ВАКЦИНА ПРОТИВ ПСЕВДОМОНОЗА ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ Российский патент 2000 года по МПК A61K39/104 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/385 

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, в частности, к средствам специфической профилактики псевдомоноза пушных зверей. Псевдомоноз пушных зверей - контагиозное инфекционное заболевание, приводящее в очаге инфекции к гибели 50% и более поголовья зверей.

Для профилактики данного заболевания разработаны и используются биопрепараты на основе возбудителя псевдомоноза пятого, шестого, восьмого и одиннадцатого сероваров по Международной классификации.

Так, известны:
вакцина против псевдомоноза норок, в основе которой содержится возбудитель псевдомоноза третьего серовара и ферменты: протеаза и эластаза [1];
вакцина против псевдомоноза пушных зверей, содержащая антиген возбудителя псевдомоноза шестого серовара, формалин, алюмокалиевые квасцы и физиологический раствор [2] и др.

Однако приведенные биопрепараты не обеспечивают надлежащего профилактического эффекта, так как в большей степени встречается смешанное течение инфекции, при этом они в малой степени предохраняют от заражения песцов и лисиц и предназначены в основном для профилактики псевдомоноза норок.

Известна также вакцина против псевдомоноза пушных зверей, преимущественно норок, содержащая смесь антигенов из штамма Ps. aeruginosa N 40 шестого серовара, N 48 - одиннадцатого серовара, N 63 - восьмого серовара и N 77 - пятого серовара, гидроокись алюминия, формалин, бульон Хоттингера и физиологический раствор [3].

Данная вакцина не обеспечивает у песцов и лисиц выработки надежного иммунитета, не предохраняет их от повторного заражения возбудителями псевдомоноза других серологических вариантов.

Целью изобретения является повышение иммунологической активности целевого продукта для песцов и лисиц.

Указанная цель достигнута тем, что она дополнительно содержит антигены из штаммов Ps. aeruginosa ВГНКИ N 110 второго серовара и N 278 третьего серовара, взятых в смеси в эффективном соотношении, при концентрации 6-8 млрд. микробных клеток, в 1 см³ бульона Хоттингера, при следующем соотношении компонентов, об.%:
Смесь антигенов из штаммов Ps. aeruginosa ВГНКИ N 40 шестого серовара, N 63 восьмого серовара, N 110 второго серовара, N 77 пятого серовара и N 278 третьего серовара, взятых в эффективном соотношении при концентрации 6-8 млрд.м.к. в 1 см³ бульона Хоттингера - 33,33-75,00
Гидроокись алюминия - 0,30-0,35
Формалин - 0,32-0,34
Физиологический раствор - Остальное
Для изготовления вакцины используют новые штаммы Ps. aeruginosu второго и третьего сероваров. Штаммы Ps. aeruginosu депонированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеют регистрационные номера 110-02 и 278-0З соответственно.

Штамм Ps. aeruginosa N 110 (лаб. Айнажи) второго серовара выделен из патологического материала лисицы в 1985 г.

Штамм Ps. aeruginosa N 278 (лаб. Песец) третьего серовара выделен из патологического материала павшего песца в 1987 г.

Штаммы Ps. aeruginosa ВГНКИ N 110-02 и ВГНКИ N 278-03 характеризуются следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки
При микроскопии мазков бульонных культур отмечают Грамм/отрицательные подвижные палочки со слегка закругленными краями длиной 0,8-1,2 ммк и шириной 0,6-0,8 ммк, расположенные поодиночке или парами в хранившихся культурах или в виде коротких цепочек в свежепассированных культурах. Спор и капсул не образуют.

Культуральные свойства
На плотных питательных средах: МПА, агар Хоттингера и Мартена культуры штаммов растут в виде круглых с сероватым оттенком слизистых колоний с образованием ярко выраженной сине-зеленой зоны (штамм N 110-02) или желто-зеленой зоны (N 278-03). При культивировании на жидких питательных средах: МПБ, бульон Хоттингера и Мартена характерно образование поверхностной пленки серо-белого цвета с окрашиванием через 14-18 ч среды в сине-зеленый цвет (культура штамма N 110-02) или желто-зеленый цвет (культура штамма N 278-03)
Ферментативные свойства
Культуры штаммов ферментируют без образования газа глюкозу, пептонизируют молоко, обладают гемолитической, каталазной, желатиназной и лецитиназной активностью.

Потребность в кислороде, строгие аэробы.

Антигенные и серологические свойства
Культуры штаммов имеют жгутиковые "H" и соматические "О" антигены. При идентификации с серотиповыми сыворотками по Международной классификации штамм N 110 относится к 02 серологическому варианту и штамм N 278 - к 03 серологическому варианту. На введение инактивированных формалином культур штаммов (Ps. aeruginosa в организме песцов, лисиц и норок образуются антитела-агглютинины в титрах 1:180-1:320.

Вирулентные свойства
ЛД₅₀ культуры штамма Ps. aeruginosa ВГНКИ N 110-02 для нелинейных мышей массой тела 14-16 г составляет 38,9 млн.м.к., а у культуры штамма Ps. aeruginosa ВГНКИ N 278-03 22,3 млн.м.к. Для морских свинок массой тела 300-350 г - 135 и 269 млн. м.к. соответственно.

