КОМПОЗИЦИЯ, ПРИМЕНИМАЯ В КАЧЕСТВЕ РОТАВИРУСНОЙ ВАКЦИНЫ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК A61K39/15 C12N7/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к вакцинным составам, содержащим ротавирусы, способные давать более высокое значение титра и проявлять свойства повышенной стабильности. Состав может быть в жидкой или лиофилизированной форме и имеет увеличенный срок годности, сохраняя при этом свою терапевтическую эффективность. Изобретение также относится к способам получения таких вирусов и способам получения таких составов. Кроме того, изобретение относится к профилактическим и терапевтическим способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Существует ряд вакцин против вирусов человека, которые применяют в настоящее время. Такие вакцины включают вакцины против вируса гепатита A, вируса гепатита B, вируса гриппа, вируса японского энцефалита B, вируса кори, вируса эпидемического паротита, вируса краснухи (MMR), вируса полиомиелита, вируса бешенства, вируса натуральной оспы, вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая, вируса желтой лихорадки. В добавление к возрастающему количеству вакцинных продуктов существуют различные композиции или составы, применяемые и разрабатываемые для данной вакцины. Успешное применение живых вирусных вакцин зависит не только от правильного выбора и доставки вируса, но также от поддержания достаточного титра или активности, необходимых для иммунного ответа. Присущая живым вирусам лабильность представляет собой особенную проблему при приготовлении составов, связанную со стабилизацией и сохранением жизнеспособности вакцины во время производства, хранения и введения. Существует ряд составов, известных в данной области, для получения ротавирусных вакцин, но они обладают недостатками, связанными с одной или несколькими проблемами, имеющими отношение к стабильности при хранении.

Ротавирус представляет род вирусов, содержащих двухцепочечную РНК, в семействе Reoviridae и передается фекально-оральным путем. Он инфицирует клетки, которые выстилают тонкий кишечник, и продуцирует энтеротоксин, который индуцирует гастроэнтерит, приводя к тяжелой диарее и иногда к смерти в результате обезвоживания. Ротавирусная инфекция является наиболее значимой причиной связанной с диареей смерти новорожденных и детей младшего возраста. Каждый год ротавирусный гастроэнтерит приводит к гибели 310000-590000 новорожденных и детей младшего возраста во всем мире.

Все ротавирусные вакцины, разработанные до настоящего времени, основаны на живых штаммах ротавирусов, которые были выделены из организма человека или животных и подвергнуты реассортации in vitro, адаптированы к культурам клеток и затем приготовлены в виде составов для пероральной доставки. И моновалентные, и поливалентные основанные на вирусах животных штаммы проявили эффективность в качестве кандидатов для вакцин.

Штамм ротавируса человека 116E, природный реассортант человека-быка и природно аттенуированный штамм, представляет собой штамм G9 человека, в который в природе был встроен один ген VP4 быка (VP = вирусный белок), гомологичный участку гена P[11]. Штамм I321, также называемый G10P [11], главным образом, содержит гены быка и имеет только два генных участка человеческого происхождения, VP5 и VP7. Два указанных штамма ротавирусной вакцины были получены по отдельности в виде опытных партий жидких составов моновалентной пероральной ротавирусной вакцины для клинических испытаний, проводимых в Индии.

Bharat Biotech International Ltd. (BBIL) получили штаммы ротавирусов человека, 116E и I321, из Национального института здравоохранения (NIH) согласно договору о передаче материалов с Национальным институтом аллергии и инфекционных болезней (NIAID), NIH, Bethesda, USA. Исходные штаммы 116E (G9[P11]) и I321 (G10P[11]) адаптировали для выращивания в культуре клеток пассированием в первичных клетках почки африканской зеленой мартышки (AGMK), затем в клеточном субстрате MA104 и затем в серийно пересеваемых клетках AGMK (SPAGMK). Клеточные субстраты MA104 и SPAGMK не одобрены Национальным регулирующим органом (NRA) для получения коммерческих вакцин. Поэтому предпочтительна адаптация 116E и I321 и других штаммов ротавирусных вакцин к одобренному, сертифицированному, лицензированному и полностью охарактеризованному клеточному субстрату, подобному субстрату на основе клеток Vero и/или к диплоидным клеткам человека, подобным MRC-5.

Предшествующий уровень техники, известный авторам изобретения, включает документ WO 02/11540 A1, в котором описаны составы ротавирусных вакцин, которые содержат буферные средства, подходящие для перорального введения ротавирусных вакцин. Составы, описанные в WO 02/11540 A1, также содержат соединения для стабилизации композиций вакцин, препятствующей потере активности. Более конкретно, для композиций, описанных в WO 02/11540, требуется сахара, фосфат и по меньшей мере один карбоксилат, по меньшей мере один сывороточный альбумин человека или аминокислота, выбранная из глутамата, глутамина и аргинина. Однако достигаемые стабильности сильно варьируют, особенно при температурах выше 20°C, что проявляется в значительных потерях активности составов, описанных в WO 02/11540 A1.

В WO 99/62500 (далее '500), WO 2005/058356 ('356) A2 и WO 2001/012797 ('197) описано использование стабилизаторов вакцин для получения вакцинных составов и лиофилизированных вакцин, стабильные при хранении вирусные композиции, способ разделения вариантов ротавирусов и живая аттенуированная ротавирусная жидкая вакцина. В '500 описана лиофилизированная вакцина против кори-эпидемического паротита-краснухи, полученная с использованием стабилизатора, состоящего из гидролизованного желатина, сорбита, фосфата, хлорида натрия, сахарозы, бикарбоната, глюкозы, сывороточного альбумина человека и цитрата. В изобретении сделана ставка на двойное присутствие повышенного количества дисахарида и многоатомного спирта при pH от 6,0 до 7,0 для обеспечения термостабильности. Несмотря на потребность в определенном количестве ингредиентов, делающих изобретение дорогостоящим, не удается добиться стабильности при температуре окружающей среды. Это в свою очередь добавляет к требованиям наличие специальной инфраструктуры для хранения вакцины, что делает изобретение еще более дорогостоящим. Однако большинство таких составов обеспечивают ограниченную стабильность при хранении и поэтому являются нерентабельными.

В документе PCT/IN07/00190, озаглавленном «Композиция, применимая в качестве вакцины», описана стабильная вакцина. Сущность изобретения сконцентрирована вокруг совместного действия первого белка, который представляет собой сывороточный альбумин человека, второго белка, который по меньшей мере частично гидролизован, и сочетания трех разных сахаров. Кроме того, изобретение также основано на включении трипсина в культуральную среду во время адаптации вирусов. Заявленная вакцина стабильна в течение 3 недель при 37°C, в течение шести месяцев при 25°C и в течение одного года при 2°C-8°C.

Из приведенного выше описания, очевидно, что несмотря на указанные успехи в области приготовления составов вакцин, сохраняется явная потребность в живой рентабельной вирусной вакцине с повышенной термостабильностью и сроком годности.

Настоящее изобретение удовлетворяет такую потребность, обеспечивая живой или живой аттенуированный вирус, который обладает улучшенными свойствами и повышенной стабильностью, либо в форме объединенной массы из трех отдельных сборов вируса из одной и той же партии, либо в жидком или лиофилизированном составе. Стабильность в отношении вируса (например, ротавируса или ротавирусной вакцины) в настоящем описании следует понимать как титр вируса в данной временной точке, начиная от момента сбора из культивируемых клеток, на протяжении стадии получения общей нефасованной массы до приготовленной в виде состава вакцины. Авторы изобретения после длительного исследования смогли разработать композицию согласно настоящему изобретению, применимую в качестве вакцины, которая имеет повышенную стабильность в виде получаемой общей массы и в виде приготовленного состава, в частности, при температуре окружающей среды.

Повышенная стабильность в статистически значимых показателях может быть достигнута в случае применения вируса, который контактировал с или был подвергнут воздействию сывороточного альбумина человека во время стадии роста и размножения вируса в культуре клеток. В целях настоящего изобретения полагают, что вирус подвергается контактированию с или подвергается воздействию сывороточного альбумина человека, когда инфицированные вирусом клетки-хозяева размножаются в среде для культивирования/среде для роста клеток с добавлением сывороточного альбумина человека. Вирус или популяция вирусов, которые таким образом были подвергнуты воздействию сывороточного альбумина человека, называют «предварительно обработанным» вирусом. Вирус, который не был подвергнут воздействию сывороточного альбумина человека, называют в настоящем описании «обычным вирусом». Предварительно обработанный вирус, либо на стадии общей массы, либо в форме состава, т.е. вакцины/приготовленной в виде состава вакцины имеет более высокую стабильность (в статистически значимых показателях), чем обычный вирус.

Настоящее изобретение дополнительно показывает, что стабильность вируса, либо предварительно обработанного вируса, либо обычного вируса, в составе также может быть дополнительно повышена или, по меньшей мере, может поддерживаться, т.е. стабильность может быть сохранена или, как минимум, может быть замедлено постепенное достижение нуля или нулевой стабильности при хранении в случае использования на практике систем (i) и (ii): Согласно системе (i), чтобы достичь повышенной или более длительной стабильности, вирус готовят в виде состава, содержащего невирусный белок или гидролизат такого белка или растительный белок или аналогичный белок, такой как сывороточный альбумин человека. Примером гидролизата может быть без ограничения гидролизат лактальбумина, дрожжевой гидролизат, пептон, гидролизат желатина и гидролизат яичного белка. Растительные белки включают без ограничения белок кукурузы, белок пшеницы, белок нута обыкновенного, белок фасоли обыкновенной, белок чечевицы, белок лимской фасоли, белок турецких бобов, соевый белок, белок лущеного гороха. Сывороточный альбумин человека имеет природное или рекомбинантное происхождение. Вирус готовят в виде состава с невирусным белком или гидролизатом такого белка просто добавлением в состав, используемый для получения вакцины невирусного белка или гидролизата такого белка. Подразумевают, что такая система (i) представляет собой однокомпонентную систему. Согласно системе (ii) вирус подвергают контактированию с невирусным белком или гидролизатом такого белка, как в однокомпонентной системе, и 1-2 дисахаридами в результате добавления в состав, используемый для получения вакцины, белка или гидролизата белка и 1-2 дисахаридов. Подразумевают, что такая система (ii) представляет собой двух- или трехкомпонентную систему, в зависимости от того, добавляют ли в состав, содержащий вирус, один дисахарид (двухкомпонентная система) или сочетание двух разных дисахаридов (трехкомпонентная система). При практическом использовании системы (ii) уровни стабильности, наблюдаемые в однокомпонентной системе, дополнительно повышаются.

Таким образом, в одном общем аспекте в настоящем изобретении предлагаются композиции, содержащие предварительно обработанный вирус или обычный вирус, обладающий повышенной и/или более длительной стабильностью.

Новизна изобретения состоит в добавлении в культуральную среду сывороточного альбумина человека при размножении вируса, чтобы получить вирусный антиген и вакцинный состав с повышенным значением титра, увеличенным сроком годности и термостабильностью даже без добавления стабилизаторов. Срок годности может быть дополнительно увеличен при добавлении стабилизаторов, которые описаны выше. Это приводит к получению терапевтически улучшенной вакцины с внедрением простого экономически выгодного рентабельного способа. Кроме технического усовершенствования изобретение также удовлетворяет критерию ACID экономической значимости.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Основной целью настоящего изобретения является получение композиции, применимой в качестве ротавирусной вакцины, имеющей повышенный срок годности, при этом устраняя недостатки соответствующего известного уровня техники.

