МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ ФИБРОЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/395 

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США номер 60/753647, поданной 23 декабря 2005 г, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Настоящее изобретение было сделано при поддержке правительства, грант № P50 HL-56402, выданный National Institutes of Health. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, эффективным для лечения хронических фиброзных нарушений. Более конкретно, настоящее изобретение относится к лечению хронических фиброзных нарушений путем иммунотерапевтического вмешательства.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Воспаление представляет собой координированный ответ на повреждение ткани или инфекцию. Воспаление начинается с высвобождения или локального высвобождения хемотаксических факторов, активации тромбоцитов и инициации путей коагуляции и комплемента. Эти события стимулируют локальный эндотелий, вызывая экстравазацию нейтрофилов и моноцитов. Вторая фаза воспаления характеризуется притоком в ткань клеток адаптивной иммунной системы, в том числе лимфоцитов. Последующая фаза разрешения, в которой происходит апоптоз избытка лимфоцитов и поглощение тканевыми макрофагами, также характеризуется восстановлением поврежденной ткани стромальными клетками, такими как фибробласты.

В процессе такого восстановления локальные покоящиеся фибробласты мигрируют в пораженный участок, продуцируют внеклеточные матриксные белки и активируют сокращение раны или фиброз. Также полагают, что циркулирующие клетки-предшественники фибробластов, фиброциты, которые присутствуют в крови, мигрируют к участкам повреждения или фиброза, где они дифференцируются и опосредуют восстановление ткани и другие фиброзные ответы. Фиброциты дифференцируются из популяции предшественников периферических моноцитов и экспрессируют маркеры как гематопоэтических клеток (CD45, MHC класса II, CD34), так и стромальных клеток (коллаген типа I и III и фибронектин). Зрелые фиброциты быстро проникают в участки повреждения ткани, где они секретируют воспалительные цитокины, а также белки внеклеточного матрикса, другие цитокины и проангиогенные молекулы, которые могут вызывать фиброз.

Дифференциация фиброцитов связана с рядом фиброзных заболеваний, включающих без ограничения склеродермию, келоидные рубцы, ревматоидный артрит, волчанку, нефрогенную фиброзную дермопатию и идиопатический фиброз легких. Они играют роль в образовании фиброзных повреждений после инфекции Schistosoma japonicum у мышей и участвуют в развитии фиброза, связанного с аутоиммунными заболеваниями. Фиброциты также участвуют в развитии патогенного фиброза, связанного с радиационным поражением, болезни Лима и фиброза легких, а также ремоделирования стромы в поджелудочной железе и стромального фиброза, тогда как отсутствие таких фиброцитов связано с опухолями поджелудочной железы и аденокарциномами. Фиброз также встречается у пациентов, страдающих от астмы и, возможно, других легочных заболеваний, таких как хроническое обструктивное заболевание легких, где фиброциты подвергаются дополнительной дифференциации в миофибробласты.

Конкретный ряд заболеваний, связанных с нерегулируемым фиброзным ответом, включает идиопатические интерстициальные пневмонии, которые относятся к другой группе хронических легочных заболеваний, характеризующихся различными уровнями фиброза легких. Основные факторы, участвующие в развитии доминантного легочного фиброзного ответа, связанного с рядом гистологически различных форм идиопатической интерстициальной пневмонии (IIP), до сих пор идентифицированы не полностью, что является одной из причин отсутствия эффективных клинических способов лечения указанных заболеваний (Green, Overview of pulmonary fibrosis. Chest 2002; 122(suppl. 6):334S-9S). Хотя многие из указанных заболеваний сопровождаются фибропролиферативным ответом в микросреде альвеол, приводящим к ухудшению дыхания, степень фиброзного изменения может сильно изменяться (Nicholason Am. J. Resp, Crit. Car Med. 2000:162:2213-7; Chapman J. Clin., Invest, 2004; 113:148-57). Также существуют противоречивые данные, указывающие на то, что противовоспалительные средства обеспечивают терапевтическое улучшение при менее тяжелых формах IIP, таких как неспецифическая интерстициальная пневмония (NSIP) и респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких (RBILD), однако такие средства зачастую не способны предотвратить нарушение дыхания у пациентов с наиболее тяжелой и смертельной формой IIP - обычной интерстициальной пневмонией (UIP) (Flaherty et al., Am. J. Med., 110:278-282 (2001); Lynch et al., Curr. Opin. Pulm. Med., 7:298-308 (2001); Flaherty et al., Thorax, 58:143-148 (2003)).

Существование разных очагов фибробластов, или фибробластных очагов, является важным патологическим признаком, связанным с плохим прогнозом и смертельным исходом при идиопатической интерстициальной пневмонии (King et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 164:1025-1032 (2001)). Новейшие способы лечения могут быть разработаны только после выяснения общих и отдельных событий, вносящих вклад в фиброзные изменения легких в процессе возникновения и развития IIP (van den Blink et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz), 48:539-545 (2000)). Хорошо известно, что рецептор 7 хемокина CC (CCR7; который связывает MIP-3b/CCL19 и 6-Ckine/CCL21 (Nagira et al., J. Biol. Chem., 272:19518-19524 (1997)) и рецептор 4 хемокина CX (CXCR4; который связывает SDF-1/CXCL12 (Forster et al., J. Immunol., 160:1522-1531 (1998)) относятся к рецепторам хемокинов, экспрессия которых ограничена клетками гематопоэтического происхождения (Kim et al., J. Leukoc. Biol., 66:455-461 (1999); Kim et al., J. Clin. Invest., 108:1331-1339 (2001)). В процессе иммунных ответов экспрессия CCR7 участвует в перемещении зрелых дендритных клеток (Sallusto et al., Eur. J. Immunol., 29:1617-1625 (1999)) к лимфоидным тканям, регулирует локализацию Т-хелперных клеток типов 1 и 2 в селезенке (Randolph et al., Science, 286:2159-2162 (1999)) и направляет Т-хелперные клетки типа 2 к аллергическому легкому (Hammad et al., J. Immunol., 169:1524-1534 (2002)). Экспрессия и действие CXCR4, как правило, ограничены иммунными клетками костно-мозгового происхождения (Ward et al., Biochem. J., 333:457-470 (1998); Gonzalo et al., J. Immunol., 165:499-508 (2000)). Полученные в последнее время данные, свидетельствующие о том, что экспрессия CCR7 и CXCR4 клетками опухоли молочной железы способствует метастазированию указанных клеток в легкие, позволяют изменить иммуноцентрическую модель (Muller et al., Nature, 410:50-56 (2001)). Клетки молочной железы не экспрессируют указанные рецепторы хемокинов или не отвечают на лиганды, которые связываются с ними (Muller et al., Nature, 410:50-56 (2001)). Данное наблюдение распространяется на некоторые типы метастазирующих опухолей, включая меланому (Murakami et al., J. Dermatol. Sci., 36:71-78 (2004)) и разные формы лейкемий (Tavor et al., Cancer Res., 64:2817-2824 (2004); Ghobrial et al., Mayo Clin. Proc, 79:318-325 (2004)).

Хронический фиброз легких возникает в результате рубцевания легких, которое может быть вызвано многими состояниями, включающими хронические воспалительные процессы (саркоидоз, грануломатоз Вегенера), инфекции, воздействие агентов окружающей среды (асбест, оксид кремния, воздействие некоторых газов), воздействие ионизирующей радиации (например, лучевой терапии, используемой для лечения опухолей молочной железы), хронические состояния (волчанка, ревматоидный артрит), а также воздействие некоторых лекарственных средств. При состоянии, известном как гиперчувствительный пневмонит, фиброз легких может развиваться вследствие усиления иммунной реакции на вдыхаемую органическую пыль или производственные химикаты. Данное состояние чаще всего возникает после вдыхания пыли, содержащей бактерии, грибки или животные продукты. Больной, страдающий некоторыми типами фиброза легких, такими как неспецифический интерстициальный пневмонит (NSIP), может отвечать на иммуносупрессивную терапию. Если, как это часто бывает, хроническое воспаление легких и фиброз развиваются без идентифицированной причины, больной, страдающий этим заболеванием, часто не отвечает на терапевтическое лечение. В особенности это справедливо для больных, страдающих идиопатическим фиброзом легких (IPF). Существует немного вариантов лечения идиопатического фиброза легких. Данные, свидетельствующие о том, что какие-либо лекарственные средства могут облегчать данное состояние, отсутствуют, поскольку после возникновения рубцевание присутствует постоянно. Трансплантация легкого является единственным доступным вариантом лечения. Постоянно проводятся научно-исследовательские работы с использованием разных лекарственных средств, которые могут уменьшать фиброзное рубцевание. Поскольку некоторые типы фиброза легких могут отвечать на кортикостероиды (такие как преднизон) и/или другие лекарственные средства, которые подавляют иммунную систему организма, эти лекарственные средства иногда прописывают для уменьшения процесса, приводящего к фиброзу. Тем не менее, хорошо известно, что в настоящее время не существует способов лечения фиброзных заболеваний. В стандартной клинической практике пациентам назначают преднизон и азатиоприн, однако не существует данных, свидетельствующих о том, что эти препараты обеспечивают терапевтическое улучшение. На самом деле побочные эффекты этих лекарственных средств могут вносить вклад в смертность пациентов с UIP.

Хотя хемокины могут участвовать в образовании фибробластных очагов и усилении фиброзного ответа при фиброзе легких, конкретная роль среды профиброзных медиаторов, присутствующих при хроническом фиброзе легких, остается неясной. Настоящее изобретение идентифицирует роль конкретных хемокинов и их рецепторов и предлагает новые методы и композиции, которые можно использовать для лечения, главным образом, идиопатических нарушений, устойчивых к терапевтическим способам лечения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, эффективным для лечения фиброзных заболеваний. Более конкретно, настоящее изобретение демонстрирует, что ингибирование или другое уменьшение активности CCL21, одного или в сочетании с CCL19, эффективно уменьшает количество фиброзных повреждений и улучшает симптомы фиброзных нарушений.

Таким образом, конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам лечения у млекопитающего хронического фиброзного нарушения, включающим уменьшение количества или активности CCL21 в фиброцитах и/или фибробластах, присутствующих в участке фиброзного повреждения при указанном фиброзном нарушении. В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать уменьшение количества или активности CCL19 в фибробластах, связанных с указанным фиброзным нарушением. Например, уменьшения количества или активности CCL21 можно достичь путем приведения в контакт указанного млекопитающего со средством, которое удаляет CCL21 из указанных фибробластов, в количестве, эффективном для облегчения одного или нескольких симптомов указанного хронического фиброзного нарушения. Примером такого средства может быть антитело, способное к специфическому иммунному взаимодействию с CCL21, например такое антитело, которое лучше распознает эпитопы на CCL21, чем на других хемокинах.

В других вариантах осуществления уменьшения количества или активности CCL21 достигают путем приведения в контакт указанного млекопитающего со средством, которое уменьшает экспрессию CCL21 в указанных фибробластах, в количестве, эффективном для облегчения одного или нескольких симптомов указанного хронического фиброзного заболевания. Примером средства, используемого в таких вариантах осуществления, может служить молекула миРНК, направленная против CCL21.

С помощью способа по настоящему изобретению можно лечить фиброзное заболевание, выбранное без ограничения из группы заболеваний, включающих фиброз легких, хроническое обструктивное заболевание легких, фиброз печени, ревматоидный артрит, застойную сердечную недостаточность, хроническое заболевание почек, пневмонит с гиперчувствительностью, респираторный бронхолит/интерстициальное заболевание легких, инфекцию, вызванную шистосомой Мансона, первичную легочную гипертензию, вызваную плексиформными повреждениями, легочные проявления заболеваний, связанных с вирусом герпеса, дерматологические проявления заболеваний, связанных с вирусом герпеса, келоидные рубцы, волчанку, нефрогенную фиброзную дермопатию, фиброзные повреждения, связанные с инфекцией Schistosoma japonicum, аутоиммунные заболевания, патогенный фиброз, болезнь Лайма, реструктурирование стромы при панкреатите и стромальном фиброзе, фиброму матки, фиброз яичников, фиброз роговицы, застойную сердечную недостаточность и другие постишемические состояния, рубцевание после хирургической операции в брюшной полости, рубцевание после трабекулотомии при открытоугольной глаукоме, а также любые сочетания перечисленных заболеваний.

Характерная легочная гипертензия, лечение которой способом по настоящему изобретению может быть эффективно, включает первичную легочную гипертензию (РРН); вторичную легочную гипертензию (SPH); семейную РРН; спорадическую РРН; прекапиллярную легочную гипертензию; легочную артериальную гипертензию (РАН); гипертензию легочной артерии; идиопатическую легочную гипертензию; тромботическую легочную артериопатию (ТРА); плексогенную легочную артериопатию; функциональные классы I-IV легочной гипертензии; и легочную гипертензию, ассоциированную или связанную с дисфункцией левого желудочка, или вторичную по отношению к дисфункции левого желудочка, митральный порок сердца, констриктивный перикардит, аортальный стеноз, кардиомиопатию, фиброз средостения, неправильный дренаж легочной вены, окклюзионное заболевание легочной вены, коллагеновую болезнь сосудов, врожденный порок сердца, инфекцию ВИЧ, воздействие лекарственных средств и токсинов, таких как фенфлюрамины, врожденную болезнь сердца, легочную венозную гипертензию, хроническое обструктивное заболевание легких, интерстициальное заболевание легких, нарушение дыхания во сне, альвеолярную гиповентиляцию, хроническое воздействие большой высоты, неонатальное заболевание легких, альвеолярно-капиллярную дисплазию, серповидно-клеточное заболевание, другое нарушение коагуляции, хроническую тромбоэмболию, заболевание соединительной ткани, волчанку, шистосомоз, саркоидоз или легочный капиллярный гемангиоматоз.

Способ по настоящему изобретению, предпочтительно, можно использовать для лечения легочной гипертензии, связанной с нарушениями респираторной системы и/или гипоксимией, такими как хроническое обструктивное заболевание легких, интерстициальное заболевание легких, нарушение дыхания во сне, альвеолярная гиповентиляция, хроническое воздействие большой высоты, неонатальное заболевание легких, альвеолярно-капиллярная дисплазия, в особенности для лечения хронического обструктивного заболевания легких. В предпочтительных вариантах осуществления фиброзное нарушение представляет собой хронический фиброз легких.

В способах лечения соединение можно вводить местно в участок фиброзного повреждения. В более конкретных вариантах осуществления фиброзное поражение находится в легком, а композиция местно контактирует с указанным поражением. Предполагается, что в некоторых вариантах осуществления средство содержит фрагмент, обеспечивающий специфическую доставку указанного средства к участку фиброзного повреждения.

В конкретных вариантах осуществления антитело или композицию против CCL21 или CCL19 вводят способом, выбранным из группы, включающей местное введение, инъекцию, ингаляцию, непрерывное высвобождение посредством депо или насоса, или с помощью любого сочетания перечисленных способов.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу ингибирования пролиферации фибробластов и/или фиброцитов, включающему приведение в контакт указанных фибробластов и/или фиброцитов с композицией, которая содержит антитело против CCL21 или молекулу миРНК, направленную против CCL21. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает приведение в контакт указанного фибробласта с композицией, которая содержит антитело против CCL19 или молекулу миРНК, направленную против CCL19. В других вариантах осуществления способ дополнительно включает приведение в контакт указанного фибробласта с композицией, которая содержит антитело против CCR7 или молекулу миРНК, направленную против рецептора CCR7. Фиброциты и/или фибробласты можно обрабатывать in vitro или in vivo. Предпочтительно их обрабатывают in vivo. Более предпочтительно, обрабатываемые in vivo фибробласты находятся в легочной ткани.

Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования миграции фиброцитов и/или активации фибробластов, включающим приведение в контакт указанных фиброцитов и/или фибробластов с композицией, ингибирующей активность CCL21. Эти способы позволяют ингибировать in vivo миграцию фиброцитов к легочной ткани млекопитающего и, как следствие, предотвращать избыточную продукцию внеклеточного матрикса. В данных способах фибробласты предпочтительно представляют собой резидентные легочные фибробласты, расположенные в легочной ткани млекопитающего, а указанные способы позволяют ингибировать активацию фибробластов в легочной ткани указанного млекопитающего, предотвращая таким образом избыточную продукцию внеклеточного матрикса.

В настоящем документе также описывается способ лечения фиброза легких, включающий ингибирование миграции фиброцитов и/или активации резидентных легочных фибробластов, расположенных в легочной ткани млекопитающего, страдающего от фиброзного заболевания легких, путем ингибирования активности или экспрессии CCL21 в указанных фиброцитах и/или фибробластах, и таким образом предотвращая избыточную продукцию внеклеточного матрикса и улучшение симптомов фиброза легких.

Изобретение также относится к способам лечения, ингибирования развития, улучшения одного или нескольких симптомов, обратного развития состояния или иным образом достижения терапевтического эффекта при индуцированном облучением легочном ламините и/или индуцированном облучением фиброзе легких у больного, такие способы включают введение указанному больному средства, уменьшающего количество или активность CCL21 в фиброцитах и/или фибробластах легочной ткани указанного больного, где упомянутое средство вводят до, во время или после лучевой терапии. Такой терапевтический способ может дополнительно включать введение средства, уменьшающего количество или активность CCL19 в легочной ткани указанного больного.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения, ингибирования развития, улучшения одного или нескольких симптомов, обратного развития состояния или иным образом достижения терапевтического эффекта при индуцированном лекарственным средством фиброзе легких у больного, такие способы включают введение указанному больному средства, уменьшающего количество или активность CCL21 в фиброцитах и/или фибробластах легочной ткани указанного больного, где упомянутое средство вводят до, во время или после введения лекарственного средства. Опять же, в таком способе иногда желательно дополнительно вводить средство, уменьшающее количество или активность CCL19 в легочной ткани указанного больного. Существует множество средств, вызывающих фиброз, они включают без ограничения цитотоксические средства, антибиотики, противоаритмические средства, противовоспалительные средства и запрещенные наркотики. Примеры средств, вызывающих фиброз легких, включают без ограничения амфотерицин B, блеомицин, бромокриптин, бусульфан, карбамазепин, хлорамбуцил, кокаин, циклофосфамид, дифенилгидантоин, эрготамин, флекаинид, героин, мелфалан, метадон, метотрексат, метилфенидат, метилсергид, минеральное масло, нитрофурантоин, нитрозомочевины, прокарбазин, силикон, сульфазалазина токаинид, а также средства, принадлежащие к классу алкалоидов барвинка. В описанных в настоящем документе способах лечения иногда желательно использовать в качестве дополнительной терапии режим, в котором терапевтическое средство, воздействующее на CCL21 и/или CCL19, сочетают с кортикостероидным и/или иммуносупрессивным средством. В других способах комбинированная терапия может включать введение антикоагулянтов, диуретиков, сердечных гликозидов, блокаторов кальциевых каналов, сосудорасширяющих средств, аналогов простациклина, антагонистов эндотелина, ингибиторов фосфодиэстеразы, агонистов бета-2, антимускариновых средств, ингибиторов эндопептидазы, средств, снижающих уровень липидов, ингибиторов тромбоксана или их сочетаний.

Кроме того, настоящее изобретение дополнительно относится к применению средства, уменьшающего количество или активность CCL21 и/или CCL19 в фиброцитах и/или фибробластах, присутствующих в участке фиброзного повреждения, для получения лекарственного средства против хронического фиброзного нарушения.

В иллюстративных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению средства, уменьшающего количество или активность CCL21, и, необязательно, средства, уменьшающего количество или активность CCL19 в фиброцитах и/или фибробластах, присутствующих в участке фиброзного повреждения, для получения лекарственного средства против хронического фиброзного нарушения у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело, способное к специфическому иммунному взаимодействию с CCL21, предпочтительно такое антитело, которое лучше распознает эпитопы на CCL21, чем на других хемокинах. В других вариантах осуществления средство представляет собой молекулу миРНК, направленную против CCL21. Промышленным способом получают лекарственное средство для лечения фиброзного заболевания, выбранного из группы, включающей фиброз легких, хроническое обструктивное заболевание легких, фиброз печени, ревматоидный артрит, застойную сердечную недостаточность, хроническое заболевание почек, пневмонит с гиперчувствительностью, респираторный бронхолит/интерстициальное заболевание легких, инфекцию, вызванную шистосомой Мансона, первичную легочную гипертензию, вызваную плексиформными повреждениями, легочные проявления заболеваний, связанных с вирусом герпеса, дерматологические проявления заболеваний, связанных с вирусом герпеса, келоидные рубцы, волчанку, нефрогенную фиброзную дермопатию, фиброзные повреждения, связанные с инфекцией Schistosoma japonicum, аутоиммунные заболевания, патогенный фиброз, болезнь Лайма, реструктурирование стромы при панкреатите и стромальном фиброзе, фиброму матки, фиброз яичников, фиброз роговицы, застойную сердечную недостаточность и другие постишемические состояния, рубцевание после хирургической операции в брюшной полости, рубцевание после трабекулотомии при открытоугольной глаукоме, а также любые сочетания перечисленных заболеваний. Предпочтительно фиброзное заболевание представляет собой хронический фиброз легких.

Предпочтительно на основе лекарственных средств получают композиции, подходящие для таких способов введения, как местное введение, инъекция, ингаляция, непрерывное высвобождение посредством депо или насоса, или любое сочетание перечисленных способов. Также предлагается применение композиции, содержащей антитело против CCL21 или молекулу миРНК, направленную против CCL21, и необязательно антитело против CCL19 или молекулу миРНК, направленную против CCL19, для получения лекарственного средства, ингибирующего пролиферацию фибробластов и/или фиброцитов. Применение может дополнительно включать применение композиции, содержащей антитело против CCR7 или молекулу миРНК, направленную против рецептора CCR7, в промышленном получении лекарственного средства, ингибирующего пролиферацию фибробластов и/или фиброцитов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции, ингибирующей активность CCL21, в промышленном получении лекарственного средства, ингибирующего миграцию фиброцитов и/или активацию фибробластов. Также предлагается применение композиции, ингибирующей активность или экспрессию CCL21 в фиброцитах и/или активацию резидентных легочных фибробластов, в промышленном получении лекарственного средства для лечения фиброза легких путем предотвращения избыточной продукции внеклеточного матрикса и улучшения симптомов фиброза легких.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению средства, уменьшающего количество или активность CCL21, и, необязательно, средства, уменьшающего количество или активность CCL19 в фиброцитах и/или фибробластах легочной ткани, для промышленного получения лекарственного средства для лечения индуцированного облучением легочного ламинита и/или индуцированного облучением фиброза легких.

