СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ VIBRIO CHOLERAE О1/О139 ПО ЭКСПРЕССИИ РИБУЛОЗОДИФОСФАТКАРБОКСИЛАЗЫ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/569 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для определения или подтверждения жизнеспособности некультивируемых форм (НФ) V. cholerae O1/O139 в водных объектах при проведении санитарных мероприятий или в научно-исследовательской работе.

Уровень техники

V. cholerae O1/O139 - возбудитель холеры - особо опасного инфекционного заболевания с диарейным синдромом. В окружающей среде и в экспериментальных условиях холерный вибрион может переходит в некультивируемое состояние (НС), которое характеризуется обратимой утратой способности расти на рутинных питательных средах. Образование некультивируемых форм (НФ) V. cholerae существенно затрудняет выявление возбудителя в различных объектах окружающей среды при проведении мониторинговых мероприятий и в исследовательской практике.

Отсутствие роста НФ на лабораторных питательных средах требует развития методов, исключающих необходимость визуализации выросших колоний. К таким методам относятся световая и люминесцентная микроскопия, иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако с помощью перечисленных методов не представляется возможным доказать жизнеспособность обнаруженных микробных клеток, а интактность клетки или амплификация специфической ДНК не эквивалентны жизнеспособности культуры.

Известен способ определения жизнеспособности микробных клеток, получивший название «прямого прижизненного подсчета» (DVD-метод от direct viable counts): тестируемую микробную культуру инкубируют с дрожжевым экстрактом в присутствии налидиксовой кислоты, которая подавляет репликацию бактериальной ДНК, блокируя тем самым деление клетки. Жизнеспособные клетки увеличиваются в размере, а визуализация результата ведется с помощью светового микроскопа. Применение данного способа ограничено тем, что из окружающей среды все чаще выделяют культуры V. cholerae O1/O139, устойчивую к налидиксовой кислоте (Mishra A. et al., 2011).

Известен способ определения жизнеспособности микробных клеток витальным окрашиванием акридиновым оранжевым (АО): микробную взвесь инкубируют 1-2 мин с АО в конечной концентрации 0,01% и визуализируют результат с помощью люминесцентного микроскопа. Жизнеспособные клетки флуоресцируют зеленым, а мертвые оранжевым (Hobbie J.E., et al., 1977). Ограничением способа является возможность изменения флуоресценции в зависимости от физиологического состояния культуры, концентрации красителя, времени экспозиции (Иванов В.Б., 1982).

Учитывая вышеизложенное, для выявления НФ и определения их жизнеспособности чаще всего используют комбинацию микроскопически, молекулярно-генетических, иммуноферментных методов (Luo Z.J. c соавт., 2012, Mishra A. et. al., 2012).

Соответственно, проблема разработки новых способов определения жизнеспособности НФ, которые можно использовать самостоятельно или в комбинации с микроскопическими и/или молекулярно-генетическими методиками, является актуальной.

Одним из перспективных инструментов определения жизнеспособности является регистрация метаболической активности с помощью радиоизотопных методов исследования, которые обладают очень высокой чувствительностью. Показано, что в НС у V. cholerae наблюдается существенная перестройка метаболизма по сапрофитическому типу, поэтому наиболее перспективной мишенью для разработки способа определения жизнеспособности является фермент рибулозодифосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РДФК), 3-фосфо-D-глицерат-карбоксилаза, код 4.1.1.39.

За прототип выбран способ определения активности РДФК в инактивных и некультивируемых клетках холерных вибрионов (Бурша с соавт., 1999 г. Соколенко с соавт. 2002). Данный способ не может быть использован для определения жизнеспособности НФ, так как он применяется для исследования метаболических путей вибрионов, но не учитывает изменение активности фермента в процессе некультивируемой трансформации, изменение концентрации белка при переходе в НС, не использует дополнительные способы контроля жизнеспособности.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка способа определения жизнеспособности НФ по активности РДФК с использованием меченого бикарбоната.

Поставленная цель достигается тем, что проводят предварительную подготовку исследуемой микробной взвеси и контрольных штаммов V. cholerae O1 и V. cholerae O139, затем определяют концентрацию белка в пробах под контролем витального окрашивания с АО и определяют активность РДФК с помощью меченого бикарбоната.

Способ осуществляется в соответствии со следующими стадиями:

1. Подготовка микробных взвесей.

2. Определение белка по Лоури и люминесцентная микроскопия препаратов «раздавленная капля», окрашенных АО.

3. Определение жизнеспособности НФ по экспрессии РДФК.