Другой целью является получение составов вакцин, содержащих живые аттенуированные ротавирусы, способные давать более высокое значение титра, проявлять свойства повышенной стабильности при температурах окружающей среды.

Состав может быть в жидкой или лиофилизированной форме и имеет увеличенный срок годности, сохраняя при этом свою терапевтическую эффективность/активность.

Изобретение также относится к способам получения таких вирусов и способам получения таких составов.

Изобретение, кроме того, относится к профилактическим и терапевтическим способам сдерживания ротавирусных инфекций посредством введения составов вакцин субъектам, страдающим такими инфекциями.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Титр вирусов, указанный на фигурах, соответствовал количеству бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 0,5 мл собранной или конечной массы ротавируса 116E и приготовленной в виде состава вакцины. На различных фигурах, приведенных в настоящей публикации, указание «биологический способ 1» означает, что исходным используемым материалом является обычный вирус, и указание «биологический способ 2» означает, что исходным используемым материалом является предварительно обработанный вирус. Если не указано иное, данные на фигурах представляют стабильность предварительно обработанного вируса. На фиг.1-12H показаны данные для жидких составов (жид. = жидкий), а на фиг.13A-17C показаны данные для лиофилизированных составов (лиоф. = лиофилизированный). Числовые показатели, выраженные в процентах, означают значения по массе для состава (композиции). Например, следует понимать, что указание «80% сахароза» означает 80% масс. сахарозы в составе (масс./об.). Среднеквадратическая ошибка в случае всех временных точек находилась в диапазоне от ±0,40 до ±0,45.

На фиг.1 показан средний титр, получаемый при сборах в случае биологического способа 1 (обычный вирус) и биологического способа 2 (предварительно обработанный вирус) в пяти экспериментах.

На фиг.2 показаны данные о стабильности для собранных вирусов, обычного вируса (биологический способ 1) и предварительного обработанного вируса (биологический способ 2), в каждом случае в отсутствие (фиг. 2A) или в присутствии (фиг. 2B) стабилизаторов, а именно, 5% LAH, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы, в жидком составе при 37°C.

На фиг.3 (жид.) показаны данные о стабильности предварительно обработанного вируса в четырех разных составах при 2-8°C (3A), 25°C (3B) и 37°C (3C). В каждом случае: серия 1 относится к составу с 2,5% гидролизата лактальбумина; серия 2 относится к составу с 10% гидролизата лактальбумина и 0,5% трегалозы; серия 3 относится к составу с 20% гидролизата лактальбумина; и серия 4 относится к составу с сочетанием 2,5% гидролизата лактальбумина, 0,5% крахмала и 0,5% трегалозы.

На фиг.4 (жид.) показаны данные о стабильности ротавируса в составе, содержащем и не содержащем 5% гидролизата лактальбумина + 80% сахарозы + 0,5% трегалозы, который хранили при 2-8°C (4A), 25°C (4B) и 37°C (4C).

На фиг.5 (жид.) показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных составах при 2-8°C (5A), 25°C (5B) и 37°C (5C). В каждом случае: серия 1 относится к составу, содержащему сочетание 20% гидролизата лактальбумина и 0,5% трегалозы; серия 2 относится к составу, содержащему сочетание 10% гидролизата лактальбумина, 1,0% лактозы; серия 3 относится к составу, содержащему сочетание 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы; и серия 4 относится к составу, содержащему сочетание 10% гидролизата лактальбумина и 50% мальтозы.

На фиг.6 (жид.) показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных составах при 2-8°C (6A), 25°C (6B) и 37°C (6C). В каждом случае: серия 1 относится к составу, содержащему сочетание 0,5% гидролизата лактальбумина, 10% соевого белка и 1,0% трегалозы; серия 2 относится к составу с сочетанием 0,5% гидролизата лактальбумина, 10% соевого белка и 1,0% лактозы; серия 3 относится к составу с сочетанием 5% гидролизата лактальбумина, 2,5% соевого белка и 80% сахарозы; и серия 4 относится к составу с сочетанием 5% гидролизата лактальбумина, 2,5% соевого белка и 50% мальтозы.

На фиг.7 (жид.) показаны данные, свидетельствующие о высокой стабильности ротавируса в четырех разных составах при -2-8°C (7A), 25°C (7B) и 37°C (7C). В каждом случае: серия 1 относится к составу, содержащему сочетание 10% гидролизата лактальбумина, 10% сахарозы и 1,0% трегалозы; серия 2 относится к составу, содержащему сочетание 10% гидролизата лактальбумина, 5% мальтозы и 1,0% трегалозы; серия 3 относится к составу, содержащему сочетание 2,5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 1% трегалозы; и серия 4 относится к составу, содержащему сочетание 2,5% гидролизата лактальбумина, 50% мальтозы и 1% трегалозы.

На фиг.8 (жид.) показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных составах при 2-8°C (8A), 25°C (8B) и 37°C (8C). В каждом случае: серия 1 относится к составу с сочетанием обычного вируса, 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы; серия 2 относится к составу, содержащему сочетание предварительно обработанного вируса, 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы; серия 3 относится к составу с сочетанием обычного вируса, 0,1% рекомбинантного сывороточного альбумина человека (rHSA) и 80% сахарозы и 0,5% трегалозы; серия 4 относится к составу с сочетанием предварительно обработанного вируса, 0,1% rHSA, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы; серия 5 относится к составу, содержащему сочетание обычного вируса, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы; и серия 6 относится к составу, содержащему сочетание предварительно обработанного вируса, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы.

На фиг.9 (жид.) показаны данные о стабильности ротавируса в пяти разных составах при 37°C.

На фиг.10 (жид.) показана стабильность ротавируса при низком титре в пяти разных составах при 2-8°C (10A) и 37°C (10B).

На фиг.11A (жид.) показаны данные о стабильности составов предварительно обработанных ротавирусов, содержащих 20% гидролизованного пептона, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.11B (жид.) показаны данные о стабильности составов предварительно обработанных ротавирусов, содержащих сочетание 20% гидролизованного пептона, 1% трегалозы и 0,02% фукозы, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.11C (жид.) показаны данные о стабильности составов предварительно обработанных ротавирусов, содержащих 20% гидролизата яичного белка, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.11D (жид.) показаны данные о стабильности составов предварительно обработанных ротавирусов, содержащих сочетание 20% гидролизата яичного белка, 0,5% трегалозы, 1% D-сорбита и 0,5% маннозы, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.11E (жид.) показаны данные о стабильности составов предварительно обработанных ротавирусов, содержащих 20% гидролизата лактальбумина, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.11F (жид.) показаны данные о стабильности составов предварительно обработанных ротавирусов, содержащих сочетание 20% гидролизата лактальбумина, 0,5% трегалозы, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг. 11G (жид.) показаны данные о стабильности составов предварительно обработанных ротавирусов, содержащих 20% дрожжевого гидролизата, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.11H (жид.) показаны данные о стабильности составов предварительно обработанных ротавирусов, содержащих сочетание 20% дрожжевого гидролизата, 5% мальтозы и 0,5% лактозы, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.12A (жид.) показаны данные о стабильности составов обычных ротавирусов, содержащих 20% гидролизованного пептона, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.12B (жид.) показаны данные о стабильности составов обычных ротавирусов, содержащих сочетание 20% гидролизованного пептона, 1% трегалозы и 0,02% фукозы, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.12C (жид.) показаны данные о стабильности составов обычных ротавирусов, содержащих 20% гидролизата яичного белка, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.12D (жид.) показаны данные о стабильности составов обычных ротавирусов, содержащих сочетание 20% гидролизата яичного белка, 0,5% трегалозы, 1% D-сорбита и 0,5% маннозы, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.12E (жид.) показаны данные о стабильности составов обычных ротавирусов, содержащих 20% гидролизат лактальбумина, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.12F (жид.) показаны данные о стабильности составов обычных ротавирусов, содержащих сочетание 20% гидролизата лактальбумина, 0,5% трегалозы, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.12G (жид.) показаны данные о стабильности составов обычных ротавирусов, содержащих 20% дрожжевого гидролизата, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.12H (жид.) показаны данные о стабильности составов обычных ротавирусов, содержащих сочетание 20% дрожжевого гидролизата, 5% мальтозы и 0,5% лактозы, при 2-8°C, 25°C и 37°C.

На фиг.13 (лиоф.) показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных лиофилизированных составах при 2-8°C (13A), 25°C (13B) и 37°C (13C). В каждом случае: серия 1 относится к составу с 0,5% сывороточного альбумина человека и 12% сахарозы; серия 2 относится к составу с 0,5% гидролизата лактальбумина, 0,5% трегалозы; серия 3 относится к составу с 0,5% соевого белка и 0,5% трегалозы; и серия 4 относится к 0,25% поливинилпирролидина, 0,5% трегалозы.

На фиг.14 (лиоф.) показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных лиофилизированных составах при 2-8°C (14A), 25°C (14B) и 37°C (14C). В каждом случае: серия 1 относится к составу с 0,5% сывороточного альбумина человека, 12% сахарозы и 0,1% крахмала; серия 2 относится к составу с 0,5% гидролизата лактальбумина, 0,5% трегалозы и 0,1% крахмала; серия 3 относится к составу с 0,5% соевого белка, 0,5% трегалозы и 0,1% крахмала; и серия 4 относится к 0,25% поливинилпирролидина, 0,5% трегалозы и 0,1% крахмала.

На фиг.15 (лиоф.) показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных лиофилизированных составах при 2-8°C (15A), 25°C (15B) и 37°C (15C). В каждом случае: серия 1 относится к составу с 0,5% сывороточного альбумина человека, 12% сахарозы, 0,1% крахмала и 304 мМ бикарбоната; серия 2 относится к составу с 0,5% гидролизата лактальбумина, 0,5% трегалозы, 0,1% крахмала и 304 мМ бикарбоната; серия 3 относится к составу с 0,5% соевого белка, 0,5% трегалозы, 0,1% крахмала и 304 мм бикарбоната; серия 4 относится к 0,25% поливинилпирролидина, 0,5% трегалозы, 0,1% крахмала и 304 мМ бикарбоната.

На фиг.16 (лиоф.) показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных лиофилизированных составах при 2-8°C (16A), 25°C (16B) и 37°C (16C). В каждом случае: серия 1 относится к составу с 0,5% сывороточного альбумина человека, 12% сахарозы и 0,1% аравийской камеди; серия 2 относится к составу с 0,5% гидролизата лактальбумина, 0,5% трегалозы и 0,1% аравийской камеди; серия 3 относится к составу с 0,5% соевого белка, 0,5% трегалозы и 0,1% аравийской камеди; и серия 4 относится к 0,25% поливинилпирролидина, 0,5% трегалозы и 0,1% аравийской камеди.

