СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОЗА И ПСЕВДОМОНОЗА ПЕСЦОВ И ЛИСИЦ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/116 A61K39/09 A61P31/04 

Сущность изобретения. Для изготовления вакцины против стрептококкоза и псевдомоноза песцов и лисиц раздельно выращивают штамм Streptococcus pyogenes №289 и Pseudomonas aeruginosa №529₂, 476₂, 527₁, 521₁, 500₂. Все полученные супернатанты подвергали инактивации с помощью диметилэтиленамина (ДЭИ) при концентрации препарата 0,5% рН 7,2 и экспозиции 18 часов. Инактиванты нейтрализуют тиосульфатом Na (концентрация 1,5%»). В каждый супернатант добавляли адъювант гидроокись алюминия 2 мг/10 мл вакцины. Супернатанты объединяют в одну емкость в равных количествах. Из выращенной культуры стрептококка, положительного по М-фактору патогенности, готовили солянокислый экстракт по методу Лансфилд. рН экстракта при помощи гидроокиси натрия до 7,2 инактивируют при 100°С. К инактивированному экстракту добавляют адъювант гидроокись алюминия 20 мг/10 мл.

Полученные вакцины объединяют в одну емкость в равных количествах. Полученная ассоциированная вакцина обеспечивает формирование иммунитета через 14 дней после иммунизации лабораторных животных. Вакцину вводят самкам песцов и лисиц перед гоном, в результате чего у молодняка создается иммунитет, который сохраняется в течение 6 месяцев после рождения.

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии и предназначено для производства вакцинных препаратов против стрептококкоза и псевдомоноза.

Стрептококковая и синегнойная инфекции распространены повсеместно, наносят значительный экономический ущерб звероводству и представляют опасность для здоровья людей.

В зверохозяйствах ежегодно регистрируются энзоотии среди песцов и лисиц. Стрептококкоз и псевдомоноз регистрируются как в отдельности, так и в ассоциации. Погибает молодняк в дорегистрационный период (до 30%). Самки абортируют во второй половине беременности (до 30%). Патология при синегнойной и стрептококковой инфекциях у животных очень разнообразна - поражение репродуктивной системы, септические процессы в организме, поражение молочных желез и т.д. У лисиц и песцов она протекает с поражением гениталий и сопровождается рассасыванием эмбрионов, пропустованием самок. В связи с этим специфическая профилактика вышеназванных болезней необходима.

В настоящее время в нашей стране не существует специфических средств профилактики стрептококкоза песцов и лисиц, а также комплексной профилактики стрептококкоза и псевдомоноза песцов и лисиц. Однако известен способ получения вакцины против стрептококкоза нутрий, а также ассоциированной вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий, приготовленных на основе штамма Str.Zooepiodemicuis ВГНКИ №К-Д Е Р и P. multociola ВГНКИ №6011, 2394, 1015.

Целью настоящего изобретения является конструирование иммуногенной ассоциированной вакцины против стрептококкоза и псевдомоноза песцов и лисиц. Возбудитель псевдомоноза обладает серотиповой вариабельностью, поэтому эффективность специфической профилактики определяется поливалентностью антигенного состава входящих в вакцину компонентов.

Штаммы Pseudomonas aereuginosa №527₁ и 529₂ предназначены в качестве продуцентов протеолитических ферментов (щелочной протеазы и эластазы), штаммы №476₂, 521₁, 500₂, 529₂ - в качестве продуцентов экзотоксина А при изготовлении специфического иммунного препарата против синегнойной инфекции песцов и лисиц.

Штамм Streptococcus pyogenes №289 группы А положительный по М-белку, с которым связана вирулентность и иммуногенность микробной клетки, использован в качестве продуцента стрептококкового антигена М-белка при изготовлении специфического иммунного препарата при стрептококковой инфекции.