Также предлагается применение средства, уменьшающего количество или активность CCL21, и, необязательно, средства, уменьшающего количество или активность CCL19 в фиброцитах и/или фибробластах легочной ткани, для промышленного получения лекарственного средства для лечения индуцированного лекарственным средством фиброза легких. В таком применении промышленным способом получают лекарственное средство для лечения неидиопатического фиброза легких, индуцированного лекарственным средством, выбранным из группы, включающей цитотоксические средства, антибиотики, противоаритмические средства, противовоспалительные средства и запрещенные наркотики, например, лекарственное средство может быть выбрано из группы, включающей амфотерицин B, блеомицин, бромокриптин, бусульфан, карбамазепин, хлорамбуцил, кокаин, циклофосфамид, дифенилгидантоин, эрготамин, флекаинид, героин, мелфалан, метадон, метотрексат, метилфенидат, метилсергид, минеральное масло, нитрофурантоин, нитрозомочевины, прокарбазин, силикон, сульфазалазина токаинид, а также средства, принадлежащие к классу алкалоидов барвинка. В некоторых вариантах осуществления для получения лекарственного средства предлагается комбинированное применение средств, где лекарственное средство на основе CCL19 или CCL21 объединяют с кортикостероидом, иммуносупрессивным средством, антикоагулянтом, диуретиком, сердечным гликозидом, блокатором кальциевых каналов, сосудорасширяющим средством, аналогом простациклина, антагонистом эндотелина, ингибитором фосфодиэстеразы, агонистом бета-2, антимускариновым средством, ингибитором эндопептидазы, средством, снижающим уровень липидов, ингибиторами тромбоксана или их сочетаниями.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг.1: Анализ с использованием макробиочипа SuperArray экспрессии генов (A) CCR7 и (B) CXCR4 в образцах биопсии, полученных хирургическим путем из верхней и нижней долей легких в группах пациентов с UIP (n=7), NSIP (n=6), RBILD (n=6) и обычной опухолью краевой зоны (n=5). Данные приведены в виде средних значений (SEM). Существенные различия отсутствуют. CCR7, рецептор 7 хемокина CC; CXCR4, рецептор 4 хемокина CX; GAPDH, глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа; NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.2: Анализ с использованием макробиочипа SuperArray экспрессии генов (A) CCL19, (B) CCL21 и (C) CXCL12 в образцах биопсии, полученных хирургическим путем из верхней и нижней долей легких в группах пациентов с UIP (n=7), NSIP (n=6), RBILD (n=6) и обычной опухолью краевой зоны (n=5). Данные приведены в виде средних значений (SEM). Существенные различия отсутствуют. CCL, лиганд рецептора хемокина CC; CXCL, лиганд рецептора хемокина CX; GAPDH, глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа; NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.3: Количественный анализ методом полимеразной цепной реакции Taqman экспрессии генов CCR7 и CCL21 в образцах биопсии, полученных хирургическим путем из верхней и нижней долей легких пациентов с UIP (n=18), NSIP (n=8), RBILD (n=6) и с обычной опухолью краевой зоны (n=6). Данные приведены в виде средних значений (SEM). **p (0,01 по сравнению с соответствующей долей пациента из группы с обычной опухолью краевой зоны). CCR7, рецептор 7 хемокина CC; CCL21, лиганд рецептора 4 хемокина CC; NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг. 4: Иммуноферментный твердофазный анализ CCL19, CCL21 и CXCL12 в образцах биопсии из верхней и нижней долей легких пациентов с UIP (n=18), NSLP (n=6), RBILD (n=6) и обычной опухолью краевой зоны (n=5). Данные приведены в виде средних значений (SEM). CCL, лиганд рецептора хемокина CC; CXCL, лиганд рецептора хемокина CX; NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.5: Характерный иммуногистохимический анализ CCR7 в SLB групп пациентов с (A, B) UIP, (C, D) NSIP, (E, F) RBILD и (G, H) обычной опухолью краевой зоны. В секторах (A), (C), (E) и (G) показано контрольное окрашивание. Иммунореактивность CCR7 (красное окрашивание) наблюдается в фокальных участках SLB групп с (B) UIP, (D) NSIP и (F) RBILD, но не (H) с обычной опухолью краевой зоны. Исходное увеличение 6200. CCR7, рецептор 7 хемокина CC; NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; SLB, хирургическая биопсия легкого; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.6: Характерный иммуногистохимический анализ CXCR4 в SLB групп пациентов с (A, B) UIP, (C, D) NSIP, (E, F) RBILD и (G, H) и обычной опухолью краевой зоны. В секторах (A), (C), (E) и (G) показано контрольное окрашивание. Иммунореактивность CXCR4 (красное окрашивание) наблюдается в мононуклеарных клетках, присутствующих в SLB пациентов с IIP и обычной опухолью краевой зоны. Исходное увеличение 6200. CXCR4, рецептор 4 хемокина CX; NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; SLB, хирургическая биопсия легкого; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.7: Характерный иммуногистохимический анализ (B, E) CCR7 и (C,F) CD45 в серийных гистологических срезах в группах пациентов с (A-C) UIP и (D-F) NSIP. В секторах (A) и (D) показано контрольное окрашивание. В SLB пациентов с UIP иммунореактивность CCR7 (красное окрашивание в секторе B) частично перекрывается с иммунореактивностью CD45 (C), причем большая часть двойного окрашивания связана с мононуклеарными клетками (C). (A, F) В серийных гистологических срезах SLB NSIP не обнаруживается совместная локализация CCR7 и CD45. Исходное увеличение 6200. CCR7, рецептор 7 хемокина CC; NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; SLB, хирургическая биопсия легкого; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.8: Характерный иммуногистохимический анализ CD34 в SLB групп пациентов с (A, B) UIP, (C, D) NSIP, (E, F) RBILD и (G, H) обычной опухолью краевой зоны. В секторах (A), (C), (E) и (G) показано контрольное окрашивание. Иммунореактивность CD34 (красное окрашивание) наблюдается в интерстициальных участках SLB всех пациентов. (D) Самая высокая экспрессия CD34 наблюдается в SLB пациентов группы NSIP. Исходное увеличение 6200. NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; SLB, хирургическая биопсия легкого; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.9: Характерный иммуногистохимический анализ коллагена 1 в SLB групп пациентов с (A, B) ULP, (C, D) NSIP, (E, F) RBILD и (G, H) обычной опухолью краевой зоны. В секторах (A), (C), (E) и (G) показано контрольное окрашивание. Иммунореактивность коллагена (красное окрашивание) наблюдается в SLB пациентов с (B) UIP, (D) NSIP, (F) RBILD и (H) обычной опухолью краевой зоны. Исходное увеличение 6200. NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; SLB, хирургическая биопсия легкого; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.10: Характерный иммуногистохимический анализ (B, E) коллагена 1 и (C, F) CCR7 в SLB групп пациентов с (A-C) UIP и (D-F) RBILD. В секторах (A) и (D) показано контрольное окрашивание. Иммунореактивность коллагена 1 (красное окрашивание) наблюдается в группах пациентов с (B) UIP и (E) RBILD. Однако в серийных гистологических срезах, участки которых являются иммунореактивными по отношению к коллагену 1, экспрессия CCR7 отсутствует (C, UIP; F, RBILD). Исходное увеличение 6200. CCR7, рецептор 7 хемокина CC; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; SLB, хирургическая биопсия легкого; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.11: Характерный иммуногистохимический анализ гладкомышечного актина (aSMA) в SLB групп пациентов с (A-C) UIP, (D-F) NSIP и (G-I) RBILD. В секторах (A), (D) и (G) показано контрольное окрашивание. Иммунореактивность CCR7 (красное окрашивание) наблюдается в фокальных участках SLB из групп пациентов с (B) UEP, (E) NSIP и (H) RBILD. Экспрессия aSMA (красное окрашивание) также наблюдается в серийных гистологических срезах тканей групп пациентов с (C) UIP, (F) NSIP и (I) RBILD. Однако перекрывание экспрессии CCR7 и aSMA не наблюдается. Исходное увеличение 6200. CCR7, рецептор 7 хемокина CC; NSIP, неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD, респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких; SLB, хирургическая биопсия легкого; aSMA, гладкомышечный актин; UIP, обычная интерстициальная пневмония.

Фиг.12: Экспрессия транскрипта CCL21 в полученных хирургическим путем образцах биопсии легких пациентов с разными формами хронического фиброза легких по сравнению с пациентами, имеющими нефиброзные заболевания других типов. Экспрессия гена CCL21 (определяемая методом TAQMAN ПЦР) варьирует среди разных групп пациентов. Максимальная экспрессия CCL21 наблюдается в SLB при верхней и нижней обычной интерстициальной пневмонии (UIP), однако различие между SLB UIP и других групп наиболее четко выражено в нижних SLB. Вместе полученные данные позволяют предположить, что экспрессия CCR7 и CCL21 значительно увеличивается в процессе UIP. NSIP = неспецифическая интерстициальная пневмония; RBILD = респираторное бронхолитическое/интерстициальное заболевание легких.

Фиг.13: Экспрессия белка CCL21 в полученных хирургическим путем образцах биопсии легких пациентов с разными формами хронического фиброза легких по сравнению с пациентами, имеющими нефиброзные заболевания других типов. В данном описании приведены результаты анализа IIP и отличных от IIP образцов биопсии методом ELISA. В образцах биопсии верхней доли групп с UIP, NSIP и отличным от IIP заболеванием наблюдаются одинаковые уровни белка CCL21. Однако в образцах нижней доли (где фиброз легких является более агрессивным у пациентов с IIP) уровни CCL21 выше в группах IIP (т.е. в группах UIP, NSIP и RBILD по сравнению с группой, имеющей отличное от IIP заболевание).

Фиг.14: Миграция фибробластов UIP, но не отличных от IIP фибробластов, значительно увеличивается в присутствии CCL21. Данные эксперименты проводят путем добавления фибробластов человека в культуральный планшет с пористой системой transwell и подсчета фибробластов, мигрирующих при инкубации в течение 24 ч. Фибробласты UIP мигрируют через transwell ко дну лунки, причем миграция происходит гораздо интенсивнее, если на дно лунки добавлен CCL21, или фибробласты обработаны TNF, а на дно лунки добавлен CCL21. Присутствие антитела против CCL21 значительно снижает миграцию фибробластов в последних двух группах, но не влияет на фибробласты первой группы.

Фиг.15: В настоящем описании показаны результаты анализа влияния экзогенных CCL19 и CCL21 (концентрация обоих составляет 10 нг/мл) на пролиферативные ответы линий первичных фибробластов, выращенных из SLB нормальной ткани, гиперчувствительного пневмонита, саркоида и UIP. Обнаружено, что фибробласты UIP пролиферируют в ответ на присутствие лигандов CCL19 и CCL21.

Фиг.16: Поскольку обнаружено, что введение фибробластов IIP мышам SCID инициирует развитие интерстициального фиброза, с использованием данной модели проводят исследования, позволяющие определить антифиброзное действие антитела против CCL21. Группы из пяти мышей получают очищенные IgG или антитело против CCL21 путем в.б. инъекции начиная с 35 дня и затем через день до 63 дня. На 63 день ткани легких удаляют и делают показательные срезы. У мышей, обработанных IgG, отчетливо наблюдается интерстициальный фиброз и ремоделирование. И наоборот, по данным гистологического анализа в группах, обработанных антителом против CCL21, наблюдаются незначительные признаки фиброза легких.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Фиброз включает нерегулируемую пролиферацию и дифференциацию фиброцитов. Фиброциты представляют собой различные популяции фибробластподобных клеток, полученных из моноцитов периферической крови, которые обычно поступают в участки повреждения ткани, стимулируя ангиогенез и заживление раны. В настоящем изобретении показано, что уменьшение количества или активности CCL21 в фиброцитах и/или фибробластах, присутствующих при фиброзе в участке фиброзного повреждения, приводит к успешному лечению фиброза и/или улучшению одного или нескольких симптомов фиброза в результате уменьшения количества фиброзных очагов и/или ингибирования их образования.

Хронический фиброз легких известного и идиопатического происхождения представляет собой экстраординарную клиническую проблему, способы его лечения обладают ограниченной эффективностью или являются токсичными (Flaherty et al., Am. J. Med., 110:278-282 (2001); (Hampton et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 149:A878 (1994)), а средний коэффициент выживаемости после диагностирования заболевания меняется мало (Ryu et al., Mayo Clin. Proc, 73:1085-1101 (1998); Lasky et al., Environ. Health Perspect., 108 Suppl 4:751-762 (2000)). Причины развития профиброза известны, к ним относятся облучение, вдыхание минеральных и органических частиц, газообразные оксиданты, фармацевтические продукты и инфекционные организмы, тогда как природа этиологических факторов, инициирующих клиникопатологические процессы идиопатической интерстициальной пневмонии (IIP) является предметом для обсуждений. IIP представляет собой отдельную группу нарушений, поражающих дистальную легочную паренхиму, которые обладают рядом общих признаков, однако ощущаются достаточно по-разному, чтобы диагностировать их как разные нарушения (Travis et al., Am. J. Surg. Path., 24:19-33 (2000)). Их патогенез остается неясным, однако полагают, что они возникают вокруг повреждения (или нескольких повреждений) легкого после попыток излечивания данного повреждения. Считается, что фибробластные очаги, небольшие агрегаты активно пролиферирующих фибробластов, формируют первичные очаги повреждения и указывают на протекание активного фиброза.

Вначале, с использованием IIP в качестве примеров хронических фиброзных нарушений, в настоящем описании приводятся данные, свидетельствующие о том, что экспрессия CCR7 и/или CXCR4 находится на высоком уровне при фиброзном нарушении (в данном случае используются полученные хирургическим путем образцы биопсии легких IIP (SLB)) и на невысоком уровне в нормальных краевых SLB. Проведен подробный анализ генных транскриптов и белков в SLB групп пациентов с IIP и обычной краевой опухолью. Анализ хемокина и транскрипта рецептора хемокина показывает, что CCR7, но не CXCR4, экспрессируется на высоком уровне в фокальных интерстициальных участках при IIP, в особенности анализируются все образцы биопсии UIP, но не в образцах биопсии нормальной краевой опухоли. CCR7-положительные участки в образцах биопсии IIP содержат фиброциты, однако с учетом того, что клетки, присутствующие в CCR7-положительных участках, не экспрессируют одновременно маркеры фиброцитов, такие как CD34 и коллаген, CCR7-положительные клетки не обязательно имеют костно-мозговое происхождение. Наконец, показано, что CCR7-положительные клетки в образцах биопсии IIP активируют фибробласты резидентной ткани. Таким образом, представленные в настоящем описании примеры показывают, что при тяжелых формах IIP наблюдается повышенная экспрессия CCR7, и такая экспрессия локализована в участках фиброзных очагов, не содержащих фиброцитов и миофибробластов.

Другие исследования показывают, что нацеливание на лиганды рецептора CCR7, CCL21 и/или CCL19 дает хороший результат при лечении хронических фиброзных заболеваний. Более конкретно, данные, полученные в клинике и на животных моделях, показывают, что экспрессия CCR7 и CCL21 значительно увеличивается при UIP. Кроме того, показано, что миграция фибробластов UIP увеличивается в присутствии CCL21. С другой стороны, препараты антител против CCL21 значительно уменьшают миграцию фибробластов при UIP. Кроме того, совершенно очевидно, что в присутствии лигандов CCL21 или CCL19 фибробласты UIP проявляют пролиферативную активность.

После введения фибробластов IIP у мышей SCID развивается интерстициальный фиброз. Такая модель служит гуманизированной SCID-моделью IIP. Если такую мышиную модель обрабатывают антителом против CCL21, то гистологический анализ показывает, что у мышей фиброз легких не развивается или развивается в незначительной степени по сравнению с аналогичными группами гуманизированных мышиных SCID-моделей IIP, которые не обрабатывают антителами против CCL21.

Данные, приведенные в настоящем описании, позволяют предположить, что способы и композиции, направленные на уменьшение и/или ингибирование действия CCL21 и/или CCL19, будут особенно эффективны для лечения фиброзных нарушений в легких, а также в других тканях. Способность человеческих фибробластов отвечать на CCL19 и CCL21 (которые осуществляют повышающую регуляцию CCR7) приводит к неадекватной активации данных клеток и, как следствие, к избыточным фиброзным ответам, наблюдающимся при IIP. Интересно, что цитокины в легких пациентов, страдающих фиброзом, могут благоприятствовать аберрантному ответу на CCL19 и CCL21, это подтверждают другие исследователи, которые обнаружили наличие высоких уровней TNF-α (Sallusto et al., Eur. J. Immunol., 29:1617-1625 (1999); Randolph et al., Science, 286:2159-2162 (1999)) и пониженных уровней IL-10 (Hammad et al., J. Immunol., 169:1524-1534 (2002)), цитокинов, модулирующих рецептор, с которым связываются указанные лиганды. Фибробласты людей с тяжелыми формами фиброза легких отчетливо отвечают на CCL19 и CCL21, что делает эти лиганды притягательными мишенями для лечения фиброзных заболеваний легких и, возможно, других тканей.

С учетом приведенного выше обсуждения следует понимать, что некоторые варианты осуществления относятся к композициям, нацеленным на CCL21 и/или CCL19, которые специфически ингибируют взаимодействие хемокина с рецептором CCR7. Такие композиции направлены против самих CCL21 и/или CCL19 (например, антитела против указанных хемокинов, антисмысловые молекулы против указанных хемокинов или молекулы миРНК против данных молекул). Альтернативно композиции могут быть направлены против рецептора CCR7 (например, антитела против рецептора, антисмысловые молекулы против рецептора или молекулы миРНК против рецептора). В других альтернативных вариантах осуществления композиция может содержать низкомолекулярный ингибитор взаимодействия хемокинов с рецептором CCR7. Указанные композиции и способы их применения для лечения и/или улучшения симптомов заболеваний у больного ниже описаны более подробно.

Лечение может быть эффективным для любого фиброзного нарушения. Например, нарушение может включать фиброз легких, хроническое обструктивное заболевание легких, фиброз печени, ревматоидный артрит, застойную сердечную недостаточность, хроническое заболевание почек, пневмонит с гиперчувствительностью, респираторный бронхолит/интерстициальное заболевание легких, инфекцию, вызванную шистосомой Мансона, первичную легочную гипертензию, вызваную плексиформными повреждениями, легочные проявления заболеваний, связанных с вирусом герпеса, дерматологические проявления заболеваний, связанных с вирусом герпеса, келоидные рубцы, волчанку, нефрогенную фиброзную дермопатию, фиброзные повреждения, связанные с инфекцией Schistosoma japonicum, аутоиммунные заболевания, патогенный фиброз, болезнь Лайма, реструктурирование стромы при панкреатите и стромальном фиброзе, фиброму матки, фиброз яичников, фиброз роговицы, застойную сердечную недостаточность и другие постишемические состояния, рубцевание после хирургической операции в брюшной полости, рубцевание после трабекулотомии при открытоугольной глаукоме, а также любые сочетания перечисленных заболеваний. Способы настоящего изобретения также можно использовать для ингибирования превращения эпителиальных клеток в мезенхимные (ЕМТ). Это явление заключается в том, что эпителиальные клетки в разных органах (в частности, в почках) "регрессируют" до более "простого" клеточного фенотипа (такого как у фибробластов). Такой процесс способствует формированию корпуса организма, роль ЕМТ в эмбриональном развитии хорошо изучена, однако указанный процесс также участвует в генезе фибробластов при фиброзе органов взрослого организма. Результаты, полученные при исследованиях фиброза почек, позволяют предположить, что более трети всех связанных с заболеванием фибробластов образуется из тубулярного эпителия в участке повреждения. Этот процесс можно ингибировать с помощью композиций по настоящему изобретению, Kalluri and Nielsen, J. Clin. Invest. 112:1776-1784 (2003).

Фиброз легких может возникать у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, атипичной пневмонией (включающей разновидности Pneumocystis) и лимфангитным распространением рака. Также известно, что данные заболевания легких могут вызывать воздействие факторов окружающей среды или производственных факторов, в том числе вдыхание неорганической пыли, такой как силикон и асбест, бериллиоз, "черные легкие". Фиброз также может возникать в результате воздействия белковых антигенов (например, "легкое фермера", болезнь любителей птиц, инфекции легких, вызванные атипичными бактериями Mykobacterium avium и токсичных газов, дымов, аэрозолей и паров (например, болезнь силосовальщиков). Воздействие облучения (ионизирующего облучения), часто используемого в медицинской практике, также является известной причиной фиброза легких, которое также наблюдается в случаях, связанных с ревматологическими заболеваниями/заболеваниями соединительной ткани, такими как: склеродермия; ревматоидный артрит; смешанное заболевание соединительной ткани; системная эритематозная волчанка. Фиброз также может развиваться при легочных-почечных синдромах (например, болезнь Вегнера или Гудпасчера), саркоидозах и других грануломатозных заболеваниях (таких как бериллиоз), системных заболеваниях, таких как гепатит C, воспалительная болезнь кишечника, синдром приобретенного иммунодефицита, идиопатические или редкие DPLD, такие как: COP (идиопатический), легочный гистиоцитоз клеток Лангерганса (редкий), эозинофильная пневмония. Фиброз также может развиваться при семейной IPF или саркоидозе, туберозном склерозе, нейрофиброматозе, болезни Ниманна-Пика, болезни Гоше и синдрома Германского-Пудлака.

Терапевтическое лечение по настоящему изобретению также можно применять к фиброзу, возникающему в ответ на разные способы лечения рака. Например, терапевтические способы по настоящему изобретению можно использовать в дополнение к лучевым режимам лечения онкологических заболеваний. Индуцированный облучением легочный ламинит и последующий фиброз легких являются побочными эффектами лучевой терапии, снижающими ее эффективность. Для лечения рака лучевую терапию обычно применяют в дозе 20-85 Гр. Однако обследования пациентов показывают, что существует практически линейная зависимость легочной токсичности, проявляющейся в виде легочного ламинита, от дозы облучения. Впоследствии появляются фиброзные повреждения. Ожидается, что введение средства, уменьшающего количество или активность CCL21, и/или введение средства, уменьшающего количество или активность CCL19, будет уменьшать развитие или прогрессирование индуцированного облучением легочного ламинита и/или индуцированного облучением фиброза легких. В некоторых вариантах осуществления терапевтические средства по настоящему изобретению, уменьшающие количество или активность CCL19 и/или CCL21, можно вводить до и/или после лучевой терапии и/или одновременно с лучевой терапией. В некоторых случаях такие средства предпочтительно вводить через 1, 2, 3, 4 или 5 дней после лучевой обработки.

Показано, что сильный фиброз легких, представляющий собой фиброз, индуцированный лекарственным средством, может быть вызван другой противораковой терапией, например введением сульфата блеомицина. Блеомицин откладывается в коже и легких, приводя к развитию фиброза. Хотя в данном случае рекомендуют прекратить введение лекарственного средства и назначить кортикостероиды, доказанных способов лечения индуцированного блеомицином повреждения легких не существует. Предполагается, что терапевтические средства по настоящему изобретению, уменьшающие количество или активность CCL19 и/или CCL21, можно вводить до и/или после сульфата блеомицина и/или одновременно с сульфатом блеомицина, и что введение средств, уменьшающих количество или активность CCL19 и/или CCL21, будет эффективно уменьшать присутствие или развитие фиброза легких у пациентов, получающих сульфат блеомицина.

Хотя сульфат блеомицина является характерным средством, вызывающим фиброз легких, другие лекарственные средства также могут индуцировать заболевание легких, причем данной проблеме в последние годы уделяется пристальное внимание. В 1972 г. было известно только 19 средств, вызывающих заболевание легких. В обзоре литературы 2001 г. опубликован все увеличивающийся список из, по меньшей мере, 150 средств, вызывающих заболевание легких. Известно, что среди этих средств фиброз могут вызывать цитотоксические средства, такие как блеомицин, бусульфан, метотрексат, антибиотики, такие как нитрофурантоин, сульфазалазан, противоаритмические средства, такие как амиодарон, токаинид, противовоспалительные лекарственные средства, такие как, например, золото, пеницилламин, запрещенные наркотики, такие как, например, кокаиновый крэк, героин. В конкретных вариантах осуществления способы и композиции по изобретению можно использовать для лечения фиброза, индуцированного такими средствами, как амфотерицин B, блеомицин, бромокриптин, бусульфан, карбамазепин, хлорамбуцил, кокаин, циклофосфамид, дифенилгидантоин, эрготамин, флекаинид, героин, мелфалан, метадон, метотрексат, метилфенидат, метилсергид, минеральное масло, нитрофурантоин, нитрозомочевины, прокарбазин, силикон, сульфазалазина токаинид, а также средствами, принадлежащими к классу алкалоидов барвинка, в том числе митомицин и противомикробные средства. Как описано, при применении нитрозомочевин, таких как кармустин, ломустин и семустин, в особенности кармустина, до 25% пациентов, получающих данное средство, страдают от раннего (в течение 36 месяцев после начала терапии кармустином) развития фиброза легких.