На фиг.17 (лиоф.) показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных лиофилизированных составах при 2-8°C (17A), 25°C (17B) и 37°C (17C). В каждом случае: серия 1 относится к составу с 0,5% гидролизата лактальбумина, 0,25% поливинилпирролидина; серия 2 относится к составу с 0,5% гидролизата лактальбумина и 0,1% аравийской камеди; серия 3 относится к составу с 0,5% гидролизата лактальбумина и 0,1% пиридоксина·HCl; и серия 4 относится к 0,5% гидролизата лактальбумина и 0,1% крахмала.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предлагается композиция, содержащая:

(a) вирусный антиген, который представляет собой живой аттенуированный ротавирус, и

(b) фармацевтически приемлемый буфер с физиологическим pH,

при этом стабильность композиции в отношении титра вируса повышена, так как влияние вируса, размножающегося в присутствии сывороточного альбумина человека, на стабильность выше, чем вируса, размножаемого в отсутствие сывороточного альбумина человека.

Согласно одному из вариантов композиция дополнительно может содержать по меньшей мере один из стабилизаторов, содержащий невирусный белок, или по меньшей мере частично гидролизованный гидролизат такого белка, или один дисахарид, или сочетание 2 дисахаридов.

Невирусным белком или гидролизатом белка может быть такой белок или гидролизат, как гидролизат лактальбумина, дрожжевой гидролизат, гидролизат желатина, гидролизат яичного белка, гидролизованный пептон или растительный белок, выбранный из белка кукурузы, белка пшеницы, белка нута обыкновенного, белка фасоли обыкновенной, белка чечевицы, белка лимской фасоли, белка турецких бобов, соевого белка, белка лущеного гороха или аналогичного белка, примером такого белка является сывороточный альбумин человека, предпочтительно гидролизат лактальбумина или гидролизованный соевый белок, более предпочтительно гидролизат лактальбумина.

Согласно другим вариантам используемым дисахаридом может быть такой как трегалоза или сочетание 2 дисахаридов, состоящее из сахарозы и трегалозы.

Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению, может содержать (a) вирусный антиген, который представляет собой живой аттенуированный ротавирус, (b) фармацевтически приемлемый буфер с физиологическим pH и (c) невирусный белок или гидролизат белка.

Композиция, которая раскрыта в настоящем описании выше, может содержать

(i) вирусный антиген, который представляет собой живой аттенуированный ротавирус, который описан в настоящей публикации выше, с титром в диапазоне от 10³ до 10^8,5 БОЕ/0,5 мл,

(ii) фармацевтически приемлемый буфер, представляющий собой фосфатно-цитратный буфер (310/100 мМ) с pH от 6,8 до 8,0, в качестве разбавителя/носителя,

(iii) гидролизат белка, который представляет собой гидролизат лактальбумина, в диапазоне 20-30% масс./об., и

(iv) дисахарид, представляющий собой трегалозу примерно 0,5% масс./об. или сахарозу примерно 80% масс./об., и другой дисахарид, представляющий собой трегалозу примерно 0,5% масс./об.

Композиция содержит живой аттенуированный ротавирус, способный давать повышенный титр в среднем от минимум 0,8 log до максимум 1,1 log на миллилитр при хранении в условиях окружающей среды, по сравнению с живым аттенуированным ротавирусом, размножаемым в отсутствие сывороточного альбумина человека.

Кроме того, указанный живой аттенуированный ротавирус размножают в присутствии 0,1% рекомбинантного сывороточного альбумина человека.

Согласно другому аспекту изобретения также предлагается способ получения живого аттенуированного ротавируса по п.1, включающий в себя:

(i) инфицирование клеток-хозяев живым аттенуированным ротавирусом;

(ii) выращивание инфицированных клеток в среде для культивирования клеток, позволяющей поддерживать рост указанных клеток, при этом в указанную среду добавлен сывороточный альбумин человека, и сбор указанного ротавируса, способного проявлять улучшенную стабильность.

В одном конкретном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей живой и предварительно обработанный вирус (или популяцию вирусов) с определенной стабильностью, при этом стабильность вируса характеризуют посредством сравнения с обычным живым вирусом (или популяцией вирусов), который не размножался в присутствии сывороточного альбумина человека (как в случае вируса, называемого предварительно обработанным), и в случае которого обнаружено падение титра на log 4, больше чем различие между 4,5 и 7,5 БОЕ/0,5 мл, когда обе композиции с живым предварительно обработанным вирусом или живым обычным вирусом хранили при 37°C в течение четырех недель после сбора. Композиция содержит фармацевтически приемлемый буфер с добавлением или без добавления стабилизатора, такого как гидролизат белка, пептон, растительный белок или дисахарид, в составе. В другом конкретном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей живой и предварительно обработанный вирус (или популяцию вирусов), способный давать титр, в среднем повышенный от минимум 0,8 log до максимум 1,1 log на миллилитр при хранении в условиях окружающей среды, по сравнению с обычным живым вирусом, и фармацевтически приемлемый буфер, и предварительно обработанный вирус способен давать такой титр без добавления в композицию какого-либо стабилизатора, такого как гидролизат невирусного белка, пептон, растительный белок и дисахарид.

В каждом из указанных выше аспектов в тех случаях, когда предполагается дополнительный стабилизатор, наиболее предпочтительным дополнительным стабилизатором является гидролизат лактальбумина. Дисахарид (например, трегалоза) или сочетание разных дисахаридов (например, сахарозы и трегалозы) являются следующими предпочтительными стабилизаторами в композиции, содержащей гидролизат лактальбумина. В одном варианте гидролизат лактальбумина в композиции имеет концентрацию примерно 5% масс./об., сахароза - примерно 80% масс./об., и трегалоза - примерно 0,5% масс./об. Композиция может содержать рекомбинантный сывороточный альбумин человека (например, 0,1% масс./об.) в качестве еще одного дополнительного стабилизатора.

В одном варианте вирус является живым ротавирусом, таким как живой аттенуированный ротавирус. Предпочтительно живой вирус является живым вирусом человека, таким как ротавирус человека. В особенно предпочтительном варианте ротавирусом человека является ротавирус штамма 116E или I321. Композиция согласно настоящему изобретению представляет собой вакцину. В одном варианте композиция согласно настоящему изобретению может содержать живой аттенуированный ротавирус с титром в диапазоне от 10³ до 10^8,5 БОЕ/0,5 мл. Живой ротавирус является предварительно обработанным ротавирусом.

В другом общем аспекте предлагается способ получения живого аттенуированного предварительно обработанного ротавируса. Способ включает в себя стадии инфицирования клеток-хозяев живым аттенуированным ротавирусом, выращивания инфицированных клеток в среде для культивирования клеток с добавлением сывороточного альбумина человека, которая позволяет поддерживать рост клеток, и сбора предварительно обработанного ротавируса. Собранный предварительно обработанный ротавирус проявляет улучшенную стабильность по сравнению с необработанным предварительно или обычным вирусом.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение также относится к способу адаптации вируса к подходящему клеточному субстрату, такому как клетки Vero, серийно пересеваемые в подходящей среде, каждый пассаж осуществляют в среде в отсутствие или в присутствии сывороточного альбумина человека, полученного от человека, или рекомбинантного сывороточного альбумина человека.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, связанным с живыми аттенуированными ротавирусами. Живые аттенуированные ротавирусы проявляют свойства повышенной стабильности и применимы для предотвращения ротавирусной инфекции и/или ротавирусного гастроэнтерита у детей.

В частности, настоящее изобретение относится к различным подходам и системам для получения ротавирусных композиций, которые проявляют повышенную стабильность в данной временной точке и стабильность, поддерживаемую в течение определенного периода времени при хранении. Один из подходов заключается в применении предварительно обработанных вирусов в качестве исходного материала в композициях согласно изобретению. Другой подход заключается в применении различных стабилизаторов для получения повышенной стабильности, когда используемый вирус является предварительно обработанным вирусом.

Как определено выше, вирус или популяция вирусов, собранных из культур клеток, размножаемых в среде, содержащей сывороточный альбумин человека, называют «предварительно обработанным» вирусом или популяцией вирусов. И наоборот, вирус или популяцию вирусов, собранных из культур клеток в среде, не содержащей сывороточного альбумина человека, называют «обычным» вирусом или популяцией вирусов. Живой аттенуированный ротавирус иногда в настоящем описании называют вирусным антигеном или антигеном вакцины.

Как описано выше, предварительно обработанный вирус проявляет свойства повышенной стабильности по сравнению с обычным вирусом. Каждый из вирусов, и предварительно обработанный вирус, и обычный вирус, проявляют стабильность, более длительно поддерживаемую во время хранения в составе с добавлением одного или нескольких стабилизаторов, по сравнению с составом без добавок. Следует понимать, что стабилизаторы, используемые для поддержания стабильности, независимо от того, является или не является вирус, используемый в качестве исходного материала для состава после сбора, предварительно обработанным, в широком смысле входят в три разных системы компонентов.

Однокомпонентная система содержит невирусный белок или гидролизат такого белка в виде части состава. Невирусный белок или гидролизат белка служит в качестве стабилизатора. Двухкомпонентная система содержит дисахарид в дополнение к невирусному белку или гидролизату такого белка. В двухкомпонентной системе и дисахарид, и белок или его гидролизат служат в качестве стабилизаторов. Трехкомпонентная система подобна двухкомпонентной системе, но содержит дополнительный дисахарид, отличный от дисахарида в двухкомпонентной системе.

В находящейся одновременно на рассмотрении заявке авторов настоящего изобретения № 842/CHE/2006, авторы описали композицию, содержащую вирусный антиген; первый белок, выбранный из сывороточного альбумина человека или рекомбинантного альбумина человека, и второй белок, который по меньшей мере частично гидролизован, выбранный из гидролизата лактальбумина, дрожжевого гидролизата, пептона и гидролизата яичного белка, и предпочтительно сочетание трех разных дисахаридов, при этом используемый вирус не размножают в присутствии HSA. Жидкая композиция проявляет стабильность в течение 3-4 недель при 37°C, шесть месяцев при 25°C и один год при 2°C-8°C, тогда как лиофилизированная композиция проявляет стабильность в течение более чем 50 недель при 2°C-8°C, 25°C, 37°C.

Жидкая композиция согласно настоящему изобретению стабильна в течение 6 недель при 37°C, в течение 6 месяцев при 25°C и 24 месяцев при 2-8°C.

Лиофилизированная композиция согласно настоящему изобретению стабильна в течение 16 недель при 37°C, в течение 6 месяцев при 25°C и 24 месяцев при 2-8°C.

Композиции могут представлять собой жидкие композиции или лиофилизированные (сухая форма). Настоящее изобретение относится к живым аттенуированным ротавирусам и их композициям, проявляющим улучшенную и повышенную стабильность при хранении при 2-8°C или в условиях окружающей среды в течение длительного периода времени. Условия окружающей среды могут представлять собой преобладающие в данном месте и обычные атмосферные условия (например, 25°C), но не превышающие примерно 37°C. Композиции согласно настоящему изобретению способны поддерживать свою способность к иммунизации во время получения и в течение периода времени, необходимого для срока годности коммерческой вакцины (т.е. композиции являются стабильными).

Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению проявляет стабильность в течение более длительного периода вследствие размножения вируса в присутствии сывороточного альбумина человека, по сравнению с его добавлением извне.