В звероводческих хозяйствах ежегодно проводится цикл мероприятий по специфической профилактике молодняка песцов и лисиц против целого ряда инфекционных заболеваний: чумы, псевдомоноза, дерматофитозов, сальмонеллеза, колибактериоза. Иммунизация против стрептококкоза до сих пор не проводилась по причине отсутствия вакцины против стрептококкозов пушных зверей.

Целью настоящего изобретения является конструирование иммуногенной ассоциированной вакцины против псевдомоноза и стрептококкоза песцов и лисиц, чтобы дополнить существующую систему профилактических и оздоровительных мероприятий и добиться более эффективного эпизоотологического контроля стрептококкоза и псевдомоноза молодняка песцов и лисиц.

Вакцину для профилактики псевдомоноза и стрептококкоза песцов и лисиц готовили на основе штаммов Pseudomonas aereuginosa №529₂, 476₂, 527₁ 521₁, 500₂ и штамма Streptococcus pyogenes №289 группы А, которые выделены от самок песца и депонированы в коллекции штаммов возбудителей заболеваний пушных зверей музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства (НИИПЗК) им. В. А. Афанасьева и имеют регистрационные номера 25 и 14.

Для приготовления серии вакцины против псевдомоноза и стрептококкоза использовали ампулы с лиофилизированной культурой стрептококка группы А штамма 289 и Pseudomonas aereuginosa №529₂, 521, 527₁ 476₂, 500₂.

Пример 1. Streptococcus pyogenes штамм №289 типа А выращивали в течение 24 часов при 37°С в 0,5- и литровых бутылях на МПБ с 1% глюкозы. Проверяли на чистоту культуры на МПА и МПБ. Проверяли чистоту роста просмотром мазков, окрашенных по Грамму.

Проверяли присутствие М-белка методом «пропускания через кровь». Для этого в пробирки с 5 мл свежей донорской крови, проверенной на отсутствие М-антител, вводили 0,5 мл суточной культуры стрептококка, содержащей 10⁶ х 0,5 мл микробных тел, и инкубировали 24 часа при 37°С.

Мазки исследовали на содержание стрептококковой культуры. Присутствие М-белка определяли по способности штамма расти в человеческой крови. Суточную культуру сеяли в 500 мл флаконы с бульоном Тодда-Хевитта и инкубировали в течение 12 часов при 37°С. При определении по оптическому стандарту мутности ГКИ им. Тарасевича в 1 мл культуры 4 миллиарда микробных клеток - 4х10⁹.

Культуру центрифугировали при 1500g в течение 30 минут. Надосадочную жидкость из каждого флакона сливали, а осадок ресуспендировали в 50 мл физраствора, флаконы с суспензией прогревали в водяной бане при 56°С 30 минут. После инактивации пробы культуры из каждого флакона проверяли на стерильность на МПА и МПБ. Из инактивированной суспензии готовили кислый экстракт по Лансфилд. Для этого флаконы с суспензией центрифугировали при 1500g 30 минут. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали с добавлением 0,35 мл 1 н HCl. Затем флаконы прогревали при 100°С 10 минут.

рН солянокислого экстракта доводили до 7,0±0,2 раствором гидроокиси натрия в концентрации 1,0 моль/л. Экстракт центрифугировали при 1500g 30 минут.

Надосадочную жидкость из каждого флакона проверяли на стерильность на МПА, МПБ, МППБ в течение 10 суток.

Надосадочную жидкость собирали в одну бутыль, снова проверяли на стерильность на МПА, МПБ, МППБ и сохраняли при 4°С.

