СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРИХОМОНИАЗА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и касается диагностики урогенитального трихомониаза на основе цитоморфотипа возбудителя. Включает культуральный метод исследования клинического материала пациентов, полученного из урогенитального тракта, с микроскопическим анализом цитоморфотипа возбудителя в нативных и окрашенных мазках-препаратах. Это позволяет улучшить качество лабораторной диагностики заболевания, обеспечивает точность постановки диагноза, что повышает эффективность лечения, а следовательно, снижает частоту осложнений при хронической трихомонадной инфекции.

Урогенитальный трихомониаз является наиболее распространенной инфекцией, передаваемой половым путем, в мире уже более 10 лет. Заболевание характеризуется многоочаговыми поражениями урогенитального тракта пациентов. При этом у мужчин инфекция протекает в форме баланопоститов, уретритов, куперитов, простатитов, везикулитов, эпидидимитов или циститов. У женщин возбудитель инфекции - Trichomonas vaginalis вызывает кольпиты, эндоцервиты, проктиты, циститы и пиелиты. Посттрихомонадные рубцовые сужения уретры служат частой причиной развития мужского бесплодия. У женщин осложнениями урогенитального трихомониаза являются эктопия шейки матки, сальпингоовариальные гнойные образования, миома матки, патология беременности, а также злокачественные новообразования. Все вышеизложенное имеет социальное значение.

В последнее время многие специалисты отмечают патоморфозы в клинической картине урогенитального трихомониаза, связанные с увеличением доли малосимптомных и торпидных форм, затрудняющих диагностику заболевания при осмотре пациентов. В таких случаях основополагающими при верификации диагноза становятся результаты микробиологических тестов.

Согласно действующим Приказам Минздрава России (№936, 173, 151н) ведущими в лабораторной диагностике урогенитального трихомониаза являются прямые методы, позволяющие выделить в исследуемом материале пациентов самого возбудителя инфекции либо его геном. Вместе с тем в практической медицине приоритетно используются микроскопический и культуральный методы исследования (Дмитриев Г.А. Диагностика инфекций, передаваемых половым путем. - М.: Бином, 2007. - 320 с., С.178), которые являются аналогами настоящего способа диагностики урогенитального трихомониаза. Однако все чаще данные методы исследования становятся малопригодными из-за большого разнообразия цитоморфологических форм возбудителя инфекции, встречающихся в клиническом материале пациентов. Это связано с его изменчивостью в ответ на действие неблагоприятных для него факторов среды обитания. Порой из-за ограничения подвижности клеток Trichomonas vaginalis их становится трудно отличить от клеток человека, тогда их дифференцировка в мазках становится весьма трудоемкой и требует от специалиста определенных навыков и опыта работы в лаборатории.

Известен способ выявления форм Trichomonas vaginalis (RU 2289813), включающий выделение ее нетипичных клеток и определение их жизнеспособности, путем посева биологического материала (крови пациентов) в питательную среду, содержащую сыворотку крови человека или лошади, инактивированную в течение 5-10 мин при температуре +56°C, и антибиотики в количестве 500 Ед/мл - пенициллин, стрептомицин и нистатин, после этого культуру инкубируют 2-е суток при температуре +37°C, затем пересевают на аналогичную среду, но содержащую сыворотку крови человека или лошади, инактивированную в течение 15-20 мин, и антибиотики в количестве 250 Ед/мл, затем осуществляют повторную инкубацию в течение 2-х суток при температуре +37°C, после этого делают пересев на среду, содержащую сыворотку, инактивированную 30 мин, без добавления антибиотиков и инкубируют пробы при температуре +37°C в течение 2-х суток, далее проводят еще 1-2 пересева на среду с полностью инактивированной сывороткой крови человека или лошади и без добавления антибиотиков, по происходящему активному почкованию или шизогонии судят о наличии живых нетипичных форм возбудителя, а при отсутствии размножения - о его дегенеративных, разрушающихся формах.

Недостатками этого способа является то, что он трудоемок (не менее 4-х пересевов культуры) и предназначен больше для экспериментальных исследований, в связи с чем не может быть использован в лабораторных тестах при массовых обследованиях пациентов с подозрением на урогенитальный трихомониаз, а также при их контрольном обследовании после проведенной антипротозойной терапии. Кроме того, при первичном осмотре пациентов, согласно нормативным документам, в качестве исследуемого материала может служить только отделяемое урогенитального тракта, где встречаются нетипичные формы возбудителя, а не кровь, как в прототипе. Ранее предложенный способ также не позволяет установить этиологическую значимость возбудителя выделенного цитоморфотипа, а следовательно, правильно интерпретировать полученный результат.

Задача изобретения состоит в разработке способа, позволяющего выявлять и оценивать этиологическую значимость нетипичных форм Trichomonas vaginalis в клиническом материале пациентов обследуемых на урогенитальный трихомониаз, а также для контроля за излеченностью таких больных. Его применение позволит снизить уровень ложноположительных результатов.