В одном примере композиция согласно настоящему изобретению содержит вирусный антиген (предварительно обработанный или обычный вирус), невирусный белок или белок, который отличается от вирусного антигена. Следует понимать, что термин «невирусный белок» означает любой из белков: лактальбумин, гидролизат дрожжевого белка, желатин, яичный белок или растительный белок, который представляет собой белок кукурузы, белок пшеницы, белок нута обыкновенного, белок фасоли обыкновенной, белок чечевицы, белок лимской фасоли, белок турецких бобов, соевый белок, белок лущеного гороха и сывороточный альбумин человека, все природного или рекомбинантного происхождения. Предпочтительно белок, по меньшей мере, частично гидролизован. Другими словами, гидролизаты таких белков или пептон можно использовать в композициях согласно настоящему изобретению.

Предполагается, что фраза «белок, по меньшей мере, частично гидролизован», в используемом в настоящем описании смысле относится к варианту, когда гидролизуемый белок был, по меньшей мере, частично разрушен на соответствующие аминокислотные строительные блоки. Поэтому такая фраза также означает включение варианта, когда белок больше не существует в виде полной молекулы, а существует только в виде набора его фрагментов. Кроме того, такая фраза означает включение варианта, когда белок полностью гидролизован. Также подразумевается, что фразой «гидролизат белка» включены все указанные варианты, и такая фраза может включать полностью гидролизованный белок, т.е. белок, разрушенный до соответствующих аминокислот, или белок, частично разрушенный, так что присутствует набор пептидов и аминокислот.

Таким образом, белок или, по меньшей мере, частично гидролизованный вариант, может представлять собой гидролизат лактальбумина, дрожжевой гидролизат, пептон, гидролизат желатина и гидролизат яичного белка или белок из растительного источника, такого как кукуруза, пшеница, нут обыкновенный, фасоль обыкновенная, чечевица, лимская фасоль, турецкие бобы, соя, лущеный горох, или гомологичный белок человека, такой как сывороточный альбумин человека, который получен из организма человека или имеет рекомбинантное происхождение. Такие белки и гидролизаты белков могут быть легко получены специалистом в данной области, например, в результате кислотного гидролиза, или могут быть получены из коммерческого источника. В настоящем описании показано, что при низкой концентрации ротавируса, особенно когда концентрация (титр) ротавируса в составе составляет 10³ БОЕ в 0,5 мл, невирусный белок, такой как гидролизат лактальбумина или соевый белок, вносит вклад в улучшенную и более высокую стабильность по сравнению с невирусным белком - сывороточным альбумином человека или бычьим сывороточным альбумином. Гидролизат лактальбумина известен специалисту в данной области и коммерчески доступен. Полагают, что гидролизат лактальбумина обеспечивает прекрасную гомогенизацию смеси с белком ротавируса, как в жидкой форме, так и в лиофилизированной форме, и сохраняет молекулы вирусного белка, даже когда вирусный белок присутствует в низкой концентрации. Вместо или дополнительно к гидролизату лактальбумина также можно использовать другие добавки, такие как дрожжевой гидролизат, пептон, гидролизат желатина и гидролизат яичного белка. Композиция дополнительно содержит дисахарид или сочетание двух дисахаридов и фармацевтически приемлемый буфер. Дисахаридом может быть любой из следующих дисахаридов: сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, целлобиоза, гентобиоза, мелибиоза, тураноза и фукоза. Трехкомпонентная система содержит сочетание двух разных типов дисахаридов кроме невирусного белка или гидролизата такого белка. Такие белки или гидролизаты белков и дисахариды, указанные в данном абзаце, называют в настоящем описании «стабилизаторы».

Стабилизаторы могут быть добавлены к эксципиенту, разбавителю или носителю (например, фармацевтически приемлемому буферу), который обычно используют в фармацевтических составах вируса. Такие эксципиенты или носители хорошо известны в данной области. В частности, в подходящий разбавитель или фармацевтически приемлемый буфер один или несколько указанных выше стабилизаторов. В предпочтительном варианте к содержащему ротавирус образцу сначала добавляют LAH, затем сахарозу. Если добавляют второй дисахарид, то следующим по порядку предпочтительным дисахаридом является трегалоза. Композиция без стабилизаторов по существу представляет собой раствор носителя или фармацевтически приемлемый буфер. Кроме названных стабилизаторов композиция может содержать красители, вкусоароматические добавки, подсластители, адсорбенты и/или активаторы текучести. Предпочтительно такие композиции забуферены при соответствующем pH, обычно от 6 до 8, предпочтительно от 6,8 до 8,0. Например, в одном варианте композиция согласно настоящему изобретению может быть приготовлена в модифицированной Дульбекко среде Игла.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к составу, содержащему популяцию живых аттенуированных и предварительно обработанных ротавирусов. Предварительно обработанный ротавирус имеет определенный уровень стабильности в фармацевтически приемлемом эксципиенте без каких-либо дополнительных стабилизаторов в композиции. Стабильность популяции предварительно обработанных ротавирусов лучше по сравнению с популяцией живых аттенуированных обычных ротавирусов, которые не подвергают такой предварительной обработке. Что касается показателей стабильности, то популяция обычных ротавирусов имеет падение титра на log 4, тогда как предварительно обработанный вирус имеет падение титра, значимо меньшее, чем падение на log 4, при хранении обоих ротавирусов при 37°C в течение четырех недель после сбора.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей живой аттенуированный предварительно обработанный ротавирус, который способен давать титр, повышенный от минимум 0,8 log до максимум 1,1 log на миллилитр по сравнению с живым аттенуированным обычным ротавирусом при хранении в условиях окружающей среды без каких-либо дополнительных стабилизаторов в композиции.

В любом случае стабильность предварительно обработанного вируса может быть повышена, если в композицию добавляют по меньшей мере один стабилизатор, такой как гидролизат лактальбумина, дрожжевой гидролизат, гидролизат желатина и гидролизат яичного белка, пептон, растительный белок и сывороточный альбумин человека. Повышенная стабильность может быть дополнительно повышена добавлением в композицию дисахарида или сочетания разных дисахаридов. Таким образом, в наиболее предпочтительном варианте композиция содержит вирусный антиген, который представляет собой предварительно обработанный ротавирус, белок, отличный от указанного вирусного антигена, по меньшей мере частично гидролизованный (такой как, например, лактальбумин, дрожжевой белок, пептон, желатин и яичный белок, белок кукурузы, белок пшеницы, нута обыкновенного, фасоли обыкновенной, чечевицы, лимской фасоли, турецких бобов, сои, лущеного гороха, или сывороточный альбумин человека, выделенный из организма человека, или рекомбинантный сывороточный альбумин человека), и дисахарид или сочетание двух дисахаридов. Композиция с обычным вирусом также предпочтительна в том случае, когда в композиции присутствуют стабилизаторы, так как в такой композиции может быть достигнута более хорошая стабильность обычного вируса по сравнению с обычным вирусом в композиции без таких стабилизаторов.

Белки, либо отдельно, либо в сочетании двух белков, могут присутствовать в диапазоне от 0,01% (масс./об.) до 80% (масс./об.), предпочтительно в диапазоне от 0,05% до 50%. Предпочтительно белком, используемым в качестве стабилизатора, является любой из следующих белков: гидролизат лактальбумина, сывороточный альбумин человека и соевый белок. Гидролизат лактальбумина может присутствовать в композиции в концентрации примерно от 0,01% до 70%, предпочтительно от 0,1% до 30%. Соевый белок может присутствовать в композиции в концентрации примерно от 0,01% до 70%, предпочтительно от 0,05% до 20%. Сывороточный альбумин человека предпочтительно имеет рекомбинантное происхождение и может присутствовать в композиции в концентрации примерно от 0,01% до 20%, предпочтительно от 0,1% до 0,5%.

Предпочтительно дисахарид, используемый в качестве стабилизатора, может представлять собой любой из дисахаридов: трегалозу, лактозу и сахарозу. Предпочтительная концентрация трегалозы составляет примерно от 0,01% до 70%, наиболее предпочтительно от 0,5% до 20%. Сочетанием двух разных дисахаридов может быть сочетание любых двух дисахаридов: сахарозы, лактозы, мальтозы, трегалозы, целлобиозы, гентобиозы, мелибиозы и туранозы. Например, сочетанием двух дисахаридов может быть любое из сочетаний сахарозы и мальтозы, сахарозы и лактозы, сахарозы и трегалозы, мальтозы и трегалозы или трегалозы и лактозы. Предпочтительным сочетанием дисахаридов является сочетание сахарозы и трегалозы. Предпочтительно сахароза присутствует в концентрации примерно 1-10% и от 70% (масс./об.) до 85% (масс./об.), более предпочтительно в концентрации от 5% до 10% и от 80% до 85% (масс./об.), и трегалоза присутствует в концентрации примерно от 0,01% (масс./об.) до 50,0% (масс./об.), предпочтительно от 0,5% до 20% (масс./об.). Концентрация сочетания дисахаридов или одного дисахарида может составлять примерно 1-10% или примерно 20%-85% (масс./об.). В одном варианте концентрация дисахаридов может иметь следующие значения: сахарозы примерно 1-10% и от 70% до 85% (масс./об.), предпочтительно от 5% до 10% или от 80% до 85% (масс./об.), лактозы примерно от 0,1% до 20,0% (масс./об.), предпочтительно от 0,5% до 10% (масс./об.), мальтозы примерно от 0,1% (масс./об.) до 50% (масс./об.), предпочтительно от 5% до 50% (масс./об.), трегалозы примерно от 0,01% (масс./об.) до 70,0% (масс./об.), предпочтительно от 0,5% до 20,0% (масс./об.).

Предпочтительно композиция забуферена с использованием фосфатно-цитратного буфера. Предпочтительно фосфатно-цитратный буфер имеет концентрацию примерно 310 мМ фосфата и примерно 100 мМ цитрата. Фармацевтически приемлемый буфер может иметь значение pH в диапазоне от 6,8 до 8,0. Буфером может быть любой из буферов, содержащих фосфаты, карбонаты, цитраты, трис, HEPES, а также их сочетания. Фосфат может иметь концентрацию в диапазоне от 10 мМ до 1000 мМ, предпочтительно от 50 мМ до 310 мМ. Карбонат может иметь концентрацию в диапазоне от 10 мМ до 1000 мМ, предпочтительно от 50 мМ до 300 мМ. Цитрат может иметь концентрацию в диапазоне от 10 мМ до 400 мМ, предпочтительно от 50 мМ до 100 мМ. Трис может иметь концентрацию в диапазоне от 0,1 мМ до 1000 мМ, предпочтительно от 5 мМ до 20 мМ. HEPES может иметь концентрацию в диапазоне от 0,1 мМ до 1000 мМ, предпочтительно от 10 мМ до 20 мМ.

В некоторых вариантах в качестве стабилизатора также может быть использован крахмал. Примерами крахмала являются зерновой, пшеничный, кукурузный и рисовый крахмал. Крахмал может быть растворимым, нерастворимым, частично или полностью гидролизованным крахмалом. Крахмал может присутствовать в концентрации примерно от 0,01% до 10%, предпочтительно от 0,1% до 3,0%.

