СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТОРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК ПО УВЕЛИЧЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ В КРОВИ МОЛЕКУЛ SCD54, SCD56, SCD71 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, физиологии, иммунологии и предназначено для прогнозирования эффекторной недостаточности цитотоксических клеток по увеличению концентраций в крови молекул sCD54, sCD56, sCD71.

Цитотоксические Т-лимфоциты обеспечивают лизис поврежденных клеток каскадом последовательно развивающихся реакций перфоринов, гранзимов, несколько позже - лимфотоксинов, а также путем антителозависимого цитолиза и участия в утилизации продуктов апоптоза [Ma L.L., Wang C.L., Neely G.G. et al. NK cells use perforin rather than granulysin for anticryptococcal activity // Journal of Immunology. 2004. Vol.173. P. 3357-3365; Woo Y.L., Sterling J., Damay I. et al. Characteising the local immune responses in cervical intraepithelial neoplasia // В JOG. 2008. Vol.115. P. 1616-1622; Cunha C.F., Ferraz R., Pimentel M.I.F. et al. Cytotoxic cell involvement in human cutaneous leishmaniasis: assessments in active disease, under therapy and after clinical cure // Parasite Immunol. 2016. Vol.38. №4. P. 244-254.].

Кластер дифференциации CD56 находится на мембране клеток иейрогенного происхождения, мышечных, а также натуральных киллерах, в том числе тимического происхождения, различных популяциях Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+), нейтрофилах, моноцитах, эпителиальных, и дендритных клетках [Lanier L.L., Testi R., Bindl J. et al. Identity of Leu-19 (CD56) leukocyte differentiation antigen and neural cell adhesion molecule // J. Exp.Med. 1989. Vol.169(6). P. 2233-2238; Kussick S.J., Wood B.L. Using 4-color flow cytometry to identify abnormal myeloid populations // Arch Pathol Lab Med. 2003. Vol.127(9). P. 1140-1147; Moon H.W., Huh J.W., Lee M. et al. Immunophenotypic Features of Granulocytes, Monocytes, and Blasts in Myelodysplastic Syndromes // Korean J Lab Med. 2010. Vol.30(2). P. 97; Gong P., Metrebian F., Dulau-Florea A. et al. Aberrant expression of CD56 on granulocytes and monocytes in myelo-proliferative neoplasm // J Hematop.2013. Vol.6(3). P. 127-134.]. CD56 проводит сигнал активизации секреции хемокинов, интегринов, ферментов, цитокинов, иммуноглобулинов, гормонов и других биологически активных веществ, характерных для данного типа клетки [Crinier A., Narni-Mancinelli Е., Ugolini S., Vivier Е. Snapshot: Natural Killer Cells // Cell. 2020. Vol.180(6). P.1280-1280.el.]. В крови циркулируют мононуклеары с преобладанием секреции литических гранул перфоринов и гранзимов CD56^dim и CD56^bnght и цитокинов [Montaldo Е., Del Zotto G., Delia Chiesa M. et al. Human NK cells receptor/markers: a tool to analyze NK cell development, subsets and function // Cytometry A. 2013. Vol.83(8). P. 702-713; Del Zotto G., Marcenaro E., Vacca P. et al. Markers and function of human NK cells in normal and pathological conditions // Cytometry В Clin. Cytom. 2017. Vol.92(2). P. 100-114; Moon H.W., Huh J.W., Lee M. et al. Immunophenotypic Features of Granulocytes, Monocytes, and Blasts in Myelodysplastic Syndromes // Korean J Lab Med. 2010. Vol.30(2). P. 97; Gong P., Metrebian F., Dulau-Florea A. et al. Aberrant expression of CD56 on granulocytes and monocytes in myelo-proliferative neoplasm // J Hematop.2013. Vol.6(3). P. 127-134.].

