ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas aeruginosa ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНОЗА СВИНЕЙ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A61K39/104 C12R1/385 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и предназначено для производства вакцинных препаратов против псевдомоноза свиней.

Псевдомоноз - острая инфекционная болезнь животных и птицы, характеризующаяся у молодняка септическим процессом, поражением легких, желудочно-кишечного тракта и суставов, а у взрослых особей репродуктивных органов и молочной железы. Возбудителем псевдомоноза является грамотрицательная аэробная бактерия Pseudomonas aeruginosa, которая по антигенной структуре подразделяется на 20 серологических групп (Псевдомоноз животных / И.А. Болоцкий, А.Г. Шипицын, А.К. Васильев и др. - М.: Колос, 2010. - 223 с.).

Псевдомоноз животных, в т.ч. свиней, регистрируется во всех регионах России независимо от природно-географических условий. В подавляющем большинстве случаев возбудителем псевдомоноза свиней является Pseudomonas aeruginosa серогрупп O1, O3, O4, O6, O11, O19 (Пруцаков С.В. Псевдомоноз продуктивных животных в регионе Северного Кавказа / Автореф. дисс. докт. вет. наук. - Краснодар, 2011. - 37 с.). Учитывая данные обстоятельства, для профилактики болезни была разработана вакцина поливалентная против псевдомоноза сельскохозяйственных животных (Пат. РФ №2308288), которая в качестве антигенов содержит суспензию клеток чистых культур Pseudomonas aeruginosa, принадлежащих к 10 серогруппам (O1, O2, O3, O4, O6, O10, O11, O13, O18, O19), полученных путем отбора паренхиматозных пораженных органов из местного эпизоотического очага. Существенным недостатком такой вакцины является использование для ее получения неохарактеризованных (случайных) штаммов с неизвестными иммуногенными свойствами.

Известен вакцинный штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 514₂, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей (Пат. РФ 2169193, прототип). Недостатком данного штамма является то обстоятельство, что он ориентирован на создание вакцины против псевдомоноза пушных зверей, при этом у вакцинированных животных формируется иммунитет к экзотоксину А, а не к соматическому O-антигену, который сохраняется непродолжительное время.

Технического решения, в ходе которого использовался штамм Pseudomonas aeruginosa для получения вакцины против псевдомоноза свиней с заданным O-антигенным профилем и иммунногенными свойствами, в доступной научной и патентной литературе нами не выявлено.

Штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ выделен от павшего поросенка в 2003 г., в 2011 г. предложен в качестве вакцинного штамма, а в 2013 г. депонирован во Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГБУ «ВГНКИ») под регистрационным номером «№1 КВЛ-ДЕП».

Штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ-ДЕП предназначен в качестве производственного штамма для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней и хранится в ФГУП «Армавирская биофабрика».

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов Pseudomonas aeruginosa, обладающих и длительно сохраняющих свои иммунногенные свойства, и пригодных для изготовления высокоэффективных вакцинных препаратов.

Технический результат достигается тем, что штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ-ДЕП, депонированный в коллекции ФГБУ ВГНКИ и предназначенный для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней.

Штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ-ДЕП характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки: грамотрицательная палочка, размерами 2-3×0,5-0,8 мкм, подвижная, спор и капсул не образует, располагается поодиночно. Растет на простых питательных средах с образованием сине-зеленого пигмента пиоцианина и слизи. На поверхности мясо-пептонного бульона дает пленку серовато-серебристого цвета, а на поверхности мясо-пептонного агара - шероховатые неправильной формы колонии.

Физиолого-биохимические признаки: мезофил, аэроб, растет при температуре от 18 до 42°C, но оптимальная температура роста 35-37°C. Окисляет глюкозу, восстанавливает нитраты до нитритов, ферментирует аргинин, разжижает желатину, свертывает молоко, разрушает эритроциты барана, образует цитохромоксидазу.

Антигенные свойства: агглютинируется типовой сывороткой O3 до титра 1:1280.

Вирулентные свойства: Вызывает гибель белых мышей при внутри-брюшинном введении 1-2×10⁶ микробных клеток.

Иммуногенные свойства: при двукратной иммунизации кроликов инак-тивированными формалином клетками в дозе 1-2×10¹⁰ и взрослых свиней в дозе 4-6×10¹⁰ микробных тел через 14 дней после последней иммунизации в сыворотке крови животных появляются антитела в титре 1:512-1:1024. Защитный титр антител, равный для данного штамма 1:64, сохраняется у иммунизированных животных в течение 12 месяцев.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ выращивают на бульоне Хоттингера в течение 24-46 ч при 36-37°C с pH 7,2-7,4 и постоянном встряхивании на шуттель-аппарате. По истечении срока инкубации культуру проверяют на чистоту путем окрашивания по Граму, доводят физиологическим раствором до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 мл, после чего инактивируют формалином, содержащим не менее 36% формальдегида до конечной концентрации 0,3-0,4%, и выдерживают в течение 14 суток при температуре культивирования. После окончания срока инактивации в культуру вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия, фасуют во флаконы и укупоривают. Полученная вакцина представляет собой прозрачную жидкость желтовато-зеленоватого цвета с беловато-сероватым рыхлым осадком, при встряхивании образуется однородная суспензия.

Пример 2. Полученную по примеру 1 вакцину проверяют на стерильность и безвредность.

Стерильность вакцины контролируют по отсутствию роста при посеве на среды Сабуро (на грибы), Эндо (колиформные бактерии), МПА (мезофильные аэробные бактерии), Китта-Тароци (на анаэробы). Рост на всех средах отсутствовал, что свидетельствует о стерильности вакцины.