Композиция может содержать по меньшей мере один разбавитель, такой как среда для культуры ткани, физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер или вода. Предпочтительным разбавителем является модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM). Композиция дополнительно может содержать по меньшей мере одно химическое вещество, такое как аскорбиновая кислота, аравийская камедь, сенегальская камедь, поливинилпирролидин, пиридоксин•HCl (витамин B6), и концентрация может составлять примерно от 0,1% до 20%, предпочтительно от 0,25% до 5% масс. композиции. Композиция предпочтительно представляет собой жидкий состав с живым аттенуированным ротавирусом. Предпочтительный жидкий состав содержит предварительно обработанный или обычный ротавирус и стабилизаторы, гидролизат лактальбумина (LAH) в диапазоне 20-30% масс./об. и трегалозу примерно 0,5% масс./об. Другой предпочтительный жидкий состав содержит предварительно обработанный или обычный ротавирус и стабилизаторы, гидролизат лактальбумина в композиции в концентрации примерно 5% масс./об., сахарозу примерно 80% масс./об. и трегалозу примерно 0,5% масс./об. Композиции согласно настоящему изобретению можно применять в качестве вакцины для вакцинации против вирусной инфекции и ассоциированных с вирусом заболеваний. Ротавирусные штаммы 116E (G9P[11]) и I321(G10P[11]) являются природными реассортантами человека-быка, природно аттенуированными и придают значительный уровень иммунитета новорожденным и детям младшего возраста. Хотя предпочтительным является ротавирус человека, другими ротавирусами, которые могут быть приготовлены в виде состава согласно настоящему изобретению, являются бычий ротавирус, ротавирус свиней и реассортантные ротавирусы человека-быка, ротавирус ягнят, ротавирус овец. Требуется, чтобы подходящие композиции и составы, которые описаны в настоящей публикации, сохраняли стабильность ротавируса при низком титре, т.е. поддерживали 10³, с учетом того, что, как известно, сохранение стабильности при низких исходных значениях титра, поддерживаемых во время хранения, является сложной задачей. Ротавирусную вакцину, которая имеет повышенную и/или более длительную стабильность, можно применять для профилактики вирусной инфекции, предпочтительно ротавирусной инфекции и/или ротавирусного гастроэнтерита у детей во всем мире. Предпочтительно лечение или профилактика включают в себя введение трех пероральных доз эффективного количества композиции новорожденному в возрасте 8-20 недель во временной точке введения дозы 1.

В следующей таблице (таблица 1) приведено сравнение составов обычного ротавируса, т.е. ротавируса, размножаемого в отсутствие сывороточного альбумина человека (1-8), и ротавируса, размножаемого в присутствии сывороточного альбумина человека (1A-8A), и ясно показано, что составы, содержащие вирус, размножаемый в присутствии сывороточного альбумина человека, обладают более высокой стабильностью.

Таблица 1 № образца Падение в log при 37°C Временная точка Падение в log при 25°C Временная точка 1 5 4 недели 1,19 24 недели 1А 3,73 12 недель 0,91 24 недели 2 4 4 недели 1,09 24 недели 2А 3,63 20 недель 0,76 24 недели 3 4,45 3 недели 3,48 16 недель 3А 3,3 12 недель 2,21 24 недели 4 4,43 4 недели 1,9 20 недель 4А 3,72 12 недель 1,61 24 недели 5 4,96 4 недели 1,66 24 недели 5А 3,39 8 недель 1,08 24 недели 6 4,77 8 недель 0,86 24 недели 6А 3,32 12 недель 0,39 24 недели 7 5,39 4 недели 1,98 24 недели 7А 2,44 12 недель 0,28 24 недели 8 4,46 4 недели 1,96 24 недели 8А 3,1 20 недель 0,34 24 недели

Настоящее исследование также относится к способу адаптации ротавируса, например, природных реассортантов человека-быка, природно аттенуированных штаммов ротавируса 116E (G9P[11]) и I321 (G10P[11]), к подходящим клеткам, например, клеткам Vero. В одном варианте адаптация заключается в серийных пассажах, 2-20 пассажах, предпочтительно 2-5 пассажах. Предпочтительно каждый пассаж происходит в течение периода времени в диапазоне от 24 часов и обычно до 6 дней и максимум в течение 10 дней. Предпочтительно вирус является ротавирусом человека. Способ включает в себя использование оптимизированной дозы трипсина (от 0,1 мкг/мл до 30 мкг/мл) и/или хлорида кальция (от 100 мкг/мл до 1000 мкг/мл) для активации вируса и среды для поддержания вируса, в которой высокий титр (от 10⁴ до 10⁸ БОЕ/мл) собираемого вируса достигается в пределах от 48 часов до шести дней. Также предусмотрено применение адаптированных штаммов для получения стабильной жидкой композиции моновалентной вакцины на основе живого ротавируса. Кроме того, настоящее изобретение раскрывает то, как получать обычные и предварительно обработанные ротавирусы. Кроме того, настоящее изобретение относится к применение вирусного антигена, белка, сочетания одного или двух разных дисахаридов для производства композиции согласно настоящему изобретению для лечения или профилактики ассоциированных с вирусами заболеваний, предпочтительно ассоциированных с ротавирусами заболеваний.

РАБОЧИЕ ПРИМЕРЫ

Следующие рабочие примеры представлены для того, чтобы продемонстрировать предпочтительные варианты изобретения, но конечно, их никоим образом не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Приведенные ниже примеры осуществляли, используя обычные способы, которые хорошо известны и являются рутинными для специалистов в данной области, за исключением случаев, когда подробно описано иное. Кроме того, специалистам в данной области должно быть понятно, что способы, раскрытые в примерах, представляют собой способы, которые, как обнаружил автор изобретения, хорошо работают при практическом осуществлении изобретения, и, следовательно, можно считать, что они составляют предпочтительные варианты способов для его практического осуществления. Однако специалистам в данной области в свете приведенного описания должно быть понятно, что могут быть осуществлены многочисленные изменения конкретных вариантов, которые описаны, и все еще получить подобный или сходный результат, не отходя от сути и не выходя за рамки объема изобретения.

Пример 1. Получение популяций обычных и предварительно обработанных ротавирусов в виде общей массы и показатели их стабильности

Bharat Biotech International Ltd. (BBIL) получили штаммы ротавирусов человека, 116E и I321, из Национального института здравоохранения (NIH) согласно договору о передаче материалов с Национальным институтом аллергии и инфекционных болезней (NIAID), NIH, Bethesda, USA. Исходные штаммы 116E (G9[P11]) и I321 (G10P[11]) адаптировали для выращивания в культуре клеток пассированием в первичных клетках почки африканской зеленой мартышки (AGMK), затем в клеточном субстрате MA104 и затем в серийно пересеваемых клетках AGMK (SPAGMK). Клеточные субстраты MA104 и SPAGMK не одобрены Национальным регулирующим органом (NRA) для получения коммерческих вакцин. Поэтому два вакцинных штамма ротавирусов человека (116E и I321) адаптировали к клеткам Vero, выращивали по отдельности в таких клетках, получая популяции вирусов в виде общей массы, и по отдельности готовили в виде опытных партий жидких составов моновалентной живой аттенуированной пероральной ротавирусной вакцины для клинических испытаний на человеке. Штамм ротавируса человека 116E, природный реассортант человека-быка и природно аттенуированный штамм, представляет собой штамм G9 человека, в который в природе был встроен один ген VP4 быка (VP = вирусный белок), гомологичный участку гена P[11]. Штамм I321, называемый G10P [11], главным образом, содержит гены быка и имеет только два генных участка человеческого происхождения, VP5 и VP7. Конкретные примеры в настоящей публикации описаны со ссылкой на живой и аттенуированный штамм 116E.

В общем, использовали следующий способ получения: Для выращивания ротавирусов использовали рабочие банки клеток Vero. Клетки Vero размножали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (Sigma®, MO, USA) с добавлением 5-10% фетальной бычьей сыворотки. В случае ротавирусов требуется расщепление трипсином одного из двух основных белков наружной оболочки VP4 в присутствии хлорида кальция, чтобы они могли инфицировать клетки Vero in vitro. Штаммы ротавирусов получали в системе банков посевного материала: основного банка вирусов и рабочего банка вирусов. Клетки Vero в среде без сыворотки инфицировали выбранным штаммом и отдельные сборы осуществляли через каждые 48 часов в течение периода времени, составляющего 144 часа. Три отдельно собранных материала объединяли, получая одну общую массу, и добавляли стабилизатор, содержащий сахарозу, фосфат, глутамат. Такие объединенные собранные общие массы материала хранили при -70°C или 2-8°C. Использовали два способа биологического процесса производства для получения популяции живых аттенуированных вирусов в виде общей массы.

Получение обычных вирусов: Рабочий клеточный банк клеток Vero, который хранили в жидком азоте, использовали для оживления и выращивания монослоев клеток Vero для процесса получения. Две криопробирки из рабочего банка клеток осторожно размораживали, вынимая из емкости для хранения в жидком азоте, и клетки переносили в два стерильных культуральных флакона из полистирола T-150 для оживления и добавляли среду DMEM, содержащую 5% фетальной сыворотки теленка. Флаконы для культивирования инкубировали при 37°C в течение двадцати четырех часов. После периода инкубации среду из культур сливали и добавляли среду DMEM, содержащую 5% фетальной сыворотки теленка, чтобы стимулировать образование слившихся монослоев.

Культуральные флаконы просматривали под микроскопом в отношении морфологии и способности размножаться в используемой среде. Затем клетки размножали еще в двух пассажах, получая несколько емкостей с клетками для инфицирования ротавирусом 116E или I321.

Ротавирус 116E или I321 выбирали из рабочего банка вирусов системы банков посевного материала, активировали трипсином и инокулировали, чтобы инфицировать клетки. Вычисление множественности инфекции осуществляли в соответствии с популяцией клеток. Клетки инфицировали и выдерживали при 37°C в течение одного часа для адсорбции. После периода адсорбции в культуры клеток добавляли DMEM без сыворотки. Инфицированные культуры клеток выдерживали при 35°C, и отдельные сборы осуществляли через каждые 48 часов в течение периода времени, составляющего 144 часа. После каждого отдельного сбора в культуры клеток добавляли DMEM без сыворотки. Культивирование клеток прекращали после третьего отдельного сбора. Профильтрованные материалы отдельных сборов собирали в стерильные емкости и хранили при 2-8°C. Материалы отдельных сборов объединяли, получая объединенную общую массу, и хранили при 2-8°C. Осуществляли отбор образцов, чтобы проверить содержание вируса, стерильность материала каждого отдельного сбора и объединенной общей массы. Объединенную общую массу хранили при -70°C или 2-8°C в стабилизаторе SPG (сахароза 7,46%, дигидрофосфат калия 0,0515%, гидрофосфат калия 0,128% и глутамат 0,101%). Также отбирали аликвоты образцов из материала отдельных сборов без стабилизаторов для получения данных о стабильности при разных температурах.