Свободные кластеры дифференциации формируются путем шеддинга в результате протеолитического расщепления трансмембранного участка рецептора [Fasching P., Veitl М., Rohac М. et al. Elevated concentrations of circulating adhesion molecules and their association with microvascular complications in insulindependent diabetes mellitus // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996. Vol.81(12). P. 4313-4317; Rothlein R., Mainolfi E.A., Czajkowski M. et al. A form of circulating ICAM-1 in human serum // J. Immunol. 1991. Vol.147(11). P. 3788-3793; Бабаев A.A., Князев Д.И., Кравченко Г.А. и др. Растворимые олигомеры молекул адгезии CD50 и CD 18 в сыворотке крови человека // Иммунология. 2011. Т. 32. №2. С. 69-71.]. Наличие определенного уровня содержания внеклеточного пула рецепторных структур у практически здоровых людей свидетельствует о том, что процесс щеддинга является физиологическим. Внеклеточный пул сигнальных молекул, рецепторов и лигандов сохраняет функциональную способность реагировать с соответствующим субстратом, не обеспечивая проведения сигнала в клетку, но, связывая и инактивируя биологически активные вещества. Сывороточные формы рецепторов и их комплексы способны взаимодействовать с мембранными лигандами, блокировать клеточные контакты, подавлять миграцию и рециркуляцию клеток, ограничивая тем самым уровни межклеточного взаимодействия в иммунном ответе [Новиков В.В., Барышников А.Ю., Караулов А.В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы // Иммунология. 2007. Т. 28. №4. С.249-253; Новиков В.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы. М.: МИА, 2008. 256 с.]. Внеклеточные молекулы циркулируют в основном в виде комплексов, что предохраняет их от деградации протеазами [Новиков В.В. Растворимые формы дифференцировочных антигенов гемопоэтических клеток // Гематология и трансфузиология. 1996. №6. С. 40-43; Heidenreich К.А., deVellis G., Gilmore P.R. Functional properties of the subtype of insulin receptor found on neurons // J. Neurochem. 1988. Vol.51(3). P. 878-887; Kitamura T. Mosaic analysis of insulin receptor function // J. Clin. Invest. 2004. Vol.113(2). P. 209-219.]. Образующиеся циркулирующие комплексы внеклеточных рецепторных структур способны к диссоциации с сохранением специфических свойств и функциональной активности [Новиков В.В., Барышников А.Ю., Караулов А.В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы // Иммунология. 2007. Т. 28. №4. С. 249-253; Новиков В.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы. М.: МИА, 2008. 256 с.].

Есть мнение, что сбрасывание рецепторов происходит при снижении функциональной активности, в том числе, при покое клетки [Monroe J.G., Cambier J.C. Plasma membrane depolarization is an early event in antiimmunoglobulin and antigen mediated В cell stimulation // Immunobiology. 1982. Vol.163. P. 181; Brieva J.A., Villar L.M., Leoro G. Soluble HLA class I antigen secretion by normal lymphocytes: relationship with cell activation and effect of interferon-gamma // Clin. Exp.Immunol. 1990. Vol.82(2). P. 390-395.]. Ряд авторов предполагает, что сбрасывание рецепторов необходимо для их обновления [Ashman R.F. Accelerated loss and replacement of receptors on antigen-binding cells after immunization // J. Immunol. 1980. Vol.124. P.893-904; Ashman R.F. Immunological role of antigen binding cell // Immunol. Today. 1982. Vol.3. P. 349-352.]. Тот факт, что интенсивность формирования антиген реактивных рецепторов ассоциирована с восстановлением способности клетки к иммунному ответу, позволяет утверждать, что замена рецепторов необходима клетке для ее дифференцировки [Teale J.M., Liu F.-T., Katz D.H. A clonal analysis of the IgE response and its implication with regard to isotope commitment // J. Exp.Med. 1981. Vol.153. P. 783-792; Ashman R.F. Immunological role of antigen binding cell // Immunol. Today. 1982. Vol.3. P. 349-352.]. Есть мнение, что шеддинг рецепторов осуществляют активированные клетки при чрезмерной их секреции и накоплении в межклеточной среде как потенциально опасные концентрации, активирующие протеолитические ферментные системы [Самодова А.В., Добродеева Л.К. Роль шеддинга в активности иммунокомпетентных клеток с реагиновым механизмом защиты // Физиология человека. 2012. Т. 38. №4. С. 114-120; Самодова А.В., Добродеева Л.К. Соотношение содержания пула свободных рецепторов молекул адгезии и уровня активности иммунной системы у жителей Мурманской области // Физиология человека. 2019. Т. 45. №1. С. 104-112].