Термины "больной" и "пациент" относятся к представителю или представителям любого вида млекопитающих или отличных от млекопитающих животных, которые могут нуждаться в фармацевтических методах, композициях и способах лечения по настоящему изобретению. Так, больные и пациенты включают без ограничения приматов (в том числе людей), собак, кошек, копытных (например, лошадей, коров, кабанов (например, свиней), обезьян и других животных. Особый интерес представляют люди и отличные от людей животные, имеющие торговое значение (например, домашний скот и одомашненные животные). Термин "млекопитающие" относится к представителю или представителям любого вида млекопитающих и включает, например, собак; кошек; лошадей; коров; овец; грызунов и других, а также приматов, в особенности людей. Отличные от человека животные модели, в частности млекопитающие, например приматы, мыши, представители отряда зайцеобразных и другие, можно использовать для экспериментальных исследований.

Композиции, содержащие одно или несколько средств, уменьшающих активность, экспрессию или количество CCL21 и/или CCL19, можно использовать для подавления фиброза в неподходящих участках и, в числе прочего, при фиброзных нарушениях и хронических воспалительных состояниях. Такие композиции можно применять локально в участке фиброзного повреждения, или альтернативно их можно вводить системно. Кроме того, композиции, направленные на уменьшение, ингибирование, подавление или иное прекращение активности/действия CCL21 и/или CCL19, можно вводить отдельно или в сочетании с другими средствами, используемыми для лечения фиброзных нарушений. Такие другие композиции могут включать, например, кортикостероиды и другие противовоспалительные средства. Благоприятное действие может оказывать лечение преднизоном, азатиоприном и цитокинами наряду с IFN-гамма. В частности, предлагаются сочетания таких композиций с композициями против CCL21/против CCL19. Хотя ранее предполагали, что применение только иммуносупрессанта и кортикостероида достаточно для лечения фиброза легких, в настоящее время известно, что иммуносупрессивная терапия в сочетании с кортикостероидами является неэффективным способом лечения данного заболевания, причем она не только не оказывает эффективного влияния на развитие заболевания, но и не увеличивает коэффициент выживания. Прогнозом для больного, страдающего фиброзом легких, в отсутствие хирургического вмешательства является летальный исход. Единственной возможностью для таких пациентов является трансплантация легкого. Таким образом, композиции и способы по настоящему изобретению обладают значительным преимуществом по сравнению с существующими в настоящее время способами лечения, поскольку они позволяют останавливать или уменьшать развитие и/или прогрессирование заболевания.

В конкретных вариантах осуществления композиции, содержащие антитела против CCL21, могут уменьшать концентрацию CCL21 в мишеневых участках. Дозы, необходимые для уменьшения уровня CCL21 и CCL19 у людей, преимущественно находятся в интервале несколько микрограммов. Например, антитела можно использовать в интервале приблизительно 5-40 микрограмм/кг. В идеале, антитела действуют в более низком интервале от 5 до 10 микрограмм/кг.

Показано, что IL-12, ламинин-1, поперечно-сшитые IgG и агрегаты IgG подавляют дифференциацию моноцитов до фиброцитов (патентная заявка США № 20050238620). Такие композиции можно использовать в сочетаниях, указанных в настоящем описании.

В способах лечения композиции могут доставляться к мишеневому участку из экзогенного источника, или они могут быть получены in vivo в клетках мишеневого участка или в клетках того же организма, что и мишеневый участок. Такие композиции могут быть выделены из донорных тканей человека, включающих биологические жидкости. Их также можно получить в виде рекомбинантных белков в бактериях, клетках тканевых культур или в клетках или тканях любого другого типа, известных в данной области или в организме животного. Их также можно получить синтетическим или любым другим способом, известным в данной области. Указанные композиции можно получить in vivo в виде продукта экспрессии трансгена или в результате увеличения продукции существующего in vivo источника. Уровни композиций, присутствующих в норме в мишеневом участке, можно также увеличить путем уменьшения их обычных скоростей деградации. Кроме того, можно увеличить способность композиций подавлять дифференциацию фиброцитов, например, путем добавления кофакторов.

Хотя способы по настоящему изобретению описываются в применении к IIP в качестве характерного фиброзного нарушения, следует понимать, что это заболевание используется в качестве примера других фиброзных нарушений. Из приведенных в данном описании разъяснений специалисту в данной области должно быть понятно, что благодаря способам по настоящему изобретению можно лечить и другие заболевания, требующие подавления фиброзного процесса. Как таковые, способы по настоящему изобретению направлены на лечение фиброза, обусловленного состояниями, включающими без ограничения: склеродермию, келоидные рубцы, ревматоидный артрит, волчанку, нефрогенную фиброзную дермопатию, фиброзные повреждения после инфекции Schistosoma japonicum, аутоиммунные заболевания, патогенный фиброз, болезнь Лайма, ремоделирование стромы в поджелудочной железе и стромальный фиброз, астму, идиопатический фиброз легких, хроническое обструктивное заболевание легких, фиброз легких, фиброму матки, фиброз яичников, другие фиброзно-кистозные образования, фиброз роговицы или другие фиброзы глаз, например, образующиеся после рефракционной хирургической операции на роговице, фиброз, возникающий в результате застойной сердечной недостаточности и других постишемические состояний, рубцевание после хирургической операции, в том числе спайки в брюшной полости, трабекулотомия открытоугольной глаукомы. При некоторых из указанных фиброзных заболеваний фиброциты не обязательно представляют последнюю стадию фиброза. Например, при астме фиброциты дополнительно дифференцируются в миофибробласты, которые присутствуют в утолщенных стенках дыхательных путей. Что касается лечения, следует понимать, что любое улучшение симптомов фиброзного заболевания является благоприятным эффектом и должно рассматриваться как доказательство протекания процесса лечения. Таким образом, термин "лечение" или "излечение" состояния или заболевания включает: (1) профилактику, по меньшей мере, одного симптома состояний, т.е. подавление значительного развития клинического симптома у млекопитающего, которое может иметь заболевание или предрасположенность к заболеванию, симптомы которого пока не проявляются, (2) подавление заболевания, т.е. прекращение или уменьшение развития заболевания или его симптомов, или (3) облегчение заболевания, т.е. индуцирование регрессии заболевания или его клинических симптомов. Термины лечение, профилактика и улучшение состояния в соответствии с настоящим изобретением могут включать, например, уменьшение или устранение болезнетворного или вредного состояния, связанного с фиброзным заболеванием. Примеры такого лечения включают: уменьшение бактериальной инфекции, усиление легочной функции, понижающую регуляцию провоспалительных цитокинов и повышающую регуляцию накопления мононуклеарных клеток.

В конкретном варианте осуществления фиброз легких или другие фиброзные заболевания легких можно лечить путем введения средств, которые ингибируют или иным образом уменьшают активность CCL21 и/или CCL19. Лечение может снижать клеточный рост, связанный с фиброзом, а также отложение коллагена. Лечение может предотвращать дальнейший фиброз или уменьшать эффекты существующего фиброза. Средство можно вводить в любых дозах в составе композиции, способной уменьшать, по меньшей мере, один симптом заболевания пациента. Введение можно осуществлять внутривенно через день в течение выбранного периода времени. Указанные дозу, способ введения и режим введения также можно использовать для лечения других фиброзных заболеваний. Дозы, композиции и способы введения можно оптимизировать с использованием животных моделей данного заболевания.

Пример модели фиброза легких описан ниже в примерах. Однако специалистам в данной области известны и другие модели фиброзного заболевания. Например, в патентной заявке США № 20050238620 фиброз легких индуцируют у крыс (Sprague Dawley, содержащих имплантированные хирургическим путем катетеры в яремной вене, Charles River Laboratories, Wilmington, Mass.) путем инъекции блеомицина в легкие. Блеомицин представляет собой противоопухолевое средство, которое после инъекции в дыхательные пути вызывает фиброз легких животного. Использование таких моделей является стандартным способом изучения фиброза легких (Crouch, E. 1990. Pathobiology of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 259:L159-Ll84). В таких способах, чтобы индуцировать фиброз, крыс анестезируют и регистрируют их состояние, проверяя достижение и поддержание правильного режима анестезии. Брюшную часть шеи подготавливают для разреза, выбривая шерсть и дезинфицируя. На брюшной стороне шеи делают срединный разрез, мышцы шеи оттягивают и обнажают трахею. 300 микролитров раствора, содержащего 3,3 ед/мл (1 единица) блеомицина (Calbiochem/EMD Biosciences, San Diego, Calif.) в стерильном 0,9% физиологическом растворе, вводят с помощью шприца и иглы 26 калибра в просвет трахеи. Контрольным крысам вводят физиологический раствор. Разрез закрывают двумя или тремя швами. Затем проводят процедуру, описанную Underwood et al. (2000. SB 239063, a p38 MAPK inhibitor, reduces neutrophilia, inflammatory cytokines, MMP-9, and fibrosis in lung. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279:L895-L902.). В процессе процедуры и после операции животное держат под нагревательной лампой и затем, после полного восстановления, снова помещают в свою клетку. В процессе проведения процедуры проверяют: i) имеет ли животное регулярное дыхание, ii) имеют ли уши и слизистые мембраны животного розовый цвет, iii) не отдергивает ли животное ступни, если ущипнуть пальцы ног, и iv) не моргает ли животное, если трогать его глаза или веки.

Для тестирования эффектов композиции против CCL21, животным, используемым в качестве модели фиброза, вводят композицию внутривенно через катетер яремной вены, имплантированный поставщиком. Композицию преимущественно готовят в физиологическом растворе (0,9% NaCl) и перед введением пропускают через фильтр 0,2 микрон.

Композиции против CCL21, особенно предпочтительные для применения в способах по настоящему изобретению, представляют собой антитела, способные к иммунному взаимодействию с CCL21. Предпочтительно такие антитела представляют собой моноклональные антитела, способные к иммунному взаимодействию только с CCL21 и его вариантами, но не с другими хемокинами. Предпочтительно антитело против CCL21 представляет собой гуманизированное антитело, которое вводят в состав композиции для введения человеку. Антитела против CCL21 для исследовательских целей хорошо известны специалистам в данной области. Например, R&D Systems (Minneapolis, MN) выпускает коммерчески доступный препарат, BAF457, представляющий собой мышиное рекомбинантное антитело против CC21, получаемое в E.coli, которое можно использовать в данном изобретении. PeproTech. (Rocky Hill, NJ) также выпускает моноклональные антитела против CCL21. Abeam (Cambridge, U.K., и Cambridge MA., USA) выпускает поликлональные антитела, способные к иммунному взаимодействию с CCL21 (например, козлиные поликлональные антитела против CCL21 ab10350 и ab10364), которые можно легко использовать в тестах по воспроизведению и продемонстрировать, что ингибирование действия CCL21 улучшает фиброз у животных моделей.

Поскольку мышиные и козлиные моноклональные антитела против CCL21 легкодоступны в данной области, предполагается, что такие антитела можно использовать в качестве "матриц" для получения человеческих версий, пригодных для лечения человека. Например, предполагается, что с использованием фаговых дисплеев можно получать полноразмерные антитела или их фрагменты, которые можно использовать в терапевтических способах настоящего изобретения. В других вариантах осуществления можно получить легкую или тяжелую цепь полноразмерного гуманизированного мышиного или козлиного иммуноглобулина, которая содержит человеческий константный участок, мышиные или козлиные CDR, и в основном мышиный или козлиный каркасный участок, который содержит ряд "гуманизирующих" изменений в аминокислотном составе, уменьшающих вероятность побочных реакций при введении такого антитела человеку. Во многих вариантах осуществления "гуманизированное антитело" представляет собой антитело, содержащее гуманизированную вариабельную легкую цепь и/или гуманизированную вариабельную тяжелую цепь. Модифицированное антитело, "гуманизированное" посредством процесса "гуманизации", связывается с тем же антигеном, что и исходное антитело, предоставляющее CDR, но обычно является менее иммуногенным для людей, чем исходное антитело. Естественно, приведенное выше описание антител против CCL21 также применимо к CCL19, антитела против которого доступны в данной области.

Следует понимать, что используемые в настоящем изобретнии антитела могут либо содержать домен Fc, либо не содержать домен Fc. В некоторых вариантах осуществления в качестве терапевтических композиций можно использовать поливалентные антитела. Под "поливалентными антителами" подразумеваются рекомбинантные антителоподобные молекулы, которые содержат связывающие домены для нескольких эпитопов. Например, для лечения фиброза особенно эффективным может быть поливалентное антитело, которое связывает как CCL21, так и CCL19. В других терапевтических композициях полученные из антитела белки включают молекулы, в которых цепь Fab антитела гибридизована со связывающими доменами, например двухвалентные антитела или трехвалентные антитела Fab-scFv. Такие молекулы представляют собой эффективные рекомбинантные биспецифичные антитела средней массы, которые не содержат участка Fc. Антитела, не содержащие домен Fc, обладают преимуществом, поскольку присутствие такого домена в родственной антителу терапевтической молекуле может увеличивать время существования в сыворотке благодаря защите от метаболизма в печени, кроме того, оно может обеспечивать перекрестное связывание с другими клетками посредством взаимодействия с рецептором Fc и, как следствие, увеличивать токсические побочные эффекты, обусловленные системным инициированием иммунных эффекторных клеток. Таким образом, некоторые родственные антителам терапевтические молекулы не содержат домена Fc. Специалистам в данной области известны способы получения таких родственных антителам молекул. Например, рекомбинантные полиспецифичные антитела можно получить путем сочетания структурных элементов антител (таких как Fc, (Fab')2, Fab, scFv, двухвалентные антитела) с гетеродимерными мотивами.

Предполагается, что в композициях для лечения фиброзных заболеваний помимо антител можно использовать молекулы миРНК, направленные против CCL21 и/или CCL19. Специалистам в данной области хорошо известно, что двухцепочечные РНК (дцРНК) у многих организмов могут вызывать посттрансляционное последовательность-специфичное молчание гена в результате процесса, известного как интерференция РНК (РНКи). Проведенные в последнее время работы позволяют предположить, что специфичными к последовательности медиаторами РНКи являются фрагменты РНК (Elbashir et al., Nature, 411, 494, 2001). В настоящее время известно, что подавление экспрессии генов с помощью указанных маленьких интерферирующих РНК (миРНК) является природной стратегией достижения молчания генов, встречающейся у C. elegans, дрозофил, растений, а также в мышиных эмбриональных стволовых клетках, ооцитах и ранних эмбрионах (Cogoni et al., Antonie Van Leeuwenhoek, 65, 205, 1994; Baulcombe, Plant Mol. Biol., 32, 79, 1996; Kennerdell, Cell, 95, 1017 1998; Timmons, Nature, 395, 854, 1998; Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13959, 1998; Wianny and Zernicka-Goetz, Nat. Cell Biol., 2, 70, 2000; Yang et al., Mol. Cell Biol., 21, 7807, 2001; Svoboda et al., Development, 127, 4147 2000). В культуре клеток млекопитающих после миРНК-опосредованного уменьшения экспрессии генов клетки трансфицируют синтетическими олигонуклеотидами РНК (Caplan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98, 9742, 2001 ; Elbashir et al., Nature, 41 1, 494, 2001).

Как правило, для осуществления экспрессии терапевтических миРНК внутри клетки, получают молекулу РНК, содержащую шпильку (например, шпильку размером 21 п.о.), которая несет последовательности, направленные против мишеневого гена, в данном случае, гена CCL21 и/или гена CCL19. миРНК, или последовательность ДНК, кодирующую миРНК, вводят в клетку-мишень, такую как клетка, продуцирующая CCL21, в участке фиброзного повреждения. миРНК уменьшает количество мишеневой мРНК и экспрессию данного агента на уровне белка. Применение тканеспецифичного промотора обеспечивает благоприятное тканеспецифичное мечение терапевтических молекул миРНК. Конструкцию, кодирующую терапевтическую миРНК, создают так, чтобы промотор и шпилька находились непосредственно друг за другом. Промотор для конкретной конструкции выбирают из легкодоступных промоторов, известных в данной области, в зависимости от того, какую экспрессию нужно осуществить: индуцируемую, тканеспецифичную или специфичную для клетки. Конструкцию вводят в клетку-мишень, например, путем инъекции, и оставляют клетки для достижения уменьшения экспрессии мишеневого гена.

Таким образом, в иллюстративных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вектору (т.е. вирусному вектору, обычно используемому для экспрессии и/или доставки рекомбинантного гена, такой как аденовирусный, лентивирусный, адено-ассоциированный вирусный (AAV), ретровирусный, полиовирусный, вирус простого герпеса (HSV), мышиный вирусный вектор на основе Мэлони и т.п.), содержащему экспрессирующую кассету, в состав которой входит выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая маленькую интерферирующую РНК (миРНК), направленную против CCL21. Структура нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL21, хорошо известна специалистам в данной области, как и структура CCL19, см., например, Genbank, номер доступа AB002409, где описана последовательность мРНК человеческого CCL21; Genbank, номер доступа NM_006274, где описана последовательность мРНК человеческого CCL21; номер доступа в Genbank для CCL21 макак-резусов приведен в NM_001032855; в Genbank также находятся свиные, мышиные и собачьи последовательности, которые входят в объем данной заявки. Все указанные последовательности можно получить и сконструировать миРНК против участков молекулы, которые играют важную роль в функциональной экспрессии CCL21 (следует отметить, что описания родственных белковых последовательностей можно использовать для получения рекомбинантных антител и генерирования антител против данных последовательностей). миРНК может быть направлена на любые 10-30 смежных нуклеотидов такой нуклеотидной последовательности, предпочтительно на такую последовательность, которая играет важную роль в функциональной экспрессии хемокина. миРНК может образовывать шпилькообразную структуру, включающую двойную спираль и петлю. Петлеобразный участок может содержать от 4 до 10 нуклеотидов, например 4, 5 или 6 нуклеотидов. Двойная спираль предпочтительно составляет менее 30 нуклеотидов в длину, например от 19 до 25 нуклеотидов. миРНК может дополнительно содержать "липкий" участок. Такой "липкий" участок может находиться на 3'-конце, на 5'-конце или на обоих концах. Длина "липкого" участка может составлять, например, от 1 до 6 нуклеотидов. Экспрессирующая кассета может дополнительно содержать промотор. Примеры промоторов включают регулируемые промоторы и конститутивные промоторы. Например, можно использовать промоторы CMV, RSV или polIII. Экспрессирующая кассета может также содержать сигнал полиаденилирования, например синтетический минимальный сигнал полиаденилирования. В состав нуклеотидной последовательности также может входить маркерный ген.

Естественно, кроме композиций, направленных против CCL21 и/или CCL19, можно использовать композиции, направленные против CCR7, рецептора указанных хемокинов. Далее, в частности, рассматриваются способы комбинированной терапии, в которых режимы лечения, направленные на уменьшение эффектов/активности CCL21, сочетают с режимами лечения, направленными на уменьшение эффектов/активности рецептора. Другие конкретные предпочтительные виды комбинированной терапии включают сочетания способов лечения, направленных на уменьшение активности CCL21 при фиброзном заболевании, и существующих способов лечения фиброза. Например, в настоящее время доказано, что циклофосфамид, один или в сочетании с микофенолятом мофетилом (MMF), либо преднизолон или другие кортикостероиды эффективно улучшают состояние при фиброзе легких. Клинические исследования также дают многообещающие результаты в отношении безопасности и эффективности босентана (Tracleer®) при идиопатической и склеродермической форме фиброза легких. Азатиоприн также может играть роль в стабилизации легочной функции и улучшении симптомов при фиброзных заболеваниях. Терапию цитокинами (IFN-гамма) также можно использовать в качестве способа лечения фиброзных заболеваний. Любые из указанных композиций можно использовать в сочетании со способами лечения, направленными против CCL21 и/или против CCL19 (следует отметить, что способы лечения, направленные "против CCL21" и/или "против CCL19", включают применение как антител, так и молекул миРНК), с целью уменьшения, устранения или иным образом подавления симптомов фиброза.

Независимо от того, получают ли антитела против конкретного антигена в организме животного или их получают в виде химерных антител с использованием фагового дисплея или с помощью генно-инженерных методов, такие антитела, в конечном счете, вводят в состав фармацевтических композиций для лечения фиброзных заболеваний. Подобным образом, препараты миРНК тоже, в конечном счете, вводят в состав фармацевтических композиций для лечения указанных заболеваний. Локальная доставка композиция является предпочтительной, однако можно использовать и системную доставку.

Фармацевтические композиции для введения в соответствии с настоящим изобретением могут содержать любой из описанных выше препаратов молекул против CCL21 и/или против CCL19. Фармацевтические композиции также могут содержать другие средства, используемые для лечения нарушений поверхностного метаболизма, например бронхолитические средства, особенно если у пациента наблюдаются признаки реактивности дыхательных путей, а также муколитические средства, такие как ацетилцистеин, трипсин и амброксол, и/или GM-CSF, кортикостероиды и другие противовоспалительные средства. Каждый из указанных препаратов в некоторых аспектах предоставляется в фармацевтически приемлемой форме, необязательно объединенной с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции вводят с помощью любых способов, обеспечивающих достижение предполагаемых целей. Конкретные количества и режимы введения композиций для ингибирования, устранения или иного воздействия на эффекты CCL21 или CCL19 в участке фиброзного повреждения в соответствии со способами настоящего изобретения могут быть легко определены рядовыми специалистами в данной области с помощью анализов, используемых для диагностики заболевания и определения уровня эффекта, продуцируемого при данном терапевтическом вмешательстве.

Любые схемы лечения, композиции, способы введения и т.п., которые применялись ранее для лечения заболеваний легких, можно легко модифицировать и использовать для лечения IIP в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых случаях, если одышка является крайне тяжелой, можно использовать механическую вентиляцию. Такая вентиляция может включать высокочастотную пульсационную вентиляцию (HFOV) или другие, нетрадиционные формы механической вентиляции.

В рамки настоящего изобретения входят все композиции, которые содержат, по меньшей мере, одно средство, уменьшающее действие или активность CCL21, в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели, заключающейся в уменьшении, ингибировании, предотвращении или снижении активности CCL21, например, путем уменьшения или снижения количества фибробластов в участке фиброзного повреждения. В некоторых аспектах такое лечение приводит к облегчению одного или нескольких симптомов IIP.

В других аспектах композиции по настоящему изобретению вводят с использованием ингалятора или перорально.

Само собой разумеется, что подходящая доза композиции по настоящему изобретению зависит от возраста, здоровья и массы реципиента, вида сопутствующего лечения, если таковое имеет место, частоты обработки и природы желаемого эффекта. Однако специалист в данной области может установить режим дозирования для каждого конкретного больного без излишнего экспериментирования. Определение режима дозирования обычно включает корректирование стандартной дозы, например уменьшение дозы, если пациент имеет низкую массу тела.