Иммуногенные свойства
Инактивированная 0,3%-ным формалином суточная культура штамма Ps. aeruginosa N 110-02 предохраняет от контрольного заражения 50% морских свинок массой тела 300-350 г в дозе 33,8 млн.м.к., а культура штамма Ps. aeruginosa N 278-03 в дозе 38,9 млн.м.к. Минимальная иммунизирующая доза поливалентного антигена на основе штаммов Ps. aeruginosa N 110, 278, 77, 63, 40 для морских свинок массой тела 300-350 г составляет 19,9 млн.м.к.

Введение вакцины на основе смеси антигенов из штаммов Ps. aeruginosa N 40, 63, 77, 110 и 278 лисицам, песцам, норкам индуцирует у 98% животных спустя 6 дней образование стойкого иммунитета продолжительностью не менее 12 месяцев (срок наблюдения).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Матровые расплодки культур штаммов Ps. aeruginosa ВГНКИ N 40 шестого серовара, N 63 восьмого серовара, N 77 пятого серовара, N 110 второго серовара и N 278 третьего cepouapa выращивают в отдельных реакторах в бульоне Хоттингера при 36,5-37,5^oC до максимального накопления бактериальной массы 12-18 млрд. м.к. в 1 см³. По окончании культивирования с помощью физиологического раствора концентрацию бактериальной массы каждого штамма снижают до 6-8 млрд.м.к./см³, добавляют формалин из расчета 0,32-0,34% от объема и инактивируют в течение 12-14 дней при 6,5-37,5^oC. После инактивации суспензию каждого штамма в эффективном соотношении смешивают в отдельном реакторе, добавляют 0,30-0,35% от объема гидроокиси алюминия и доводят pH биопрепарата до 7,2-7,4, проверяют на стерильность и расфасовывают.

Готовая вакцина представляет собой гомогенную суспензию серовато-белого цвета. При отстаивании на дне флакона образуется осадок серовато-беловатого цвета, легко разбивающийся при встряхивании флакона.

Вакцину выдерживают в течение 14 дней при 16-20^oC, после чего снова проверяют на стерильность, а также на безвредность и иммуногенность.

Пример 2. Изучают безвредность вакцины против псевдомоноза пушных зверей, приготовленную по примеру 1, содержащей в своем составе следующие компоненты, об.%:
Смесь антигенов из штаммов Ps. aeruginosa ВГНКИ N40 шестого серовара, N 63 восьмого серовара N 77 пятого серовара, N 110 второго серовара и N 278 третьего серовара, взятых в эффективном соотношении, при концентрации 8 млрд.м.к. в 1 см³ бульона Хоттингера - 75,00
Гидроокись алюминия - 0,30
Формалин - 0,32
Физиологический раствор - Остальное
Морским свинкам в количестве 270 голов живой массой 300-350 г вакцину вводят подкожно в область спины в дозе 3,0-3,5 см³, песцам (120 голов) и лисицам (75 гол.) внутримышечно в дозе 5-6 см³ (по 2,5-3,0 см³) в правую и левую заднюю конечности.

Изучение показало, что вакцина безвредна для животных. В результате наблюдения в течение 10 дней у животных не отмечалось отклонений от нормального физиологического состояния. Все животные остались живыми.

Пример 3. Активность полученной по примеру 1 вакцины против псевдомоноза пушных зверей в сравнении с известной вакциной (по прототипу) проверяют на морских свинках (235 гол.) живой массой 300-350 г. С этой целью морским свинкам подопытных групп, однократно, внутримышечно вводят предварительно оттитрованную дозу вакцины, содержащую в своем составе следующие компоненты, об. %:
Смесь антигенов из штамма Ps. aeruginosa ВГНКИ N 40 шестого серовара, N 63 восьмого серовара, N 77 пятого серовара, N 1110 второго серовара, взятых в эффективном соотношении, при концентрации 7 млрд. микробных клеток в 1 см³ бульона Хоттингера - 40,00
Гидроокись алюминия - 0,33
Формалин - 0,33
Физиологический раствор - Остальное
Контрольной группе морских свинок (30 гол.) вводят аналогичную вакцину против псевдомоноза пушных зверей, содержащую в основе антигены из штаммов Ps. aeruginosa ВГНКИ N40 шестого серовара, N 48 одиннадцатого серовара, N 63 восьмого серовара и N 77 пятого серовара (прототип).

Через 7-10 дней у 50% привитых животных берут кровь и сыворотку исследуют в РА с гомологичными штаммами возбудителя псевдомоноза, входящего в состав вакцины.

Результаты представлены в таблице.

Из приведенных данных видно, что активность предложенной вакцины значительно выше активности известной вакцины, несмотря на одинаковое количество антигена в дозе каждого препарата.