Поставленная задача решается с помощью результатов комплексного клинико-лабораторного и микробиологического исследования отделяемого урогенитального тракта пациентов с определением цитоморфотипа возбудителя инфекции при культуральном методе исследования и оценки степени выраженности воспаления (лейкоцитоза) в урогенитальном тракте обследуемых. Аналогично прототипу в данном способе определяется жизнеспособность выделенных из клинического материала цитоморфотипов возбудителя путем пересева материала на питательную среду, обогащенную сывороткой крови лошади, инактивированной при температуре +56°C в течение 30 мин. После инкубации культуры возбудителя при температуре +37°C в течение 2-х суток в мазках по активному почкованию или шизогонии судят о наличии жизнеспособных клеток возбудителя, а при выявлении дегенеративных, разрушающихся клеток - о их нежизнеспособности. В предлагаемом способе в отличие от прототипа в качестве клинического материала используют отделяемое урогенитального тракта (0,5 мл), который вносят в 1,0 мл 0,9%-ного изотонического раствора, нагретого до +37°C, и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин; после этого надосадочную жидкость отсасывают стерильной пипеткой, а центрифугат (0,5 мл) вносят в теплую селективную питательную среду (4,0 мл) с последующей инкубацией при температуре +37°C в течение 3-х суток под слоем вазелинового масла (0,5-1,0 см); по истечении времени инкубации из культуральной жидкости, содержащей клетки возбудителя, параллельно готовят нативный мазок с добавлением 1,0%-ного раствора метиленовой сини и фиксированный препарат, окрашенный по методу Фельгена, что позволяет дифференцировать цитоморфотипы возбудителя. При этом в готовых препаратах отмечают форму и размер клетки, характер подвижности, наличие или отсутствие ядра, что не проводится в прототипе. Кроме того, из клинического материала обследуемых готовят препарат, окрашенный по методу Романовского-Гимзе, для определения уровня лейкоцитоза. На основе комплекса вышеобозначенных показателей оценивают этиологическую значимость выделенных форм возбудителя Trichomonas vaginalis. При этом когда в клиническом материале обследуемых превалирует возбудитель грушевидной формы, с волнообразной подвижностью, мелких размеров, с двумя и более ядрами, сопровождается выраженной местной реакцией (лейкоцитоз 94,3±9,7 п/з), это указывает на острую стадию заболевания и его прогрессирование. Обнаружение в исследуемом материале больных возбудителя округлой формы, средних размеров, одноядерных с маятникообразной подвижностью, сопровождается умеренно выраженной местной реакцией (лейкоцитоз 35,5±15,9 п/з) и говорит о затяжном или хроническом процессе. Выделение из клинического материала больных возбудителя овальной формы, крупных размеров, без ядра и неподвижных, когда уровень лейкоцитов в пределах физиологической нормы или местная воспалительная реакция слабовыраженная (лейкоцитоз 10,1±3,8 п/з), то это свидетельствует о гибели возбудителя и затухании патологического процесса (Таблица 1).

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

1) исследуемый материал, полученный из урогенитального тракта пациентов (0,5 мл), вносят в 1,0 мл 0,9%-ного изотонического раствора, нагретого до +37°C, и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин; параллельно из исследуемого материала готовят препарат, окрашенный по методу Романовского-Гимзе, для определения уровня лейкоцитоза;

2) надосадочную жидкость отсасывают стерильной пипеткой, а центрифугат (0,5 мл) вносят в теплую селективную питательную среду (4,0 мл) с последующей инкубацией при температуре +37°C в течение 3-х суток под слоем вазелинового масла (0,5-1,0 см), что создает анаэробные условия;

3) из культуральной жидкости, содержащей клетки возбудителя, готовят нативный мазок с добавлением 1,0%-ного раствора метиленовой сини и фиксированный препарат, окрашенный по методу Фельгена, что позволяет дифференцировать цитоморфотипы;

4) при описании цитоморфотипа возбудителя отмечают его форму и размер, характер подвижности, а также наличие или отсутствие ядра в клетке;

5) для определения жизнеспособности клеток возбудителя делают пересев материала на аналогичную питательную среду, обогащенную сывороткой крови лошади, инактивированной при температуре +56°C в течение 30 мин. После 2-х суток инкубации при температуре +37°C готовят мазки и по активному почкованию или шизогонии, говорят о наличии жизнеспособных нетипичных форм возбудителя, а при выявлении дегенеративных, разрушающихся клеток - о их нежизнеспособности.

Пример 1

Больной, возраст 31 год, обратился в специализированную клинику г. Иркутска с жалобами на учащенное мочеиспускание ночью и боль в промежности. Из анамнеза: женат, случайные половые связи исключает, хотя год назад в длительной командировке у больного был незащищенный половой контакт, на инфекции, передаваемые половым путем, ранее не обследовался. Трансректальное ультразвуковое исследование простаты (ТРУЗИ) выявило парапростатический варикоз, признаки простатита. В соскобах уретры встречаются единичные в поле зрения лейкоциты, Trichomonas vaginalis не обнаружена. В мазках из сока простаты лейкоцитов 10-15-20 п/з, обнаружены округлые, одноядерные, средних размеров, малоподвижные клетки, морфологически схожие с клетками возбудителя. ПЦР на Trichomonas vaginalis положительная. Окончательный диагноз: хронический урогенитальный трихомониаз, подострое течение, простатит. После первого курса лечения пациент улучшения не отмечал, в соке простаты были выделены округлые, овальные, средние по размеру, неподвижные, одноядерные клетки возбудителя. После пересева на обогащенную питательную среду их количество увеличилось. Повторное лечение с учетом чувствительности выделенных изолятов Trichomonas vaginalis сопровождалось значительным улучшением самочувствия пациента, при контрольном обследовании в соке простаты лейкоцитов 5-10 п/з, обнаружены единичные неподвижные, безъядерные, крупные, полуразрушенные клетки.