Общую дозу терапевтического средства вводят в несколько приемов или в один прием. В некоторых вариантах осуществления композиции вводят отдельно, в других вариантах осуществления композиции вводят в сочетании с другими терапевтическими средствами, направленными против заболевания или направленными на другие симптомы данного заболевания.

В некоторых аспектах композиции по настоящему изобретению вводят в состав фармацевтических композиций, подходящих для применения in vivo при лечении фиброзного заболевания. Как правило, такие композиции практически не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут оказывать вредное воздействие на людей или животных. В некоторых аспектах получают композиции для непосредственного введения в легкие. Композиции предназначены для перорального введения с помощью ингалятора, однако можно использовать и другие способы введения (такие как инъекция и т.п.). Высокий уровень экспрессии CCL21 в фибробластах IIP, но не в нормальных фибробластах и не в других тканях, позволяет сделать вывод, что основная роль данного хемокина связана с образованием фиброзных повреждений, в особенности это справедливо в отношении IBP. Предпочтительно используют композиции и способы введения, которые обеспечивают легкое введение композиций в ткани легких.

Для того чтобы придать композициям стабильность и обеспечить поглощение композиций в мишеневом участке, обычно используют подходящие соли и буферы. Как правило, белковые композиции по изобретению находятся в лиофилизированной форме, предназначенной для преобразования перед введением. Альтернативно композиции можно получать в виде таблеток или других форм для пероральной доставки. Буферы и растворы для преобразования терапевтических средств могут предоставляться вместе с фармацевтической композицией для получения водных композиций по настоящему изобретению перед введением. Такие водные композиции содержат эффективное количество каждого из используемых терапевтических средств, растворенное или диспергированное в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде. Такие композиции также называют инокулятами. Фраза "фармацевтически или фармакологически приемлемый" относится к молекулам и композициям, которые не вызывают вредных, аллергических или других неблагоприятных реакций при введении животному или человеку. В данном описании термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает все растворители и каждый из них в отдельности, диспергирующую среду, покрытия, противобактериальные и противогрибковые средства, средства для придания изотонических свойств, средства, замедляющие абсорбцию, и т.п. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением тех случаев, когда какая-либо среда или какое-либо средство являются несовместимыми с терапевтическими композициями, они могут применяться в терапевтических композициях. В состав композиций могут быть включены дополнительные активные ингредиенты.

Способы получения белков и нуклеиновых кислот для терапевтического введения также известны специалистам в данной области. Введение композиций настоящего изобретения осуществляют любым традиционным способом при условии, что используемый способ позволяет достичь мишеневой ткани. Чаще всего указанные композиции получают в форме для перорального введения, например с помощью ингалятора. Однако можно использовать и другие способы введения, например путем подкожной, внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, внутрибрюшинной, интратекальной, внутриглазной, ретробульбарной, внутрилегочной (например, с замедленным высвобождением), аэрозольной, подъязычной, назальной, анальной, вагинальной или чрескожной доставки, или путем хирургической имплантации в конкретный участок, особенно если пероральная доставка является проблематичной. Лечение может включать применение однократной дозы или нескольких доз в течение некоторого периода времени.

В некоторых вариантах осуществления активные соединения вводят в виде растворов свободного основания или фармакологически приемлемых солей в воде, содержащей поверхностно-активное вещество, такое как гидроксипропилцеллюлоза. Также получают дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. В случае обычных условий хранения и применения в состав данных препаратов вводят консервант, чтобы предотвратить рост микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии, а также стерильные порошки для получения растворов или дисперсий для немедленного введения путем инъекции. Во всех случаях форма должна быть стерильной и в достаточной степени жидкой, чтобы ее можно было легко ввести через шприц. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия мкроорганизмов, таких как бактерии и грибки. В некоторых аспектах носитель представляет собой растворитель или диспергирующую среду, которая содержит, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси, а также растительные масла. Подходящую текучесть поддерживают, например, путем применения покрывающего вещества, такого как лецитин, с получением частиц требуемого размера в случае дисперсии, и путем применения поверхностно-активных веществ. Активность микроорганизмов подавляют с помощью разных противобактериальных и противогрибковых средств, таких как парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимерозал и т.п. Во многих случаях предпочтительно включать в состав композиции средства, придающие изотонические свойства, например сахара или хлорид натрия. Чтобы достичь пролонгированную абсорбцию композиций для инъекций, в состав композиций вводят средства, замедляющие абсорбцию, такие как моностеарат алюминия и желатин.

Стерильные растворы для инъекций получают путем растворения требуемого количества активных соединений в подходящем растворителе, содержащем, при необходимости, другие ингредиенты, перечисленные выше, с последующей стерилизацией фильтрованием. Дисперсии обычно получают путем смешивания различных стерильных активных ингредиентов со стерильной средой, которая содержит основную диспергирующую среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. Стерильные порошки для получения стерильных растворов для инъекций получают путем вакуумной сушки и сушки из замороженного состояния в виде порошкообразного активного ингредиента в смеси с дополнительным требуемым ингредиентом из приготовленного ранее раствора, стерилизованного фильтрацией.

В данном описании термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает все растворители и каждый из них в отдельности, диспергирующую среду, покрытия, противобактериальные и противогрибковые средства, средства для придания изотонических свойств, средства, замедляющие абсорбцию, и т.п. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением тех случаев, когда какая-либо среда или какое-либо средство являются несовместимыми с терапевтическими композициями, они могут применяться в терапевтических композициях. В состав композиций могут быть включены дополнительные активные ингредиенты.

В некоторых аспектах композиции настоящего изобретения получают в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образуемые свободными аминогруппами белка) и соли, образованные неорганическими кислотами, такими как, например, хлористоводородная или фосфорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образуемые свободными карбоксильными группами, получают из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и из органических оснований, таких как изопропиламин, триэтиламин, гистидин, прокаин и т.п.

После получения растворов их вводят с помощью способа, совместимого с лекарственной композицией в терапевтически эффективном количестве. Композиции вводят в виде разных лекарственных форм, таких как растворы для инъекций, капсулы, высвобождающие лекарственное средство и т.п. Водный раствор для парентерального введения при необходимости забуферивают соответствующим образом, а жидкий разбавитель вначале делают изотоническим с помощью достаточного количества физиологического раствора или глюкозы. Указанные конкретные водные растворы в особенности подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения.

"Стандартная доза" представляет собой дискретное количество терапевтической композиции, диспергированной в подходящем носителе. В отдельном варианте осуществления парентеральное введение терапевтических композиций проводят путем начальной болюсной инъекции с последующей непрерывной инфузией для поддержания терапевтических уровней лекарственного средства в кровотоке. Рядовые специалисты в данной области могут легко оптимизировать эффективные дозы и режимы введения в соответствии с медицинской практикой и клиническим состоянием конкретного пациента.

Частота введения дозы зависит от фармакокинетических параметров средств и способов введения. Оптимальная фармацевтическая композиция определяется специалистом в данной области в зависимости от способа введения и желаемой дозы. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo вводимых средств. В зависимости от способа введения подходящую дозу рассчитывают в зависимости от массы тела, площади поверхности организма или размера органа. Применение животных моделей облегчает определение подходящих доз конкретного терапевтического средства. Дополнительное уточнение расчетов, необходимое для определения подходящей дозы лекарственного средства, обычно осуществляется рядовым специалистом в данной области без излишнего экспериментирования, особенно с учетом информации по дозировкам и анализов, раскрытых в данном описании, а также фармакокинетических данных, полученных на животных или в клинических испытаниях на людях.

Как правило, подходящие дозы устанавливаются с помощью результатов стандартных анализов, проводимых с целью определения уровней в крови, в сочетании с результатами определения ответа на соответствующую дозу. Конечный дозировочный режим устанавливает лечащий врач с учетом факторов, модифицирующих действие лекарственных средств, таких как специфическая активность лекарственного средства, тяжесть повреждения и интенсивность ответа пациента, возраст, состояние, масса тела, пол и диета пациента, тяжесть инфекции, время введения и другие клинические факторы. По мере проведения исследований появляется дополнительная информация, касающаяся подходящих дозировочных уровней и продолжительности лечения для конкретных заболеваний и состояний. Любые такие дозировочные режимы можно легко оптимизировать с помощью моделей заболевания, таких как описанные в данном документе модели грызунов.

Очевидно, что фармацевтические композиции и способы лечения настоящего изобретения можно использовать в областях медицины и ветеринарии. Следовательно, больной, подлежащий лечению, представляет собой млекопитающее, такое как человек или другое млекопитающее животное. В применении к ветеринарии больные включают, например, сельскохозяйственных животных, таких как коровы, овцы, свиньи, лошади и козы, животных-компаньонов, таких как собаки и кошки, экзотических и/или диких животных, лабораторных животных, таких как мыши, крысы, кролики, морские свинки и хомяки, и домашних птиц, таких как куры, индейки, утки и гуси.

Настоящее изобретение также относится к наборам для лечения фиброзных заболеваний. Такие наборы включают, по меньшей мере, первую композицию, содержащую описанные выше терапевтические средства, направленные против CCL21 и/или против CCL19, в фармацевтически приемлемом носителе. Другой компонент представляет собой второе терапевтическое средство для лечения нарушения, наряду с подходящим контейнером и средами для введения терапевтических композиций. Наборы могут дополнительно содержать растворы или буферы для эффективной доставки первой и второй композиций. Наборы могут дополнительно содержать катетеры, шприцы или другие устройства для доставки одной или нескольких композиций в соответствии со способами настоящего изобретения. Наборы могут дополнительно содержать инструкции с описанием терапевтических режимов введения.

ПРИМЕРЫ

Нижеследующие примеры приведены для иллюстрации некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения. Специалистам в данной области следует понимать, что методы, раскрытые в нижеследующих примерах, представляют собой методы, разработанные авторами настоящего изобретения для успешного осуществления изобретения, и следовательно составляют некоторые аспекты его осуществления. Однако в свете настоящего описания специалисты в данной области смогут понять, что можно осуществить разные изменения конкретных вариантов осуществления и при этом получить такой же или подобный результат, не отступая от объема и сущности изобретения.

Пример 1: Материалы и способы, используемые для демонстрации роли CCR7 в интерстициальной идиопатической пневмонии

Компиляция результатов клинических, физиологических, радиографических и патологических анализов показывает, что пациенты предположительно имеют IIP (Flaherty et al., Am. J. Med., 110:278-282 (2001 ); Flaherty et al., Curr. Opin. Pulm. Med., 6:404-410 (2000); Kazerooni et al., AJR Am. J. Roentgenol., 169:977-983 (1997); American Thoracic Society, European Respiratory Society (ATS/ERS), Am. J. Respir. Crit. Care Med., 165:277-304 (2002)). Никто из пациентов, участвующих в настоящем исследовании, не подвергался предварительной хирургической биопсии и не получал лечение IIP. SLB осуществляют в рамках исследования патобиологии фиброзного заболевания легких в интервале от мая 2000 г. до августа 2004 г., проводимого Специализированным исследовательским центром Мичиганского университета. Гистологически нормальные образцы биопсии легких с отсутствием патологических признаков заболевания получают из отдаленных краев образцов, вырезанных у пациентов, подвергавшихся торакальной резекции по поводу рака легкого. Каждый SLB обрабатывают отдельно в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком и подвергают молекулярному, белковому и иммуногистохимическому анализу (см. ниже).

Получение РНК и кДНК из SLB. Часть каждого SLB, используемую для молекулярного анализа, быстро замораживают в жидком азоте и хранят при 280°C. Чтобы выделить РНК, полученные образцы оттаивают на льду и механически гомогенизируют в реагенте TRIzolH (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA), после чего получают общую РНК, следуя инструкциям производителя. Затем очищенную РНК из SLB подвергают обратной транскрипции с получением кДНК, используя набор для обратной транскрипции BRL и олигонуклеотидные праймеры (dT) 12-18. Буфер для амплификации содержит 50 мМ KCl, 10 мМ Tris/HCl (pH 8,3) и 2,5 мМ MgCl₂.

Матричный анализ генов. Мембраны с генными чипами Non-Rad GEArray от SuperArray Inc (Bethesda, Maryland, USA) используют для анализа изменения профиля генов человеческих хемокинов и рецепторов хемокинов, как описано выше (Choi et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 170:508-515 (2004)). Глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназу (GAPDH) используют в качестве внутреннего положительного контроля, поскольку она постоянно экспрессируется во всех SuperArray, анализируемых в данном исследовании.

Анализ методом ПЦР Taqman в режиме реального времени. Экспрессию генов человеческих CCR7, CXCR4, CCL19, CCL21 и CXCL12 в IIP и нормальных краевых SLB анализируют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскриптазой в режиме реального времени с использованием системы детекции последовательностей ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA), как описано выше (Jakubzick et al., Am. J. Pathol., 162:1475-1486 (2003)). кДНК из SLB верхней и нижней долей анализируют на экспрессию рецептора хемокина, хемокина и GAPDH (внутренний контроль). Все используемые праймеры и зонды получают от Applied Biosystems. Экспрессию гена хемокина нормализуют по GAPDH и затем рассчитывают степень изменения экспрессии хемокина. Увеличение степени экспрессии гена цитокина рассчитывают путем сравнения экспрессии гена у всех пациентов с экспрессией, детектируемой в верхних и нижних долях пациентов из группы с нормальной краевой опухолью.

Анализ ELISA. Концентрации человеческих CCL19, CCL21 и CXCL12 измеряют в не содержащих клеток образцах супернатанта объемом 50 мл, полученных из гомогенизированных IIP и нормальных краевых SLB, с помощью стандартизированного иммуноферментного твердофазного сэндвич-анализа (ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Для получения стандартных кривых, с помощью которых определяют концентрации хемокинов в образцах, используют рекомбинантные человеческие хемокины. Предел детекции CCL19 для детекции CCR7, CXCR4, CD45, CD34 и aSMA в SLB используют иммуногистохимические и обычные иммунохимические методы, как описано ранее (Jakubzick et al., J. Clin. Pathol., 57:477-486 (2004)). Используют следующие мишеневые антитела и соответствующие им контрольные изотипы: мышиное антитело против человеческого CCR7 и мышиный IgMk, полученные от BD Biosciences PharMingen (San Diego, California, USA); мышиное антитело против человеческого CXCR4 и мышиный IgG2B, полученные от R&D Systems; мышиное антитела против человеческих CD45, CD34 и коллагена 1, полученные от Abcam (Cambridge, Massachusetts, USA), и мышиный IgG1, полученный от R&D Systems. SLB верхних и нижних долей, полученных от 10 пациентов с UIP, шести пациентов с NSIP и пяти пациентов с RBILD, анализируют с помощью указанных иммуногистохимических методов. Обычные края удаленных опухолей анализируют у пяти пациентов. Получают серийные срезы каждого SLB (толщиной 5 мм) и анализируют их, определяя совместную локализацию CCR7 и других антигенов в соседних срезах.

Пример 2: Результаты, демонстрирующие роль CCR7 в интерстициальной идиопатической пневмонии

SuperArray анализ транскриптов CCR7, CXCR4, CCL19, CCL21 и CXCL12 в IIP и нормальных краевых SLB. Присутствие CCR7 и CXCR4 в IIP и нормальных краевых SLB определяют с помощью специфического SuperArray GEArray. Хотя данный метод является качественным, но не количественным, экспрессию CCR7 (Фиг.1A) и CXCR4 (Фиг.1B) нормализуют по GAPDH, и приводят значения для обоих рецепторов. Самый высокий относительный уровень экспрессии CCR7 и CXCR4 наблюдается в образцах биопсии верхней и нижней долей группы пациентов с UIP (n=7). Образцы биопсии верхней и нижней долей в группах пациентов с NSIP (n=6), RBILD (n=6) и нормальной краевой опухолью (n=5) анализируют подобным образом. Хотя существенные отличия отсутствуют, в целом, относительная экспрессия обоих рецепторов хемокинов связана с тяжестью заболевания следующим образом: UIP.NSIP.RBILD.нормальная краевая опухоль. В настоящее время идентифицированы два лиганда CCR7, CCL19 (Yoshida et al., J. Biol. Chem., 272:13803-13809 (1997)) и CCL21 (Campbell et al., J. Cell Biol., 141:1053-1059 (1998)). CCL19 (или ELC, экзодус-3 и CKb-1134) конститутивно экспрессируется в афферентном лимфатическом эндотелии и в Т-клеточной области лимфатических узлов, что свидетельствет о его ключевой роли в перемещении дендритных клеток и T-клеток к указанным иммунным участкам (Sallusto et al., Eur. J. Immunol., 29:1617-1625 (1999)). Параллельные исследования показали, что CCL21 (или SLC, экзодус-2, TCA-4 и CKb-99) имеет подобные функции и подобный характер экспрессии.33. Однако оба хемокина были обнаружены в легких (Gunn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:258-263 (1998)) и почках (Banas et al., J. Immunol., 168:4301-4307 (2002)), это позволяет предположить, что они могут играть роль, не связанную с иммунным контролем. Анализ относительной экспрессии транскрипта CCL19 показывает, что в образцах биопсии верхней и нижней долей UIP данный лиганд CCR7 присутствует в более высоких количествах (Фиг.2A). Подобные количества транскрипта CCL19 обнаружены в образцах биопсии NSIP и RBILD, а в нормальных краевых образцах биопсии наблюдаются более низкие количества. Однако в образцах биопсии IIP и нормальной краевой опухоли отчетливая экспрессия транскриптов CCL21 (Фиг.2B) и CXCL12 (Фиг.2C) не наблюдается.

Анализ экспрессии транскриптов CCR7, CXCR4, CCL19, CCL21 и CXCL12 в SLB IIP и нормальной краевой опухоли проводят методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Анализ ПЦР Taqman в режиме реального времени образцов биопсии верхней и нижней долей от четырех групп пациентов показывает значительное увеличение экспрессии транскрипта CCR7 как в верхних, так и в нижних SLB пациентов с UIP (n=18) по сравнению с образцами биопсии группы пациентов с нормальной краевой опухолью (n=5) (Фиг.3A). Средние значения уровней транскриптов CCR7 приблизительно в 146 (SEM, 58) и 675 (SEM, 300) раз выше в SLB верхней и нижней долей UIP, соответственно, по сравнению с соответствующей долей группы пациентов с нормальной краевой опухолью. Детектируют приблизительно пятикратное увеличение экспрессии транскрипта CCR7 в образцах биопсии нижней доли UIP по сравнению с образцами биопсии верхней доли UIP. Средние значения уровней транскриптов CCR7 в SLB как верхней, так и нижней долей NSIP в четыре раза (SEM, 1) превышают значения, полученные для SLB нормальных краевых опухолей. Средние значения уровней транскриптов CCR7 в SLB RBILD также повышены по сравнению со значениями SLB нормальных краевых опухолей: в 36 (SEM, 28) раз в SLB верхней доли и в 4,4 (SEM, 3,2) раза в образцах биопсии нижней доли. Увеличение экспрессии транскрипта CCR7 в SLB NSIP и RBILD по сравнению с нормальными краевыми SLB не является значимым.

Полученные результаты являются уникальными для CCR7, поскольку анализ CXCR4 методом ПЦР Taqman показал отсутствие значительного увеличения экспрессии транскрипта CXCR4 в SLB IIP по сравнению с нормальными краевыми SLB (результаты не показаны). Наконец, в группах пациентов с IIP и нормальной краевой опухолью отсутствуют или не детектируются выраженные особенности или значительные различия в экспрессии транскриптов CCL19 (результаты не показаны), CCL21 (Фиг.3B) и CXCL12 (результаты не показаны). Однако максимальное увеличение экспрессии транскрипта CCL21 по сравнению с группой пациентов с нормальной краевой опухолью наблюдается в образцах биопсии верхней и нижней долей в группе пациентов с UIP (более чем в 40 раз выше, чем экспрессия в нормальных краевых SLB). Экспрессия транскрипта CCL21 сильнее увеличена в верхних и нижних SLB RBILD, чем в SLB NSIP. Вместе полученные результаты позволяют предположить, что экспрессия транскрипта CCR7 очень сильно увеличивается при UIP, и что при менее тяжелых формах IIP также происходит увеличение экспрессии транскрипта CCR7.

Анализ методом ELISA белков CCL19, CCL21 и CXCL12 в SLB IIP и нормальной краевой опухоли. На Фиг.4 показаны концентрации белков CCL19 (Фиг.4A), CCL21 (Фиг.4B) и CXCL12 (Фиг.4C) в не содержащих клеток супернатантах гомогенизированных SLB. Среди анализируемых групп пациентов не обнаружено выраженных особенностей и значительных различий в экспрессии CCL. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что фиброзные события при IIP не связаны с повышенной продукцией лигандов CCR7 и CXCR4 в легких.

Фокальная интерстициальная экспрессия белка CCR7 в SLB IIP. Анализ транскриптов с использованием SuperArray и методом ПЦР в режиме реального времени позволяет предположить, что экспрессия CCR7 гораздо выше в SLB IIP, чем в нормальных краевых SLB; чтобы подтвердить данные наблюдения проводят иммуногистохимический анализ срезов целых легких из IIP и нормальных краевых SLB. Как показано на Фиг.5, фокальная интерстициальная экспрессия CCR7 наблюдается в SLB групп пациентов с UIP, NSIP и RBILD. Хотя экспрессия CCR7 наблюдается в макрофагах пациентов с RBILD (Фиг.5F), в образцах биопсии UIP (Фиг.5B) и NSIP (Фиг.5D) фокальный интерстициальный характер экспрессии CCR7 связан не только с иммунными клетками. Несколько участков фокальной экспрессии белка CCR7 присутствует в интерстициальных областях всех SLB верхних и нижних долей группы пациентов с UIP (n=10). Следует отметить, что очаги экспрессии CCR7 связаны не только с фибробластами, другие клетки, в том числе мононуклеарные и эпителиальные клетки, также экспрессируют данный рецептор хемокинов. В подтипах NSIP и RBILD экспрессируется меньше CCR7, чем в более тяжелом подтипе UIP. Хотя в 50% указанных образцов биопсии наблюдается окрашивание CCR7, гораздо меньше фокальных участков экспрессии CCR7 наблюдается в SLB верхних и нижних долей группы пациентов с NSIP (n=6). В трех четвертях SLB RBILD (n=5) экспрессия CCR7 преимущественно происходит в кровеносных сосудах и мононуклеарных клетках, однако окрашивание CCR7 редко наблюдается в интерстициальных участках образцов биопсии из группы IIP. В противоположность выраженному окрашиванию, наблюдающемуся в SLB UIP, экспрессия CCR7 не детектируется иммуногистохимическими методами в SLB верхних и нижних долей пациентов с нормальной краевой опухолью (n=5) (Фиг.5H).

Анализ показывает, что в таких же IIP и нормальных краевых SLB окрашивание CCR7 и CXCR4 ограничено иммунными клетками и, что более важно, в четырех анализируемых группах пациентов экспрессия данного рецептора хемокинов находится на одинаковом уровне. Во всех образцах биопсии IIP и нормальной краевой опухоли наблюдается высокая экспрессия CXCR4, связанная с мононуклеарными клетками. Это отражено на Фиг.6, на которой показано характерное окрашивание CXCR4 в SLB UIP (Фиг.6B), NSIP (Фиг.6D), RBILD (Фиг.6F) и нормальной краевой опухоли (Фиг.5D). Таким образом, иммуногистохимический анализ показывает, что CCR7, в отличие от CXCR4, заметно экспрессируется в SLB IIP, но не в нормальных краевых SLB, и что экспрессия CCR7 при IIP локализована в фокальных интерстициальных участках.