На первой стадии контрольные штаммы в вегетативной форме выращивали 18 часов на агаре Маретна, рН 7,6-7,8, смывали 0,85% раствором натрия хлорида, рН 7,4, дважды отмывали центрифугированием в 50 мМ трис-804 буфере, рН 8,0. В этом же буфере концентрацию клеток доводили до 5×10¹⁰ кл/мл и разрушали их в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 10 мин на холоду. Аналогичным образом готовили переходные и некультивируемые пробы, для чего 50 мл бактериальной взвеси из флаконов центрифугировали для осаждения клеток при 10000 об/мин 10 мин, 2 мл осадка ресуспендировали в 50 мМ трис-804 буфера, еще раз центрифугировали. Полученную микробную взвесь некультивируемых клеток обрабатывали так же, как вегетативные пробы.

НФ и переходные формы получали следующим образом. Культуру V. cholerae O1/O139 выращивали в течение трех часов на 0,3% бульоне Мартена, рН 7,6, пересевали газоном на агар Мартена, рН 7,8, инкубировали 18 часов при 37°С. Микробную массу смывали с поверхности агара средой суспендирования (речная, морская или дистиллированная вода, 0,85% р-р NaCl). Полученные таким образом микробные взвеси вносили в стеклянные флаконы емкостью 100 мл в объеме 50-70 мл и в конечной концентрации 10⁶-10⁹ мк.кл/мл в зависимости от целей эксперимента. Флаконы хранили в холодильнике при температуре 6-8°С без дополнительной аэрации и без освещения. О переходе в НС судили по отсутствию роста на агаре Мартена и наличию в мазках, окрашенных АО, подвижных или неподвижных флуоресцирующих зеленым клеток. Переходными считались культуры, в которых единичные клетки сохраняли способность расти на агаре Мартена в виде изолированных колоний, при окрашивании АО в препарате «раздавленная капля» количество клеток было близко исходному уровню.

На второй стадии во всех исследуемых образцах определяли активность белка по Лоури, для чего отбирали 500 мкл подготовленной пробы, исследовали, как описано у Lowry et al., 1951, результаты учитывали на фотоколориметре KF-77 при длине волны 560 нм. Параллельно из всех исследуемых проб готовили препарат «раздавленная капля», витально окрашенный АО. Для этого на предметное стекло наносили каплю исследуемой микробной взвеси, добавляли АО в конечной концентрации 0,01% (рабочий раствор АО Sigma; разведение 1:6000 в дистиллированной воде), инкубировали 3-4 мин при комнатной температуре и изучали в люминесцентный микроскоп с иммерсионным объективом, увеличение ×1250, длина волны 420 нм. Наличие в поле зрения подвижных и/или неподвижных клеток типичной или измененной морфологии, флюоресцирующих зеленым, указывало на жизнеспособность культуры.

На третьей стадии реакционная смесь содержала: 18 mM трис-Cl буфер, рН 8,0, 20 mM MgCl₂×6H₂O; 10 mM дитиотреитола, 4 mM рибозо-5-фосфата и 500 мкл суспензии гомогенизированных клеток. Пробы инкубировали при 30°С 30 минут с целью ферментативного превращения рибозо-5-фосфата в рибулозо-5-фосфат. Затем в реакционную смесь добавляли 0,026 mM NaH¹⁴CO₃, 6 mM АТФ; 0,6 mM NAD-H и инкубировали 5 минут. Останавливали реакцию 0,02 мл 100% ТХУ. Смесь центрифугировали при 8000 об/мин, 200 мкл полученного супернатанта переносили во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8. Подсчет активности вели в сцинтилляционном счетчике Mark-11. Параллельно контролировали радиационный фон. Активность фермента выражали в импульсах в минуту на мкг/белка (имп.мин/мкг белка).

Осуществление изобретения

Пример 1.

В качестве исследуемых культур использовали контрольные штаммы V. cholerae O1 17551 и V. cholerae O139 17673 в вегетативной форме, переходные и НФ разного возраста этих же культур, полученные во флаконах с морской водой. На первой стадии проводили предварительную подготовку культур: концентрировали центрифугированием, отмывали 50 мМ трис-SO₄ буфере, рН 8,0, гомогенизировали на холоду. На второй стадии определяли в исследуемых пробах концентрацию белка по Лоури и готовили препараты «раздавленная капля» с АО, которые микроскопировали с помощью люминесцентного микроскопа. На третьей стадии в подготовленных пробах определяли активность РДФК.