Известен способ определения цитотоксической активности NK-клеток для оценки риска невынашивания беременности [Патент РФ №2657433, опубл. 13.06.2018]; при цитотоксической активности, превышающей физиологический уровень, прогнозируют высокий риск невынашивания. Однако, оценка цитотоксичности натуральных киллеров проводится на культуре клеток, которые в динамике культивирования обычно трансформируются и далеко не идентичны клеткам ткани трофобласта.

Способ ранней диагностики тяжелой формы герпесвирусной инфекции у новорожденных детей [Патент РФ №2542467, опубл. 20.02.2015], путем исследования крови ребенка, отличающийся тем, что в крови новорожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией на 7-10 сутки определяют уровень CD16+CD25+ и IL-6 и при значениях CD16+CD25+ 3,5% и ниже, a IL-6 32,6 пг/мл и выше диагностируют развитие тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа. Инфицирование вирусами простого герпеса регистрируется фактически у каждого человека, а уровень активированных Т-лимфоцитов (CD16+CD25+) зависит от рецидива.

При прогнозе предрасположенности к раку и его первичной профилактики [Патент РФ №2568590, опубл. 20.11.2015 Способ первичной профилактики рака] применяют метод фенотипирования с определением субпопуляций лимфоцитов по CD-маркерам: a) CD3+; б) CD4+; в) CD8+; г) CD 16+; д) CD56+, при отклонении содержания которых в крови пациента от нормы (главным образом увеличение содержания CD8+ и уменьшение CD 16+ и CD56+) проводят профилактику путем приема комплексных растительных лекарственных препаратов. Заявленный способ включает длительную пробоподготовку с выделением клеточной взвеси и определением 5 популяций фенотипов лимфоцитов, в то время как в нашем изобретении предложен простой и понятный способ прогнозирования формирования эффекторной недостаточности цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров.

Аналогами изобретения являются 3 изобретения по определению концентрации sICAM-1 (sCD54) [Патент РФ №2574984, опубл. 10.02.2016, патент US 20060199239, опубл. 07.09.2006 «Assessment of cardiac health and thrombotic risk in a patient», Kim D.S., Paik S.H., Lim CM. et al. Value of ICAM-1 expression and soluble ICAM-1 level as a marker of activity in sarcoidosis // Chest. 1999. Vol.115. P. 1059-1065.]. В первом и втором патенте регистрируются низкие концентрации sICAM-1 менее 300 нг/мл, а в третьем исследовании решение принимается при повышенных концентрациях sCD54.

Следует отметить, что в данных предложениях оценивается активность иммунного ответа, функциональное состояние сердца, ремиссия при саркоидозе, но не дифференцируется механизм влияния разных концентраций ICAM-1, мы же говорим о цитотоксичности клеток. Повышенная активность шеддинга CD54 (ICAM-1) наблюдается при активизации воспаления любой этиологии, а сбрасывают молекулы адгезии при воспалении различные типы клеток.