Чтобы идентифицировать клетки, составляющие CCR7-положительные участки в SLB IIP, проводят дополнительный анализ экспрессии CD45 и CCR7 (Фиг.7) путем окрашивания серийных срезов. При иммуногистохимическом анализе SLB UIP обнаружено, что экспрессия CCR7 (Фиг.7B) частично перекрывается с экспрессией CD45 (Фиг.7C). Клетки, экспрессирующие CCR7 и CD45, представляют собой мононуклеарные клетки. Наоборот, хотя CCR7 интенсивно экспрессируется в образцах биопсии NSIP (Фиг.7E), иммунная локализация данного рецептора хемокина не соответствует иммунной локализации CD45. Подобные иммуногистохимические исследования SLB RBILD показывают аналогичное отсутствие совместной локализации CCR7 и CD45 (не показано). Следовательно, двойная экспрессия CD45 и CCR7 наблюдается в мононуклеарных клетках при UIP, но не других формах IIP. Как описано выше, CD34 представляет собой антиген гемопоэтических стволовых клеток, обнаруженный в фиброцитах периферической крови (Abe et al., J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)). Затем авторы настоящего изобретения определяют, действительно ли данный маркер можно обнаружить в гистологических срезах образцов биопсии IIP и нормальной краевой опухоли (Фиг.8). Интересно, что в образцах биопсии UIP наблюдается очень низкая экспрессия CD34 (Фиг.8B), и если она детектируется, данный антиген преимущественно локализуется в интерстициальных участках образца биопсии. Самая высокая экспрессия CD34 наблюдается в образцах биопсии NSIP, где данный маркер интенсивно экспрессируется в интерстициальных участках и на мононуклеарных клетках (Фиг.8D). Интенсивная экспрессия CD34 также наблюдается в интерстициальных участках в SLB RBILD (Фиг.8F) и нормальной краевой опухоли (Фиг.8H). С помощью последующего анализа совместной локализации CD34 и CCR7 в SLB IIP или нормальной краевой опухоли не обнаружено двойной экспрессии данных белков (результаты не показаны). Таким образом, CD34 экспрессируется на заметном уровне в SLB менее тяжелых форм IIP и нормальной краевой опухоли.

Коллаген 1 заметно экспрессируется фиброцитами в процессе рекрутинга данных клеток к участкам повреждения ткани (Abe et al., J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)). На Фиг.9 показаны результаты иммуногистохимического анализа экспрессии белка коллагена 1 в SLB IIP и нормальной краевой опухоли. Иммунная локализация коллагена 1 наблюдается в интерстициальных участках образцов биопсии пациентов с UIP (Фиг.9B), NSIP (Фиг.9D), RBILD (Фиг.9F) и нормальной краевой опухолью (Фиг.9H). Самая высокая экспрессия коллагена 1 наблюдается в SLB UIP, однако высокая экспрессия белка коллагена 1 также обнаружена в нормальных краевых SLB. Чтобы определить, действительно ли коллаген 1 и CCR7 совместно локализуются в образцах биопсии IIP, проводят анализ экспрессии обоих белков путем окрашивания серийных срезов (Фиг.10). Хотя коллаген 1 интенсивно экспрессируется во всех SLB UIP (Фиг.10B), CCR7 не экспрессируется в участках с высокой экспрессией коллагена 1 (Фиг.10C). Аналогичные результаты получены для SLB NSIP (не показаны) и RBILD (Фиг.10E,F), в которых не наблюдается совместная локализация коллагена 1 (Фиг.10E) и CCR7 (Фиг.10F). Таким образом, CCR7-положительные участки в SLB IIP не являются положительными по коллагену 1.

В CCR7-положительных участках SLB IIP отсутствует экспрессия aSMA. На Фиг.11 показано характерное иммуногистохимическое окрашивание CCR7 и aSMA в гистологических срезах легких пациентов с диагнозом UIP (Фиг.11A-C), NSIP (Фиг.11D-F) и RBILD (Фиг.11G-I). Во всех трех группах пациентов очаги экспрессии CCR7 (Фиг.11B,E,H) наблюдаются в интерстициальных участках легких, как описано выше. Однако участки серийных срезов, положительные по CCR7, не перекрываются с участками, положительными по aSMA (Фиг.11C,F,I).

Общей целью исследования является определение особенностей экспрессии CCR7, CXCR4, CCL19, CCL21 и CXCL12 в образцах биопсии легких пациентов из групп с IIP и нормальной краевой опухолью. Количественный анализ транскрипции и качественный анализ белков показывают, что экспрессия CCR7, но не CXCR4, сильно увеличивается в SLB UIP по сравнению с нормальными краевыми SLB. SLB UIP и в меньшей степени SLB NSIP содержат фокальные интерстициальные участки интенсивной экспрессии белка CCR7, которые при этом не являются положительными по CD34, коллагену 1 или aSMA. Фокальная экспрессия белка CCR7 наблюдается во всех SLB UIP и в меньшей степени в образцах биопсии NSIP и RBILD. В SLB UIP фокальная интерстициальная экспрессия белка CCR7 связана с некоторыми CD45-положительными клетками (Sallusto et al., Eur. J. Immunol., 28:2760-2769 (1998)), однако большая часть CCR7-положительных клеток не экспрессирует CD45, кроме того, перекрывание экспрессии CCR7 и CD45 в образцах биопсии пациентов с NSIP и RBILD не наблюдается. Хотя экспрессия CCR7 в интерстициальных участках образцов биопсии UIP и NSIP может быть связана с рекрутингом фиброцитов костно-мозгового происхождения (Bucala et al., Mol. Med., 1:71-8l (1994)), существуют данные, свидетельствующие о том, что CCR7-положительные участки в указанных образцах биопсии являются положительными по маркерам фиброцитов, таким как CD34 и коллаген 1. Кроме того, указанные CCR7-положительные клетки не содержат маркера миофибробластов aSMA. Полученные результаты позволяют предположить, что фокальная экспрессия белка CCR7 может указывать на участки идиопатического повреждения и неадекватную активацию резидентных фибробластов в большей степени, чем на рекрутинг фиброцитов, экспрессирующих CCR7. Хотя их роль в развитии заболевания человека еще не установлена и специфические клеточные поверхностные маркеры фиброцитов не идентифицированы, некоторые экспериментальные модели фиброза указывают на участие циркулирующих в кровотоке клеток костно-мозгового происхождения в фиброзных событиях, происходящих в коже (Fathke et al., Stem Cells, 22:812-822 (2004)) и легких( Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips et al., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004); Epperly et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 29:213-224 (2003); Schmidt et al., J. Immunol., 171:380-389 (2003)). Большую часть указанных экспериментальных исследований проводят с использованием костно-мозговых химерных моделей, полученных путем адоптивного переноса трансгенного мышиного костного мозга, экспрессирующего химерный зеленый флуоресцентный белок, облученным мышам. Показано, что положительные по зеленому флуоресцентному белку клетки костно-мозгового происхождения, которые имеют макрофагоподобную (Epperly et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 29:213-224 (2003)) и/или фибробластоподобную (Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips et al., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)) морфологию, вносят основной вклад в фиброз ткани. Кроме того, указанные клетки костно-мозгового происхождения являются чувствительными к марганец-супероксиддисмутазе (Epperly et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 29:213-224 (2003)) и экспрессируют коллаген 1 (Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips et al., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004); Schmidt et al., J. Immunol., 171:380-389 (2003)), CD34 (Schmidt et al., J. Immunol., 171:380-389 (2003)), CD45 (Phillips et al., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)), обратную траскриптазу теломеразы (Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004)), CCR7 (Hashimoto et al., J. Clin. Invest, 113:243-252 (2004)) и CXCR4 (Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips et al., J. Clin. Invest, 114:438-446 (2004)).

Тем не менее, существуют разногласия по поводу того, действительно ли фиброциты в конечном счете дифференцируют в миофибробласты после локализации в легких. В настоящее время полагают, что фиброциты, рекрутированные в бронхиальную ткань после воздействия аллергена (Schmidt et al., J. Immunol., 171:380-389 (2003)) или к участкам поврежденной кожи (Abe et al., J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)), дифференцируются в миофибробласты, тогда как фиброциты, мигрирующие в легкие в процессе интерстициального фиброза, вызванного блеомицином, не экспрессируют aSMA и не способны подвергаться индукции, приводящей к экспрессии данного маркера миофибробластов (Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004)). Другим вопросом, вызывающим разногласия в отношении указанных клеток, является наблюдение, что не все клетки костно-мозгового происхождения оказывают вредное влияние в процессе восстановления ткани. Соответственно, Ortiz и коллеги (Ortiz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:8407-8411 (2003)) показали, что мышиные мезенхимальные стволовые клетки мигрируют в поврежденные легкие, приобретают эпителиеподобный фенотип и уменьшают воспаление и отложение коллагена у мышей, получающих блеомицин. Очевидно, что для выяснения роли клеток костно-мозгового происхождения в клиническом фиброзном ответе требуются дополнительные исследования.

Побудительным мотивом для исследования CCR7 и CXCR4 в SLB пациентов с IIP являются результаты предыдущих исследований, показывающих, что CCL21, лиганд рецептора хемокина CCR7, эффективно стимулирует хемотаксис фиброцитов in vitro и in vivo (Abe et al., J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)), и что CXCR4-положительные клетки костно-мозгового происхождения вносят вклад в экспериментально индуцированный фиброз (Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips et al., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)). Постулируется, что фиброциты могут быстро проникать в участки повреждения ткани посредством хемотактических событий, опосредованных CCR7, CXCR4, или, возможно, другим рецептором хемокинов, и вносят вклад в патогенез фиброза легких (Phillips et al., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)). В настоящем исследовании фокальные участки экспрессии CCR7 анализируют на присутствие предполагаемых маркеров, включающих CD45, CD34 и коллаген 1 (Abe et al., J. Immunol., 166:7556-7562 (2001); Hartlapp et al., FASEB J., 15:2215-2224 (2001)). CD45 является единственным маркером, присутствующим в фокальных участках экспрессии CCR7, а совместная локализация CD45 и CCR7 наблюдается только в мононуклеарных клетках образцов биопсии UIP, но не других IIP. Кроме того, все указанные маркеры детектируют в нормальных краевых SLB, хотя иммуногистохимические методы не позволяют обнаружить CCR7 в указанных образцах биопсии. Хотя полученные результаты не исключают того, что CCR7-положительные клетки, присутствующие в образцах биопсии пациентов, представляют собой фиброциты, возможно, что экспрессия данных маркеров подвергается быстрой понижающей регуляции при миграции фиброцитов из кровотока в легкие.

Тот факт, что CXCR4 не присутствует в фокальных участках SLB IIP, также не исключает важную роль данного рецептора хемокинов в рекрутинге фиброцитов и/или коллаген-продуцирующих клеток костного мозга в легкие. Диффузный характер экспрессии CXCR4 наблюдается во всех анализируемых SLB, причем большая часть клеток, экспрессирующих данный рецептор хемокинов, представляет собой мононуклеарные клетки.

С учетом аномальных синтетических и пролиферативных характеристик фибробластов UIP, отражающихся в гистологически различных очагах фибробластов (King et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 164:1025-1032 (2001)), авторы настоящего изобретения предполагают, что данные клетки также могут неправильно отвечать на лиганды-хемокины, которые обычно регулируют функции иммунных клеток. Резидентные фибробласты ткани составляют основной компонент пространственной организации легких, и многие исследователи полагают, что несоответственная активация данных клеток лежит в основе патологического фиброзного ответа, наблюдающегося при UIP и, возможно, других формах IIP (Suganuma et al., Thorax, 50:984-989 (1995); Hogaboam et al., Proc. Assoc. Am. Physicians, 110:313-320 (1998); Ramos et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 24:591-598 (2001); Selman et al., Respir. Res., 3:3 (2002)). Факторы, участвующие в такой несоответственной активации пока не выяснены, однако данные, полученные из нескольких лабораторий, указывают на то, что хемокины могут играть роль в данном процессе (van den Blink et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz), 48:539-545 (2000); Selman, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 168:730-731 (2003)). Например, широко известно, что фибробласты UIP из фиброзных легких мигрируют быстрее, чем фибробласты контрольных легких (Suganuma et al., Thorax, 50:984-989 (1995)), а результаты проводимых на мышах исследований позволяют предположить, что в увеличении скорости миграции основную роль играют хемокины (Moore et al., J. Immunol., 167:4368-4377 (2001)). Стимулом для исследования вероятности того, что CCR7 и CXCR4 могут играть роль в аберрантной, связанной с миграцией активности клеток при IIP, являются последние открытия в области биологии рака, заключающиеся в том, что на клетках рака молочной железы экспрессируется уникальный ряд рецепторов хемокинов, которые отчасти обуславливают метастатические свойства опухолей молочной железы (Muller et al., Nature, 410:50-56 (2001)).

Таким образом, настоящее исследование демонстрирует фокальную интерстициальную экспрессию CCR7 при IIP. Природа клеток, экспрессирующих данный рецептор, пока полностью не определена, однако области, содержащие фокальную экспрессию CCR7, не являются положительными по CD34 и коллагену 1. CCR7-экспрессирующие клетки интерстициальных участков образцов биопсии IIP также не экспрессируют aSMA, следовательно, вероятность того, что данные клетки представляют собой миофибробласты, исключается.

Результаты, полученные в приведенном ниже примере 3, демонстрируют, что экзогенные CCL19 и CCL21 оказывают разное влияние на синтетические и пролиферативные свойства фибробластов IIP, но не нормальных краевых фибробластов. Данные исследования имеют потенциальное терапевтическое значение, поскольку они показывают, что можно ингибировать миграцию фиброцитов и/или активацию резидентных легочных фибробластов в ответ на CCR7-специфичные хемокины, и, как следствие, предотвращать избыточную продукцию внеклеточного матрикса и инициировать соответствующее восстановление легких.

Пример 3: Нацеливание на CCL19 или CCL21 с целью лечения хронических фиброзных нарушений

В данном примере подробно описываются новые возможности нацеливания на CCL19 и/или CCL21 при хроническом фиброзе легких. Хронический фиброз легких известного и идиопатического происхождения представляет собой экстраординарную клиническую проблему, способы его лечения обладают ограниченной эффективностью или являются токсичными (Flaherty et al., Am. J. Med., 110:278-282 (2001); Hampton et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 149:A878 (1994)), а средний коэффициент выживаемости после диагностирования заболевания меняется мало (Ryu et al., Mayo Clin. Proc, 73:1085-1101 (1998); Lasky et al., Environ. Health Perspect., 108 Suppl 4:751-762 (2000)). Профиброзные стимулы известны, они включают облучение, вдыхание минеральных и органических частиц, газообразные оксиданты, фармацевтические продукты и инфекционные организмы, тогда как природа этиологических факторов, инициирующих клиникопатологические процессы идиопатической интерстициальной пневмонии (IIP), является предметом для обсуждений. IIP представляет собой отдельную группу нарушений, поражающих дистальную легочную паренхиму, которые обладают рядом общих признаков, однако ощущаются достаточно по-разному, чтобы диагностировать их как разные нарушения (Travis et al., Am. J. Surg. Path., 24:19-33 (2000)). Их патогенез остается неясным, однако полагают, что они возникают вокруг повреждения (или нескольких повреждений) легкого после попыток излечивания данного повреждения. Считается, что фибробластные очаги, небольшие агрегаты активно пролиферирующих фибробластов, представляют собой формирование первичных очагов повреждения и указывают на протекание активного фиброза. В настоящее время существует гипотеза, заключающаяся в том, что реакция человеческих фибробластов на CCL19 и CCL21 (вследствие повышающей регуляции CCR7) приводит к несоответствующей активации данных клеток и, как следствие, к избыточным фиброзным ответам, наблюдающимся при IIP.

Интересно, что цитокины в легких фиброзных пациентов могут благоприятствовать аберрантному ответу на CCL19 и CCL21, это подтверждают другие исследователи, которые обнаружили наличие высоких уровней белка TNF-α (Ziegenhagen et al., J. Investig. Med., 46:223-231 (1998); Kapanci et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152:2163-2169 (1995)) и пониженных уровней IL-10 (Martinez et al., Am. J. Physiol., 273:L676-683 (1997)), цитокинов, модулирующих рецептор, с которым связываются указанные лиганды. Фибробласты людей с тяжелыми формами фиброза легких отчетливо отвечают на CCL19 и CCL21, что делает эти лиганды притягательными мишенями для лечения фиброзных заболеваний легких и, возможно, других тканей.

Авторы настоящего изобретения изучили возможность индукции фиброза легких путем внутривенного введения линий человеческих фибробластов иммунодефицитным мышам. С помощью данной модели можно определить, могут ли введенные внутривенно человеческие фибробласты инициировать фиброзный ответ in vivo в системе, не способной генерировать воспалительный ответ.

Результаты также показывают, что данную модель можно использовать для тестирования эффективности нацеливания на CCR7 или его лигандов в процессе инициации или после развития фиброза легких. Показано, что мыши CB-17-bg SCID идеально подходят для исследований с использованием адоптивного переноса человеческих фибробластов, поскольку мыши CB-17-bg не содержат T- и B-клеток (подобно CB-17 и ICR SCID), и, кроме того, они несут мутацию beige, приводящую к ухудшению функций цитотоксичных T-клеток, макрофагов и NK-клеток.

Внутривенное введение фибробластов, выращенных из образцов биопсии фиброзной ткани человека, мышам CB-17-bg вызывает гистологически очевидный и выраженный фиброз легких, детектируемый с помощью окрашивания трихромом Масона.

В других исследованиях ткани легких мышей SCID анализируют на 35 день после инъекции фибробластов с помощью гидроксипролинового анализа и обнаруживают, что уровни гидроксипролина значительно повышены в образцах легких мышей, получающих фибробласты, выращенные из образцов биопсии фиброзной ткани человека, по сравнению с мышами, получающими нормальные человеческие фибробласты. Таким образом, результаты, полученные с использованием гуманизированной модели SCID, позволяют предположить, что фиброзное заболевание можно "передавать" с помощью человеческих фибробластов IIP. Такая гуманизированная модель SCID позволяет определять факторы, участвующие в поддержании легочного фиброгенеза.

В исследованиях, проводимых на людях, показано, что экспрессия транскрипта (Фиг.12) и белка (Фиг.13) CCL21 значительно увеличена в образцах биопсии, полученных хирургическим путем от пациентов с разными формами хронического фиброза легких, по сравнению с образцами биопсии от пациентов с не фиброзными заболеваниями других типов. Результаты показывают, что легочные фибробласты, полученные от пациентов с признаками фиброза легких, но не фибробласты от пациентов без признаков аномального фиброза, способны генерировать миграционный (Фиг.14) и пролиферативный ответы (Фиг.15) на экзогенные стимулы CCL19 или CCL21. Тот факт, что CCL19 и CCL21 управляют миграцией легочных фибробластов (Фиг.14), имеет большое значение, поскольку этот ответ может вносить вклад в развитие очагов пролиферирующих фибробластов, основного гистопатологического признака UIP.

Наконец, терапевтическую эффективность нацеливания на CCR7 в процессе инициации или развития фиброза легких демонстрируют с помощью мышиной SCID модели фиброза, которая характеризуется интерстициальным фиброзом и фибробластными очагами (Фиг.16).

Пример 4: Нацеливание на CCL21 или CCR7 эффективно устраняет фиброз легких, индуцированный адоптивным переносом человеческих легочных фибробластов иммунодефицитным мышам

Как описано выше, рецептор 7 хемокина CC (CCR7) экспрессируется в образцах биопсии IIP и линиях первичных фибробластов. В настоящем примере подробно описано исследование in vivo роли CCR7 на модели фиброза легких. Коротко говоря, 1,0×10⁶ первичных фибробластов, выращенных из образцов биопсии идиопатического фиброза легких/обычной интерстициальной пневмонии (IPF/UIP), неспецифической интерстициальной пневмонии (NSIP) или гистологически нормальных образцов биопсии вводят внутривенно мышам C.B.-17SCID/beige (bg). На 35 и 63 дни после инъекции фибробластов IPF/UIP в легких иммунодефицитных мышей наблюдается очаговый интерстициальный фиброз и повышенный уровень гидроксипролина. В обеих временных точках фибробласты NSIP после адоптивного переноса вызывают более диффузный интерстициальный фиброз и повышение уровней гидроксипролина, однако нормальные человеческие фибробласты не индуцируют интерстициальных ремоделирующих изменений у мышей C.B-17SCID/bg. Системная терапевтическая иммунонейтрализация человеческого CCR7 или CCL21, его лиганда, значительно ослабляет фиброз легких в группах мышей C.B-17SCID/bg, которые получают один из типов фибробластов IIP. Таким образом, настоящее исследование демонстрирует, что фиброз легких инициируется внутривенным введением линий первичных человеческих фибробластов иммунодефицитным мышам, и что данный фиброзный ответ зависит от взаимодействия CCL21 и CCR7.

Мышиные модели фиброза легких предоставляют экспериментальные системы, соответствующие аномальному ремоделированию ткани и рубцеванию в респираторной системе (Gharee-Kermani et al., Meths. Mol. Med., 2005, 117:251-259). Для индуцирования фиброза легких можно использовать ряд способов, включающих трансгенный и генный перенос, облучение, неорганические раздражающие вещества, такие как оксид кремния, и лекарственные средства, стимулирующие индуцированное оксидантом воспалительное повреждение, такие как блеомицин (Chua et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol., 2005, 33:9-13). Из указанных моделей чаще всего используют блеомициновую модель вследствие ее воспроизводимости и патологического подобия фиброзу легких человека (Chua et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol., 2005, 33:9-13). Соответственно, блеомициновую модель используют для анализа ряда представляющих интерес мишеней при IPF/UIP (Kaminski et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 200, 97:1778-1783; Pardo et al., PLoS Med 2005, 2e251).

К сожалению, не существует животных моделей, которые полностью воспроизводят клиникопатологические признаки IPF/UIP, а относительное значение воспалительного повреждения (первичный механизм индуцирования экспериментального фиброза) для конечной стадии UIP все еще вызывает споры (Gauldie, Am. J. Resp. Grit. Care Med. 2002, 165:1205-1206; Stierter Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2002, 165:1207-1208).

Настоящий пример позволяет преодолеть существующую в данной области проблему путем применения альтернативной стратегии для индуцирования экспериментального фиброза легких. Генетически модифицированные иммунодефицитные мыши, полученные в результате генной мутации, приводящей к тяжелому комбинированному иммунодефициту (scid), или нокаута гена 1, активирующего рекомбиназу (rag-1), широко используются в качестве in vivo хозяев нормальных или больных человеческих клеток, вводимых путем адоптивного переноса. В настоящем примере показано, что адоптивный внутривенный (в.в.) перенос фибробластов IPF/UIP или фибробластов неспецифической интерстициальной пневмонии (NSIP; другой менее тяжелой формой IIP), но не нормальных фибробластов, мышам C.B-17, несущим мутацию scid-beige (C.B-17SCED/bg), инициирует и поддерживает фиброз легких. Гистологические и биохимические признаки фиброза начинают проявляться в фибробластах обеих групп IIP мышей C.B-17SCID/bg на 35 день и становятся отчетливыми на 63 день после инъекции фиброцитов. И цитокины, и хемокины играют важные роли в патогенезе IIP, анализ ELISA образцов целых легких мышей C.B-17SCID/bg, получающих либо IPF/UIP фибробласты, либо NSIP фибробласты, показывает значительное увеличение уровней мышиных IL-13, CCL6 и CCL21 на 63 день по сравнению с уровнями в образцах целых легких, измеренными в более ранний момент времени, или в образцах тканей легких мышей, не получающих фибробласты.