Из Таблицы 1 видно, что во всех пробах, как вегетативных, так и переходных и некультивируемых, при микроскопировании с флуорохромом фиксировали жизнеспособность культуры. Концентрация белка после небольшого увеличения в переходных популяциях снизилась в НФ, что необходимо учитывать при определении активности исследуемого фермента. Активность РДФК в вегетативных культурах была на уровне фона, что говорит об отсутствии его экспрессии. В переходных пробах обнаружена экспрессия РДФК, радиоактивность образцов превысила значения фона в 1,86-3,17 раз. В НФ активность фермента возросла еще больше, превысив фон в 2,9-3,44 раза. Таким образом, определение активности РДФК позволяет не только подтвердить жизнеспособность НФ, которые не растут на агаре Мартена, но и дифференцировать вегетативные культуры холерных вибрионов от переходных (старвирующих), что должно учитываться при проведении мониторинговых мероприятий.

Таблица 1 Активности РДФК в культурах V. cholerae O1/O139 в вегетативных, переходных и НФ, полученные в микрокосмах с морской водой Штамм Форма Концентрация белка мкг/мл Жизнеспособные клетки в мазках с АО Активность РДФК, имп.мин/мкг белка Контроль (фон)       4,660 V. cholerae O1 17551 вегетативная 80 + 4,688 V.cholerae O139 17673 вегетативная 70 + 4,285 V. cholerae O1 17551 переходная, 20 сут 95 + 10,063

V. cholerae O1 17551 переходная, 45 сут 70 + 14,828 V. cholerae O139 17673 переходная, 45 сут 80 + 7,980 V. cholerae O1 17551 НФ, 30 сут 55 + 16,112 V. cholerae O139 17673 НФ, 30 суток 65 + 12,442

Пример 2.

В качестве исследуемых использовали культуры контрольных штаммов V. cholerae O1 17551 и V. cholerae O139 17673 в вегетативной форме и их некультивируемые варианты возраста 7, 30 и 60 суток, полученные в микрокосмах с различными органическими добавками, которые встречаются в поверхностных водоемах.

Таблица 2 Активность РДФК V. cholerae O1/O139 в НФ разного возраста, полученных в микрокосмах разного состава Штамм Среда Форма/возраст Конц-ия белка
мкг/мл Жизнеспособные кл. в мазках с АО Акт-ть РДФК Имп/мкг. белка Контроль         2,000 V. cholerae O139 17673 физ. р-р вегетативная 70 + 2,311 V. cholerae O1 17551 физ. р-р вегетативная 70 + 1,833 V. cholerae O139 17673 Дис. вода НФ, 7 сут 85 + 4,073 V. cholerae O1 17551 Дист. вода НФ, 7 сут 100 + 4,118 V. cholerae O139 17673 Дист. вода НФ, 30 сут 20 + 22,418 V. cholerae O1 17551 Дист. вода НФ, 30 сут 20 + 30,685 V. cholerae O139 17673 Дист. вода НФ, 60 сут <20 + 3,634 V. cholerae O1 17551 Дист. вода НФ, 60 сут <20 + 7,716 V. cholerae O139 17673 NH₄Cl НФ, 7 сут 90 + 4,073 V. cholerae O1 17551 NH₄Cl НФ, 7 сут 57 + 4,505

V. cholerae O139 17673 KNO₃ НФ, 30 сут 35 + 13,531 V. cholerae O139 17673 Янт. к-та НФ, 30 сут <20 + 37,333 V. cholerae O1 17551 Янт. к-та НФ, 60 сут 20 + 12,075 V. cholerae O139 17673 Янт. к-та НФ, 60 сут <20 + 11,201 V. cholerae O139 17673 Каталаза НФ, 30 сут 30 + 13,531 V. cholerae O1 17551 Каталаза НФ, 30 сут 30 + 27,930 V. cholerae O139 17673 Каталаза НФ, 60 сут 20 + 8,606 V. cholerae O1 17551 Каталаза НФ, 60 сут 25 + 3,969

На этапе индукции НС в микрокосмы добавляли по одному из следующих компонентов: 1 или 10 мМ NH₄Cl и 1 или 10 мМ KNO₃, витамин Е 1 или 10 мМ, 1 или 10 мМ янтарной кислоты. Для определения жизнеспособности вегетативные и НФ проводили согласно трем стадиям, описанным выше.

Из таблицы 2 видно, что в вегетативных культурах активность РДФК отсутствует. Витальное окрашивание АО показало, что все НФ, взятые в эксперимент, независимо от возраста и среды суспендирования, жизнеспособны. Концентрация белка после небольшого увеличения в 7-суточных НФ, снижалась в более старых культурах, достигая к 60-суткам порога чувствительности метода. Активность РДФК обнаружена как в самых молодых НФ (7-суточных), так и в 60-суточных. Максимальная экспрессия фермента зафиксирована в 30-суточных некультивируемых популяциях. В среднем радиоактивность образцов в 7-суточных НФ превышала уровень фона в 4,19 раз, в 30-суточных - в 26, 38 раз, в 60-суточных - в 7,87 раз.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что определение активности фермента РДФК в некультивируемых популяциях позволяет выявить жизнеспособные культуры, не зависимо от состава среды инкубирования и возраста НФ с учетом депротеинизации культуры.