Способ дифференциальной диагностики анемии у детей (патент РФ №2538722, опубл. 10.01.2015), включающий определение параметров метаболизма железа, отличающийся тем, что на гематологическом анализаторе определяют показатели гемограммы и индексы красной крови, такие как: гемоглобин (НВ) и гемоглобин ретикулоцитов (Ret-He), а в сыворотке крови определяют уровень растворимого рецептора трансферрина (sCD71), эритропоэтина сыворотки (ЭПО). При значениях: НВ<120 г/л, sCD71<25 нМЕ/мл, Ret-He>29 пг, ЭПО<21 мМЕ/мл делают вывод об анемии на фоне воспаления (АВ), при значениях: НВ<120 г/л, sCD71>25 нМЕ/ мл, Ret-He<29 пг, ЭПО>50 мМЕ/мл делают вывод о железодефицитной анемии (ЖДА). Заявленный способ является очень трудоемким и предполагает выделение клеточной взвеси и исследование сыворотки. Кроме того, дифференциация анемии основана преимущественно на различиях в концентрации эритропоэтина.

Таким образом, в указанных изобретениях увеличение концентрации сывороточных рецепторов, цитоксических Т-лимфоцитов и снижение содержания натуральных киллеров изучается в диагностике и динамике патологического процесса с целью неблагоприятного прогноза заболевания.

Близким по достигаемому техническому результату можно считать способ оценки цитотоксической активности лимфоцитов натуральных киллеров (НК) [Патент РФ №2514019, опубл. 27.04.2014]. Но рассматриваемый способ включает иное техническое решение поставленной задачи, нежели предложенное нами изобретение. В ходе реализации прототипа из периферической крови обследуемых людей в градиенте плотности фиколл-верографина выделяют взвесь мононуклеарных клеток с последующей постановкой цитотоксического теста, который основан на инкубации НК лимфоцитов и клеток-мишеней К-562 с дальнейшим подсчетом числа оставшихся, не деградированных клеток-мишеней. Таким образом, в прототипе осуществляется постановка цитотоксической реакции в условиях in vitro и на линии культуры клеток.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа прогнозирования эффекторной недостаточности цитотоксических клеток по увеличению концентрации в крови sCD54, sCD56, sCD71. Изобретение позволяет в обычных условиях без дополнительных трудозатрат на выделение клеточной взвеси выявить интегральную недостаточность цитотоксичности (цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров, в том числе тимического происхождения), как в сыворотке крови, так и в межтканевой жидкости, транссудатах, экссудатах, моче и слюне. Использование данного способа позволит выявить лиц, имеющих риск онкологии, внутриклеточных инфекций, инфекционной аллергии и аутоиммунных заболеваний.

Заявленный способ осуществляется следующим образом. Объектом исследования может быть сыворотка крови или другая биологическая жидкость (до 0,5 мл), в которой иммуноферментным способом с диагностическими наборами на автоматическом анализаторе определяются концентрации sCD54, sCD56, sCD71.

Указанным способом были обследованы 525 человек в возрасте от 21 до 55 лет, из них 328 женщин и 197 мужчин, в т.ч. 178 практически здоровых на момент обследования человек, проживающих в Архангельской (г.Архангельск, поселки Коношского района), Мурманской (поселки Ревда и Ловозеро) областей и архипелага Шпицберген (Баренцбург), 139 больных с диагнозом стафилококковая инфекционная аллергия, 103 человека с раком желудка и 105 больных с раком толстой кишки. База данных иммунологического обследования больных онкопатологией и инфекционной аллергией получена в МК «Биолам». Обследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft», США).