IL-13 и CCL6 представляют собой медиаторы фиброза легких, однако роль CCL21 в событиях, связанных с ремоделированием тканей легких, неизвестна. Стимулом для исследования роли CCL21 и CCR7 в событиях, связанных с ремоделированием тканей легких, опосредуемых человеческими фибробластами IIP, являются вышеуказанные результаты, заключающиеся в том, что экспрессия CCR7 повышается в образцах биопсии IIP, а миграционные, синтетические и пролиферативные свойства фибробластов IIP значительно усиливаются под действием CCL21 (EMP и CMH, неопубликованные результаты). В отдельных исследованиях по иммунонейтрализации показано, что нацеливание на человеческие CCL21 или CCR7 (рецептор CCL21) в течение периода от 35 до 63 дня после инъекции фибробластов IIP мышам C.B-17SCID/bg значительно уменьшает все параметры фиброза легких по сравнению с группами мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IIP и IgG. Вместе полученные результаты показывают, что получена новая мышиная модель фиброза легких, инициированного и поддерживаемого в.в. введением фибробластов IIP мышам CB-17SCID/bg, и демонстрируют новую роль CCL21 и CCR7 в поддержании фиброза у данной модели.

Мыши: самки, ICR-scid (ICRSCID), C.B-17-scid (C.B-17SCID) и CB-17-scid-beige (C.B-17SCID/bg) (6-8 недель), полученные от Taconic Farms (Germantown, NY), всех мышей SCID держат в лаборатории гнотобиологического барьера медицинского факультета университета Мичигана. Первые две группы мышей несут мутацию тяжелого комбинированного иммунодефицита (scid), приводящую к утрате как T-, так и B-лимфоцитов вследствие дефекта рекомбинации V(D)J, тогда как мыши C.B-17SCID/bg имеют две мутации: первая представляет собой мутацию scid, а вторая представляет собой мутацию, приводящую к основному дефекту в цитотоксических T-клетках и функции макрофагов, а также к селективному ухудшению функции NK-клеток. Все мыши имеют свободный доступ к стерилизованной в автоклаве воде и гранулированной пище для мышей. Все описанные ниже процедуры проводят в стерильных, ламинарных условиях, с ободрения Комитета по уходу за животными и их применению медицинского факультета университета Мичигана.

Клеточная культура человеческих фибробластов: Смешанную популяцию клеток получают путем механического разъединения полученных хирургическим путем образцов биопсии легких IPF/UIP и NSIP, а чистые культуры человеческих фибробластов получают с помощью способов, подробно описанных в литературе (Jakubzick et al., Am. J. Pathol., 2004 164:1989-2001). Нормальные фибробласты легких выделяют таким же способом из клеточных суспензий нормальных краевых опухолей легкого. В настоящем исследовании всего 10 линий IPF/UIP, 6 линий NSIP и 4 линии нормальных фибробластов используют после четвертого пассажа в начальной, модельной характеризации, кроме того, описаны исследования терапевтического вмешательства.

Внутривенное введение человеческих легочных фибробластов мышам SCID: Препараты отдельных клеток IPF/UIP, NSIP и нормальных фибробластов получают путем трипсинизации культуральных колб объемом 150 см² и мечения красителем PKH26 в соответствии с инструкциями производителя (Sigma Co., St. Louis, MO). Каждую линию меченых фибробластов разбавляют до 1×10⁶ клеток/мл PBS, и 1 мл полученной суспензии вводят через хвостовую вену группам, состоящим из пяти мышей SCID. Другим группам, состоящим из пяти мышей SCID, внутривенно вводят только раствор, меченный PKH26 и PBS (контрольные группы). Мышей подвергают эвтаназии путем введения избыточной дозы анестетика на 7, 21, 35, 49 и 63 дни после в.в. переноса человеческих легочных фибробластов. В указанные моменты времени ткань легкого рассекают для проведения молекулярных, гистологических, биохимических и/или протеолитических анализов (см. ниже).

Оценка роли CCL21 и CCR7 у мышей C.B-17SCID/bg после адоптивного переноса человеческих легочных фибробластов: Чтобы соотнести роль CCL21 и CCR7, его рецептора, с легочным ремоделирующим ответом после в.в. адоптивного переноса человеческих фибробластов, используют группы мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IPF/UIP (n=35 мышей), фибробласты NSIP (n=20 мышей), нормальные фибробласты (n=15 мышей) или только среду (т.е. PBS) (n=15 мышей). Через тридцать пять дней все группы, состоящие из пяти мышей C.B-17SCID/bg, получают один из мышиных IgG, мышиное моноклональное антитело против человеческого CCL21 или мышиное моноклональное антитело против человеческого CCR7 (все в концентрации 10 мкг/мл; R&D Systems, Minneapolis., MN) через день, начиная с 35 и до 63 дня. На 63 день всех мышей подвергают эвтаназии путем введения избыточной дозы анестетика, после чего ткань легкого рассекают для проведения молекулярных, гистологических, биохимических и/или протеолитических анализов (см. ниже).

Молекулярный анализ: Общую РНК выделяют и получают кДНК из образцов целых легких по способу, подробно описанному ранее (Jakubzick et al., J. Immunol. 2003, 171:2684-2693). Изменения в профилях генов человеческих и мышиных хемокинов и рецепторов хемокинов анализируют в объединенных образцах (n=5) с использованием нерадиоактивных мембран с генными чипами GEArray в соответствии с инструкциями производителя (SuperArray, Inc., Bethesda, MD), интенсивность сигнала определяют по способу, подробно описанному ранее (Jakubzick et al., Am. J. Pathol., 162:1475-1486 (2003). Отдельные образцы кДНК целого легкого (n≥5) анализируют на экспрессию человеческого CCR7, коллагена 1, катепсина E, матриксной металлопротеиназы (MMP)-2, MMP-9, MMP-19, фибронектина, тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP)-1 и GAPDH методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием системы для ПЦР в режиме реального времени 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA), как описано ранее (Jakubzick et al., J. Immunol. 2003, 171:2684-2693).

Гистологический анализ: После индуцированной анестезией эвтаназии правые доли каждой мыши удаляют, накачивают полностью 10% раствором формалина и помещают в свежий формалин на 24 часа. Для проведения стандартных гистологических методов каждую долю погружают в парафин, получают 5-мкм срезы и окрашивают их H&E и трихромом Масона. Другие неокрашенные срезы ткани целого легкого анализируют с помощью флуоресцентной микроскопии.

Биохимический анализ: Образцы целого левого легкого гомогенизируют в 1X PBS и осаждают центрифугированием. Не содержащие клеток супернатанты используют для проведения анализа ELISA, а осадки сушат в вакууме и ресуспендируют в 0,5 M ледяной уксусной кислоте. Затем в ткани определяют концентрацию гидроксипролина с помощью описанного ранее способа (Zhang et al., J. Immunol. 1994, 153:4733-4741).

Протеомики: Мышиные белки IL-13, CCL6, CCL21, IFN-γ, IL-12, IL-4, CCL2, CCL7, CCL17, CCL3, CXCL13, TNF-α, CXCL10, CXCL9 и CXCL2 анализируют в 50 мкл не содержащих клеток супернатантах гомогенизированных образцов целых легких, используя стандартизованный иммуноферментный твердофазный сэндвич-анализ (ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, MN), подробно описанный ранее (Jakubzick et al., J. Immunol. 2003, 171:2684-2693).

Статистический анализ: Все результаты выражают в виде среднего значения ± SEM. Для определения статистических различий среди групп UIP, NSIP, нормальных и контрольных мышей SCID используют однофакторный анализ ANOVA и критерии множественного сравнения Тьюки-Крамера или Дуннетта. Различие считают значимым при p<0,05.

Адоптивный внутривенный перенос IPF/UIP или NSIP, но не нормальных легочных фибробластов приводит к гистопатологии и ремоделированию легких у мышей C.B-17SCID/bg. Вначале оценивают влияние адоптивного переноса нормальных и IIP фибробластов на пространственную организацию легких у разных штаммов мышей SCID, в том числе ICRSCID, C.B-17SCID и C.B-17SCID/bg (n=5 для одной временной). Данные исследования проводят с использованием 3 линий IPF/UIP и 2 линий нормальных человеческих фибробластов. Перед введением мышам SCID все линии человеческих фибробластов метят PKH26, чтобы обеспечить детекцию меченных клеток в гистологических срезах. На 7 и 21 дни после инъекции в легочных кровеносных сосудах всех групп SCID детектируют скопления человеческих фибробластов. Однако после 21 дня интенсивность данного маркера уменьшается (информация из проспекта, предоставленного Sigma), и, следовательно, на 35 день после инъекции фибробластов флуоресценцию PKH26 не удается детектировать (данные не показаны). Другие органы (т.е. печень, селезенка и почки) предположительно содержат человеческие легочные фибробласты, однако объемные макроскопические изменения в данных органах не наблюдаются. Поскольку IIP является легочным заболеванием, при котором во всех других органах фиброгенез отсутствует, в настоящем исследовании не проводят подробный гистологический анализ других органов.

Анализ срезов целых легких в группах мышей SCID в более поздние моменты времени показывает, что заметное ремоделирование легких наблюдается только у мышей C.B-17SCTD/bg. А именно, на 49 день после введения фибробластов IPF/UIP мышам ICRSCID фибропролиферация не наблюдается (n=5 мышей; результаты не показаны). Подобным образом, в.в. адоптивный перенос фибробластов IPF/UIP мышам C.B-17SCID не вызывает гистологически очевидного ремоделирования легких на 7 (n=5 мышей), 21 (n=10 мышей), 35 (n=5 мышей) или 49 (n=5 мышей) дни после в.в. инъекции фибробластов IPF/UIP.

При наличии заметной легочной патологии в группе CB-17SCID/bg, все последующие исследования, описанные ниже, включают адоптивный перенос нормальных и IIP фибробластов мышам C.B-17SCID/bg. В характеристическом исследовании модели четыре линии IPF/UIP, четыре линии NSIP и одну линию нормальных фибробластов адоптивно переносят разным группам мышей C.B17-SCID/bg и анализируют гистопатологические, геномные и протеомные изменения в легких на 35 и 63 дни после переноса фибробластов.

В легких мышей C.B-17SCID/bg, получающих нормальные легочные фибробласты, наблюдается незначительная степень или отсутствие гистопатологии. Однако у мышей C.B-17SCID/bg развивается значительная гистопатология легких, которая становится заметной на 35 день после в.в. инъекции линий фибробластов NSIP или IPF/UIP. Гистопатология легких у мышей C.B-17SCID/bg после введения легочных фибробластов NSIP или IPF/UIP характеризуется разрушением альвеолярного пространства, очевидной фибропролиферацией и присутствием эозинофильных гранулоцитов. Окрашивание трихромом Масона гистологических срезов тканей легких мышей C.B-17SCID/bg на 35 день после адоптивного переноса нормальных, NSIP или IPF/UIP человеческих легочных фибробластов позволяет обнаружить присутствие внеклеточного матрикса (светло-голубое окрашивание) в ремоделированных участках групп C.B-17SCID/bg, которые получают IIP, но не нормальные фибробласты.

Более поздний анализ гистологических срезов из групп C.B-17SCID/bg показывает значительные различия в степени и проявлении ремоделирования легких, вызванного введением фибробластов IPF/UIP или NSIP. Легкие мышей C.B-17SCID/bg, получивших фибробласты IPF/UIP 63 дня назад, имеют гетерогенный вид и содержат участки относительно нормальной легочной ткани наряду с участками тяжелого интерстициального разрушения и ремоделирования. Кроме того, в легких мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IPF/UIP, наблюдаются очаги человеческих фибробластов, однако данные очаги детектируют в кровеносных сосудах, но не в интерстициальных участках, как при клиническом UIP (Am. J. Resp. Crit. Care Med 2002, 165:277-304). Гистологический характер срезов ткани целого легкого мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты NSIP 63 дня назад, характеризуется уплотнением интерстиция и явно фиброзными участками, причем ремоделирование у данных мышей охватывает большую часть легкого. Вместе полученные данные показывают, что введение человеческих фибробластов IIP мышам C.B-17SCID/bg вызывает у данных мышей фиброзные повреждения.

Уровни гидроксипролина значительно изменяются во времени после введения фибробластов IIP мышам C.B-17SCID/bg: Гидроксипролин представляет собой традиционно используемый маркер синтеза коллагена de novo в экспериментальных моделях, включающих ремоделирование легких (Jakubzick et al., Am. J. Pathol., 2004, 165:1222-1221). В настоящем исследовании уровни гидроксипролина измеряют в образцах целых легких мышей CB-17SCID/bg, не получающих фибробласты или получающих нормальные человеческие легочные фибробласты, или человеческие легочные фибробласты NSIP или IPF/UIP, на 35 или 63 день после введения. Уровни гидроксипролина остаются неизменными в указанные моменты времени после введения нормальных фибробластов. Уровни гидроксипролина в указанных группах C.B-17SCID/bg составляют 4,7±0,3 и 5,6±,5 мкг/мг белка на 35 и 63 день, соответственно, и указанные уровни гидроксипролина близки к уровням, обнаруженным в группе мышей C.B-17SCID/bg, которые не получают человеческих фибробластов (4,5±1,3 мкг/мг белка). Однако легкие мышей содержат более высокие количества гидроксипролина на 35 день после внутривенного введения фибробластов NSIP (11,4±3,7 мкг/мг белка) или IPF/UIP (8,2±2 мкг/мг белка) по сравнению с группой, получающей нормальные фибробласты. Кроме того, уровни гидроксипролина дополнительно увеличиваются в 3 и 2,5 раза в группах, получающих фибробласты NSIP (31±11 мкг/мг белка) и IPF/UIP (22±4 мкг/мг белка), соответственно, на 63 день после в.в. адоптивного переноса. На 63 день увеличение уровней гидроксипролина в группах C.B-17SCID/bg, получающих человеческие фибробласты NSIP или IPF/UIP, достигают статистически значимых величин по сравнению с группой C.B-17SCID/bg, получающей нормальные фибробласты. Таким образом, внутривенное введение человеческих фибробластов IIP увеличивает уровни гидроксипролина на 35 день и, более наглядно, на 63 день после адоптивного переноса.

Анализ цитокинов в целом легком показывает, что уровни мышиных IL-13, CCL6 и CCL21 значительно повышены в легких мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IIP: Анализ методом ELISA в целом легком некоторых цитокинов, лиганда CC и хемокинов-лигандов CXC, на 35 и 63 дни после в.в. адоптивного переноса человеческих нормальных или IIP фибробластов, показывает, что существует ряд статистически значимых изменений в уровнях мышиных IL-13, CCL6 и CCL21. Хотя уровень IL-13 в целом легком в группе C.B-17SCID/bg, получающей нормальные фибробласты, ниже уровня детекции ELISA, в группе C.B-17SCID/bg, получающей фибробласты NSIP или IPF/UIP, уровень IL-13 в целом легком значительно выше, чем в группе C.B-17SCID/bg, получающей нормальные фибробласты 35 или 63 дня назад. Кроме того, значительно более высокий уровень IL-13 обнаружен в легких мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IPF/UIP, на 63 день по сравнению с 35 днем после адоптивного переноса фибробластов. На 63 день после инъекции фибробластов уровни CCL6 в целом легком значительно выше в группах C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IPF/UIP или NSIP, чем в группе C.B-17SCID/bg, получающей нормальные фибробласты. Значительно более высокий уровень CCL6 детектируют в легких мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IPF/UIP или NSIP на 63 день по сравнению с 35 днем после адоптивного переноса фибробластов. Единственным другим лигандом мышиного CC, на который влияет введение человеческих фибробластов мышам C.B-17SCID/bg, является CCL21. Уровень данного хемокина значительно выше в группах C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты NSIP и IPF/UIP, на 63 день, по сравнению с группой C.B-17SCID/bg, получающей нормальные фибробласты, на 63 день. Кроме того, уровень мышиного CCL21 в целом легком значительно выше в группах, получающих фибробласты IPF/UIP, на 63 день после переноса фибробластов, по сравнению с группой, получающей фибробласты NSIP, в то же время. Наконец, значительно более высокие уровни CCL21 присутствуют в образцах целых легких из группы C.B-17SCID/bg, получающей фибробласты IIP на 63 день после адоптивного переноса фибробластов, по сравнению с группой C.B-17SCID/bg, получающей фибробласты IIP на 35 день после адоптивного переноса. Таким образом, совокупность полученных результатов позволяет предположить, что присутствие фибробластов IIP, но не нормальных фибробластов, у мышей C.B-17SCID/bg значительно изменяет в целых легких уровни мышиных цитокинов и хемокинов с установленной (например, IL-13 и CCL6) и предполагаемой (например, CCL21) ролью в развитии фиброза в легких.

Генные транскрипты человеческих CCR7 и CCL21 присутствуют в легких мышей C.B-17SCID/bg, получивших человеческие легочные фибробласты 35 дней назад: Изменения уровня мышиного CCL21 в целых легких мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты NSIP или IPF/UIP, вызывают интерес в свете предыдущих исследований, демонстрирующих важную роль данного лиганда CC в процессах ремоделирования в почках (Banas et al., J. Immunol., 2002 168:4301-4307) и печени (Bonaccgi et al. Gastroenterology, 2003, 125:1060-1076). Полученные результаты инициировали дальнейшие исследования роли данного лиганда CC и его рецептора, CCR7, в процессе ремоделирующих ответов в легких, вызванных человеческими фибробластами IIP. Человеческие транскрипты CCR7 и CCL21 детектируют с помощью генного анализа SuperArray, и среди трех групп C.B-17SCID/bg максимальная экспрессия транскриптов CCR7 и CCL21 наблюдается в образцах легких в группе, получающей фибробласты IPF/UIP. Далее, присутствие CCR7 подтверждают с помощью анализа TAQMAN, и снова в группе IPF/UIP наблюдается наивысший уровень экспрессии транскрипта CCR7 среди групп C.B-17SCID/bg. Анализы SuperArray и TAQMAN мышиных CCR7 и CCL21 также подтверждают присутствие данных продуктов транскрипции во всех трех группах C.B-17SCID/bg, получающих человеческие фибробласты, а наивысшие уровни обоих транскриптов присутствуют в группах C.B-l7SCID/bg, получающих фибробласты IPF/UIP. Таким образом, в.в. адоптивный перенос нормальных фибробластов и фибробластов IIP приводит к генерированию генных транскриптов человеческих CCR7 и CCL21.

Количественный анализ методом ПЦР TAQMAN генов, ассоциированных с мышиным внеклеточным матриксом, после адоптивного переноса человеческих фибробластов мышам C.B-17SCID/bg: Изменение уровня генов, ассоциированных с мышиным внеклеточным матриксом, в легких анализируют методом количественной ПЦР. Экспрессия коллагена 1, катепсина E, MMP-19 и TIMP-1 наблюдается у мышей C.B-17SCID/bg, которые получили нормальные, NSIP и IPF/UIP фибробласты человека 63 дня назад. Важнее всего, что при сравнении уровней данных генов у мышей, получающих фибробласты, с уровнями транскриптов у контрольных мышей C.B-17SCID/bg увеличение экспрессии транскриптов коллагена 1 и катепсина у мышей C.B-17SCID/bg, получающих один из типов фибробластов IIP, и экспрессии транскриптов MMP-19 и TIMP-1 у мышей, получающих фибробласты IPF/UIP, достигает статистической значимости при сравнении с увеличением уровня транскриптов указанных генов у мышей C.B-17SCID/bg, получающих нормальные человеческие фибробласты. С помощью метода TAQMAN анализируют другие гены внеклеточного матрикса и подтверждают их присутствие: гены MMP-2, MMP-9 и фибронектина. Среди групп мышей C.B-17SCID/bg значительных различий в уровнях указанных транскриптов не наблюдается, однако максимальное увеличение уровней MMP-2 и фибронектина наблюдается в группе IPF/UIP C.B-17SCID/bg, тогда как минимальное увеличение уровня MMP-9 наблюдается в той же группе C.B-17SCID/bg. Таким образом, полученные данные показывают, что уровни транскриптов генов, ассоциированных с мышиным внеклеточным матриксом, изменяются после введения человеческих фибробластов мышам C.B-17SCID/bg.

Иммунонейтрализация человеческого CCR7 или человеческого CCL21 подавляет ремоделирование в легких мышей C.B-17SCID/bg, которые получают человеческие фибробласты IIP: В следующей серии экспериментов анализируют роли человеческих CCR7 и CCL21 у мышей C.B-17SCID/bg, получающих человеческие нормальные (n=1 линия) или IIP фибробласты (n=3 линии IPF/UIP и n=2 линии NSIP). Хотя попытки измерить уровень человеческого CCL21 в образцах целых легких не имели успеха, возможно, в результате того, что уровень данного лиганда CC ниже уровня детекции ELISA, предыдущие исследования показали, что и мышиный, и человеческий CCL21 могут стимулировать истечение клеточного кальция посредством человеческого CCR7 (Jenh et al., J. Immunol., 1999 162:3765-3769). Кроме того, показано, что иммунонейтрализация мышиного CCL21 с использованием поликлонального антитела подавляет миграцию человеческих дендритных клеток и примирование человеческих T-клеток в гуманизированной модели аллергического заболевания дыхательных путей, индуцированного домашней взвешенной пылью (Hammad et al. J. Immunol. 2002, 169:1524-1534). С учетом описанной перекрестной реактивности мышиного и человеческого CCL21 используют способ лечения, в котором человеческий CCL21 или человеческий CCR7 нацеливают путем введения моноклонального антитела в период от 35 до 63 дня после адоптивного переноса фибробластов. Гистологический анализ тканей целого легкого на 63 день в трех группах C.B-17SCID/bg с использованием трех режимов лечения показывает, что в группе C.B-17SCID/bg, получающей нормальные фибробласты, признаки интерстициального ремоделирования в легких отсутствуют во всех исследуемых группах (группа, получающая IgG; группа, получающая антитело против CCL21; группа, получающая антитело против CCR7). Однако гистологический анализ показывает, что во всех группах C.B-17SCID/bg происходит накопление нормальных фибробластов в сосудах. Ни один из режимов лечения не изменяет данный признак у мышей C.B-17SCID/bg, получающих нормальные фибробласты. Интерстициальное ремоделирование наблюдается в группе C.B-17SCID/bg, получающей фибробласты NSIP и IgG, однако ремоделирование подавляется в результате введения антитела против CCL21 или антитела против CCR7 в период от 35 до 63 дня после адоптивного переноса. Подобным образом, интерстициальное ремоделирование, наблюдающееся в группе C.B-17SCID/bg, получающей IgG и фибробласты IPF/UIP, отсутствует в группах мышей C.B-17SCID/bg, получающих антитело против CCL21 или антитело против CCR7 в период от 35 до 63 дня после адоптивного переноса фибробластов IPF/UIP. Таким образом, терапевтическое нацеливание на CCL21 или CCR7 подавляет гистологические признаки интерстициального ремоделирования у мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IIP.