Получение предварительно обработанных вирусов: Рабочий клеточный банк клеток Vero, который хранили в жидком азоте, использовали для оживления и выращивания монослоев клеток Vero для процесса получения. Две криопробирки из рабочего банка клеток осторожно размораживали, вынимая из емкости для хранения в жидком азоте, и клетки переносили в два стерильных культуральных флакона из полистирола T-150 для оживления и добавляли среду DMEM, содержащую 5% фетальной сыворотки теленка и 0,1% сывороточного альбумина человека. Флаконы для культивирования инкубировали при 37°C в течение двадцати четырех часов. После периода инкубации среду из культуральных флаконов сливали и добавляли среду DMEM, содержащую 5% фетальной сыворотки теленка и 0,1% сывороточного альбумина человека, чтобы стимулировать образование слившихся монослоев.

Набирали вторую группу культур клеток, каждая из которых содержала 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,5% или 1% сывороточного альбумина человека (получаемого из организма человека) наряду с 5% фетальной сыворотки теленка в DMEM. Также набирали вторую группу культур клеток, каждая из которых содержала 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,5% или 1% сывороточного альбумина человека (рекомбинантной природы) наряду с 5% фетальной сыворотки теленка в DMEM.

Криопробирку с ротавирусами 116E или I321 выбирали из рабочего банка вирусов системы банков посевного материала и готовили инокуляты, чтобы инфицировать культуры клеток Vero. Определение множественности инфекции осуществляли в соответствии с популяцией клеток. Культуры клеток два раза промывали фосфатно-солевым буфером с pH от 7,4 до 7,6. Культуры клеток инфицировали и выдерживали при 37°C в течение одного часа для адсорбции вируса. После периода адсорбции в культуры клеток добавляли среду DMEM с 0,1% сывороточного альбумина человека. В культуры клеток добавляли сывороточный альбумин человека, полученный из организма человека, или рекомбинантный сывороточный альбумин человека. Инфицированные культуры клеток выдерживали при 37°C и осуществляли многократные сборы через каждый 48 часов, и в культуры добавляли среду, содержащую соответствующий сывороточный альбумин человека (полученный от человека и рекомбинантный сывороточный альбумин человека). Сборы осуществляли в стерильные емкости. Собранные материалы хранили при 2-8°C. Инфицированные культуры выдерживали при 37°C для размножения вирусов, и клетки поддерживали вплоть до третьего сбора, и культивирование прекращали после третьего сбора. Материалы трех сборов из каждой группы объединяли, получая объединенную общую массу, и хранили при 2-8°C. Осуществляли отбор образцов, чтобы проверить содержание вируса и стерильность материала каждой объединенной общей массы из отдельных сборов. Объединенную общую массу хранили при -70°C или 2-8°C в стабилизаторе SPG (сахароза 7,46%, дигидрофосфат калия 0,0515%, гидрофосфат калия 0,128% и глутамат 0,101%). Отбирали аликвоты из материала отдельных сборов без стабилизаторов для получения данных о стабильности при разных температурах.

На фиг.1 показаны данные о среднем титре, полученные для обычного вируса и предварительно обработанного вируса в пяти экспериментах. Все пять экспериментов осуществляли с использованием одних и тех же параметров, чтобы продемонстрировать, что присутствие HSA в культуральной среде во время размножения ротавируса на субстрате из клеток Vero в результате приводит к более высокому титру, чем без HSA. Осуществляли три отдельных сбора на 2-ой, 4-ый и 6-ой день после инфекции и материал объединяли; титр представлял собой средний титр для 3 сборов при 2°-8°C. Предварительно обработанный вирус давал более высокий выход титра. Минимальное различие среднего титра составляло 0,8 log и максимальное 1,1 log на миллилитр.

Пример 2. Состав обычных и предварительно обработанных ротавирусов в жидкой и лиофилизированной формах, и влияние каждого состава на параметры стабильности

Объединенный материал в виде общей массы, который хранили при 2-8°C или -70°C, готовили в виде конечной общей массы на основе целевого титра от 10³ до 10^8,5 БОЕ/0,5 мл, и полученным материалом наполняли емкости в виде вакцины. На основе титра объединенной общей массы брали вычисленный объем объединенного материала и добавляли к предварительно определяемому объему конечной общей массы, который содержал стабилизаторы, антибиотики и буферы. Полученной конечной общей массой наполняли флаконы. В составах использовали различные стабилизаторы в разных сочетаниях и концентрациях, такие как гидролизат лактальбумина (LAH), трегалоза, сахароза, крахмал, лактоза, мальтоза, соевый белок, rHSA (не включая остаточный rHSA, который мог быть перенесен с предварительно обработанным вирусом, собранным в результате осуществления способа получения предварительно обработанного вируса). Аликвоты объемом 0,5 мл состава, содержащего вирус, асептически переносили во флаконы объемом 2,0 мл и хранили при 2-8°C, 25°C и 37°C. Параметры стабильности тестировали с регулярными интервалами, чтобы показать стабильность обычного вируса и предварительно обработанного вируса после приготовления составов с различными стабилизаторами (см. таблицу 2).

Приготовление жидких составов 1-25: Различные составы готовили в асептических условиях, вычисляя объем стабилизаторов, буфера и объем вирусного антигена и целевой титр. Отбор образцов из каждого состава осуществляли асептически и метили по отдельности, указывая номер образца, дату получения и предназначение образца для хранения при конкретной температуре. Флаконы с образцами хранили при 2°-8°C, 25°C и 37°C. Номера образцов были закодированы, и их периодически испытывали в отношении титров в соответствии с планом исследования стабильности. Результаты на фигурах с фиг.1 по фиг.12.

Получение лиофилизированных составов 26-45: Различные составы готовили в асептических условиях, вычисляя объем стабилизаторов, буфера и объем вирусного антигена и целевой титр. Приготовленной конечной массой материала асептически заполняли флаконы для лиофилизации и их подвергали процессу сублимационной сушки в течение периода от 42 часов до 48 часов. Процесс сублимационной сушки обычно имеет три части: предварительное охлаждение, первичная сушка и вторичная сушка. Цикл сублимационной сушки устанавливали так, чтобы преимущественно поддерживать криогидратные точки различных стабилизаторов, используемых в разных составах. После завершения сублимационной сушки флаконы надлежащим образом герметично закрывали в вакууме. Отбор образцов из каждого состава осуществляли асептически и метили по отдельности, указывая номер образца, дату получения и предназначение образца для хранения при конкретной температуре. Флаконы с образцами хранили при 2°-8°C, 25°C и 37°C. Образцы периодически испытывали в отношении титров в соответствии с планом исследования стабильности. Лиофилизированное содержимое флаконов перерастворяли, используя воду для инъекций.

Таблица 2 № препа-рата (фиг.) Стабилизатор LAH Сахароза Трегалоза Крахмал Лактоза Мальтоза Соя HSA ПВП Бикарбонат, мМ Арав. камедь Pyr·HCl 1
(2B) 5,0 80,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2
(3) 2,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3
(3) 10,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4
(3) 20,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 5
(3) 2,5 0,0 0,5 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6
(4) 5,0 80 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 7
(5) 20,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 8
(5) 10,0 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 9
(5) 5,0 80 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 10
(5) 10,0 0,0 0,0 0,0 0,0 50 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 11
(6) 0,5 0,0 1,0 0,0 0,0 0,0 10,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 12
(6) 0,5 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0 10,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 13
(6) 5,0 80,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 14
(6) 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0 50,0 2,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 15
(7) 10,0 10 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 16
(7) 10,0 0,0 1,0 0,0 0,0 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 17
(7) 2,5 80 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 18
(7) 2,5 0,0 1,0 0,0 0,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 19
(8) 5,0 80,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 20
(8) 5,0 80,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 21
(8) 0,0 80 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 22
(8) 0,0 80 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 23
(8) 0,0 80 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 24
(8) 0,0 80 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 25
(9 и 10) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 26
(13) 0,0 12,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 27
(13) 0,5 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 28
(13) 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 29
(13) 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,25 0,0 0,0 0,0 30
(14) 0,0 12,0   0,1 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 31
(14) 0,5 0,0 0,5 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 32
(14) 0,0 0,0 0,5 0,1 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 33
(14) 0,0 0,0 0,5 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,25 0,0 0,0 0,0 34
(15) 0,0 12,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 304 0,0 0,0 35
(15) 0,5 0,0 0,5 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 304 0,0 0,0 36
(15) 0,0 0,0 0,5 0,1 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 304 0,0 0,0 37
(15) 0,0 0,0 0,5 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,25 304 0,0 0,0 38
(16) 0,0 12 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,1 0,0 39
(16) 0,5 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 40
(16) 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 41
(16) 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,25 0,0 0,1 0,0 42
(17) 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,25 0,0 0,0 0,0 43
(17) 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 44
(17) 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 45
(17) 0,5 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 *Сокращения и объяснения:
№ состава - номер состава;
ПВП - поливинилпирролидон;
Бикарбонат - 304 мМ бикарбонат;
Арав. камедь - аравийская камедь;
Pyr·HCl - пиридоксин·HCl.
Составы 1-24 являются жидкими составами со стабилизаторами.
В составах 19, 20, 23 и 24 использован обычный вирус.
В составах 21 и 22 использован предварительно обработанный вирус.
Состав 25 - жидкая состав, содержащий только буфер без стабилизаторов.
Составы 26-45 являются лиофилизированными составами.

На фиг.2 показаны данные о стабильности обычного вируса и предварительно обработанного вируса в отсутствие (2A) или в присутствии (2B) стабилизаторов: 5% LAH + 80% сахарозы + 0,5% трегалозы, в жидком составе (№ состава 1), который хранили при 37°C. При такой температуре наблюдали, что стабильность вируса постепенно падала, начиная с 0 дня до 16-ой недели в присутствии или без стабилизаторов. В отсутствие стабилизаторов падение титра предварительно обработанного вируса составляет 3,2 log после 4 недель при 37°C, тогда как падение титра обычного вируса составляет 4,0 log. На основании фиг.2B можно отметить, что присутствие стабилизаторов замедляло падение титра до уровней, наблюдаемых в отсутствие стабилизаторов. Кроме того, в исследованиях в присутствии или в отсутствие стабилизаторов показано, что уменьшение титра немного медленнее происходит в случае предварительно обработанного вируса, чем обычного вируса, что свидетельствует о том, что HSA, используемый в способе получения, вносил существенный вклад в стабильность.

На фиг.3 показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных составах при 2-8°C (3A), 25°C (3B) и 37°C (3C). В каждом случае серия 1 относится к составу с 2,5% гидролизата лактальбумина, серия 2 относится к составу с 10% гидролизата лактальбумина и 0,5% трегалозы, серия 3 относится к составу с 20% гидролизата лактальбумина, и серия 4 относится к составу с сочетанием 2,5% гидролизата лактальбумина, 0,5% крахмала и 0,5% трегалозы. При 2-8°C не было падения титра в серии 3 вплоть до двадцати четырех месяцев, и наблюдали падение титра на 0,09 log-0,49 log в серии 1, 2 и 4 через 14 месяцев - 24 месяца при 2-8°C. При 25°C в сериях 1-4 наблюдали падение титра в диапазоне от 0,94 log до 2,69 log через 3 месяца и в диапазоне от 1,19 до 4,19 log через 6 месяцев, и в диапазоне от 1,89 до 5,39 через 12 месяцев. При 37°C в сериях 1-4 наблюдали падение титра в диапазоне от 1,39 до 2,49 log через шесть недель, и в сериях 2 и 3 наблюдали падение титра от 2,99 до 3,09 log через 10 недель. В сериях 1 и 4 титр становился нулевым через десять недель.