Проведенные нами исследования показали, что у 332 из 347 больных (95,68%) инфекционной аллергией и злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта по сравнению с группой практически здоровых лиц патологические реакции сопровождаются резким увеличением концентрации sCD54 (с 167,53±7,68 до 363,88±12,35 нг/мл), sCD56 (с 15,92±1,35 до 41,20±6,56 нг/мл), sCD71 (с 707±53 до 2073±145 нг/мл). Аномальное повышение концентраций sCD54>300 нг/мл, sCD56>20 нг/мл, sCD71>1900 ассоциируется со снижением содержания эффекторных клеток CD8+ (с 0,40±0,04 до 0,17±0,04×10⁹ кл/л; р<0,001) и CD56+ (с 0,51±0,06 до 0,25±0,04×10⁹ кл/л; р<0,001); статистически достоверные различия в содержании этих клеток в зависимости от уровня повышения sCD54, sCD56, sCD71 получены при инфекционной аллергии и при онкопатологии (р<0,05-0,01). Итак, при одновременном выявлении содержания sCD54>300 нг/мл, sCD56>20 нг/мл, sCD71>1900 нг/мл прогнозируется высокий уровень риска (95%) эффекторной недостаточности цитотоксических клеток.

Частные примеры использования заявленного способа.

1. Практически здоровая женщина В., возраст 55 лет. При лабораторном обследовании периферической крови выявлено, что концентрация sCD54 составила 235,80 нг/мл, sCD56 - 8,30 нг/мл, sCD71 - 882,3 нг/мл. Сделан вывод об отсутствии риска эффекторной недостаточности цитотоксических клеток, что доказывается результатами иммунологического исследования лимфоцитов: CD8+ (0,42×10⁹ кл/л) и CD56+ (0,45×10⁹ кл/л). Значения данных показателей оказались в пределах нормы. Выявленная закономерность подтверждена.

2. Больной П., возраст 31 год. Диагноз стафилококковая инфекционная аллергия. При лабораторном обследовании выявлено, что концентрация sCD54 в крови составила 478,10 нг/мл, sCD56 - 23,712 нг/мл, sCD71 - 2160,87 нг/мл. Сделан вывод о высоком риске эффекторной недостаточности цитотоксических клеток, что доказывается результатами иммунологического исследования. Установлена недостаточность содержания лимфоцитов с рецепторами CD8+ (0,17×10⁹ кл/л) и CD56+ (0,27×10⁹ кл/л). Значения показателя CD8+ оказалось ниже нормы, а концентрация CD56+- очень низкой. Выявленная закономерность подтверждена.

3. Больная Р., возраст 52 года. Диагноз рак желудка. При лабораторном обследовании периферической крови выявлено, что концентрация sCD54 составила 355,79 нг/мл, sCD56 - 25,712 нг/мл, sCD71 - 1994,8 нг/мл. Сделан вывод о высоком риске эффекторной недостаточности цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров, что доказывается результатами иммунологического исследования лимфоцитов. Установлена недостаточность содержания лимфоцитов с рецепторами CD8+ (0,16×10⁹ кл/л) и CD56+ (0,12×10⁹ кл/л). Значения показателей CD8+ и CD56+ оказались ниже нормы. Выявленная закономерность подтверждена.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, физиологии, иммунологии и предназначено для прогнозирования эффекторной недостаточности цитотоксических клеток по увеличению концентраций молекул sCD54, sCD56, sCD71. В периферической венозной крови обследуемых лиц определяют концентрации sCD54, sCD56, sCD71. При одновременном повышении концентраций sCD54>300 нг/мл, sCD56>20 нг/мл и sCD71>1900 нг/мл прогнозируется высокий уровень риска - 95% эффекторной недостаточности цитотоксических клеток. Изобретение позволяет выявить лиц, имеющих риск онкологии, внутриклеточных инфекций, инфекционной аллергии и аутоиммунных заболеваний. 3 пр.

Способ прогнозирования эффекторной недостаточности цитотоксических клеток по увеличению концентраций молекул sCD54, sCD56, sCD71, отличающийся тем, что в периферической венозной крови обследуемых лиц определяют концентрации sCD54, sCD56, sCD71; при одновременном повышении концентраций sCD54>300 нг/мл, sCD56>20 нг/мл, sCD71>1900 нг/мл прогнозируется высокий уровень риска - 95% эффекторной недостаточности цитотоксических клеток.