Количественный анализ методом ПЦР TAQMAN генов, ассоциированных с мышиным внеклеточным матриксом, после терапевтического нацеливания на человеческие CCL21 или CCR7 у мышей C.B-17SCID/bg, получающих нормальные человеческие фибробласты и фибробласты IIP: Количественный анализ TAQMAN групп, получающих антитело, также подтверждает, что введение антитела против CCL21 и антитела против CCR7 также значительно изменяет уровни транскриптов MMP-2 и MMP-19. Уровни транскриптов указанных MMP у обработанных антителом контрольных мышей C.B-17SCID/bg сравнивают с уровнем данных транскриптов у мышей C.B-17SCID/bg, получающих антитело и фибробласты. Обработка антителом против CCL21 значительно снижает степень увеличения уровней транскриптов MMP-2 в группах C.B-17SCID/bg, получающих нормальные фибробласты, по сравнению со степенью увеличения уровней транскриптов в группах C.B-17SCID/bg, получающих IgG. Обработка антителом против CCR7 значительно снижает степень увеличения уровней транскриптов MMP-2 по сравнению с соответствующей группой, получающей IgG. Количественный анализ MMP-19 методом TAQMAN показывает, что антитело против CCR7 значительно увеличивает степень изменения в группе C.B-17SCID/bg, получающей нормальные фибробласты, тогда как введение обоих антител значительно увеличивает степень изменения данного транскрипта по сравнению с соответствующей группой IgG. Таким образом, обработка антителом мышей C.B-17SCID/bg, получающих человеческие фибробласты, значительно изменяет экспрессию транскриптов генов, ассоциированных с мышиным внеклеточным матриксом.

Иммунонейтрализация человеческого CCR7 или человеческого CCL21 значительно уменьшает уровни гидроксипролина в целых легких мышей C.B-17SCID/bg, получающих человеческие фибробласты IIP: Измеряют уровни гидроксипролина в образцах целых легких после введения IgG, антитела против CCL21 или антитела против CCR7 у контрольных мышей C.B-17SCID/bg (т.е. мышей, не получающих человеческие фибробласты) и у мышей, получающих нормальные фибробласты, фибробласты NSIP или фибробласты IPF/UIP. Уровни гидроксипролина увеличиваются в образцах целых легких мышей C.B-17SCID/bg, которые получают нормальные фибробласты и IgG, однако обработка антителами не влияет на данные уровни. В группах C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты NSIP, уровни гидроксипролина значительно выше, чем уровни в контрольной группе C.B-17SCID/bg, а лечение антителом против CCL21 и антителом против CCR7 значительно уменьшает уровни гидроксипролина на 52±6,7 и 51±5,6%, соответственно, по сравнению с группой, получающей IgG. В группе C.B-17SCID/bg, получающей фибробласты IPF/UIP и IgG, уровни гидроксипролина также значительно превышают уровни в контрольной группе C.B-17SCID/bg. Кроме того, уровни гидроксипролина у мышей, получающих фибробласты IPF/UIP, ниже на 66±7,2 и 59±7,1% в группах, обработанных антителом против CCL21 и антителом против CCR7, соответственно, по сравнению с группой C.B-17SCID/bg, получающей IgG и фибробласты IPF/UIP. Таким образом, полученные данные подтверждают, что нацеливание на CCL21 или CCR7 заметно и значительно уменьшает ремоделирование в легких мышей C.B-17SCID/bg после адоптивного переноса фибробластов NSIP или IPF/UIP.

Анализ цитокинов в целых легких показывает, что уровни мышиного CCL21 значительно ниже в легких мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IPF/UIP и терапию антителом против CCR7. Поскольку уровни мышиных IL-13, CCL6 и CCL21 в целых легких изменяются и/или увеличиваются в присутствии фибробластов NSIP и IPF/UIP у мышей C.B-17SCID/bg, анализируют влияние введения IgG и моноклонального антитела на указанные медиаторы на 63 день. Лечение антителом против CCR7 и антителом против CCL21 не влияет на уровни IL-13 или CCL6 в целых легких ни в одной из групп CB-17SCID/bg, получающих фибробласты. Однако терапия антителом против CCR7 значительно уменьшает уровни мышиного CCL21 в целых легких в группе C.B-17SCID/bg, получающей фибробласты IPF/UIP, по сравнению с группой C.B-17SCID/bg, получающей фибробласты IPF/UIP + IgG. Таким образом, терапевтическое нацеливание на CCR7 уменьшает уровни мышиного CCL21, но не влияет на уровни двух других мышиных медиаторов, которые, как обнаружено, повышены у моделей, получающих фибробласты IIP.

Обсуждение. Настоящее исследование направлено на решение следующих двух вопросов: 1) вызывает ли адоптивный перенос человеческих легочных фибробластов ремоделирование пространственной организации легких у мышей SCID? 2) какую роль играют CCL21 и CCR7 в ремоделирующем ответе, вызванном адоптивным переносом человеческих фибробластов? Ответ на первый вопрос является утвердительным, поскольку в.в. адоптивный перенос 1×10⁶ фибробластов IPF/UIP или NSIP мышам C.B-17SCID/bg, утратившим как адаптивный, так и врожденный иммунитет, вызывает фиброз, наличие которого подтверждается гистологическими, молекулярными и биохимическими анализами. Такой фиброз подавляется терапевтическим введением моноклональных антител против человеческих CCL21 или CCR7, что свидетельствует о важной роли данного рецептора и его лиганда в развитии фиброза легких, а также в развитии фиброза в почках (Banas et al., J. Immunol., 2002, 168:4301-4307) и печени (Bonacchi et al., Gastroenterology 2003, 125:1060-1076).

Хотя мышиные эквиваленты известных и предполагаемых профиброзных медиаторов повышены у мышей C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IPF/UIP или NSIP, участие данных медиаторов в фиброзном процессе является спорным, поскольку их уровни не меняются во многих группах мышей C.B-17SCID/bg, демонстрирующих значительное уменьшение ремоделирования легких. Таким образом, настоящее исследование доказывает, что адоптивный перенос фибробластов IIP стимулирует фиброз у мышей C.B-17SCID/bg и выявляет новую терапевтическую мишень при IIP.

Моделирование клинического фиброза легких остается главной проблемой в лаборатории (Chua et al., Am J. Resp. Cell Mol. Biol., 2005 33:9-13). Хотя для индуцирования экспериментального фиброза легких обычно используют сульфат блеомицина, индуцированный блеомицином фиброз легких подвергается критике как не идеальная модель IPF/UIP (Chua et al., Am J. Resp. Cell Mol. Biol., 2005 33:9-13). Учитывая то, что новые модели фиброза легких должны содержать максимально возможное число признаков клинического IIP, настоящее исследование основывается на наблюдении, заключающемся в том, что при указанных заболеваниях фибробласты в первую очередь отвечают за сильное, зачастую приводящее к летальному исходу ремоделирование (Zisman et al., Meth. Mol. Med. 2005, 117:3-44). Адоптивный перенос фибробластов IPF/UIP или NSIP инициирует интерстициальное ремоделирование, и на 35 день после адоптивного переноса указанных линий, но не раньше, появляются гистологические признаки фиброза. Задержку появления фиброза объяснить достаточно трудно, однако полученные результаты согласуются с полученными ранее данными, свидетельствующими о том, что после адоптивного переноса человеческих эндотелиальных клеток мышам C.B-17SCID/bg изменения в кровеносных сосудах появляются приблизительно через 30-40 дней (Skovseth et al., Am. J. Pathol., 2002, 160:1629-1637). Таким образом, настоящее исследование демонстрирует, что соответствующую клиническим требованиям модель фиброза легких можно инициировать у иммунодефицитных мышей с помощью адоптивного переноса человеческих легочных фибробластов.

Очевидное преимущество моделей C.B-17SCID/bg, инициированных фибробластами IPF/UIP и NSIP, описанных в данном документе, заключается в том, что их можно применять для тестирования новых терапевтических средств для лечения данных заболеваний. Настоящее исследование направлено на изучение ролей человеческих CCL21 и CCR7, поскольку авторы обнаружили, что оба эти соединения экспрессируются на заметном уровне в образцах биопсии IIP (Choi et al., J. Clin. Pathol. 2006, 59:28-39) и культивированных фибробластах IIP. Авторы настоящего изобретения выдвинули гипотезу, что терапевтический эффект антител против человеческого CCL21 и против человеческого CCR7 связан с подавлением пролиферативного действия CCL21 на фибробласты IPF/UIP и NSIP. Хотя маловероятно, что моноклональные антитела, используемые в данном изобретении, влияют на миграцию введенных в.в. фибробластов, поскольку обработку антителами начинают только после того, как фиброз гистологически проявится у мышей C.B-17SCID/bg, возможно, данный терапевтический подход при применении к другим моделям фиброза легких будет влиять на рекрутинг фиброцитов в легкие. CCR7 заметно экспрессируется на фиброцитах (Abe et al., J. Immunol., 2001, 166:7556-7563; Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 2004 113:243-252), а CCL21 стимулирует их рекрутинг в разные участки ткани (Abe et al., J. Immunol., 2001, 166:7556-7563). Исследования по изучению роли CCR7-положительных фиброцитов в блеомицин-индуцированном фиброзе легких с использованием мышей дикого типа и мышей, дефицитных по гену CCR7, в настоящее время находятся в стадии разработки.

Точный вклад адоптивно перенесенных человеческих фибробластов IIP и мышиных фиброзных компонентов (т.е. клеток и медиаторов) в общий ответ, связанный с ремоделированием легких у мышей C.B-17SCID/bg, остается неясным. В настоящем исследовании демонстрируется, что существует взаимодействие между перенесенными человеческими фибробластами и мышиными компонентами, что доказывается динамическими изменениями уровней мышиных транскриптов, ассоциированных с внеклеточным матриксом, и мышиных растворимых профиброзных белков в легких мышей C.B-17SCID/bg, которые получают наиболее значительную дозу одного из двух типов фибробластов IIP. Хотя относительное значение растворимых мышиных белков, участвующих в фиброзном ответе C.B-17SCID/bg, в данный момент является сомнительным, изменения уровней катепсина E, MMP, компонентов внеклеточного матрикса (т.е. коллагена и фибронектина) и ингибиторов MMP в группах C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IIP, по сравнению с группой C.B-17SCID/bg, получающей нормальные фибробласты, могут указывать на то, что мышиные фиброзные компоненты активно участвуют в процессе ремоделирования. Количественный анализ методом ПЦР TAQMAN подтверждает, что уровни транскриптов коллагена 1, катепсина E, MMP-19 и TIMP-1 значительно повышены в группах C.B-17SCID/bg, получающих фибробласты IIP, по сравнению с изменениями уровней транскриптов данных генов у мышей C.B-17SCID/bg, получающих нормальные фибробласты. Указанные изменения уровней транскриптов связаны с клиническим фиброзом легких, поскольку при более тяжелых формах IIP, таких как IPF/UIP и NSIP, наблюдаются повышенные уровни катепсинов (Kimura et al., J. Med. Invest 2005, 52:93-100; Wattiez at al., Electrophoresis 2000, 21:2703-2712), MMP и TIMP (обзор опубликован Pardo et al. Proc. Am. Thorac Soc, 2006, 3:383-388) и внеклеточного матрикса (Kuhn and Mason, Am. J. Pathol. 1995; Adachi Am J. Pathol 1988, 133: 193-203). Уровень MMP-19 наиболее заметно повышается у мышей C.B-17SCID/bg, которые получают фибробласты IPF/UIP, и, хотя известно, что данная протеиназа играет ключевую роль в ответах, связанных с заживлением кожных ран (комментируется Mauch J. Invest. Dermatol. 2003, 121), ее роль в развитии фиброза легких пока неясна. По данным количественного анализа методом ПЦР TAQMAN все, почти без исключения, способы лечения с использованием антител против CCL21 и антител против CCR7 уменьшают все вышеуказанные генные продукты, ассоциированные с мышиным внеклеточным матриксом. Исключением является MMP-19, и последующее исследование относительного значения MMP-19 в легочном фиброзном ответе, индуцированном адоптивным переносом человеческих фибробластов IIP, предпринято на основе приведенных выше и других результатов.

Итак, данный пример подтверждает, что фиброз легких можно перенести мышам C.B-17SCID/bg путем в.в. адоптивного переноса линий первичных фибробластов IPF/UIP или NSIP. Показано применение данной модели в тестировании новых терапевтических стратегий, и полученные результаты дополнительно подтверждают, что взаимодействие CCL21-CCR7 может быть важной мишенью в клинике NSIP и IPF/UIP.

Пример 5: Идиопатический фиброз легких. Фибробласты мигрируют и пролиферируют в ответ на лиганд 21 хемокина СС. Целью данного примера является функциональное и сигнальное значение экспрессии CCR7 в первичных фибробластах, выращенных из полученных хирургическим путем образцов биопсии IPF/UIP и нормальной ткани. Первичные фибробласты культивируют из полученных хирургическим путем образцов биопсии пациентов с IPF/UIP и нормальных пациентов. Фибробласты, обрабатываемые в присутствии или в отсутствие лиганда хемокина CC (CCL) 21, анализируют на функциональные, транскрипционные и протеомные различия с использованием иммуноцитохимического анализа, генных чипов, ПЦР Taqman в режиме реального времени, анализа миграции, анализа пролиферации и вестерн-блоттинга.

CCR7 экспрессируется фибробластами IPF-UIP, но не нормальными фибробластами. IPF/UIP, но не нормальные фибробласты, генерируют значительные миграционные и пролиферативные ответы под воздействием CCL21, которые ингибируются коклюшным токсином или нейтрализующими антителами против CCR7. Воздействие CCL21 на фибробласты IPF/UIP изменяет статус фосфорилирования MEK 1/2, ERK 1/2 и p90RSK в данных клетках и подавляется коклюшным токсином или CCR7-специфичными маленькими интерферирующими РНК. Вместе полученные данные подтверждают, что CCL21 модулирует функциональные свойства фибробластов IPF/UIP, но не нормальных фибробластов.

Исходя из интерстициальной экспрессии CCR7 в SLB IIP авторы настоящего изобретения полагают, что данный рецептор хемокинов может экспрессироваться и обладать функциональной активностью в первичных фибробластах, полученных из SLB. В настоящем исследовании обнаружено, что миграционная и пролиферативная активности наблюдаются после воздействия CCL21 на IPF/UIP, но не на нормальные фибробласты. Воздействие CCL21 на фибробласты IPF/UIP приводит к изменению фосфорилирования белков, ассоциированных с сигнальным путем киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK 1/2), в фибробластах IPF/UIP, которое блокируется коклюшным токсином или миРНК CCR7. Таким образом, полученные данные показывают, что фибробласты IPF/UIP отвечают на CCR7-зависимую активацию, и, следовательно, CCR7 является привлекательной мишенью при IPF/UIP.

Пациенты: Все пациенты перед волокнисто-оптической бронхоскопией подвергаются клиническому обследованию, включающему рентгеноскопию легких, измерение легочных функций и компьютерную томографию тонких срезов. У этих пациентов IIP диагностируют путем компиляции симптомов, физиологических симптомов и радиографических данных. Ни один из пациентов, участвующих в настоящем исследовании, не подвергался ранее хирургической биопсии или не получал лечения IIP. SLB получают при посредстве клинического центра, связанного со специализированным центром исследований IIP медицинского факультета университета Мичигана, от пациентов, предположительно имеющих UIP или NSIP, начиная с мая 2000 до мая 2003 года. SLB получают из, по меньшей мере, двух долей (обычно с левой стороны) всех пациентов, проверяемых на IIP, как подробно описано выше. Гистологически нормальные легкие получают из удаленных образцов пациентов, подвергающихся торакальной резекции. Для культивирования линий первичных фибробластов каждый образец биопсии обрабатывают отдельно стерильным способом в ламинарном шкафу (см. ниже).

Выделение и культивирование фибробластов: Фибробласты, полученные из IPF/UIP или гистологически нормальных SLB, механически разъединяют и культивируют с помощью описанных ранее способов (Hogaboam et al., Meths. MoI. Med., 2005, 117:209-221).

Собирание белка и экстракция РНК: Первичные фибробласты помещают в 12-луночные планшеты для культивирования тканей в количестве 2,5×10⁵ клеток/мл и оставляют прилипать в течение ночи. Фибробласты промывают один раз PBS. В лунки с четырехкратными повторами добавляют 500 мкл модифицированной по Дульбекко среды Игла, содержащей 0,5% FBS (DMEM-0,5), и содержащей или не содержащей 10 нг/мл рекомбинантных белков CCL19 или CCL21, и инкубируют в течение 24 часов. Бесклеточные супернатанты собирают и хранят при -80°C до анализа на содержание растворимых белков. После удаления супернатантов в каждую лунку добавляют 250 мкл тризола и экстрагируют РНК в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Антитела: Вестерн-антитела включают: моноклональное антитело против человеческого CCR7 (R&D systems, Minneapolis, MN), киназу Phospo-p44/42 Map (Thr202/Tyr204), Phospho-MEK1/2 (Ser217/221), Phospho-p90RSK (Thr573), Phospho-SEK1/MKK4 (Ser257/Thr261), Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185), Phospho-c-Jun (Ser63) II, киназу Phospho-p38 MAP (Thr180/Tyr182), Phospho-MKK3/MKK6 (ser189/207) (все от Cell Signaling, Danvers, MA), антитело против бета-актина, антитело против GAPDH, кроличьи поликлональные антитела против гладкомышечного альфа-актина (Abeam, Cambridge, MA). В качестве вторичных антител используют: антитела против кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированные с HRP, антитела против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированные с HRP, антитела против биотина, конъюгированные с HRP (Cell Signaling, Danvers, MA).

Генные чипы: Экспрессию генов человеческих CCR7, CCL19 и CCL21 анализируют с использованием специфического чипа для идентификации генов хемокинов и рецепторов хемокинов от SuperArray (Carlsbad, CA).

Анализ TAQMan: Экспрессию CCR7 и GAPDH анализируют в IPF/UIP и нормальных фибробластах методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием системы для проведения ПЦР в режиме реального времени 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA), как описано ранее (19). Все антитела и зонды получают от Applied Biosystems (Foster City, CA). Экспрессию CCR7 нормализуют по GAPDH и затем рассчитывают степень изменения экспрессии.

Иммуногистохимия: Экспрессию человеческого белка CCR7 анализируют методом иммуногистохимии, используя набор для окрашивания клеток и тканей HRP-AEC, в соответствии с инструкциями производителя (R & D Systems, Minneapolis, MN).

Анализ миграции фиброцитов. Первичные IPF/UIP и нормальные фибробласты добавляют в 8-мкм вставки между лунками в 6-луночные планшеты для культивирования клеток в присутствии или в отсутствие 10 нг/мл CCL19 или CCL21 и инкубируют в течение 24 часов. Фибробласты, мигрировавшие на дно лунки, фиксируют, окрашивают гемотоксилином и считают. Чтобы определить специфичность к рецептору или лиганду, в каждую лунку добавляют 5 мкг/мл антител против человеческих CCR7, CCL19 или CCL21. В качестве контроля используют 5 мкг/мл IgG или 10 мкл PBS.

Анализ пролиферации: Способность фибробластов к пролиферации определяют в 24-луночном планшете для культивирования тканей с использованием включения [³H]тимидина, как описано ранее (9).

Анализ коллагена с использованием Sircol: Содержание растворимого коллагена определяют с помощью анализа Biocolor Sircol (Accurate Chemical & Scientific Corp, Westbury, NY). Чтобы провести данный анализ, 100 мкл образцов бесклеточных супернатантов добавляют к 1 мл красителя Sircol и встряхивают при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем пробирки центрифугируют в течение 10 минут при 10000×g. Краситель удаляют, в каждую пробирку добавляют 1 мл раствора щелочи и тщательно перемешивают. Для прочтения результатов данного анализа 200 мкл каждого раствора переносят в 96-луночный оптический плоскодонный планшет вместе с 200 мкл стандартов. Затем планшет прочитывают при 540 нм с помощью планшет-ридера и концентрации нормализуют по содержанию общего белка, определенному методом Брэдфорда.

Анализ белков с использованием Bioplex: Образцы бесклеточных супернатантов анализируют на содержание человеческих RANTES/CCL5, используя набор Extracellular Antibody (Invitrogen BioSource, Carlsbad, CA) и систему Bio-Rad Luminex Bio-Plex 200 (Hercules, CA). Коротко говоря, 50 мкл образцов бесклеточных супернатантов и стандартов инкубируют с 50 мкл сложных гранул в течение 30 минут на шейкере. Гранулы промывают 3 раза 100 мкл буфера для промывания и затем инкубируют с 25 мкл раствора детекционного антитела в течение 30 мин на шейкере. Промывают еще 3 раза, добавляют стрептавидин-PE, затем гранулы инкубируют 10 минут на шейкере и промывают еще 3 раза. Затем гранулы ресуспендируют в буфере для анализа и прочитывают с помощью указанной выше системы.

Анализ методом вестерн-блоттинга: Фибробласты помещают в шестилуночные планшеты в количестве 5×10⁵ клеток/лунку и оставляют прилипать в течение ночи. Фибробласты оставляют на 24 часа в сыворотке без DMEM для истощения. Затем фибробласты обрабатывают 0,5% фетальной бычьей сывороткой в DMEM или в DMEM, содержащей 10 нг/мл рекомбинантных белков CCL19 или CCL21, в течение 0,5, 2, 5 и 30 минут. Некоторые фибробласты подвергают воздействию 200 нМ коклюшным токсином (Sigma, St. Louis, MO) за 2 часа до обработки. Затем фибробласты промывают охлажденным на льду забуференным фосфатом физиологическим раствором и затем лизируют в 500 мкл охлажденного на льду буфера для лизиса, содержащего 1% тритон X-100, 50 мМ NaF, 2 мМ EDTA, 0,15 M NaCl, 0,01 M фосфата натрия, 200 мкМ ортованадат натрия, 5 мкг/мл пепстатина, 5 мкг/мл лейпептина и 100 нМ каликулина. После инкубации на льду в течение 5 минут лизаты фибробластов соскабливают и переносят в пробирки. Общее содержание белка определяют с помощью метода Брэдфорда. Образцы, содержащие 20 мкг общего белка, смешивают с 4 мкл буфера для образцов 4× LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) и дважды деионизированной водой (ddH₂O) путем кипячения при 90°C в течение 5 минут с последующим разделением методом SDS-PAGE в 4-12% гелях NuPage Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA). Белки переносят на нитроцеллюлозные мембраны (Invitrogen, Carlsbad, CA). После блокирования 5% NFDM в 1× TBS/T мембраны анализируют на первичные фосфо-антитела, разрезают (Restore(TM) Western Blot Stripping Buffer, Pierce, Rockford, IL), промывают и снова анализируют на GAPDH, контроль загрузки.

Трансфекция миРНК: Чтобы блокировать экспрессию CCR7, получают маленькие интерферирующие РНК (миРНК), используя набор для синтеза Qiagen. Эффективность двух миРНК-кандидатов тестируют путем трансфекции в легочные фибробласты IPF/UIP с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) и анализируют на CCR7 методом Taqman. Более эффективные миРНК (приблизительно 70% нокдаун, AGCGGACATCAGCTGGTCAA) используют для вестерн-блоттинга пути фосфорилирования Erk 1/2.

Экспрессия генов CCR7, CCL19 и CCL21 наблюдается в фибробластах, выращенных из нормальных и IPF/UIP SLB. Три линии фибробластов, полученных из нормальных SLB, и три линии фибробластов, полученных из SLB IPF/UIP, подвергают анализу РНК с использованием SuperArray, специфичного для человеческих хемокинов и рецепторов хемокинов. Данный анализ показывает, что CCR7, CCL19 и CCL21 присутствуют в обеих группах, однако экспрессия CCR7 значительно выше в линиях IPF/UIP, чем в линиях нормальных фибробластов. Дополнительный анализ экспрессии генов методом ПЦР TAQMAN в режиме реального времени подтверждает, что транскрипты CCR7, CCL19 и CCL21 присутствуют во всех линиях фибробластов, используемых в данном исследовании. Таким образом, полученные данные показывают, что транскрипты генов CCR7, CCL19 и CCL21 присутствуют в нормальных и IPF/UIP фибробластах.