Посевы не должны иметь роста в течение 10 дней. После проверки вакцины на стерильность в емкость добавляли адъювант - 10% к общему объему 3% раствора гидрата окиси алюминия. Содержимое тщательно перемешивали. Через трое суток после внесения адъюванта формировали серию готовой моновакцины. рН моновакцины должен быть в пределах 7,0-7,2. Приготовленную серию моновакцины проверяли на стерильность на МПА, МПБ, МППБ. Вакцину проверяли на безвредность на 5 морских свинках и 10 белых мышах, которым вводили подкожно соответственно 2,0 и 0,5 мл. Если у лабораторных животных в течение 7 дней не наблюдалось болезненных отклонений от нормы, вакцина считается безвредной. Серию вакцины проверяли на активность. 10 белым мышам вводили по 0,5 мл вакцины. Через 30 дней после иммунизации 10 иммунных и 10 контрольных мышей заразили подтитрованной смертельной дозой стрептококка, содержащей 10 LD₅₀-10 (10⁵ х 0,2 мл). В течение семи дней велось наблюдение. Все мыши остались живы, т.е. сохранность составила 100%. Вакцина считается иммуногенной, если здоровыми остаются 80% мышей.

Пример 2. Для приготовления серии вакцины против псевдомоноза готовили моновакцины из 5 используемых штаммов отдельно. Каждый штамм проверяли на контаминацию с другой микрофлорой путем посевов на МПА, МПБ, ЦПХ, Сабуро по общепринятой методике. Через двое суток колонии приобрели зеленовато-синеватый цвет, агар приобретал цвет пигмента пиоционина, на МПА под вазелиновым маслом рост отсутствовал. Каждый серотип проверяли на патогенность путем внутримышечного заражения 2 песцов суточной бульонной культурой, выращенной на МПА при 37°С.При определении по оптическому стандарту мутности ГКИ им. Тарасевича в 1 мл культуры, используемой для приготовления вакцины, должно содержаться не менее 500 мл микробных клеток. У зараженных песцов в области инъекции в течение 24-72 часов наблюдается припухлость, повышенная температура, хромота. Из всех использованных штаммов приготовили супернатант. Штамм 529₂ (продуцент экзотоксина А) выращивали на обогащенном бульоне Мартена. Экзотоксин должен иметь в РТГА титр в разведении 1:512

Штаммы 521₁, 500₂ (продуценты щелочной протеазы) выращивали на лио-филизированной среде Lensen. При контроле супернатанта щелочная протеаза должна быть выявлена в разведениях не менее 1:32 в РП. Штаммы 476₂, 527 (продуценты эластазы) культивировали на лиофилизированной среде Lensen. При контроле в РП титр устанавливается в разведениях 1:16.

Все полученные супернатанты подвергли инактивации при помощи диме-тилэтиленамина (ДЭИ) при концентрации препарата 0,5%, рН 7,2 и экспозиции 18 часов. Через 18 часов добавляют тиосульфат натрия (конечная концентрация 1,5%) для нейтрализации инактиванта. Эффективность инактивации проверяли путем высева на чашки с TSA, МПБ, МПА и цеитримидный агар. Рост на средах должен отсутствовать.

Каждый супернатант вводили 5 морским свинкам подкожно по 3,0 мл и 10 белым мышам по 1,0 мл внутрибрюшинно. Наблюдения проводили в течение 7 дней. За время наблюдения вялость, похудение и гибель животных отсутствовали. В каждый супернатант добавляли гидроокись алюминия из расчета 2 мг/10 мл.

Через 18 часов супернатанты проверяли на стерильность на МПА, МПБ. Затем супернатанты соединили в одну емкость в равных количествах. Полученную поливакцину проверяли на стерильность на МПА, МПБ. Протективные свойства поливакцины проверяли на мышах. Для этого через 30 дней после иммунизации по 10 иммунизированных и 30 контрольных мышей заражали каждым сероваром. При заражении мышей 4 LD₅₀ сохранность их через 30 дней должна составлять 90-100%.

Пример 3. Затем готовили серию ассоциированной вакцины. С этой целью полученные инактивированные вакцины объединяют одну емкость. рН готовой вакцины должен быть в пределах 7,0-7,2. Вакцину проверяли на стерильность на МПБ, МПА, МППБ и среде Сабуро. Расфасовку вакцины производили по 100 мл в стерильные флаконы, которые закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивая герметичность упаковки содержимого флаконов.