На фиг.4 показаны данные о стабильности ротавируса 116E в составе в присутствии или в отсутствие стабилизаторов (5% гидролизата лактальбумина + 80% сахарозы + 0,5% трегалозы), который хранили при 2-8°C (4A), 25°C (4B) и 37°C (4C). При 2-8°C в составе ротавируса без гидролизата лактальбумина и двух дисахаридов наблюдали постепенное снижение титра на 1,84 log вплоть до 24 месяцев. В случае ротавируса с 5% гидролизата лактальбумина и сочетанием 80% сахарозы и 0,5 % трегалозы не наблюдали падения титра вплоть до 24 месяцев. При 25°C в составе ротавируса без гидролизата лактальбумина и сочетания двух дисахаридов наблюдали снижение титра на 6,0 log вплоть до 12 месяцев. В случае ротавируса с 5% гидролизата лактальбумина и сочетанием 80% сахарозы и 0,5% трегалозы наблюдали постепенно падение титра на 2,81 log вплоть до 12 месяцев. При 37°C в составе ротавируса без гидролизата лактальбумина и сочетания двух дисахаридов наблюдали общее снижение титра, и титр становился нулевым через 6 недель. В случае ротавируса с 5% гидролизата лактальбумина и сочетанием 80% сахарозы и 0,5% трегалозы наблюдали постепенно падение титра на 3,85 log вплоть до 16 недель.

На фиг.5 показаны данные о стабильности ротавируса в четырех разных составах при 2-8°C (5A), 25°C (5B) и 37°C (5C). В каждом случае серия 1 относится к составу с сочетанием 20% гидролизата лактальбумина и 0,5% трегалозы, серия 2 относится к составу с сочетанием 10% гидролизата лактальбумина, 1,0% лактозы, серия 3 относится к составу с сочетанием 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы, и серия 4 относится к составу с сочетанием 10% гидролизата лактальбумина и 50% мальтозы. При 2-8°C титр не снижался в сериях 1 и 3 вплоть до 24 месяцев, и в сериях 2 и 4 не наблюдали падения титра вплоть до девяти месяцев и наблюдали падение на 0,37-0,57 log через 24 месяца. При 25°C не было падения титра во всех четырех сериях вплоть до трех месяцев при 25°C и падение на 1,47 log через 7 месяцев в сериях 1 и 3. В сериях 2 и 4 титр снижался на 3,47-4,07 log через семь месяцев. При 37°C в сериях 1-4 наблюдали падение титра в диапазоне от 1,37 до 2,77 log через четыре недели и в диапазоне от 1,77 до 4,07 log через 6 недель.

На фиг.6 показаны данные о стабильности жидких составов ротавируса 116E при 2-8°C (6A), 25°C (6B) и 37°C (6C). В каждом случае серия 1 относится к составу с сочетанием 0,5% гидролизата лактальбумина, 10% соевого белка и 1,0% трегалозы, серия 2 относится к составу с сочетанием 0,5% гидролизата лактальбумина, 10% соевого белка и 1,0% лактозы, серия 3 относится к составу с сочетанием 5% гидролизата лактальбумина, 2,5% соевого белка и 80% сахарозы, и серия 4 относится к составу с сочетанием 5% гидролизата лактальбумина, 2,5% соевого белка и 50% мальтозы. При 2-8°C не было падения титра в сериях 3 и 4 вплоть до двадцати четырех месяцев, и в сериях 1 и 2 наблюдали незначительное падение титра на 0,17 и 0,27 log. При 25°C в сериях 1-4 наблюдали падение титра в диапазоне от 1,07 до 2,17 log через 3 месяца и падение титра в диапазоне от 2,7 до 4,47 log через восемь месяцев. При 37°C в сериях 1-4 наблюдали падение титра в диапазоне от 1,16 до 5,07 log через четыре недели и падение титра в диапазоне от 2,1 до 6,17 log в сериях 2, 3 и 4, и нулевой титр в серии 1 через восемь недель.

На фиг.7 представлены данные о высокой стабильности жидких составов ротавируса 116E при 2-8°C (7A), 25°C (7B) и 37°C (7C). В каждом случае серия 1 относится к составу с сочетанием 10% гидролизата лактальбумина, 10% сахарозы и 1,0% трегалозы, серия 2 относится к составу с сочетанием 10% гидролизата лактальбумина, 5% мальтозы и 1,0% трегалозы, серия 3 относится к составу с сочетанием 2,5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 1% трегалозы, и серия 4 относится к составу с сочетанием 2,5% гидролизата лактальбумина, 50% мальтозы и 1% трегалозы. При 2-8°C не было падения титра в сериях 3 и 4 вплоть до двадцати четырех месяцев, и в сериях 1 и 2 наблюдали падение титра на 0,19-0,4 log через 15 месяцев. При 25°C в сериях 1-4 наблюдали падение титра в диапазоне от 0,89 до 1,59 log через три месяца и падение титра в диапазоне от 2,89 до 4,49 log через семь месяцев. При 37°C в сериях 1-4 наблюдали падение титра в диапазоне от 0,69 до 3,19 log через четыре недели и падение титра в диапазоне от 1,39 до 4,89 log через шесть недель.

На фиг.8 показаны данные о высокой стабильности жидких составов ротавируса 116E при 2-8°C (8A), 25°C (8B) и 37°C (8C). В каждом случае серия 1 относится к составу с сочетанием обычного ротавируса, 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы, серия 2 относится к составу с сочетанием предварительно обработанного ротавируса, 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы, серия 3 относится к составу с сочетанием антигена, полученного биологическим способом 1, 0,1% HSA и 80% сахарозы, и 0,5% трегалозы, и серия 4 относится к составу с сочетанием антигена, полученного биологическим способом 2, 0,1% HSA, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы, серия 4 относится к составу с сочетанием антигена, полученного биологическим способом 2, 0,1% HSA, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы, серия 5 относится к составу с сочетанием антигена, полученного биологическим способом 1, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы, серия 6 относится к составу с сочетанием антигена, полученного биологическим способом 2, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы. При 2°-8°C не было падения титра в сериях 1, 2 и 4 через 24 месяца, и в сериях 3, 5 и 6 не наблюдали снижения вплоть до 18 месяцев и падение примерно на 0,2 log наблюдали через 24 месяца. При 25°C в сериях 1, 2, 3 и 4 наблюдали падение титра в диапазоне от 0,64 до 1,44 log через шесть месяцев и падение титра в диапазоне от 2,64 до 3,05 log через одиннадцать месяцев. В сериях 5 и 6 наблюдали падение титра в диапазоне от 2,44 до 2,82 через шесть месяцев и падение от 5,09 до 5,02 через 11 месяцев. При 37°C в сериях 1, 2, 3 и 4 наблюдали падение титра в диапазоне от 1,51 до 4,83 log через шесть недель, и падение титра в диапазоне от 4,0 до 5,04 log через шестнадцать недель. В сериях 5 и 6 наблюдали падение титра в диапазоне от 2,92 до 3,54 log через шесть недель, и титр становился нулевым через шестнадцать недель.

На фиг.9 показаны данные о стабильности ротавируса в пяти разных составах при 37°C. В составе, в котором не было стабилизатора, наблюдали глубокое падение значения титра, и титр становился нулевым через шесть недель. Конечная общая масса материала, которая представляла собой предварительно обработанный вирус с 80% сахарозы и 0,5% трегалозы, имела падение на 2,2 log через 4 недели, на 2,92 log через шесть недель, на 6,02 log через 8 недель, и титр становился нулевым через десять недель. Конечная общая масса с 20% гидролизата лактальбумина имела падение на 1,39 log через четыре недели, падение на 2,09 log через шесть недель, на 2,29 log через восемь недель и падение на 5,39 log через 16 недель. Конечная общая масса с 20% гидролизата лактальбумина и 0,5% трегалозы имела падение титра на 4,97 через 16 недель. Конечная общая масса с сочетанием 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы имела постепенное падение с первой недели по 16-ую неделю; падение на 1,1 log через 6 недель, падение на 2,42 log через 12 недель и падение на 3,85 log через 16 недель. Когда из общей массы готовили составы с 80% сахарозы, 0,5% трегалозы, то стабильность вакцины при 37°C наблюдали вплоть до одной недели и медленный распад вплоть до четырех недель и резкое падение через шесть недель. Общая масса, приготовленная в виде состава с 20% гидролизата лактальбумина, имела улучшенную стабильность и была способна сохраняться вплоть до четырех недель, при этот падение титра составляло менее чем 1,5 log, и постепенное снижение титра наблюдали вплоть до 16 недели. Не наблюдали резкого падения титра в случае 20% гидролизата лактальбумина и 0,5% трегалозы через 16 недель при 37°C по сравнению с вакциной, содержащей только 20% лактальбумина. Когда из общей массы готовили составы с 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы, то наблюдали падение титра менее чем на 1,5 log через шесть недель и падение на 3,85 logs через 16 недель.

На фиг.10 показана стабильность ротавирусной вакцины с низким титром (менее чем 10⁴) в пяти разных составах при 2-8°C (10A) и 37°C (10B). При 2-8°C в составе, в котором не было стабилизатора, наблюдали падение значения титра, и титр становился равным 0,6 через 24 месяца. В составе с 80% сахарозы и 0,5% трегалозы наблюдали падение на 1,8 log через 24 месяца, в составе с 20% гидролизата лактальбумина и в составе с 20% гидролизата лактальбумина и 0,5% трегалозы наблюдали падение на 0,8 log и 0,89 log, и в составе с 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы наблюдали падение титра на 0,7 log через 24 месяца. При 37°C в составе, в котором не было стабилизатора, наблюдали сильное падение значения титра, и титр становился равным 0,8 через четыре недели. Конечная общая масса, которую готовили с 80% сахарозы и 0,5 % трегалозы, имела снижение на 2,06 log через 4 недели, тогда как общая масса с 20% гидролизата лактальбумина имела снижение на 2,48 log через шесть недель, основная масса, приготовленная с 20% гидролизата лактальбумина и 0,5% трегалозы имела падение титра 2,79 через 8 недель. Конечную общую массу готовили в виде состава с сочетанием 5% гидролизата лактальбумина, 80% сахарозы и 0,5% трегалозы и наблюдали постепенное падение с первой по 10-ю неделю; падение на 1,2 log наблюдали через 4 недели, падение на 1,7 log через 8 недель и падение на 2,5 log через 10 недель. Фиг.10 демонстрирует тот факт, что гидролизат лактальбумина в определенных концентрациях несомненно улучшает стабильность ротавирусных вакцин, имеющих низкий титр, при 37°C.

На фиг.11A-11H показаны данные о стабильности жидких составов предварительно обработанного вируса с разными стабилизаторами. Такие же данные приведены ниже в таблице 3.

На фиг.12A-12H показаны данные о стабильности жидких составов обычного вируса с разными стабилизаторами. Такие же данные приведены ниже в таблице 4.

