. (1999) Efficient formation of influenza virus-like particles: dependence on the expression level of viral proteins. J. Gen. Virol. 80, 1635-1645.

- Gomez-Puertas, P., Albo, C., Perez-Pastrana, E., Vivo, A., and Portels, A (2000) Influenza Virus protein is the major driving force in virus budding. J Virol. 74, 11538-11547.

- Hamilton, A., Voinnet, O., Chappell, L. & Baulcombe, D. Two classes of short interfering RNA in RNA silencing, EMBO J. 21, 4671-4679 (2002).

- Hofgen, R & Willmitzer, L. Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic Acid Res. 16, 9877 91988).

- Harbury PB, Zhang Т, Kim PS, Alber T. (1993) A switch between two-, three-, and four-standed coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science; 262: 1401-1407)

- Horimoto Т., Kawaoka Y. Strategies for developing vaccines against h5Н1 influenza a viruses. Trends in Mol. Med. 2006; 12(11):506-514.

- Huang Z, Elkin G, Maloney BJ, Beuhner N, Arntzen CJ, Thanavala Y, Mason HS, Virus-like particle expression and assembly in plants: hepatitis В and Norwalk viruses.

- Vaccine. 2005 Mar 7; 23 (15): 1851-8.

- Johansson, B.E. (1999). Immunization with influenza A virus hemogglutinin and neuraminidase produced in recombinant baculovirus results in a balanced and broadened immune response superior to conventional vaccine. Vaccine 17, 2073-2080.

- Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M, & Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 122, 101-108 (1997),

- Kuroda et al. (1990) Virology. 174: 418-429.

- Latham, t., and Galarza, J.M. (2001). Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. J. Virol. 75, 6254-6165.

- Lefebvre, B. et al. Plant Physiol. 144, 403-418 (2007).

- Liu, L & Lomonossoff, G.P. Agroinfection as a rapid method for propagating Gowpea mosaic virus-based constructs. J. Virol. Methods 105, 343-348 (2002).

- Macala, L.J., Yo, R.K. & Ando, S. J Lipid Res. 24, 1243-1250 (1983).

- Mattanovich, D., Ruker, F., da Camara Machado, A., Laimer, M., Regner, F., Steinkellner, H., Himmler, G., and Katinger, H. (1989) Efficient transformation of Agrobacterium spp.By electroporation. Nucl. Ac. Res. 17, 6747.

- Mena, I., Vivo, A., Perez, E., and Portela, A. (1996) Rescue of synthetic chloramphenicol acetyltransferase RNA into influenza virus-like particles obtained from recombinant plasmids. J. Virol. 70, 5016-5024.

- Mongrand S, Morel J, Laroche J, Claverol S, Carde JP, Hartmann MA et al.. Lipid rafts in higher plant cells. The Journal of Biological Chemistry 2004; 279(35): 36277-36286.

- Neumann, G., Watanabe, Т., and Kawaoka, Y. (2000) Plasmid-driven formation of virus-like particles. J Virol. 74, 547-551.

- Nayak DP, Reichl U. (2004) Neuraminidase activity assays for monitoring MDCK cell culture derived influenza virus. J Virol Methods 122(1):9-15.

- Olsen, C.W., McGregor, M.W., Dybkahl-Sissoko, N., Schram, B.R., Nelson, K, M., Lunn, D., Macklin, M.D., and Swain, W.F. (1997). Immunogenicity and efficacy of baculovirus-expressed and DNA-based equine influenza virus hemagglutinin vaccines in mice. Vaccine 15, 1149-1156.

- Quan FS, Huang C, Compans RW, Kang SM. Virus-like particle vaccine induces protective immunity against homologous and heterologous stains of influenza virus. Journal of Virology 2007; 81(7); 3514-3524.

- Saint-Jore-Dupas С, Faye L, Gomord V. (2007) From plants to pharma with glycosylation in the toolbox. Trends in biotech, 25(7) 317-323.

- Sambrook J, and Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

- Suzuki, Y, (2005) Sialobiology of influenza. Molecular mechanism of host range variation of influenza viruses. Boil. Pharm. Bull 28, 399-408.

- Tsuji M., Cell. Mol. Life Sci., 63 (2006); 1889-1898.

- Vigerust DJ el al. Journal of virology. (2007) 81: 8593-8600.

- Wakefield L., G.G. Brownlee Nuc Acid Res. 17 (19890); 8569-8580.

- Kendal, АР, Pereira MS, Skehel J. Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: CDC; 1982. p.B17-B35.

- WHO. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. Department of communicable disease surveillance and response. World Health Organization Global Influenza Program. 2002.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен способ получения вирусоподобных частиц вируса гриппа (ВПЧ) в растении или его части. Способ включает экспрессию нового белка НА вируса гриппа в растениях и его очистку. Изобретение также направлено на ВПЧ, включающие белок НА вируса гриппа и растительные липиды. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей усовершенствованный НА вирус гриппа, а также к векторам. Такие ВПЧ могут быть использованы при разработке вакцин против гриппа или для обогащения уже существующих вакцин. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 6 н. и 12 з.п. Ф-лы, 44 ил., 1 пр.

1. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую гемагглютинин (HA) вируса гриппа, включающий домен HA1, который модифицирован заменой, чтобы быть свободным от N-связанных сайтов гликозилирования в положении 154, 165 и 286, где нумерация соответствует последовательности штамма A/Вьетнам/1194/04, и где нуклеотидная последовательность оперативно связана с регуляторной областью, обладающей активностью в растении.

2. Нуклеиновая кислота по п. 1, где регуляторная область выбрана из следующих групп: регуляторная область пластоцианина; промотор напина; промотор круциферина; регуляторная область, полученная из рибулоза-1,5-бифосфат-карбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO), a/b-связывающий хлорофилл белок, ST-LS, промотор полигедрона и промотор gp64.

3. Нуклеиновая кислота по п. 1, где последовательность нуклеотидов соответствует последовательности SEQ ID NO. 17, последовательность нуклеотидов кодирует HA, где остатки, кодирующие аминокислоты в положении 154, 165 и 286, модифицированы, чтобы кодировать не аспарагин.

4. Нуклеиновая кислота по п. 1, где последовательность нуклеотидов соответствует последовательности SEQ ID NO. 17, последовательность нуклеотидов кодирует HA, где остатки, кодирующие аминокислоты, в положении: 156, 167 и 288, модифицированы чтобы кодировать не серии и не треонин или аланин.

5. Нуклеиновая кислота по п. 1, в которой последовательность нуклеотидов соответствует последовательности SEQ ID NO. 29.

6. Нуклеиновая кислота по п. 1, где последовательность нуклеотидов, кодирующая гемагглютинин (HA) вируса гриппа, включает последовательность SEQ ID NO. 34 и где аминокислоты в положениях 154, 165 и 286 заменены не аспарагином.

7. Нуклеиновая кислота по п. 1, где последовательность нуклеотидов, кодирующая гемагглютинин (HA) вируса гриппа, включает последовательность SEQ ID NO. 34 и где аминокислоты в положениях 156, 167 и 288 заменены не серином и треонином или аланином.

8. Способ получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) гриппа в растении, его части или клетке растения, включающий:
а) введение нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7 в растение, его часть или клетку растения, и
б) инкубацию растения, его части или клетки растения в условиях, которые позволяют реализоваться экспрессии нуклеиновой кислоты, следовательно, образованию ВПЧ,
при этом нуклеиновая кислота может экспрессироваться в растении, его части или клетке растения временно или постоянно.

9. Вирусоподобная частица (ВПЧ), полученная в растении для индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающая молекулу гемагглютинина гриппа, кодируемую последовательностью нуклеотидов, определенной в п. 1.

10. Вирусоподобная частица по п. 9, в которой указанный сайт гликозилирования состоит из триады распознавания гликозилирования N-X-S/T, где N - это аспарагин, X - это любая аминокислота, за исключением пролина, S - это серин, а T - это треонин, или аспарагиновый остаток замещен неаспарагиновой аминокислотой или треониновый остаток, входящий в триаду распознавания гликозилирования N-X-S/T, замещен несериновой и нетреониновой аминокислотой, или их комбинация.

11. Вирусоподобная частица по пп. 9-10, в которой вирус гриппа представлен вирусом гриппа A и вирусом гриппа B или HA представлен одним или несколькими подтипами вируса гриппа A, выбранными из группы, состоящей из: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16.

12. Вирусоподобная частица по любому из пп. 9-11 для применения в качестве вакцины для лечения или предотвращения вирусной инфекции у субъекта.

13. Вирусоподобная частица (ВПЧ), полученная в растении для индуцирования иммунного ответа у субъекта, причем ВПЧ получена способом по п. 8.

14. Вирусоподобная частица по п. 13, в которой указанный сайт гликозилирования состоит из триады распознавания гликозилирования N-X-S/T, где N - это аспарагин, X - это любая аминокислота, за исключением пролина, S - это серин, а T - это треонин, или аспарагиновый остаток замещен неаспарагиновой аминокислотой или треониновый остаток, входящий в триаду распознавания гликозилирования N-X-S/T, замещен несериновой и нетреониновой аминокислотой, или их комбинация.

15. Вирусоподобная частица по пп. 13-14, в которой вирус гриппа представлен вирусом гриппа A и вирусом гриппа B или HA представлен одним или несколькими подтипами вируса гриппа A, выбранными из группы, состоящей из: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16.

16. Вирусоподобная частица по любому из пп. 12-15 для применения в качестве вакцины для лечения или предотвращения вирусной инфекции у субъекта.

17. Композиция, включающая эффективное количество ВПЧ по любому из пп. 9-16, и фармацевтически приемлемый носитель, где композиция предназначена для индуцирования иммунного ответа у субъекта.

18. Растение или часть растения, временно или постоянно трансформированные нуклеиновой кислотой по любому из пп. 1-7, где растение производит вирусоподобные частицы (ВПЧ) гриппа.