СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ФОРМ ТРИХОМОНАД Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, паразитологии, гематологии, урологии, венерологии, медицинской микробиологии.

По данным литературы известны способы выявления трихомонад из клинического материала. Наиболее надежным является культуральный способ, который служит для выявления типичных форм трихомонад в исследуемом материале на питательных средах. Наибольшие ростовые качества проявляются на средах сложного состава, например, Тераса или Джонсона-Трасселя, содержащих в качестве основных компонентов печеночный бульон, раствор Рингера, пептон, мальтозу, агар-агар, L-цистеин с добавлением в качестве обогащающего фактора сыворотку крови человека или лошади, инактивированную в течение 30 минут при температуре +56°С. В целях подавления сопутствующей микрофлоры в среду добавляют антибиотики пенициллин, стрептомицин и нистатин в количестве 1500-2000 Ед/мл, предварительно растворенных в растворе Рингера. Устанавливают рН среды до 6,0-6,3.

Сущность известных способов в том, что после забора патологического материала со слизистых оболочек мочеполовых органов, проводят его посев способом инокуляции в жидкую, питательную среду, с последующим инкубированием при температуре +37°С в течение 5-7 суток (Б.В.Клименко, Э.Р.Авазов и др. Трихомониаз мужчин, женщин и детей. Санкт-Петербург, ООО "Сюжет", 2001, с.131-138). Однако известно обитание трихомонад не только на слизистых оболочках мочеполовых органов, но и в периферической крови, где трихомонады, находясь в не свойственной им среде обитания, представлены значительным количеством атипичных форм, а методика, позволяющая культурально выявлять атипичные формы трихомонад в крови, в настоящее время не разработана (П.П.Семенов, В.П.Семенов Трихомонадные поражения мочеполовых органов человека. Л. отд-е, "Медицина", 1972, с.23-25).

Недостатком данных способов является то, что они не позволяют выявлять атипичные формы трихомонад, в частности при посеве крови, которые, проявляя низкую метаболическую активность, с трудом размножаются на питательных средах.

Технический результат предлагаемого способа заключается в выявлении атипичных форм трихомонад за счет добавления в питательную среду сыворотки крови человека или лошади и увеличения времени проводимой инактивации сыворотки с 5 до 30 минут в три этапа, что активирует пролиферативную активность клеток простейших.

Данный результат достигается тем, что в питательную среду добавляют стрессовый фактор - биологически активное вещество - сыворотку крови человека или лошади мало инактивированную, что способствует активному размножению путем почкования или шизогонии амебовидных, цистоподобных или различных неправильных, без ядерных и неподвижных форм трихомонад, обладающих низкой метаболической активностью.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Кровь, взятую из вены пациента, не менее 2,0 мл смешивают с 15 Ед/мл гепарина и разливают в центрифужные пробирки, в количестве не более 1 мл в каждую. Пробы центрифугируют 20-30 минут при 3000 об/мин. После надосадочную жидкую часть - плазму сливают, а осадок в количестве 0,5 мл пипеткой Пастера засевают в 4 мл питательной среды. Первый пассаж атипичных форм получают на питательной среде Тераса с добавлением в качестве стрессового и обогащающего фактора сыворотки крови человека или лошади, инактивированную в течение 5-10 минут при температуре +56°С. В целях подавления сопутствующей микрофлоры в среду добавляют антибиотики в количестве 500 Ед/мл пенициллин, стрептомицин и нистатин, что является дополнительным стрессовым фактором.

Культуру инкубируют 2 суток при температуре +37°С под слоем вазелинового масла для создания анаэробных условий. Далее делают пересев на аналогичную среду, но содержащую меньший стрессовый фактор: частично инактивированную сыворотку крови человека или лошади (в течение 15-20 минут) и антибиотики в количестве 250 Ед/мл. Пробы инкубируют при температуре +37°С. Через 2 суток производят третий пассаж культуры на среду, не содержащую стрессовых факторов: антибиотиков и с полностью инактивированной сывороткой крови (время инактивации 30 минут при температуре +56°С). Пробы инкубируют при температуре +37°С в течение 2 суток. Далее осуществляют еще 1-2 пересева культуры на среду, также не содержащую стрессовых факторов. Такое длительное пассирование дает возможность выделения чистой культуры трихомонад, содержащей максимальное количество различных типичных и атипичных форм в виде беловатой придонной взвеси.