Таблица 3 Жидкие составы ротавируса 116E
Подробное описание состава
Пептон гидролизованный - 20%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 5,99 5,75 5,48 4,85 4,05 3,72 2,98 2,26               25°С 5,99 6,18 6,01 6 6,08 5,89 5,94 5,98 5,82 5,69 5,08         2°С-8°С 5,99       6,02     6,05     5,97 6,01 5,95 6,13 6,02 Подробное описание состава
Пептон гидролизованный - 20%
Трегалоза - 1%
Фукоза - 0,02%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,28 6,11 5,65 5,45 5,28 4,97 4,57 4,05 3,32 2,65           25°С 6,28 6,12 6,13 6,03 6,05 5,98 6,21 6,2 5,94 5,82 5,52         2°С-8°С 6,28       6,15     6,02     6,17 6,15 6,12 6,25 6,16 Подробное описание состава
Гидролизат яичного белка - 20%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,11 5,56 5,68 4,56 4,11 3,98 3,25 2,81 6,11 5,56           25°С 6,11 6,1 6 5,98 5,97 6,14 6,02 4,99 4,25 3,95 3,9        

2°С-8°С 6,11       6,18     6,1     6,03 6,04 6,08 6,12 6,18 Подробное описание состава
Гидролизат яичного белка - 20%
Трегалоза - 0,5%
D-сорбит - 1%
Манноза - 0,5%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,17 5,58 5,02 4,89 4,15 3,75 3,05 2,45               25°С 6,17 6,05 6,12 6,03 6,05 5,97 6,04 5,84 5,34 4,97 4,56         2°С-8°С 6,17       6,23     6,04     6 6,15 6,19 6,23 6,17 Подробное описание состава
Гидролизат лактальбумина - 20%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,08 4,96 2,81 1,78 1,12                     25°С 6,08 6,12 6,21 5,96 6,22 5,89 6,01 5,92 5,43 4,98 4,42         2°С-8°С 6,08       6,18     6,36     6,11 6,06 5,99 6,12 6,23 Подробное описание состава
Гидролизат лактальбумина - 20%
Трегалоза - 0,5%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,12 4,56 3,46 2,66 2,06 1,89 1,35                 25°С 6,12 6,21 6,15 6,06 6,13 6,18 6,25 6,31 5,85 5,67 5,26        

2°С-8°С 6,12       6,32     6,21     6,26 6,11 6,15 6,01 6,07 Подробное описание состава
Дрожжевой гидролизат - 20%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,22 6,01 3,35 1,76 0,83                     25°С 6,22 6,1 6,23 6,03 6,13 5,76 5,28 5,18 5,02 4,89 4,24         2°С-8°С 6,22       6,28     6,45     6,16 6,04 6,15 6,27 6,35 Подробное описание состава
Дрожжевой гидролизат - 20%
Мальтоза - 5%
Лактоза - 0,5%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 5,98 6,03 3,45 2,58 1,52                     25°С 5,98 6,13 6,32 6,22 6,18 6,23 6,31 5,98 5,38 4,88 4,02         2°С-8°С 5,98       6,03     6,15     6,28 6,13 6,22 6,11 6,18

Таблица 4 Подробное описание состава
Пептон гидролизованный - 20%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,13 5,93 4,75 3,21 1,13                     25°С 6,13 6,18 6,23 6,31 6,08 6,1 6,15 5,98 5,55 5,28 4,94         2°С-8°С 6,13       6,19     6,22     6,08 6,01 5,99 6,11 6,23 Подробное описание состава
Пептон гидролизованный - 20%
Трегалоза - 1%
Фукоза - 0,02%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,31 6,11 4,59 3,34 2,32                     25°С 6,31 6,28 6,13 6,01 6,05 5,95 6,21 6,38 5,75 5,52 5,22         2°С-8°С 6,31       6,35     6,28     6,17 5,93 6,12 6,22 6,31 Подробное описание состава
Гидролизат яичного белка - 20%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,02 4,54 2,67 1,57                       25°С 6,02 6,17 6,19 6,08 5,97 5,18 4,37 3,68 2,54            

2°С-8°С 6,02       6,18     6,23     6,29 6,11 5,93 6,12 6,24 Подробное описание состава
Гидролизат яичного белка - 20%
Трегалоза - 0,5%
D-сорбит - 1%
Манноза - 0,5%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,02 5,58 3,28 2,76 1,59                     25°С 6,02 6,05 6,11 6,14 5,94 5,97 6,13 5,29 4,51 4,12           2°С-8°С 6,02       6,23     6,12     6,28 6,33 6,15 6,01 6,17 Подробное описание состава
Гидролизат лактальбумина - 20%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,08 4,96 2,81 1,78 1,12                     25°С 6,08 6,12 6,21 5,96 6,22 5,89 6,01 5,92 5,43 4,98 4,42         2°С-8°С 6,08       6,18     6,36     6,11 6,06 5,99 6,12 6,23 Подробное описание состава
Гидролизат лактальбумина - 20%
Трегалоза - 0,5%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,12 4,56 3,46 2,66 2,06 1,89 1,35                 25°С 6,12 6,21 6,15 6,06 6,13 6,18 6,25 6,31 5,85 5,67 5,26        

2°С-8°С 6,12       6,32     6,21     6,26 6,11 6,15 6,01 6,07 Подробное описание состава
Дрожжевой гидролизат - 20%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 6,22 6,01 3,35 1,76 0,83                     25°С 6,22 6,1 6,23 6,03 6,13 5,76 5,28 5,18 5,02 4,89 4,24         2°С-8°С 6,22       6,28     6,45     6,16 6,04 6,15 6,27 6,35 Подробное описание состава
Дрожжевой гидролизат - 20%
Мальтоза - 5%
Лактоза - 0,5%   0
дней
титр 1
неделя 2
недели 3
недели 4
недели 6
недель 8
недель 12
недель 16
недель 20
недель 24
недели 36
недель 48
недель 72
недели 97
недель 37°С 5,98 6,03 3,45 2,58 1,52                     25°С 5,98 6,13 6,32 6,22 6,18 6,23 6,31 5,98 5,38 4,88 4,02         2°С-8°С 5,98       6,03     6,15     6,28 6,13 6,22 6,11 6,18

На фиг.13-17 показаны данные о стабильности лиофилизированных составов ротавируса 116E, № составов 26-45, в каждом случае при 2°-8°C (A), 25°C (B) и 37°C (C).

Данный пример демонстрирует, что некоторые составы подходят для поддержания стабильности при 2°-8°C в течение длительных периодов. Пример также показывает, что некоторые составы особенно подходят для хранения при 25°C или даже при 37°C.

Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, упоминаемые в описании, являются показателем уровня специалистов в области техники, к которой настоящее изобретение относится. Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов включены в настоящее описание в такой степени, как в случае, когда специально и отдельно указывается, что каждая отдельная публикация или заявка на выдачу патента включена в виде ссылки. Хотя указанное выше изобретение описано подробно с помощью иллюстрации и примера в целях более ясного понимания, будет очевидно, что на практике могут быть осуществлены некоторые изменения и модификации в объеме прилагаемой формулы изобретения.

Представлены композиция и способ ее получения. Охарактеризованная композиция содержит: эффективное количество вирусного антигена, который представляет собой живой аттенуированный ротавирус, предварительно обработанный 0,1% сывороточным альбумином человека, и фармацевтически приемлемый буфер. Способ получения композиции включает выращивание культуры клеток Vero, первоначально культивированной в присутствии 5% фетальной сыворотки теленка и 0,1% сывороточного альбумина человека, инфицирование такой культуры клеток Vero живым аттенуированным ротавирусом, размножения вируса в клеточной культуре и добавление к указанному вирусу фармацевтически приемлемого буфера. Представленные изобретения могут быть использованы для профилактики ротавирусной инфекции и/или ротавирусного гастроэнтерита. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 17 ил., 4 табл., 2 пр.

1. Стабильная композиция в качестве вакцины для профилактики ротавирусной инфекции, содержащая:
(a) эффективное количество вирусного антигена, который представляет собой предварительно обработанный живой аттенуированный ротавирус, и
(b) фармацевтически приемлемый буфер с физиологическим значением рН,
при этом указанным предварительно обработанным живым аттенуированным ротавирусом является ротавирус, который контактировал или был подвергнут воздействию 0,1% сывороточным альбумином человека в ходе стадии роста и размножения вируса в культуре клеток Vero, где культуру клеток Vero первоначально культивировали в присутствии 5% фетальной сыворотки теленка и 0,1% сывороточного альбумина человека до предварительной обработки вируса.

2. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая, по меньшей мере, один из стабилизаторов, включающих гидролизат невирусного частично гидролизованного такого белка или сочетание двух дисахаридов.

3. Композиция по п. 2, в которой указанным гидролизатом белка является гидролизат лактальбумина.

4. Композиция по п. 2, в которой сочетание двух дисахаридов включает сахарозу и трегалозу.

5. Композиция по п. 2, содержащая
(а) вирусный антиген, который является живым аттенуированным ротавирусом,
(b) фармацевтически приемлемый буфер с физиологическим значением рН и
(c) невирусный белок или гидролизат белка.

6. Композиция по п. 2, содержащая
(a) вирусный антиген, который является живым аттенуированным ротавирусом, и
(b) фармацевтически приемлемый буфер с физиологическим значением рН,
(c) невирусный белок или гидролизат белка и
(d) сочетание по меньшей мере двух дисахаридов.

7. Композиция по п. 6, содержащая
(a) вирусный антиген, который является живым аттенуированным ротавирусом, указанным в п. 1, с титром в диапазоне от 10³ до 10^8,5 БОЕ/0,5 мл,
(b) фармацевтически приемлемый буфер, представляющий собой фосфатно-цитратный буфер (фосфат 310 мМ и цитрат 100 мМ) с рН от 6,8 до 8,0, в качестве разбавителя/носителя,
(c) гидролизат белка, представляющий собой гидролизат лактальбумина, в концентрации примерно 5% масс./об.,
(d) один дисахарид, представляющий собой сахарозу, в концентрации примерно 80% масс./об. и другой дисахарид, представляющий собой трегалозу, в концентрации примерно 0,5% масс./об.

8. Композиция по п. 1, в которой живой аттенуированный ротавирус способен давать титр, в среднем повышенный от минимум 0,8 log до максимум 1,1 log на миллилитр при хранении в условиях окружающей среды по сравнению с живым аттенуированным ротавирусом, размножаемым в отсутствие сывороточного альбумина человека.

9. Композиция по любому из предшествующих пунктов, представляющая собой жидкую композицию.

10. Композиция по п. 9, где жидкая композиция стабильна в течение 6 недель при 37°С, в течение 6 месяцев при 25°С и в течение 24 месяцев при 2-8°С.

11. Способ получения стабильной композиции по п. 1, включающий
(i) выращивание культуры клеток Vero, первоначально культивированной в присутствии 5% фетальной сыворотки теленка и 0,1% сывороточного альбумина человека;
(ii) инфицирование упомянутой культуры клеток Vero (i) живым аттенуированным ротавирусом в упомянутой культуре клеток Vero (i), что является последовательной обработкой живого аттенуированного ротавируса путем контактирования ротавируса или осуществления на него воздействия 0,1% сывороточного альбумина человека в ходе стадии роста и размножения вируса в клеточной культуре для размножения вируса;
(iii) добавления к указанному вирусу фармацевтически приемлемого буфера с физиологическим значением рН.