Для определения качества ассоциированной вакцины делают выборку из разных мест серии в количестве 10 флаконов, из которых 5 используют для проведения испытания, а 5 флаконов хранят в архиве государственного контролера в течение 12 месяцев. Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонней примеси, хлопьев, плесени, неразвивающегося осадка флаконы с вакциной тщательно встряхивают и просматривают визуально в проходящем свете. Одновременно флаконы проверяют на герметичность укупорки и правильность этикетирования.

Концентрацию водородных ионов определяют электрометрическим методом, используя потенциометр марки ЛПУ-01 или другой прибор того же класса точности. Для испытания используют 3 флакона с вакциной. Содержимое каждого флакона испытывают отдельно. Определение рН вакцины проводят по инструкции, приложенной к потенциометру. Вакцина должна иметь рН в пределах 7,0-7,2.

Для проведения испытания на стерильность используют 5 флаконов с вакциной. Посевы проводят из каждого флакона в две пробирки с МПА, МПБ, МППБ и средой Сабуро. Питательные среды с посевами выдерживают в течение 10 дней, роста микрофлоры не должно быть. Безвредность вакцины проверяют на белых мышах массой 16-18 г и морских свинках весом 300-350 г. Для этого используют 3 флакона вакцины. Из каждого отбирают 20-30 мл препарата и смешивают в одном флаконе в общую пробу, используя для определения безвредности и иммуногенности.

Для определения безвредности 5 морским свинкам подкожно в области спины вводят 2,0 мл и 10 белым мышам также в области спины по 0,5 мл. Вакцина не должна вызывать заболевания и гибели лабораторных животных в течение 10 дней наблюдения.

Для определения протективной активности 40 белым мышам весом 16-18 г в области спины вводят по 0,2 мл вакцины. Через 14 дней после иммунизации 20 вакцинированных и 20 контрольных мышей аналогичной массы заражают подкожно в области бедра подтитрованной десятикратной смертельной дозой вакцинного штамма стрептококков и каждого штамма синегнойной палочки (по 20 мышей). Срок наблюдения 10 дней. Вакцину считают иммуногенной, если она предохраняет от заболевания и гибели не менее 18 иммунизированных мышей в каждой группе при заболевании всех мышей в контрольных группах в течение 10 дней.

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной медицины. Способ заключается в том, что раздельно выращивают штаммы Streptococcus pyogenes №289 и Pseudomonas aeruginosa №529₂, 476₂, 527₁, 521₁, 500₂, инактивируют и добавляют адъювант. После чего полученные моновакцины смешивают в равных соотношениях. При этом используют суточную культуру штамма Streptococcus pyogenes №289, содержащую 10⁶х0,5 млн микр. кл., штамм Pseudomonas aeruginosa №529₂ с титром в РТГА 1:512, штаммы Pseudomonas aeruginosa №476₂ и №527₁ с титром в РП 1:16, штаммы Pseudomonas aeruginosa №521₁ и №500₂ с титром в РП 1:16. Полученная данным способом вакцина позволяет предотвратить потери при воспроизводстве пушных зверей в хозяйствах, неблагополучных по стрептококковой и синегнойной инфекциям.

Способ изготовления ассоциированной вакцины против стрептококкоза и псевдомоноза песцов и лисиц, отличающийся тем, что раздельно выращивают штаммы Streptococcus pyogenes №289 и Pseudomonas aeruginosa №529₂, 476₂, 527₁, 521₁, 500₂, инактивируют и добавляют адъювант, после чего полученные моновакцины смешивают в равных соотношениях, при этом используют суточную культуру штамма Streptococcus pyogenes №289, содержащую 10⁶·0,5 млн микр.кл., штамм Pseudomonas aeruginosa №529₂ с титром в РТГА 1:512, штаммы Pseudomonas aeruginosa №476₂ и №527₁ - с титром в РП 1:16, штаммы Pseudomonas aeruginosa №521₁ и №500₂ с титром в РП 1:16.