Использование предлагаемого изобретения позволяет с высокой степенью чувствительности (≥20 мкг белка/мл) с помощью меченого бикарбоната определить жизнеспособность некультивируемых холерных вибрионов в водной среде разного состава, преодолевая тем самым главную проблему работы с НФ - отсутствие роста на плотных питательных средах. Обнаружение активности РДФК в некультивируемых или переходных пробах - показатель жизнеспособности возбудителя, трансформации его ферментативного профиля, свидетельство возможности переживания неблагоприятных условий в НС в окружающей среде, что должно учитываться при проведении мониторинговых мероприятий.

Кроме того, способ может использоваться в научно-исследовательской работе с НФ как высокочувствительный инструмент определения жизнеспособности полученных культур в условиях индукции НС, изучения устойчивости НФ к различным воздействиям (антибиотикам, дезинфицирующим средствам, физическим воздействиям и т.д.) или как подтверждающий жизнеспособность тест при проведении витальной микроскопии или молекулярно-генетических исследований.

Список использованной литературы

1. Бурша О.С., Каграманов B.C., Соколенко А.В. Определение активности рибулозодифосфаткарбоксилазы у инактивных вариантов V. cholerae eltor. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. №6, с.90-91.

2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней. МУ. М: 2011 г., 63 с.

3. Соколенко А.В., Ломов Ю.М., Асеева Л.Е., Каграманов B.C., Бурша Л.Е. Особенности обмена некультивируемых форм холерных вибрионов. // Успехи современного естествознания. 2002. №2, с.22-30.

4. Luo Z.J., Zhou Z.S., Hao C.H., Guo Y.S., Liu H.Y., Zheng H.Y., Huang Z. Detection of the viable but nonculturable Escherichia coli 0157:H7 in aquatic microcosm. // Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2012. Feb; 46(2): 129-32.

5. Mishra A, Taneja N, Sharma М. Demonstration of viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in fresh water environment of India using ciprofloxacin DFA-DVC method. // Lett. Appl. MicrobioL 2011 Jul; 53(1):124-6.

6. Mishra A, Taneja N, Sharma М. Viability kinetics, induction, resuscitation and quantitative real-time polymerase chain reaction analyses of viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in freshwater microcosm. // J. Appl. Microbiol. 2012 May; 112(5):945-5

7. Иванов В.Б. Активные красители в биологии. М., «Наука», 1982. - 214 с.

8. Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. // Appl. Environ. Microbiol. 1977, 33(5): 1225-1228.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для определения жизнеспособности некультивируемых форм (НФ) Vibrio cholerae O1/O139 в водных объектах при мониторинговых исследованиях, в научно-исследовательской работе с НФ в экспериментах по индукции НС, при изучении устойчивости НФ к физическим и химическим воздействиям, в других исследованиях, в которых необходимо подтвердить жизнеспособность культуры, нивелировав отсутствие роста НФ на плотных питательных средах. Способ заключается в том, что проводят предварительную подготовку контрольных вегетативных культур V. cholerae O1 и V. cholerae O139 и исследуемых образцов, определяют во всех образцах концентрацию белка по Лоури, параллельно из всех образцов готовят препараты «раздавленная капля» с акридиновым оранжевым, фиксируя в люминесцентном микроскопе характер флуоресценции (зеленая - жизнеспособные, красная/оранжевая - мертвые), с последующим определением активности рибулозодифосфаткарбоксилазы (РДФК) радиоизотопным методом с меченым бикарбонатом. Результаты учитывают в сцинтилляционном счетчике, выражают в имп.мин/мкг белка. Наличие в исследуемой пробе активности РДФК указывает на жизнеспособность НФ V. cholerae O1/O139. Использование способа позволяет определить жизнеспособность НФ V. cholerae O1/O139 разного возраста в водной среде различного состава. 2 табл., 2 пр.

Способ обнаружения жизнеспособности некультивируемых форм V. cholerae O1/O139, отличающийся тем, что проводят предварительную подготовку контрольных вегетативных культур и исследуемых некультивируемых образцов, концентрируя микробные взвеси центрифугированием и гомогенизируя клетки на холоду, определяют в них концентрацию белка по Лоури, параллельно готовят мазки «раздавленная капля» с акридиновым оранжевым, оценивают жизнеспособность культур по цвету флуоресценции, с последующим определением экспрессии РДФК с помощью меченого бикарбоната натрия, результат считывают в сцинтилляционном счетчике, при этом наличие в исследуемой пробе активности фермента РДФК свидетельствует о жизнеспособности некультивируемых форм возбудителя.