Ясно различимая экспрессия белка CCR7 наблюдается в фибробластах IPF/UIP, но не в нормальных фибробластах. Авторы настоящего изобретения показали, что в интерстициальных участках приблизительно 100% SLB UIP наблюдается сочетание фокальной и диффузной экспрессии белка CCR7. Кроме того, фокальные участки экспрессии CCR7 совпадают с гистологически различными фибробластными очагами. Чтобы определить, действительно ли первичные фибробласты, выращенные из нормальных и IPF/UIP SLB, экспрессируют CCR7, проводят иммуногистохимическое окрашивание CCR7. Фибробласты IPF/UIP отчетливо являются положительными по CCR7, тогда как нормальные фибробласты экспрессируют незначительное количество или совсем не экспрессируют CCR7.

CCL21 контролирует миграцию IPF/UIP, но не нормальных фибробластов. Экспрессия CCR7 подвергается повышающей регуляции в зрелых дендритных клетках, что обеспечивает миграцию данных клеток к лимфатическим узлам и активацию иммунной системы (Sozzani et al., J. Immunol., 1998, 16l(3):l083-1086). Показано, что взаимодействие CCR7 с CCL21 на некоторых клетках опухоли молочной железы (Muller et al., Nature, 2001, 410(6824):50-56) и клетках меланомы (Murakam et al., J. Dermatol. Sci., 2004, 36(2):71-78) играет важную роль в метастазировании. В настоящем исследовании и CCL19, и CCL21 стимулируют миграцию IPF/UIP, но не нормальных фибробластов. Однако CCL21 является более мощным индуктором миграции фибробластов IPF/UTP, увеличивая миграцию данных клеток приблизительно в 7 раз по сравнению с миграцией, наблюдающейся в культурах фибробластов, подвергающихся воздействию только DMEM. Чтобы определить, действительно ли данная миграция является CCR7-зависимой, в лунки с тройными повторами добавляют либо IgG, либо антитело против человеческого CCR7, либо антитело против человеческого CCL21 (все в концентрации 5 мкг/мл). Присутствие IgG не влияет на миграцию фибробластов IPF/UIP, тогда как присутствие антитела против CCR7 или антитела против CCL21 значительно ингибирует миграционный ответ фибробластов IPF/UTP. Предварительная обработка фибробластов 200 нг/мл коклюшного токсина также ингибирует CCL21-индуцированный миграционный ответ фибробластов IPF/UTP. Таким образом, полученные результаты показывают, что активация CCR7 стимулирует миграцию IPF/UIP, но не нормальных фибробластов.

Активация CCR7 стимулирует пролиферацию первичных фибробластов IPF/UIP. IPF/UIP характеризуется интенсивным альвеолярным и интерстициальным рубцеванием легкого вследствие, отчасти, экстенсивной фибропролиферации. В настоящем исследовании показано, что в линиях фибробластов IPF/UIP наблюдается повышенный пролиферативный ответ, и что во всех трех линиях IPF/UIP базовый уровень (т.е. обрабатывают только DMEM) скорости пролиферации приблизительно в 3 раза выше, чем в исследуемых линиях нормальных фибробластов. Кроме того, добавление CCL21, но не CCL19, в концентрации 10 нг/мл значительно увеличивает пролиферативные свойства всех трех линий первичных фибробластов IPF/UIP по сравнению с культурами, подвергающимися воздействию только DMEM. Пролиферативные свойства нормальных фибробластов не меняются в присутствии CCL19 или CCL21.

Активация CCR7 стимулирует CCL5, но не синтез коллагена de novo в первичных фибробластах IPF/UIP. Предыдущие исследования показывают, что хемокины могут управлять экспрессией других хемокинов в клетках разных типов. Например, добавление CCL5 к культурам фибробластов IPF/UIP значительно увеличивает экспрессию CCL7, предполагаемого биомаркера IPF/UIP. Чтобы определить, действительно ли активация CCR7 посредством CCL21 изменяет способность IPF/UIP и нормальных фибробластов генерировать хемокины, обе группы фибробластов подвергают воздействию CCL21 за 24 ч до анализа совокупности растворимых белков. CCL5 присутствует в культурах IPF/UIP и нормальных фибробластов, а CCL21 значительно увеличивает уровни CCL5 в IPF/UIP, но не в нормальных фибробластах. Удивительно, что присутствие CCL21 в культурах фибробластов IPF/UIP в течение 24 ч не влияет на синтез растворимого коллагена в данных клетках в соответствии с результатами анализа Sircol. Полученные данные вместе с результатами предыдущих исследований показывают, что активация CCR7 повышает способность фибробластов IPF/UIP синтезировать хемокины.

Экспрессия гладкомышечного альфа-актина (αSMA) не меняется под действием CCL21 в первичных фибробластах IPF/UIP и нормальных фибробластах. αSMA представляет собой белковый маркер подтипа фибробластов с высокой синтетической способностью, известного как миофибробласты (White et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2006, 173(1):112-1121). Зная, что CCL21 обладает выраженным влиянием на синтез хемокинов в фибробластах IPF/UIP, авторы стали выяснять, влияют ли лиганды CCR7 на экспрессию αSMA в данных клетках. Анализ методом вестерн-блоттинга показывает, что культуры фибробластов IPF/UIP экспрессируют более высокие уровни αSMA, чем культуры нормальных фибробластов, что согласуется с повышенными синтетическими свойствами клеток IPF/UIP. Однако CCL21 не влияет на экспрессию αSMA. Хотя αSMA-положительные фибробласты IPF/UIP экспрессируют CCR7 (по данным иммуногистохимического анализа), добавление CCL21 к этим клеткам не увеличивает дополнительно уровень данного белка, это позволяет предположить, что активация CCR7 не является основным стимулом дифференциации фибробластов в миофибробласты.

Сигнальный путь киназы, регулируемой внеклеточным сигналом P44/p42 (ERK 1/2), в фибробластах IPF/UIP активируется после активации CCR7 под действием CCL21. Многие важные клеточные функции регулируются группой сигнальных белков, в совокупности известных как пути митогенактивируемой протеинкиназы (MAPK). Каждый путь реализует уникальный эффект, оказываемый на клеточный цикл, рост и миграцию, отчасти вследствие того, что каждый путь активируется разными стимулами, в том числе факторами роста, стрессовыми факторами и воспалительными цитокинами. Каскад активации, инициируемой данными стимулами, включает последовательное фосфорилирование киназы MAPKK, киназы MAPK и MAPK. После конечной стадии MAPK может проникать в ядро и активировать один или несколько нижестоящих факторов транскрипции, что приводит к развитию биологических ответов, таких как пролиферация, миграция и выживание клеток. Чтобы определить влияние активированного CCR7 на пути MAPK, белки необработанных фибробластов и CCL21-активированных фибробластов собирают через 30 сек, 2, 5 и 30 минут, и методом вестерн-блоттинга проводят анализ ERK 1/2, p38 и c-Jun N-концевой киназы (JNK) путей MAPK. Хотя изменение фосфорилирования сигнальных белков, связанных с путями p38 и JNK, не наблюдается, в пути ERK 1/2 происходит изменение фосфорилирования после добавления CCL21 к культурам фибробластов IPF/UIP. Кроме того, отсутствует фосфорилирование c-RAF, MAPKKK данного пути.

Митогенактивируемая протеинкиназа (MEK 1/2) фосфорилируется в фибробластах IPF/UIP после воздействия CCL21. В необработанных (т.е. лишенных сыворотки) линиях первичных нормальных и IPF/UIP фибробластов конститутивная активация MEK 1/2 отсутствует. Добавление DMEM-0,5 к нормальным фибробластам вызывает времязависимое увеличение фосфорилирования MEK 1/2, максимальное значение которого достигается через 5 минут. Однако данный профиль фосфорилирования не изменяется в присутствии 10 нг/мл CCL21. В то время как добавление только DMEM-0,5 стимулирует времязависимую активацию MEK 1/2 в фибробластах IPF/UIP с пиком активации через 5 минут, добавление CCL21 (в концентрации 10 нг/мл) приводит к увеличению фосфорилирования через 2 и 5 минут, причем уровень фосфорилирования MEK 1/2 возвращается к среднему уровню через 30 минут. В совокупности полученные результаты позволяют предположить, что CCL21 ускоряет активацию MEK 1/2 в фибробластах IPF/UIP.

CCL21 ускоряет фосфорилирование ERK 1/2 в фибробластах IPF/UIP. В необработанных первичных нормальных и IPF/UIP фибробластах наблюдается конститутивное фосфорилирование ERK 1/2, однако базовая активность данной MAPK в нормальных фибробластах выше, чем в фибробластах IPF/UIP, в которых конститутивное фосфорилирование ERK 1/2 происходит на очень низком уровне. Добавление только DMEM-0,5 к нормальным фибробластам приводит к увеличению активации ERK 1/2 с пиком через 5 минут. Подобный характер активации ERK 1/2 наблюдается в культурах нормальных фибробластов, подвергающихся воздействию 10 нг/мл CCL21, добавленного к DMEM-0,5, однако общие уровни фосфорилирования ERK 1/2 в данных культурах ниже. Добавление только DMEM-0,5 к культурам фибробластов IPF/UIP вызывает фосфорилирование ERK 1/2, характер которого подобен наблюдающемуся в культурах нормальных фибробластов, однако величина активации гораздо выше в фибробластах IPF/UIP, чем в нормальных фибробластах. В культурах фибробластов IPF/UIP, подвергающихся воздействию CCL21 и DMEM-0,5, через 2 мин наблюдается значительное увеличение фосфорилирования по сравнению с фосфорилированием ERK 1/2 в культурах данных фибробластов, подвергающихся воздействию только DMEM-0,5. Вследствие низкого конститутивного фосфорилирования ERK 1/2 в фибробластах IPF/UIP, уровни фосфорилирования после воздействия только DMEM-0,5 или DMEM-0,5 + 10 нг/мл CCL21 на данные клетки в 60-125 раз выше, чем в культурах, содержащих необработанные фибробласты IPF/UIP.

Фосфорилирование рибосомальной киназы S6 (p90RSK) в фибробластах IPF/UIP стимулируется CCL21. Показано, что p90RSK активируется хемокином CXCL12 в процессе миелопоэза (Lee et al., 2002, Blood 99(12):4307-4317). Анализ p90RSK в настоящем исследовании показывает, что данный фактор транскрипции (расположенный ниже ERK 1/2) присутствует в фосфорилированном состоянии в необработанных нормальных и IPF/UIP фибробластах. Изменения активации p90RSK происходят подобным образом в культурах нормальных фибробластов независимо от присутствия CCL21. Наоборот, присутствие CCL21 в культурах фибробластов IPF/UIP во все анализируемые моменты времени увеличивает фосфорилирование данного фактора транскрипции примерно в 2,5 раза по сравнению с необработанными культурами. В совокупности полученные результаты показывают, что CCR7 является активным рецептором в фибробластах IPF/UIP, и что данный рецептор отвечает на сигнал, по меньшей мере, отчасти, через путь ERK 1/2. Хотя в нормальных фибробластах наблюдается активация пути ERK 1/2, данная активация не зависит от присутствия CCL21.

Ингибирование G-белка коклюшным токсином или молчание гена CCR7, достигаемое с помощью маленьких интерферирующих РНК, уменьшает CCL21-опосредованную активацию ERK 1/2. Чтобы подтвердить роль CCR7 в активации фибробластов IPF/UIP, предпринимают дополнительные исследования, позволяющие определить, действительно ли коклюшный токсин (ингибитор белков Gi и Go) или миРНК-опосредованное молчание гена CCR7 подавляет влияние CCL21 на активацию ERK 1/2. Добавление специфичной для CCR7 миРНК уменьшает белковую экспрессию данного рецептора приблизительно на 70% через 24 ч после трансфекции. Такое ингибирование экспрессии белка CCR7 сохраняется в течение 30 мин в процессе данного исследования. Ни специфичная для ламина A/C миРНК, ни случайная миРНК не влияют на экспрессию белка CCR7 в фибробластах IPF/UIP. Таким образом, полученные данные показывают, что CCR7 успешно нацеливается in vitro с использованием специфичной миРНК. Присутствие коклюшного токсина или миРНК CCR7 в культурах фибробластов IPF/UIP уменьшает фосфорилирование MEK 1/2, ERK 1/2 и p90RSK до уровней, наблюдающихся в культурах, подвергающихся воздействию только DMEM-0,5. В нескольких исследованиях было показано, что первичные человеческие легочные фибробласты вступают в профиброзную активацию в ответ на хемокины (Atamas et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2003, 29(6):743-9; Keane et al., J. Immunol., 1997, 159(3):1437-1443; Prasse et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2006, 173(7)781-792; Puxeddu et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2006, 117(l):103-110) и являются надежным источником хемокинов (Keane et al., J. Immunol., 1997, 159(3): 1437-1443; Prasse et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2006, 173(7)781-79).

Настоящее исследование направлено на изучение роли экспрессии CCR7 в первичных фибробластах IPF/UIP, полученных из SLB, взятых во время диагностирования заболевания. В отличие от первичных нормальных фибробластов, полученных из нормальных краев удаленных опухолей легких, фибробласты IPF/UIP и αSMA-положительные миофибробласты экспрессируют CCR7, рецептор, который предположительно ограничен клетками гематопоэтического происхождения. Активация CCR7 посредством скорее CCL21, чем CCL19, стимулирует и/или значительно изменяет миграцию, пролиферацию и способность к синтезу хемокинов фибробластов IPF/UIP. Экзогенный CCL21 в CCR7-зависимой манере активирует путь ERK 1/2 MAPK. Таким образом, проведенное исследование позволяет предположить, что фибробласты IPF/UIP приобретают способность отвечать на лиганды CCR7, которые обильно экспрессируются в легких независимо от статуса заболевания (Choi et al., J. Clin. Pathol., 2006 59(1):28-39), и такая отвечаемость может играть ключевую роль в избыточной пролиферации, характерной для IPF/UIP.

Итак, данный пример показывает, что первичные человеческие фибробласты, полученные из SLB IPF/UIP, экспрессируют функциональный CCR7. Активация CCR7 его лигандами, в особенности CCL21, вызывает миграцию, пролиферацию и синтез хемокинов в фибробластах IPF/UIP. CCL21-индуцированная активация посредством CCR7 является G-белок-зависимой и включает активацию пути ERK 1/2 MAPK. На основе полученных результатов и других данных, заключающихся в том, что CCL21 ингибирует экспериментальное гломерулярное (Banas et al., J. Immunol., 2002, 168(9):4301-4307) и печеночное (Bonacchi et al. Gastroenterology, 2003, 125(4):1060-1076) рубцевание, делают вывод, что CCR7 представляет собой новую мишень при IPF/UTP. Кроме того, полученные результаты показывают, что индуцированное CCL21 фосфорилирование MEK 1/2, ERK 1/2 и p90RSK зависит от сигнальных событий и CCR7, функционально связанных с G-белком.

На протяжении приведенного описания и нижеследующей формулы изобретения, если контекст не требует иного толкования, фраза "включают" или ее вариации, такие как "включает" или "включающий", предполагает включение указанного целого значения или стадии, или группы целых значений или стадий, но не исключение какого-либо другого целого значения или стадии, или группы целых значений или стадий.

В свете настоящего описания все композиции и/или способы, раскрытые и заявленные в данном документе, могут быть получены и осуществлены без излишнего экспериментирования. Хотя композиции и способы настоящего изобретения описаны в контексте конкретных вариантов осуществления, специалистам в данной области следует понимать, что вариации композиций и/или способов, а также стадий или последовательности стадий описанного в данном документе способа могут быть осуществлены без отступления от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, следует понимать, что некоторые химически и физиологически родственные средства можно использовать вместо средств, описанных в данном документе, получая при этом такие же или подобные результаты. Все эти подобные заменители и модификации, известные специалистам в данной области, удовлетворяют сущности, объему и концепции настоящего изобретения, которые определены в прилагающейся формуле изобретения.

Приведенные в данном описании ссылки в той степени, в которой они иллюстрируют процедуры или другие детали в дополнение к указанным в данном документе, специально включены в данное описание в качестве ссылки.

Группа изобретений относится к области фармацевтики. Способ включает уменьшение количества или активности CCL21 в фиброцитах и/или фибробластах, присутствующих в участке фиброзного повреждения при указанном фиброзном нарушении, где уменьшение количества или активности CCL21 предусматривает приведение данного млекопитающего в контакт со средством, уменьшающим количество или активность CCL21 в указанных фибробластах. Данное средство вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или нескольких симптомов указанного хронического фиброзного нарушения. Группа изобретений позволяет снизить количество фиброзных повреждений и эффективно лечить симптомы фиброзных нарушений. 6 н. и 17 з.п. ф-лы, 16 ил., 5 пр.

1. Способ лечения хронического фиброзного нарушения у млекопитающего, включающий уменьшение количества или активности CCL21 в фиброцитах и/или фибробластах, присутствующих в участке фиброзного повреждения при указанном фиброзном нарушении, где уменьшение количества или активности CCL21 предусматривает приведение данного млекопитающего в контакт со средством, уменьшающим количество или активность CCL21 в указанных фибробластах, где данное средство вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или нескольких симптомов указанного хронического фиброзного нарушения.

2. Способ по п.1, который дополнительно включает уменьшение количества или активности CCL19 в фибробластах, связанных с указанным фиброзным нарушением, предусматривающее приведение данного млекопитающего в контакт со средством, уменьшающим количество или активность CCL21 в указанных фибробластах.

3. Способ по п.2, где указанное уменьшение количества или активности CCL21 и CCL19 в фиброцитах и/или фибробластах достигают путем приведения указанного млекопитающего в контакт со средством, которое ингибирует CCL21 и CCL19 в указанных фиброцитах и/или фибробластах, в количестве, эффективном для облегчения одного или нескольких симптомов указанного хронического фиброзного нарушения.

4. Способ по п.1, где указанное средство представляет собой антитело, способное к специфическому иммунному взаимодействию с CCL21.

5. Способ по п.1, где уменьшение количества или активности CCL21 достигают путем приведения указанного млекопитающего в контакт со средством, которое уменьшает экспрессию CCL21 в указанных фибробластах, в количестве, эффективном для облегчения одного или нескольких симптомов указанного хронического фиброзного заболевания.

6. Способ по п.5, где указанное средство представляет собой молекулу миРНК, направленную против CCL21.

7. Способ по п.1, где указанное фиброзное нарушение выбрано из группы, состоящей из фиброза легких, хронического обструктивного заболевания легких, фиброза печени, ревматоидного артрита, застойной сердечной недостаточности, хронического заболевания почек, пневмонита с гиперчувствительностью, респираторного бронхиолита/интерстициального заболевания легких, инфекции, вызванной шистосомой Мансона, первичной легочной гипертензии, вызванной плексиформными повреждениями, легочных проявлений заболеваний, связанных с вирусом герпеса, дерматологических проявлений заболеваний, связанных с вирусом герпеса; келоидных рубцов, волчанки, нефрогенной фиброзной дермопатии, фиброзных повреждений, связанных с инфекцией Schistosoma japonicum, аутоиммунных заболеваний, патогенного фиброза, болезни Лайма, реструктурирования стромы при панкреатите и стромальном фиброзе, фибромы матки, фиброза яичников, фиброза роговицы, застойной сердечной недостаточности и других постишемических состояний, рубцевания после хирургической операции в брюшной полости, рубцевания после трабекулотомии при открытоугольной глаукоме, а также любых сочетаний перечисленных заболеваний.

8. Способ по п.1 или 5, включающий введение указанного средства локально в участок фиброзного повреждения.

9. Способ по п.8, где указанное фиброзное повреждение находится в легком, и указанную композицию приводят в локальный контакт с указанным повреждением.

10. Способ по п.1 или 5, где указанное средство включает фрагмент, обеспечивающий специфическую доставку указанного средства к участку фиброзного повреждения.

11. Способ по п.10, где указанное фиброзное повреждение находится в легком, и указанную композицию приводят в локальный контакт с указанным повреждением.

12. Способ ингибирования пролиферации фибробластов и/или фиброцитов, включающий приведение указанных фибробластов и/или фиброцитов в контакт с композицией, которая содержит антитело против CCL21 или молекулу миРНК, направленную против CCL21.

13. Способ по п.12, дополнительно включающий приведение в контакт указанного фибробласта с композицией, которая содержит антитело против CCL19 или молекулу миРНК, направленную против CCL19.

14. Способ по п.12 или 13, дополнительно включающий приведение указанного фибробласта в контакт с композицией, которая содержит антитело против CCR7 или молекулу миРНК, направленную против рецептора CCR7.

15. Способ по п.12, где указанные фиброциты и/или фибробласты локализованы in vitro или in vivo.

16. Способ по п.12, где указанные фиброциты и/или фибробласты локализованы in vivo в легочной ткани.

17. Способ ингибирования миграции фиброцитов и/или активации фибробластов, включающий приведение в контакт указанных фиброцитов и/или фибробластов с композицией, ингибирующей активность CCL21.

18. Способ лечения фиброза легких, включающий ингибирование миграции фиброцитов и/или активации резидентных легочных фибробластов, расположенных в легочной ткани млекопитающего, страдающего от фиброзного заболевания легких, путем ингибирования активности или экспрессии CCL21 в указанных фиброцитах и/или фибробластах, и посредством этого предотвращение избыточной продукции внеклеточного матрикса и улучшение симптомов фиброза легких, предусматривающий приведение данного млекопитающего в контакт со средством, уменьшающим количество или активность CCL21 в указанных фиброцитах и фибробластах.

19. Способ лечения или ингибирования развития индуцированного облучением легочного ламинита и/или индуцированного облучением фиброза легких, и/или развития индуцированного лекарственным средством фиброза легких у больного, включающий введение указанному больному средства, уменьшающего количество или активность CCL21 в фиброцитах и/или фибробластах легочной ткани указанного больного, где упомянутое средство вводят до, во время и/или после лучевой терапии или введения лекарственного средства.

20. Способ по п.19, который дополнительно включает введение средства, уменьшающего количество или активность CCL19 в фибробластах, связанных с указанным фиброзным нарушением.

21. Способ по п.19, где указанное средство выбрано из группы, состоящей из цитотоксического средства, антибиотика, противоаритмического средства, противовоспалительного средства и наркотика.

22. Способ по любому из пп.18 или 19, где указанное средство вводят в сочетании с кортикостероидом, иммуносупрессивным средством, антикоагулянтом, диуретиком, сердечным гликозидом, блокатором кальциевых каналов, сосудорасширяющим средством, аналогом простациклина, антагонистом эндотелина, ингибитором фосфодиэстеразы, агонистом бета-2, антимускариновым средством, ингибитором эндопептидазы, средством, снижающим уровень липидов, ингибитором тромбоксана или их сочетанием.

23. Применение средства, уменьшающего количество или активность CCL21, и необязательно средства, уменьшающего количество или активность CCL19, в фиброцитах и/или фибробластах, присутствующих в участке фиброзного повреждения, для получения лекарственного средства для лечения хронического фиброзного нарушения у млекопитающего.