Предлагаемый способ обеспечивает культуральную диагностику атипичных - округлых и амебовидных, а также различных измененных неправильной формы трихомонад: гантелевидных, бисквитовидных и других, различных по размеру, даже если они присутствуют в клиническом материале в единичном количестве. Это происходит под действием слабо инактивированной сыворотки крови человека или лошади, которая является стрессовым фактором, что вызывает активное размножение трихомонад путем почкования или шизогонии с целью самосохранения.

Данный способ имеет важное значение при диагностике генерализованной формы трихомониаза, когда инфекция протекает асимптомно и латентно, а возбудитель имеет атипичную форму с низкой метаболической активностью, которую трудно обнаружить при обычных культуральных способах диагностики.

Пример 1

Больная Киричева Р.А., возраст 64 года.

Диагноз: c-r colon. В анамнезе трихомонадный кольпит. Для лечения назначались протистоцидные препараты. После первого пассажа при посеве крови обнаружено трихомонад 36×10⁵ клеток/мл. После 5 пересевов в питательной среде количество трихомонад возросло до 280×10⁵ клеток/мл. Следовательно, у больной выявлены живые типичные и атипичные формы трихомонад.

Пример 2

Больная Безрученкова А.А., возраст 67 лет.

Диагноз: c-r sigmae. В анамнезе трихомонадный кольпит. Для лечения назначались протистоцидные препараты. После первого пассажа при посеве крови обнаружено трихомонад 18×10⁴ клеток/мл. После 5 пересевов в питательной среде роста не наблюдалось, а количество трихомонад уменьшалось. Следовательно, у больной выявлены дегенеративные, разрушающиеся формы трихомонад.

ТаблицаКоличественное соотношение клеток Trichomonas vaginalis в среде Тераса в зависимости от времени инактивации сыворотки.№ пересеваВремя инактивации сывороткиКоличество клеток × 10⁵/мл15-10 мин36215-20 мин110330 мин160430 мин200530 мин280

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии. Для выявления форм трихомонад производят посев крови в питательную среду Тераса с добавлением инактивированной в течение 5-10 минут при температуре +56°С сыворотки крови человека или лошади и антибиотиков в количестве 500 Ед/мл. Культуру инкубируют 2 суток при температуре +37°С. Делают пересев на аналогичную среду, но содержащую сыворотку крови человека или лошади, инактивированную в течение 15-20 минут, и антибиотики в количестве 250 Ед/мл. Повторно инкубируют в течение 2 суток при температуре +37°С. Делают пересев на среду, содержащую сыворотку, инактивированную 30 минут, без добавления антибиотиков, и инкубируют пробы при температуре +37°С в течение 2 суток. Осуществляют еще 1-2 пересева на среду, с полностью инактивированной сывороткой крови человека или лошади и без добавления антибиотиков. По происходящему активному почкованию или шизогонии судят о наличии живых атипичных форм трихомонад, а при отсутствии размножения о дегенеративных, разрушающихся формах. Использование способа позволяет выявить атипичные формы трихомонад. 1 табл.

Способ выявления форм трихомонад, включающий посев биологического материала в питательную среду, содержащую инактивированную сыворотку крови человека или лошади и антибиотики, отличающийся тем, что производят посев крови в питательную среду Тераса с добавлением сыворотки крови человека или лошади, инактивированной в течение 5-10 мин при температуре +56°С, и антибиотиков в количестве 500 Ед/мл - пенициллин, стрептомицин и нистатин; затем культуру инкубируют 2 суток при температуре +37°С, делают пересев на аналогичную среду, но содержащую сыворотку крови человека или лошади, инактивированную в течение 15-20 мин, и антибиотики в количестве 250 Ед/мл, осуществляют повторную инкубацию в течение 2 суток при температуре +37°С; затем делают пересев на среду, содержащую сыворотку, инактивированную 30 мин, без добавления антибиотиков, и инкубируют пробы при температуре +37°С в течение 2 суток, далее осуществляют еще 1-2 пересева на среду, с полностью инактивированной сывороткой крови человека или лошади и без добавления антибиотиков, и по происходящему активному почкованию или шизогонии судят о наличии живых атипичных форм трихомонад, а при отсутствии размножения - о дегенеративных, разрушающихся формах.