Пример 2

Больная, возраст 24 года, обратилась в клинику с жалобами на зуд и жжение при мочеиспускании, обильные слизистые выделения из влагалища. У партнера месяц назад был диагностирован урогениальный трихомониаз. При гинекологическом осмотре выявлены признаки воспаления слизистой оболочки влагалища. В мазках выраженный лейкоцитоз (≥100 в п/з), встречаются грушевидные, мелкие, подвижные, одноядерные и многоядерные клетки возбудителя. Было проведено комплексное этиотропное лечение, после которого больная отметила улучшение самочувствия. В контрольных мазках лейкоцитов 15-20-25 п/з, Trichomonas vaginalis не обнаружена.

Анализ результатов собственных исследований показал взаимосвязь цитоморфотипа возбудителя трихомонадной инфекции с выраженностью воспалительного процесса в урогенитальном тракте обследованных пациентов (Таблица 1).

На основе предложенного способа можно оценивать этиологическую значимость выделенных цитоморфотипов Trichomonas vaginalis в развитии воспалительного процесса урогенитального тракта больных. Новый методический подход в лабораторной диагностике заболевания позволит улучшить эффективность терапии пациентов, страдающих хроническим урогенитальным трихомониазом.

Предлагаемый способ является новым и в литературе не описан.

Изобретение относится к медицине и касается диагностики урогенитального трихомониаза на основе цитоморфотипа возбудителя. Способ включает комплексное клинико-лабораторное и микробиологическое исследование отделяемого урогенитального тракта пациентов с определением цитоморфотипа возбудителя при культуральном методе исследования и оценки степени выраженности воспаления или лейкоцитоза в урогенитальном тракте обследуемых. Изобретение позволяет улучшить качество лабораторной диагностики заболевания, обеспечивает точность постановки диагноза, что повышает эффективность лечения, а следовательно, снижает частоту осложнений при хронической трихомонадной инфекции. 1 табл., 2 пр.

Способ диагностики урогенитального трихомониаза, включающий культуральный метод исследования клинического материала пациентов, позволяющий выделять нетипичные формы возбудителя на основе микроскопии и определять их жизнеспособность путем пересева материала на питательную среду, обогащенную сывороткой крови лошади, инактивированной при температуре +56°C в течение 30 мин, с последующей инкубацией в течение 2-х суток при температуре +37°C, в мазках по активному почкованию или шизогонии судят о жизнеспособности возбудителя, при выявлении дегенеративных, разрушающихся клеток - об их гибели, отличающийся тем, что в качестве клинического материала используют отделяемое урогенитального тракта в объеме 0,5 мл, который вносят в 1,0 мл 0,9%-ного изотонического раствора, нагретого до +37°C, и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин; после этого надосадочную жидкость отсасывают стерильной пипеткой, а центрифугат 0,5 мл вносят в теплую селективную питательную среду 4,0 мл с последующей инкубацией при температуре +37°C в течение 3-х суток под слоем вазелинового масла 0,5-1,0 см; затем из культуральной жидкости, содержащей клетки возбудителя, параллельно готовят нативный мазок с добавлением 1,0%-ного раствора метиленовой сини и фиксированный препарат, окрашенный по методу Фельгена, что позволяет дифференцировать цитоморфотипы возбудителя инфекции; в препаратах, окрашенных по методу Романовского-Гимзе, оценивается уровень лейкоцитоза, это дает возможность определить этиологическую значимость цитоморфотипа Trichomonas vaginalis в клиническом материале: превалирование клеток возбудителя грушевидной формы, с волнообразной подвижностью, мелких размеров, с двумя и более ядрами с выраженной местной реакцией - лейкоцитоз: 94,3±9,7 лейкоцитов в поле зрения, указывает на острую стадию заболевания и его прогрессирование; обнаружение в исследуемом материале больных возбудителя округлой формы, средних размеров, одноядерных, с маятникообразной подвижностью, с умеренно выраженной местной реакцией - лейкоцитоз: 35,5±15,9 лейкоцитов в поле зрения, говорит о затяжном или хроническом процессе; выделение из клинического материала больных возбудителя овальной формы, крупных размеров, без ядра и неподвижных, когда уровень лейкоцитов в пределах физиологической нормы или местная воспалительная реакция слабовыраженная - лейкоцитоз: 10,1±3,8 лейкоцитов в поле зрения, свидетельствует о гибели возбудителя и затухании патологического процесса.