Пример 4. Проводят проверку иммуногенных свойств вакцины против псевдомоноза пушных зверей, приготовленной по примеру 1, содержащей в своем составе следующие компоненты, об.%:
Смесь антигенов из штамма Ps. aeruginosa N 40 шестого серовара, N 63 восьмого серовара, N 77 пятого серовара, 110 второго серовара и N 278 третьего серовара, взятых в эффективном соотношении, при концентрации 6 млрд. микробных клеток в 1 см³ бульона Хоттингера - 33,33
Гидроокись алюминия - 0,35
Формалин - 0,34
Физиологический раствор - Остальное
Морских свинок (675 гол. ) живой массой 300-350 г. вакцинируют живой вакциной указанного состава однократно, внутримышечно в дозах 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 см³ песцов и лисиц иммунизируют внутримышечно в дозе 1,0 и 1,5 см³ соответственно. Контрольным животным вакцину не вводят. Через 14 дней после иммунизации привитых и контрольных морских свинок заражают подтитрованной дозой культур штаммов Ps. aeruginosa ВГНКИ N40 шестого серовара, N 63 восьмого серовара, N 77 пятого серовара, N 110 второго серовара и N 278 третьего серовара.

Установлена 100%-ная иммунологическая защита привитых морских свинок при гибели от возбудителя псевдомоноза 95% не привитых морских свинок. Гибели среди вакцинированного поголовья песцов и лисиц также не установлено. У песцов, привитых в дозах 1,0 см³, и лисиц, вакцинированных в дозах 1,5 см³, в сыворотке крови установлено наличие агглютининов в титре 1:220-1:380.

Пример 3. Вакцину против псевдомоноза пушных зверей состава (по примеру 4) используют с профилактической целью при иммунизации самок песцов и лисиц (общим количеством 1500 гол.) в звероводческих хозяйствах неблагополучных по псевдомонозу. Вакцину вводят однократно, внутримышечно с внутренней стороны бедра в дозе 1,0-1,5 см³, лисицам в дозе 1,5-2,0 см³. Контрольной группе (1) зверей (500 гол. песцов и лисиц) вводят известную вакцину (по прототипу) в тех же дозах. Часть животных не прививают (контроль II - 503 самки песца и лисицы). За привитыми и контрольными зверями ведут клиническое и эпизоотологическое наблюдение в течение года. Исследованием установлено, что в группе песцов и лисиц, привитых предлагаемой вакциной, случаев осложнений и прорыва иммунитета не отмечено. В группах зверей, привитых вакциной (по прототипу), аборты псевдомонозной этиологии отмечены в 18 случаях. Среди не привитых зверей контрольной группы отмечены случаи абортов и рассасывания плодов в первую половину беременности в 38 случаях.

Использование предложенной вакцины в ветеринарной практике позволит повысить эффективность проводимых мероприятий по борьбе с псевдомонозом песцов и лисиц.

Источники информации
1. Патент США N 4120950, кл. 424-87, 1978.

2. Авторское свидетельство СССР N 575889, кл. C 12 K 5/00, 1972.

3. Авторское свидетельство СССР N 1066074, кл. A 61 K 39/104, 1982 (прототип).

Изобретение предназначено для получения средств специфической профилактики. Вакцина содержит смесь антигенов из штаммов Ps. aeruginosa ВГНКИ N 40 шестого серовара, N 63 восьмого серовара, N 77 пятого серовара, N 110 второго серовара, N 278 третьего серовара. Штаммы берут в эффективном соотношении при концентрации 6-8 млрд. м.т. в 1 см³ бульона Хоттингера в объеме 33,33-75,00%. Вакцина также содержит необходимое количество гидроокиси алюминия, формалина и физиологического раствора. Вакцина Псевдополивак безвредная для песцов и лисиц. Сохранность среди вакцинированного благополучного и неблагополучного поголовья по псевдомонозу пушных зверей составляет 100%. Средний геометрический титр агглютининов в сыворотке крови песцов и лисиц составляет 1:220-1:380. Вакцину применяют песцам и лисицам в оптимальные сроки в эффективных дозах. Использование изобретения в ветеринарной практике позволит повысить эффективность проводимых мероприятий по борьбе с псевдомонозом песцов и лисиц. 1 табл.

Вакцина против псевдомоноза пушных зверей, преимущественно песцов и лисиц, содержащая антигены из штаммов Pseudomonas aeruginosa ВГНКИ N 40 шестого серовара, N 63 восьмого серовара, N 77 пятого серовара в бульоне Хоттингера, гидроокись алюминия, формалин и физиологический раствор, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антигены из штаммов Pseudomonas aeruginosa ВГНКИ N 110 второго серовара и N 278 третьего серовара, взятые в смеси в эффективном соотношении при концентрации 6 - 8 млрд. микробных клеток в 1 см³ бульона Хоттингера при следующем соотношении компонентов, об.%:
Смесь антигенов из штаммов Pseudomonas aeruginosa ВГНКИ N 40 шестого серовара, N 63 восьмого серовара, N 77 пятого серовара, N 110 второго серовара и N 278 третьего серовара, взятых в эффективном соотношении при концентрации 6-8 млрд. микробных клеток в 1 см³ бульона Хоттингера - 33,33 - 75,00
Гидроокись алюминия - 0,30 - 0,35
Формалин - 0,32 - 0,34
Физиологический раствор - Остальное