Безвредность проверяют на 3 белых мышах массой 18-20 г, которым вакцину вводят подкожно в объеме 0,3 мл и наблюдают в течение 7 дней. Все подопытные животные остались живы, на месте введения вакцины патологических изменений не было, что свидетельствует о безвредности препарата.

Пример 3. Иммуногенность вакцины оценивают по протективности при экспериментальном псевдомонозе на белых мышах и величине накопления титров специфических антител у иммунизированных вакциной кроликов и свиней.

3 группы белых мышей по 10 животных в каждой за 10 дней до заражения эпизоотическим штаммом Pseudomonas aeruginosa O3 иммунизировали: мышей 1 группы вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ в дозе 0,1 мл подкожно; мышей из 2 группы вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ в дозе 0,1 мл подкожно; мышам из 3 группы ввели физраствор в объеме 0,1 мл подкожно. Через 10 дней после иммунизации всех мышей заразили патогенным изолятом Pseudomonas aeruginosa серогруппы O3 в дозе 300 млн. микробных тел внутрибрюшинно. В течение 14 дней за мышами вели наблюдение и производили учет павших.

Результаты отражены в таблице 1, из которой видно, что в первой группе выжило 90% экспериментально зараженных животных, что на 30% больше, чем во второй группе, животные которой иммунизировались вакциной из эпизоотического штамма. В контрольной группе, где животным вводился физраствор, погибли все мыши. Следовательно, вакцина против псевдомоноза из штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ защитила наибольшее количество экспериментально зараженных животных, а значит она более иммуногенна, чем вакцина, приготовленная из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂.

Таблица 1 Защитный эффект вакцин при экспериментальном псевдомонозе, обусловленном Pseudomonas aeruginosa серогруппы O3 Группа Кол-во мышей Пало Выжило Защитный эффект вакцины, % 1. Иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ 10 1 9 90 2. Иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ 10 4 6 60 3. Контроль (вводился физраствор) 10 10 - -

Иммуногенность штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ оценивали по способности стимулировать выработку специфических антител на 10 кроликах и 10 взрослых свиньях. Для этого животных иммунизируют дважды с интервалом 14 дней кроликов в дозе 1 мл на голову, свиней - 5 мл на голову. По истечении 14, 30, 90, 180, 270 и 360 дней после последней иммунизации в реакции агглютинации определяют титры антител к Pseudomonas aeruginosa серогруппы O3.

Результаты отражены в таблице 2, из которой видно, что депонированный штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ, предназначенный для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней, обладает более выраженными иммуногенными свойствами, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂, поскольку обеспечивает образование в 3-5 раз большего уровня специфических антител. Кроме того, в организме иммунизированных животных в группах, где использовалась вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ, защитный уровень антител к соматическому антигену O3 (не менее 1:64) сохранялся в течение 12 месяцев, а у животных иммунизированных вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ - только 6 месяцев. Отсюда следует, что вакцина, приготовленная из штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ, обеспечивает более продолжительный иммунитет, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂.

Пример 4. На свино-товарной ферме, неблагополучной по псевдомонозу, иммунизируют 30 поросят 2-недельного возраста полученной по примеру 1 вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ (опытная группа) и 30 поросят аналогичного возраста вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ (положительный контроль), 30 поросят не иммунизировались (отрицательный контроль). Бактериологическими исследованиями установлено, что заболевание вызывает Pseudomonas aeruginosa серогруппы O3. Поросята опытной группы и группы положительного контроля иммунизировались по одинаковой схеме: дважды с интервалом 14 дней внутримышечно с внутренней стороны бедра в дозе 1,0 и 1,5 мл. Наблюдение за животными вели в течение 120 дней, отмечая все случаи заболевания и гибели поросят, связанные с псевдомонозом.

Результаты опыта отражены в таблице 3, из материалов которой видно, что в опытной группе заболело псевдомонозом 5 поросят, из них 1 пал. В группе положительного контроля заболело 8 поросят, из которых пало 3. В группе отрицательного контроля заболело 15 поросят, из которых пало 7. Следовательно, заболеваемость и смертность в опытной группе составила соответственно 16,7 и 3,3%, в группе положительного контроля - 26,7 и 10%, в группе отрицательного контроля - 50 и 23,3%. Сохранность поросят в опытной группе составила 96,7%, в группе положительного контроля - 90% и в группе отрицательного контроля - 76,7%.

Таблица 3 Профилактическая эффективность вакцины против псевдомоноза свиней из штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ Группа Количество поросят подвергнутых иммунизации Заболело поросят в группе Пало поросят в группе Сохранность поросят, % 1. Опытная, иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ 30 5 (16,7%) 1 (3,3%) 96,7 2. Контрольная, иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ 30 8 (26,7%) 3 (10%) 90,0 3. Контрольная, не иммунизировалась 30 15 (50,0%) 7 (23,3%) 76,7

Таким образом, вакцина, полученная в соответствии с предлагаемым изобретением, а именно из штамма Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ, обеспечивает наибольшую выживаемость животных при экспериментальном и спонтанном псевдомонозе, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂, поскольку способна в большей степени стимулировать выработку и циркуляцию в организме иммунизированных животных специфических антител к соматическому антигену O3. Следовательно, штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ пригоден для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ-ДЕП депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ. Штамм имеет высокую иммуногенную активность и предназначен для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней. При использовании вакцины на основе предложенного штамма титр антител к соматическому антигену О3 Pseudomonas aeruginosa в сыворотке крови кроликов и свиней через 14 дней после последней иммунизации составляет соответственно 1:768 и 1:1024. 3 табл., 4 пр.

Штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ-ДЕП, депонированный в коллекции ФГБУ ВГНКИ и предназначенный для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней.